KR20120099688A - 음식에서 발견된 페놀 화합물의 상승적 상호작용 - Google Patents

음식에서 발견된 페놀 화합물의 상승적 상호작용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 천연 발생 식품에서의 비율로부터 유래한 비율을 가진 다중 항산화제 화합물의 상승적 영양 보조제에 관한 것이다.

Description

음식에서 발견된 페놀 화합물의 상승적 상호작용{SYNERGISTIC INTERACTIONS OF PHENOLIC COMPOUNDS FOUND IN FOOD}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2009년 10월 20일에 출원된 미국 가특허출원 제61/279,368호; 2010년 3월 2일에 출원된 미국 가특허출원 제61/339,244호; 및 2010년 7월 14일에 출원된 미국 가특허출원 제61/339,548호로부터의 이익을 주장하며, 상기 특허출원들은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.
식물은 세포의 신호작용 분자, 항산화제 또는 침입하는 해충에 대한 독소로서 작용하는 페놀 화합물을 생성한다(Crozier 외 공저 2006). 과일의 성분들에 대한 연구가 이루어져 왔는데(Robards 외 공저 1999; Franke 외 공저 2004; Harnly 외 공저 2006), 그 성분들의 높은 항산화능으로 인해 주로 페놀 화합물이 강조되었다.
과일에서 발견되는 농도의 개개의 페놀 화합물의 항산화능과 전체 과일의 항산화능 사이에는 불일치가 있으며(Miller 및 Rice-Evans 1997; Zheng 및 Wang 2003), 전체 과일의 항산화능이 더 높다. 이 차이에 대한 가능한 설명은 과일의 미확인 화합물, 저농도로 과일에 존재하는 다수의 화합물의 총합 또는 페놀 화합물 사이의 상승적 상호작용을 포함할 수 있다.
Lila 및 Raskin(2005)은 내부 상호작용, 즉 그 약리학적 효과를 변형할 수 있는 식물 내의 상호작용, 및 무관한 식물 성분 및/또는 약제들 사이의 상호작용인 외부 상호작용의 관점에서 첨가적 또는 상승적 강화작용을 논의하였다. 외부 상호작용을 통한 항산화 상승작용이 약간의 주목을 받아 왔다. Yang 및 Liu(2009)는 사과 추출물과 퀘르세틴 3-β-D-글루코시드의 배합물이 인간의 유방암 세포에 대해 상승적 항증식 활성을 나타낸다고 보고하였다. 콩과 알팔파 피토에스트로겐 추출물과 아세롤라 체리 추출물의 배합물은 시험관 내에서 LDL 산화를 상승적으로 저해하는 작용을 한다(Hwang 외 공저 2001). Liao 및 Yin(2000)은 알파-토코페롤 및/또는 아스코르빈산과 카페인산, 카테킨, 에피카테킨, 미리세틴, 갈산, 퀘르세틴 및 루틴의 배합물이 Fe2 +-유도 지질 산화계에서 어떤 단독 화합물보다 더 큰 항산화 활성을 가졌음을 입증하였다.
효과적인 천연 방부제를 개발 또는 발견하는 것이 최근의 관심사이다(Galal 2006). 접근법에는 항미생물제로서 추출물(Serra 외 공저 2008; Conte 외 공저 2009), 페놀 화합물(Rodriguez Vaquero 및 Nadra 2008) 또는 화합물들의 혼합물 (Oliveira 외 공저 2010)을 사용하는 것을 포함한다. 잠재적인 항산화제 혼합물의 기능성 이면의 기작을 이해하는 것이 방부제로서의 그들의 잠재력 개발에 중요하다.
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페놀 화합물은 항산화성 및 항미생물성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 성질들은 음식 또는 음료의 보존에 유용할 수 있다. 음식내의 페놀 화합물의 상호적인 항산화능에 대해서는 널리 연구되어 있지 않다. 과일 항산화제의 배합물이 어떻게 함께 작용하는 지에 대한 이해가 음식 및/또는 음료의 보존에 있어서의 그 미래의 사용을 지지할 것이다.
하나의 측면은 항산화 페놀 화합물의 상승적 배합물이 식품에 존재한다는 것에 대한 발견이다. 상승적 내부 상호작용이 항산화제들 사이에서 자체적으로 일어난다는 발견은 중대한 것이다. 또 다른 측면은 항산화제의 상승적 배합물을 결정하는 시스템이며, 상승작용은 이들 항산화제 화합물이 혼합물에 존재하는 비율에 부분적으로 의존하고 있다는 발견이다.
또 다른 측면은 가능한 상승적 항산화제 배합물과 비율을 결정하기 위한 모델로서 과일과 같은 식품을 사용하는 것이다. 식품에 존재하는 항산화제의 모든 가능한 비율과 배합을 시험하는 비현실적으로 길고 비싼 과정 대신에, 식품에서 발생하고 있는 배합 및 비율로 항산화제를 시험하였다. 이러한 방식으로, 상승적 항산화능을 가질 가능성이 더 높은 배합물을 시험할 것이다.
또 하나의 측면은 상승적 항산화능을 가진 영양 보조제를 제조하는 방법이다. 식품에는 2종 이상의 항산화제 화합물이 확인되며, 그 개개의 항산화능이 측정된다. 또한, 식품에서 서로에 대한 비율, 즉 식품 비가 측정된다. 혼합물의 항산화능이 첨가적 또는 예측된 능력, 즉 개별적으로 취한 혼합물 중의 화합물들의 항산화능의 합계보다 더 큰 지를 측정함으로써, 항산화능에서 화합물들 사이에 상승작용이 있는 지를 측정할 수 있다.
항산화제 화합물은 항산화능을 가진 화합물이다. 임의의 적합한 시스템을 사용하면 항산화능을 측정할 수 있다. 실시예에서는, 단일 화합물 및 혼합물의 항산화능은 산소 라디칼 흡광능(ORAC) 뷴석에 의해 측정된다. 목표 중의 하나는 인체 영양 또는 음식 보존을 위한 결과의 잠재적인 응용을 나타내는 것이므로, 그것은 학술적 연구 외의 통상의 용도 및 친숙함에 대한 항산화 분석의 다수의 선택 중에서 선택되었다. 그러나, 항산화능을 측정하기에 적합한 임의의 방법이 고려된다. 적합한 방법의 예로는 다음과 같은 것들이 있으나, 이에 국한되지 않는다:
ORAC - 산소 라디칼 흡광능 분석(Oxygen Radical Absorbance Capacity assay),
NORAC - 퍼옥시나이트라이트 ORAC 분석,
HORAC - 히드록실 ORAC 분석,
ORAC-PG - 산소 라디칼 흡광능 피로갈롤 레드 분석(Oxygen Radical Absorbance Capacity pyrogallol red assay),
DPPH - 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질 라디칼 분석,
FRAP - 플라즈마의 페릭 환원능 분석(Ferric Reducing Ability of Plasma assay),
TEAC - 트롤록스 당량 항산화능 분석(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity assay),
VCEAC - 비타민 C 당량 항산화능 분석,
ABTS - 2'-아지노비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산) 분석,
CUPRAC - 큐프릭 환원 항산화능 분석(Cupric Reducing Antioxidant Capacity assay),
TRAP - 총 라디칼 트래핑 항산화제 파라미터 분석 (Total Radical Trapping Antioxidant Parameter assay), 및
CAA - 세포의 항산화 활성 분석.
항산화제 혼합물에서의 상승작용은 먼저 2종 이상의 항산화제 화합물을 식품 비(식품 중의 화합물들의 서로에 대한 비율)로 포함하는 혼합물을 형성하고, 혼합물의 항산화능을 측정함으로써 측정한다.
상승작용은 혼합물의 항산화능을 예측된 또는 첨가적 항산화능 값과 비교함으로써 측정한다. 첨가치는 혼합물의 개개의 항산화제 화합물 각각의 항산화능의 합산치인데, 이것은 개별적으로 취하거나 각자가 독립적으로 작용한다는 것을 가정한 것이다. 비교치는 모든 항산화제 화합물들의 혼합물의 결과적인 항산화능으로부터 개개의 화합물에 대한 항산화능의 합계를 뺌으로써 계산할 수 있다. 양의 결과가 상승작용을 나타낸다. 음의 값 또는 통계적으로 작은 양의 값 또는 값 없음은 길항작용 또는 화합물들 사이의 상호작용 없음을 나타낸다. 항산화능의 측정시에는, 몇 가지 샘플의 평균이 통계적으로 더 양호한 값을 제공할 것이다.
또 다른 측면은 상승적 항산화능을 가진 화합물들의 혼합물을 형성함으로써 만들어진 영양 보조제인데, 여기서 혼합물은 상승적 항산화성을 가진 것으로 측정된 서로에 대한 비율의 특정 항산화제 화합물들의 혼합물이다.
과일과 같은 특정 식품에서 발견되는 농도 비의 개개의 페놀 항산화제로 시작하여, 그러한 상승작용은 내부 상호작용만을 사용하여 측정할 수 있다는 것이 확인되었다. 이것은 전체 식품과 개개의 성분들 사이의 항산화능 차이를 설명하는 데 도움이 되며, 최적화된 과일 유래의 항산화 방부제의 개발에 대한 기초를 수립한다.
식품에는 인간 소비용으로 키운 식물 기원의 임의의 음식이 포함되며, 후가공, 예컨대, 건조, 동결, 가열(저온 살균을 포함), 기타 성분과의 혼합 또는 인간 소비용으로 이용되기 전에 음식에 적용되는 모든 가공 처리가 수행된 음식이 포함된다. 페놀 항산화제 화합물을 함유하는 모든 음식이 식품으로서 고려되며, 이것은 항산화제 화합물의 상승적 배합물을 결정하기 위해 분석될 수 있다. 그 예로는 과일(예컨대, 오렌지, 딸기 및 아래에 예시되는 블루베리), 야채, 견과, 달걀, 식물성 기름, 곡물(흑미를 포함), 콩, 초콜렛, 계피, 오레가노, 발효된 드링크(적포도주), 차 및 커피를 포함한다. 특정 육류로는 가금류 및 생선과 같은 항산화물을 포함하며, 상승적 항산화제 비율의 결정을 위한 식품으로 고려될 수 있다.
도 1은 배합물과 배합물 중의 개개의 화합물들을 뺀 것에 대한 산소 라디칼 흡광능(ORAC) 차에 관한 것이다 (식 1 내지 식 3). 도시된 모든 배합물은 통계적으로 유의 수준의 것이며(피셔의 최소 유의차를 사용하여 p < 0.05), 통계적으로 유의 수준이 아닌 배합물은 도시하지 않는다. C = 클로로겐산; H = 헤스페리딘; L = 루테올린; M = 미리세틴; N = 나린게닌; P = p-쿠마르산; Q = 퀘르세틴. HC는 다른 배합물에 대한 것과 마찬가지로, H 및 C의 혼합물의 ORAC에서 H의 ORAC 및 C의 ORAC를 뺀 것을 나타낸다. 각각의 값은 4개 반복 측정의 평균이다.
도 2는 오렌지에서 발견된 농도에서 3개의 페놀 화합물의 배합물의 산소 라디칼 흡광능(ORAC)에서 2 + 1 ORAC 데이터의 합을 뺀 것을 도시한 것이다(식 4). 이런 방식의 데이터 분석은 패턴을 규명하며, 어느 화합물 상호작용이 ORAC에 가장 영향을 끼치는 지를 결정할 수 있게 만든다(추가 논의에 대해서는 상세한 설명 참조). 도시된 모든 배합물은 통계적으로 유의 수준의 것이며(ANOVA 추정치를 사용하여 p < 0.05), 통계적으로 유의 수준이 아닌 배합물은 도시하지 않는다. C = 클로로겐산; H = 헤스페리딘; L = 루테올린; M = 미리세틴; N = 나린게닌; P = p-쿠마르산; Q = 퀘르세틴. HC + N은 다른 배합물에 대한 것과 마찬가지로, H, C 및 N의 혼합물의 ORAC에서 HC의 혼합물의 ORAC 및 N의 ORAC를 뺀 것을 나타낸다. 각각의 값은 4개 반복 측정의 평균이다.
도 3은 오렌지에서 발견된 농도에서 4개의 페놀 화합물의 배합물의 산소 라디칼 흡광능(ORAC)에서 3 + 1 ORAC 데이터의 합을 뺀 것을 도시한 것이다(식 5). 이런 방식의 데이터 분석은 패턴을 규명하며, 어느 화합물 상호작용이 ORAC에 가장 영향을 끼치는 지를 결정할 수 있게 만든다(추가 논의에 대해서는 상세한 설명 참조). 도시된 모든 배합물은 통계적으로 유의 수준의 것이며(ANOVA 추정치를 사용하여 p < 0.05), 통계적으로 유의 수준이 아닌 배합물은 도시하지 않는다. C = 클로로겐산; H = 헤스페리딘; L = 루테올린; M = 미리세틴; N = 나린게닌; P = p-쿠마르산; Q = 퀘르세틴. HC + N은 다른 배합물에 대한 것과 마찬가지로, H, C 및 N의 혼합물의 ORAC에서 HC의 혼합물의 ORAC 및 N의 ORAC를 뺀 것을 나타낸다. 각각의 값은 4개 반복 측정의 평균이다.
도 4는 페놀 화합물들의 구조 및 이들의 1-전자 환원 전위를 도시한 것이다.
도 5는 딸기에서의 항산화제 화합물들의 구조를 도시한 것이다.
도 6은 블루베리에서의 개개의 화합물들의 ORAC를 도시한 것이다.
도 7은 1:1 비 혼합물 및 과일비 혼합물의 ORAC를 예측된 결과와 비교하여 도시한 것이다.
실시예 1
네이블 오렌지에서 발견되는 페놀 화합물들의 상승적 및 길항적 상호작용
네이블 오렌지(시트러스 시넨시스)에서 발견되는 농도에서 개개의 페놀 화합물(클로로겐산, 헤스페리딘, 루테올린, 미리세틴, 나린게닌, p-쿠마르산 및 퀘르세틴)의 상호작용을 항산화능에 대해 분석하여 잠재적인 길항적, 첨가적 또는 상승적 상호작용을 관찰하였다. 2, 3 및 4개의 페놀 화합물들의 혼합물을 제조하였다. 산소 라디칼 흡광능(ORAC) 분석을 사용하여 이들 배합물의 항산화능을 정량 분석하였다. 2개 화합물의 3개의 상이한 배합물 및 3개 화합물의 5개 배합물이 상승적인 것으로 확인되었다. 2개 화합물의 하나의 길항적 배합물도 확인되었다. 제4 화합물의 첨가로 추가의 상승작용은 일어나지 않았다. 결과를 설명하기 위한 모델이 개발되었다. 환원 전위, 상대 농도 및 카테콜(o-디히드록시 벤젠) 기의 존재 또는 부재가 모델에서의 요소이었다.
재료 및 방법
화학 물질
트롤록스((±)-6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2 카르복실산)(97% 순도, 아크로스 오가닉스), 나린게닌(95%, MP 바이오메디칼스 인코포레이티드), 퀘르세틴 수화물(95%, 아크로스 오가닉스), 수산화나트륨(50% 용액), K2HPO4, 및 KH2PO4(말린크로트 인코포레이티드)를 피셔 사이언티픽 인코포레이티드(미국 매사추세츠 월덤)를 통해 구입하였다. 클로로겐산(95%), 헤스페리딘(>80%), 루테올린(99%), 미리세틴(95%), p-쿠마르산(98%), 및 플루오레세인(Na 염)을 시그마-알드리치 (미국 미주리 세인트 루이스)로부터 구입하였다. AAPH(2,2'-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)디히드로클로라이드)는 와코 케미칼스 U.S.A. 인코포레이티드(미국 버지니아 리치몬드)로부터 구입하였다.
화학 물질 제조
오렌지에서 발견되는 가장 농축된 페놀 화합물 중 7종은 다음과 같이 선택되었다: 클로로겐산, 헤스페리딘, 루테올린, 미리세틴, 나린게닌, p-쿠마르산, 및 퀘르세틴 (Proteggente 외 공저 2003; Franke 외 공저 2004; USDA 플라보노이드 데이터베이스 2007). 이들 각각은 인용 문헌에서 헤스페리딘을 제외하고는 아글리콘으로서 정량되었다. 모든 화합물은 공개된 농도로 제조되었다(표 1).
선택된 페놀 화합물 및 네이블 오렌지에서 발견되는 양
화합물 ㎎/100g 신선 과일
클로로겐산 0.19
헤스페리딘 31
루테올린 0.7
미리세틴 0.01
나린게닌 7.1
p-쿠마르산 0.02
퀘르세틴 0.2
오렌지의 높은 함수량으로 인해, 밀도 조정은 이루어지지 않았다. 화합물들은 100g이 부피 100㎖라고 가정하고 준비하였다. 헤스페리딘 및 루테올린을 제외한 모든 화합물은 (계량을 용이하게 하기 위해 표 1의 농도의 10배 내지 1000배) 계량하여 메탄올에 용해하였다. 루테올린 및 헤스페리딘은 실온(RT)에서 메탄올 및 1N NaOH의 8:2(v:v) 혼합물로 준비하였는데, 이들 두 화합물은 염기성 용액에서 계량 가능한 농도로만 충분히 용해될 수 있기 때문이다. 페놀 화합물 모액은 -20℃에서 1㎖ 분취액으로 저장하였다. 페놀 화합물을 RT에서 와동시키고, 표 1의 과일 농도에 일치시키기 위해 7:3(v:v) 아세톤:물에서 희석하였다. 트롤록스 표준 곡선(하기 분석 설명 참조)에 맞추기 위해, 화합물들을 96-웰 평판으로 옮기기 전에 7:3(v:v) 아세톤:물에서 다음과 같은 몰 농도로 추가로 희석하였다: 클로로겐산, 10.7μΜ; 헤스페리딘, 10.2μΜ; 루테올린, 2.45μΜ; 미리세틴, 0.786μΜ; 나린게닌, 2.61μΜ; p쿠마르산, 1.95μΜ; 및 퀘르세틴, 6.62μΜ. 해동 및 희석 후에 용해도를 검사하였다. 페놀 화합물, 플루오레세인 및 트롤록스와 관련된 모든 작업은 어두운 조건에서 수행하여 분해를 최소화하였다.
혼합물
2개 화합물의 모든 가능한 배합물을 상대 농도가 유지될 수 있게 하기 위해 표 1에서 확인되는 농도로 준비한 후에 동일한 부피 기준으로 혼합하였다. 트롤록스 표준 곡선에 맞추기 위해 혼합물을 추가로 희석하여 최저의 개별 화합물 몰농도로 맞추었다. ORAC를 측정하고 통계 분석을 완성하기 위해, 2개 화합물의 상위 3개의 통계적으로 상승적인 배합물을 모든 가능한 제3 화합물과 배합하고, 마찬가지로 분석하였다. 4개 화합물의 배합물에 대해 동일한 패턴을 반복하였고; 3개 화합물의 상위 3개의 상승적 배합물을 모든 가능한 제4 화합물과 배합하였다. 2, 3 및 4개 화합물의 배합물을 그 ORAC 분석과 동일자에 준비하였다.
산소 라디칼 흡광능 ( ORAC )
ORAC 분석은 약간 변형하여 Davalos 외 공저(2004)에 따라 수행하였다. 간략히 언급하면, 플루오레세인은 인산염 완충제에서 70.3mM로 희석하고, -20℃에서 한달 이하의 기간 동안 25㎖ 분취액으로 저장하였다. 트롤록스는 아세톤 및 물의 7:3 혼합물에서 80μΜ로 희석하고, -20℃에서 한달 이하의 기간 동안 100㎕ 분취액으로 저장하였다. AAPH는 각각의 ORAC 분석 5분 전에 인산염 완충제에 12mM로 희석하였다. 플루오레세인 및 AAPH를 37℃까지 가열하고, 프리시전 마이크로피페터(미국 버몬트 위누스키 소재의 바이오텍 인스트루먼츠 인코포레이티드)를 통해 96-웰 평판의 모든 웰로 옮겼다. 모든 농도 (10μΜ, 20μΜ, 40μΜ, 60μΜ, 80μΜ)의 트롤록스를 동일한 열내의 중복 웰에 옮겨서 표준 곡선을 형성하였다. 페놀 용액을 사전 고안된 평판 레이아웃에 따라 중복 웰로 옮겼다. 모든 충전된 평판을 AAPH의 추가 및 후속 형광 측정의 15분 전에 평판 판독기(37℃로 설정됨) 내에서 가온하였다. 각각의 거울상 사본을 평균하고 1 복제본으로 계수하였다. 모든 샘플은 4 복제본으로(총 8개 웰) 측정하여 필요한 통계력을 얻었다.
모든 웰의 형광은 바이오텍 시너지 2 형광 평판 판독기(바이오텍 인스트루먼츠 인코포레이티드)에서 120분 동안 매분 485/20nm 여기 및 528/20nm 발광으로 측정하였다. ORAC 값은 네이블 오렌지에서 발견되는 페놀 화합물(들)의 농도를 함유하는 용매의 1리터당 트롤록스 당량(TE/L)으로 표현하였다.
통계
2개 화합물의 배합물의 경우, 차는 두 화합물의 배합물의 결과적인 평균 ORAC 값으로부터 개개의 화합물에 대한 평균 ORAC 값의 합계를 뺌으로써 계산하였다(식 1).
차 = (배합물 ab) - (개개의 a + 개개의 b). (1)
마찬가지로, 3 및 4개 화합물의 배합물의 경우, 차는 배합물로부터 개개의 3 또는 4개 화합물의 평균을 뺌으로써 계산하였다(식 2 및 3).
차 = (배합물 abc) - (a + b + c). (2)
차 = (배합물 abcd) - (a + b + c + d). (3)
이런 방식으로 결과를 제시함으로써 SAS 통계 패키지(미국 노스 캐롤라이나 캐리 소재의 SAS 인스티튜트 인코포레이티드)에서 피셔의 최소 유의차(LSD) 분석을 사용하여 최소 누적치인 이들 배합물을 쉽게 구별할 수 있었다.
추가적으로, 3 및 4개 화합물의 배합물의 경우, 차는 모든 3 또는 4개 화합물의 배합물의 결과적인 평균 ORAC 값으로부터 2 또는 3개 화합물의 배합물과 1개의 개별 화합물의 합에 대한 평균 ORAC 값의 합계를 뺌으로써 계산하였다(식 4 및 5).
차 = (배합물 abc) - (배합물 ab + 개개의 c). (4)
차 = (배합물 abcd) - (배합물 abc + d). (5)
SAS를 사용하여, 데이터를 조합할 때 오차 조건을 고려하는 추정 통계를 사용하여 배합물의 유의 수준을 결정하였다. 전술한 차는 개별 화합물의 ANOVA 및 ORAC 값의 조합 결과를 통해 그리고 개개의 화합물 및 배합물을 조합하는 효과를 측정하기 위한 사후검정으로서 차를 형성하면서 비교하였다.
결과 및 검토
배합물 ORAC - 개개의 페놀 ORAC 값의 합계
도 1은 식 1 내지 식 3에 따라 모든 통계적으로 유의 수준의 배합물에 대한 ORAC 값을 제시한다. 배합물 헤스페리딘/미리세틴, 헤스페리딘/나린게닌, 및 헤스페리딘/클로로겐산은 시험된 21개 쌍방향 배합물 중에서 통계적으로 상승적인 ORAC 값을 가졌다. 유의 수준의 차를 나타낸 3개 화합물의 배합물은 헤스페리딘/클로로겐산/나린게닌, 헤스페리딘/미리세틴/나린게닌, 헤스페리딘/나린게닌/루테올린, 헤스페리딘/나린게닌/p-쿠마르산, 및 헤스페리딘/나린게닌/퀘르세틴이었다. 4개 화합물의 배합물의 ORAC 값은 4개의 개별 값을 뺄 때 모두 통계적으로 상승적이었다.
단계적 분석
단계적인 방식으로 분석할 때(식 4), 3개 화합물의 일부 배합물의 값은 유의 수준이었다(도 2). 예컨대, 헤스페리딘/클로로겐산 + 나린게닌, 클로로겐산/나린게닌 + 헤스페리딘, 및 헤스페리딘/나린게닌 + 클로로겐산은 모두 상당히 상승적이었으며, 이들 모두는 도 1에서 헤스페리딘/클로로겐산/나린게닌에 대한 유의 수준의 결과와 일치한다. 추가적으로, 본 발명자들은 헤스페리딘/나린게닌을 배합하거나 헤스페리딘/나린게닌에 임의의 제3 화합물을 첨가하는 것은 항상 상당히 양의 값임을 확인하였다. 달리 말하면, 다른 하나의 화합물은 헤스페리딘/나린게닌의 ORAC를 증가시키는 것으로 보인다.
도 1에 도시된 외관상 양의 결과에도 불구하고, 4개 화합물의 배합물의 분석은 4개 화합물의 배합물이 3개 화합물의 배합물보다 상당히 더 높은 미가공 ORAC 값을 갖지 못하였음을 나타냈다(도 1 및 3 비교). 추가적으로, 배합물이 이미 헤스페리딘 및 나린게닌을 포함하였으면, 제4 화합물을 첨가하면 거의 항상 ORAC를 감소시켰다. 2 및 3개 화합물의 배합물에서 발견되는 바와 같이 나린게닌을 헤스페리딘을 함유하는 임의의 배합물에 첨가하면 항상 ORAC를 상당히 증가시켰다. 헤스페리딘 및 나린게닌이 이미 함께 존재하는 경우에는 제4 화합물의 첨가 ORAC를 증가시키지 못했다. 제4 화합물은 항산화제 쌍으로서 헤스페리딘/나린게닌의 성능을 감소시키는 것으로 보이거나 그것에 영향을 끼치지 않는다. 첨가적 배합물(식 1, 도 1)과 대조적으로, 개개의 페놀 화합물의 합계보다 상당히 더 낮은 ORAC 값을 갖는 2 + 1 및 3 + 1의 배합물은 미리세틴 또는 p-쿠마르산을 주로 함유하였다.
길항적 상호작용
길항적 상호작용은 여러 배합물에서 명확하였다. 유의 수준의 길항작용을 나타내는 2개 화합물의 유일한 배합물은 미리세틴/나린게닌이었다. 첨가 분석(식 2 및 식 3)에서 3 또는 4개 화합물의 어떤 배합물도 유의 수준의 길항작용이 없었다. 식 4 및 식 5의 단계적 분석에서, 여러 가지 통계적으로 유의 수준의 길항적 상호작용이 있었다(도 2 및 3 참조). 미리세틴은 길항적 상호작용을 나타낸 모든 2 + 1 배합물의 일부이었다. 헤스페리딘을 미리세틴/나린게닌의 길항적 배합물에 첨가하면 강한 상승작용을 생성시키는 대신에 배합물에서 길항작용을 제거하였다. 미리세틴은 또한 길항적인 다른 4개의 3 + 1 배합물에서는 명확한 패턴이 없었지만, 3 + 1 배합물 길항적 상호작용 중 5개 화합물에서 존재한다.
5개 이상의 화합물의 배합물
종합적으로, 본 발명자는 2, 3 및 4개 화합물의 몇 가지 배합물이 배합될 때 유의 수준의 상승작용을 입증하였음을 확인하였다. 이러한 결과 및 관찰된 상호작용을 기초로, 본 발명자는 복잡성이 클수록 3개 화합물의 배합물에서 이미 달성된 것보다 더 높은 유의 수준의 항산화능을 갖지 않을 것임을 예측하였다. 3개 화합물의 레벨을 넘은 배합물의 복잡성의 증가는 배합물의 총 ORAC를 증가시키지 않았다(도 1). 3개 화합물의 배합물의 경우 이미 발생하지 않은 4개 화합물의 배합물과 함께 발견된 추가의 상호작용은 없었다. 따라서, 5개 이상의 화합물의 배합물의 추가 분석은 실행하지 않았다.
구조적 분석
임의의 이론에 구속되는 것은 아니지만, 페놀 화합물의 항산화능은 고리 구조 상의 히드록실기의 배열 및 수에 의존하며, B 고리의 카테콜기와 C 고리의 2, 3개 이중결합(도 4 참조)은 항산화능과 크게 상관 관계가 있다고 보여지는 2 가지 특성이다(Rice-Evans 2001; Ami'c 외 공저 2007). 이들 2개의 작용기는 또한 길항작용을 논의하게 될 환원 전위를 예측한다. 또한 루테올린은 B 고리와 그 다음에 카테콜기를 가진다. 이들 작용기에 기초하여, 본 발명자들은 C 고리에 다음 2, 3 이중결합을 만들었으며, 상기 결과로부터의 관찰과 유사한 결과를 나타낸다: 미리세틴은 카테콜기 미리세틴을 둘다 보유한다. 한편, 2개 화합물은 그 B 고리에 카테콜기 및 C 고리에 2, 3 이중결합을 나타냈다. 그러나, 가장 강력한 상승작용은 항산화능 내지 항산화 강도를 개선하는 데 강한 관계를 나타내지 않는 것과 관련된 구조적 특성을 갖지 않는다. 나린게닌과 헤스페리딘은 둘다 이들 실험에서 유사한 결과를 나타내지 않았다. 실제로, 유의 수준을 나타낸 상기 화합물은 카테콜기 또는 2, 3 이중결합을 가지고 있으나, 상승작용을 나타낸 모든 배합물에 존재하는 화합물들이다. 또한, 헤스페리딘은 글리코시드이며, 이것은 분자의 항산화능을 추가로 방해하는 것으로 나타났다(Di Majo 외 공저 2005). 나린게닌 및 헤스페리딘은 이들 배합물에서 최고의 농도 및 가장 가까운 몰비를 가진 화합물이며, 이것은 그들의 명백한 상승작용을 설명할 수 있다(Cuvelier 외 공저 2000).
항산화제 배합물의 상승적 및 길항적 효과를 설명하기 위한 몇 가지 가설이 개발되어 왔다. Peyrat-Maillard 외 공저(2003)는 약한 항산화제와 강한 항산화제의 배합물을 기재하고 있는데, 여기서 약한 항산화제는 강한 항산화제를 재생하여 배합물의 전체 라디칼 켄칭(quenching) 능력을 개선할 수 있다. 유사한 상황에서, 길항작용은 강한 항산화제가 약한 항산화제를 재생한 다음 다시 라디칼을 켄칭하는 것으로써 설명될 수 있다. 이것은 배합물의 전체 항산화 강도를 감소시킬 것이다. 강한 항산화제와 또 다른 강한 항산화제의 배합물에서, 2개의 화합물은 서로를 재생하여 항산화 강도를 전체적으로 개선할 수 있다. 항산화제의 상호작용을 설명하기 위해 제시된 다른 공준은 항산화제의 반응 속도, 상호작용 분자의 극성 및 산화 부위에서의 항산화제의 효과적인 농도를 포함한다(Frankel 외 공저 1994; Koga 및 Terao 1995, Cuvelier 외 공저 2000).
환원 전위
임의의 이론에 구속되는 것은 아니지만, 예측된 상호작용은 또한 페놀 항산화제의 1-전자 환원 전위를 사용함으로써 이론적으로 측정할 수 있다(도 4). 환원 전위가 낮을 수록 분자는 그 전자를 공여할 가능성이 더 크다. 또한, 그 전자를 다음 최고 E 값을 가진 분자에 공여할 가능성이 더 크다. 이것은 Peyrat-Maillard 외 공저(2003)에 제공된 설명에 정량적인 기준을 추가한다. 이들 환원 전위에 기초하여(Jovanovic 외 공저 1994; Foley 외 공저 1999; J
Figure pct00001
rgensen 및 Skibsted, 1998), 사용된 7개 화합물은 다음과 같이 순서를 정할 수 있다: 미리세틴 > 퀘르세틴 > 루테올린 > 클로로겐산 > p-쿠마르산 > 헤스페리딘 > 나린게닌. AAPH(E = 약 1V; Buettner 1993)에 의해 생성된 퍼옥실 라디칼을 나린게닌 다음에 첨가한다. 이것은 동등한 몰 농도에서 미리세틴은 항상 그 전자를 퀘르세틴, 이어서 루테올린, 그리고 퍼옥실 라디칼에 (재활용하기 위해) 공여할 것임을 시사한다. 그러나, 네이블 오렌지의 경우에, 상대 농도에서 상당한 차가 있다. 최고의 환원 전위를 가진 헤스페리딘 및 나린게닌은 분석된 다른 5개 페놀 화합물보다 상당히 더 높은 상대 농도에서도 확인된다.
이론적으로, 2개 화합물의 모든 배합물은 2개 종 중의 하나가 그 전자를 다른 것에 공여하여 AAPH에 의해 생성된 퍼옥실 라디칼을 더 효과적으로 제거할 수 있게 한다면 상승적일 수 있다. 공여의 위계 역시 환원 전위에 근거하여 명백하다. 예컨대, 헤스페리딘 및 나린게닌의 배합물에서, 헤스페리딘은 전자를 나린게닌에 공여하고, 나린게닌은 퍼옥실 라디칼에 공여할 것이다. 그러나, 이것은 정확한 예측을 야기하지 않는다. 전부가 아니라 단지 몇 개의 배합물만이 유의 수준이었다.
ORAC 분석 반응 기작이 수소 원자 전이(HAT)에 기초하지만, 환원 전위는 단일 전자 전이(SET)의 척도이다. 불행하게도, 페놀 화합물에 이용 가능한 HAT의 볼트 척도는 없다. 그러나, 최종 결과는 여전히 동일하다(Ou 외 공저 2002). SET 및 HAT 둘다에서, 퍼옥실 라디칼이 결국 과산화물이 되며, 항산화제는 전자를 상실하며, 이때 생성되는 약반응성의 비공유전자가 그 구조에 존재한다. 전자는 두 기작 모두에서 추출되어야 한다. 따라서, 페놀 반응성의 순서는 2 기작 사이에서 유사한 것으로 추정될 수 있다. 이 추청은 정량적 기준을 가진 모델을 개발하기 위해 이루어졌다.
모델
임의의 이론에 구속되는 것은 아니지만, 카테콜기(또는 헤스페리딘 상의 메톡시 카테콜기)의 존재 또는 부재에 집중함으로써 2개 화합물의 환원 전위 및 상대 농도, 상승적 (및 길항적) 배합물을 설명할 수 있다. 카테콜기가 있는 페놀 화합물 분자는 더 낮은 환원 전위를 가지며, 그 전자를 더 쉽게 공여할 것이다. 카테콜기가 없는 분자와 배합 상태인 카테콜기를 가진 더 낮은 상대 농도의 분자가 있으면, 전자 공여는 최소화된다. 이것은 미리세틴/나린게닌의 경우에 그렇다. 그러나, 미리세틴/헤스페리딘의 경우, 공유가 더 효율적이어서 헤스페리딘 상의 메톡시 카테콜기로 인해 상승작용(헤스페리딘/클로로겐산에 대해서도 마찬가지)을 생성하며, 이것은 B 고리상의 단일 히드록실기를 가진 화합물보다 더 잘 재활용된다. 헤스페리딘/나린게닌의 경우, (카테콜로부터 비카테콜로의) 공여는 비효율적이더라도 , 농도는 압도하며(헤스페리딘은 나린게닌의 4배 농도로 존재함), 배합물은 유의 수준이다.
이 모델을 충족시키지 않는 몇 가지 배합물이 있다. 미리세틴/퀘르세틴, 루테올린/퀘르세틴, 및 미리세틴/루테올린 각각은 이론적으로 그 배합물쌍에 공여할 수 있는 카테콜기를 가지만, 이들 모두 간단한 첨가적인 ORAC를 가졌다. 구조의 유사성은 전자들의 서로에 대한 상호작용 및 공여를 비효율적이게 만들 수 있는데, 이들은 어느 정도 앞뒤로 간단히 공여하여 첨가적인 ORAC만을 산출할 수 있기 때문이다. 이들 배합물 중의 화합물들은 파괴될 때까지(고리 구조가 절단됨) 퍼옥실 라디칼과 독립적으로 또는 첨가적으로 상호작용하는 것으로 보인다.
동일한 모델이 또한 3개 화합물의 배합물에도 적용된다. 제3 화합물의 첨가가 ORAC 차의 크기를 증가시켰지만, 유의 수준인 모든 배합물은 헤스페리딘 및 나린게닌을 포함하였다(도 1). 더 낮은 환원 전위를 가진 제3 화합물의 첨가는 헤스페리딘 또는 나린게닌과 비교하여 매우 저농도임에도 불구하고, 전자 전이 또는 그들의 보존의 효율을 충분히 증가시켜 산출되는 ORAC 값에 크기를 첨가하였다. 헤스페리딘/나린게닌 + 제3 화합물(도 2)을 비교할 때, 유리한 순서는 상기 검토한 환원 전위 순서(미리세틴 > 퀘르세틴 > 루테올린 > 클로로겐산 > p-쿠마르산)는 아니지만, 상기 농도(표 1)와 유사한, ORAC를 증가시키는 농도로 루테올린 > 퀘르세틴 = 클로로겐산 = p-쿠마르산 > 미리세틴이다. 이 경우에는, 농도가 전자 공여 효율 또는 작용기보다 더 중요하다.
4개 화합물의 배합물의 경우, 제4 화합물의 첨가(도 3)가 다수의 배합물의 효율을 감소시켰으며, 상승작용은 헤스페리딘을 함유하는 배합물에 나린게닌을 첨가한 배합물들에만 존재하였다. 헤스페리딘 및 나린게닌이 이미 3개 화합물의 그룹에 존재한 경우에는, 제4 화합물의 첨가는 효과가 없거나 길항적이었다. 그들은 전술한 카테콜기/환원 전위/농도 모델을 충족시키지 않는 것으로 보인다. 상당히 길항적인 결과의 크기는 3, 4, 2 + 1 및 3 + 1의 배합물에서의 상승적 결과의 크기에 비해 모두 작았다. 제4 화합물은 3개 화합물의 강한 기들 사이의 전자 전이의 효율을 감소시키는 것 같다. 이것은 모든 길항적 배합물을 설명할 수 있다.
본 실시예의 결론
상승적 상호작용이 네이블 오렌지에서 발견되는 농도 및 비율로 페놀 화합물들 사이에서 일어날 것이라는 본 발명자의 가설은 사실인 것으로 확인되었다. 제3 화합물의 첨가가 그러한 상승작용을 증가시켰지만, 나린게닌과 헤스페리딘 사이의 상호작용이 가장 큰 상승작용을 제공했다. 제4 화합물의 첨가는 3개 화합물의 배합물에 비해 ORAC의 크기에 유의 수준으로 첨가하지 않았다. (1) 작용기, (2) 환원 전위 및 (3) 상대 농도를 함께 분석하는 것이 상승적 및 길항적 상호작용을 가장 잘 설명하였다. 이러한 상승적 페놀 화합물의 상호작용은 음식 또는 음료를 보존하는 잠재적인 용도를 가진다.
실시예 2
오렌지에서 발견되는 상승적 광화학적 배합물
실시예 1에 예시한 절차로부터 유래한 데이터에 기초하여 보조제 조성물을 제조하였다.
표 2에는 네이블 오렌지에서 발견되는 광화학 화합물의 강한 배합물이 제시되어 있다. 또한, 비교를 위해 그 높은 ORAC 값으로 인해 현재 시판되고 있는 두 제품이 포함되어 있다. 표는 1 그램당 최고의 ORAC로부터 최저의 순서로 기재되어 있다.
표 3에 제시된 바와 같이 이들이 29%의 상승작용을 함께 입증하였으며 모두 낮은 비용으로 쉽게 입수가능하기 때문에 표 2의 가장 유망한 배합물은 헤스페리딘/나린게닌/p-쿠마르산/퀘르세틴이다.
상승작용을 나타내는 배합물은 보조제의 품질 및 항산화력에 상당한 개선을 가져오는 잠재력을 가진다. 개개의 과일을 무작위로 간단히 배합하거나 미지의 독성을 가진 농축된 추출물을 생성시키기 보다는, 데이터는 매우 효과적이고 안전한 용량을 제시하면서 그 과일이 제공하는 용량을 제공하는 힘을 입증한다.
예를 들면, 보조제에 1g의 항산화제 혼합물을 사용하는 것은 오렌지 약 3000g 또는 6lb에 해당할 것이다. 이것은 소비하기에는 비현실적이고 아마도 안전하지 않을 것이다. 이것의 약 3분의 1을 함유하는 캡슐은 하루에 소비될 수 있는 과일의 양을 보존적으로 나타낼 것인데, 이것은 여전히 예외적인 상승적 항산화제 보호를 제공하면서 그러한 양의 안정성을 확보한다. 캡슐은 또한 편리성을 제공하며, 하나 이상의 항산화제를 과일 형태로 합리적으로 소비할 수 있으며, 장기간의 보존 수명을 가지며, 제품 뒤에 회사를 표시할 수도 있다.
배합물 /제품명 ORAC 값(μ mol 트롤록스당량 /혼합물 g 상승작용(개별 화합물의 합 이상의 증가율 %
헤스페리딘/나린게닌/루테올린 14327 35%
헤스페리딘/나린게닌/클로로겐산/퀘르세틴 14048 37%
네이쳐스 앤서 ORAC 슈퍼 7 13,917 N/A
헤스페리딘/나린게닌/p-쿠마르산/퀘르세틴 13903 29%
헤스페리딘/나린게닌/p-쿠마르산 13817 35%
헤스페리딘/나린게닌/퀘르세틴 13777 34%
헤스페리딘/클로로겐산/나린게닌 13753 35%
헤스페리딘/나린게닌/루테올린/p-쿠마르산 13487 27%
헤스페리딘/나린게닌/미리세틴/퀘르세틴 13008 26%
헤스페리딘/나린게닌/루테올린/퀘르세틴 12983 28%
헤스페리딘/미리세틴/나린게닌 12918 26%
헤스페리딘/나린게닌 11648 14%
헤스페리딘/클로로겐산 8316 16%
헤스페리딘/미리세틴 8009 11%
퓨쳐 바이오틱스 안티옥시단트 슈퍼푸드 4,583 N/A
계피 2,640 N/A
아스코르빈산(비타민 C) 2,000 N/A
네이블 오렌지 18 N/A
화학물질 공급업체 시그마로부터의 현재의 소매 비용
화합물 $ 양 ㎎당
클로로겐산 281.50 5g 0.0563
헤스페리딘 127.50 100g 0.00128
루테올린 281.50 50㎎ 5.63
미리세틴 293.00 100㎎ 2.93
나린게닌 161.50 25g 0.00646
p-쿠마르산 68.5 25g 0.00274
퀘르세틴 155 100g 0.00155
실시예 3
딸기에서 발견되는 페놀 화합물의 상승적 및 길항적 상호작용
딸기에서 발견되는 상대 농도의 7개 페놀 화합물의 대부분 아글리콘의 상호작용은 산소 라디칼 흡광능 (ORAC) 분석을 사용하여 시험하였다. 더 간단한 배합물에서 일어났던 상호작용은 더 복잡한 배합물에서 분석하였다. 상호작용이 왜 일어났는지 설명하기 위한 모델이 개발되었다. 2개 페놀 화합물의 3개 배합물 사이에서 및 3개 페놀 화합물의 5개 배합물 사이에서 통계적으로 유의 수준의 상승작용이 관찰되었다. 2개 페놀 화합물의 2개 배합물 사이에서 및 3개 화합물의 1개 배합물 사이에서 통계적으로 유의 수준의 길항작용이 관찰되었다. 환원 전위, 상대 농도 및 카테콜(o-디히드록시 벤젠) 기의 존재 또는 부재를 포함하는 모델이 그 결과를 설명한다. 본 실시예는 딸기의 페놀 화합물의 구조 내의 복합 환경에서 일어날 수 있는 상호작용의 일부를 입증한다. 음식에 기초한 항산화제 비율에 대해 확인된 상승작용은 딸기가 최적화된 자유 라디칼 보호를 가진다는 것을 시사하며, 이것은 음식 보존에 응용될 수 있다.
식물은 세포 신호작용 분자, 항산화제 또는 침입 해충에 대한 독으로서 작용하는 페놀 화합물을 생산한다(Crazier et al., 2006). 이러한 다양한 페놀 화합물이 과일에 존재하며, 이들은 널리 특성이 규명되어 있다(Robards et al., 1999; Franke et al., 2004; Harnly et al., 2006). 이러한 특성 규명은 부분적으로 이러한 화합물들의 높은 항산화능으로 인해 개발되었다.
딸기는 페놀 화합물의 좋은 공급원이며(Aaby et al., 2005), 이것은 100g의 생 중량당 약 290㎎의 갈산 당량인 총 페놀 함량을 가진다. 딸기는 광범위한 종류의 페놀 화합물, 예컨대 시아니딘 및 펠라고니딘 글리코시드, 엘라그산(글리코시드 및 탄닌 형태를 포함), 카테킨, 프로시아니딘, 계피산 유도체 및 플라보놀을 함유한다. 천연 딸기의 산소 라디칼 흡광능(ORAC)은 생 중량 g당 35μmol 토코페롤 당량(TE)(2007 USDA ORAC 데이터베이스)인데, 이것은 블루베리 및 라즈베리보다 더 낮지만, 오렌지나 바나나보다는 높은 수치이다.
딸기에서 발견되는 농도로 (대부분의 경우에 아글리콘을 사용하여) 개개의 페놀 항산화제를 제조함으로써, 딸기의 내용물 내에서 입증된 상승작용과 함께 그 배합물들이 확인할 수 있다는 것을 가정하였다. 주로 아글리콘을 사용함으로써, 관찰된 결과를 설명하는 모델의 개발을 위해 플라보노이드의 종래 연구된 구조 요소를 검사할 수 있었다. 이것이 실제 과일에 대한 결과의 외삽을 제한할 것이지만, 추출물과 함께 검사된 것처럼, 그것은 최적화된 과일 유래의 항산화 방부제의 개발의 기초를 세우는 것을 도울 것이다. 딸기에서 발견되는 7개의 페놀 화합물들 사이의 복합 상호작용은 산소 라디칼 흡광능(ORAC)을 사용하여 분석하며, 그 결과를 설명하기 위한 모델을 개발하였다.
재료 및 방법
화학 물질
염화시아니딘(순도: 95%), p-쿠마르산(98%), (+)-카테킨(96%), 퀘르세틴-3-글루코시드(90%), 캠퍼롤(96%), 엘라그산(96%), 염화펠라고니딘(95%), 및 플루오레세인 이나트륨염을 시그마 케미컬 컴퍼니(미국 미주리 세인트 루이스)로부터 입수하였다. 트롤록스(6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸-2-카르복실산), 수산화나트륨(50% 용액), K2HPO4 및 KH2PO4 및 코닝 코스타 96-웰 흑색쪽 투명 바닥 평판은 피셔 사이언티픽(미국 펜실베니아 피츠버그)로부터 입수하였으며, 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디히드로클로라이드(AAPH)는 와코 케미컬 USA(미국 버지니아 리치몬드)로부터 입수하였다.
화학 물질 제조
표 4는 배양된 딸기에서 발견되는 것으로 연구된 7개 화합물의 농도를 나타낸다. 도 5는 그 구조를 제시한다. 화합물들은 딸기 중의 최고 평균 농도에 기초하여 선택하였다. 사용된 농도는 나중의 모델화를 용이하게 하기 위해 (탄닌은 아니지만) 글리코시드의 가수분해가 완전히 일어난다는 것을 가정하고, 딸기 페놀 화합물의 종래 출간된(2007 USDA 플라보노이드 데이터베이스; Zhao, 2007) 절대 농도로부터 선택하였다. 밀도 조정은 시험되는 상대 농도를 변화시키지 않을 것이기 때문에 샘플 제조를 위해 과일 퓨레(puree) 1g이 부피로 1㎖라고 가정하였다. 엘라그산을 제외한 모든 화합물을 계량한 다음 메탄올에 용해시켰다. 엘라그산은 염기성 용액에서 계량 가능한 농도에서만 완전히 가용성이기 때문에 엘라그산을 계량하여 메탄올 및 1M 수산화나트륨의 가열된 4:1 혼합물에 용해시켰다. 페놀 화합물 모액은 -20℃에서 1㎖ 분취액으로 저장하였다. 페놀 화합물을 RT에서 와동시키고, 표 4의 과일 농도에 일치시키기 맞추기 위해 7:3(v:v) 아세톤:물에서 희석하였다. 트롤록스 표준 곡선(하기 분석 설명 참조)에 맞추기 위해, 화합물들을 96-웰 평판으로 옮기기 전에 7:3(v:v) 아세톤:물에서 다음과 같은 몰 농도로 추가로 희석하였다: p- 쿠마르산, 9.99μΜ; 시아니딘, 3.04μΜ; 카테킨, 4.58μΜ; 퀘르세틴-3-글로코시드, 2.45μΜ; 캠퍼롤, 1.61μΜ; 펠라고니딘, 5.10μΜ; 엘라그산, 15.4μΜ. 해동 및 희석 후에 용해도를 검사하였다. 페놀 화합물, 플루오레세인 및 트롤록스와 관련된 모든 작업은 어두운 조건에서 수행하여 분해를 최소화하였다.
연구된 딸기 페놀 화합물의 농도
화합물 ㎎/생 중량 100 g a
p-쿠마르산 4.10b
시아니딘 1.96c
(+)-카테킨 3.32c
퀘르세틴-3-글루코시드 1.14d
캠퍼롤 0.46c
펠라고니딘 31.3c
엘라그산 46.5d
a 밀도 조정이 이루어지지 않았으며; ORAC 분석이 상대비율만을 평가하듯이 100g을 부피 100㎖로 가정하고 화합물들을 준비하였다. b Zhao(2007)에 의해 보고된 최대량. c 2007 USDA 플라보노이드 데이터베이스. d 2007 USDA 플라보노이드 데이터베이스 및 Zhao(2007)에 의해 보고된 평균값.
혼합물
두 화합물의 모든 가능한 배합물을 표 4에서 확인되는 농도로 제조한 후에 동일한 부피 기준으로 혼합하여 상대 농도가 유지되는 지를 확인하였다. 혼합물을 추가로 희석하여 최저 개별 화합물 몰농도에 일치시켜 트롤록스 표준 곡선에 맞추었다. ORAC를 측정하고 통계 분석을 완료한 후, 2개 화합물의 상위 3개의 통계적으로 상승적인 배합물을 모든 가능한 제3 화합물과 배합하고 동일하게 분석하였다. 동일한 패턴을 4개 화합물의 배합물에 대해 반복하였다: 3개 화합물의 상위 3개의 상승적 배합물을 모든 가능한 제4 화합물과 배합하였다. 항산화능에 있어 통계적으로 상승적인 증가는 4개 화합물의 배합물에 대해서는 발견되지 않았다. 따라서, 배합물 중 7개 모든 화합물을 분석하였지만, 5 또는 6개 화합물의 배합물은 시험하지 않았다. 배합물은 그 ORAC 분석과 동일한 날에 제조하였다.
산소 라디칼 흡광능 ( ORAC ) 분석
ORAC 분석은 약간 변형하여 바이오텍 시너지 2 평판 판독기(미국 버몬트 위누스키 소재의 바이오텍 인스트루먼츠 인코포레이티드)를 사용하여
Figure pct00002
외 공저(2004)에 따라 수행하였다. 반응은 75mM 인산염 완충제(pH 7.1)에서 수행하고, 최종 분석 혼합물(200㎕)은 산화성 기질로서 플루오레세인(120㎕, 70.3nM 최종 농도)을, 산소 라디칼 생성제로서 AAPH (60㎕, 12mM 최종 농도), 및 항산화제 (20㎕, 트롤록스[1~8μM, 최종 농도] 또는 샘플)를 함유하였다. 이 분석의 매개변수는 다음과 같았다: 판독기 온도 37℃; 사이클수 120; 사이클 시간 60초; 진탕 형식은 각 사이클 전의 궤도 진탕 3초. 485/20nm의 여기 파장 및 520/20nm의 발광 파장을 가진 형광 필터를 사용하였다. 샘플은 계획된 레이아웃을 기준으로 거울 형식으로 96-웰 평판에서 제조하였다. 각각의 거울상 사본을 평균하고 하나의 데이터점으로 계수하였다. 모든 샘플은 4 복제본으로(총 8개 웰) 측정하여 필요한 통계력을 얻었다. 데이터는 용액 1 리터당 트롤록스 당량(TE)의 마이크로몰로 표현하였다. 데이터는 마이크로소프트 엑셀 2007(미국 매사추세츠 레드몬드 소재의 마이크로소프트) 스프레드시트를 사용하여 분석하여 곡선 아래 면적을 측정하고 데이터를 트롤록스 표준 곡선을 기준으로 트롤록스 당량으로 전환하였다.
통계
2개 화합물의 배합물의 경우, 차는 두 화합물의 배합물의 결과적인 평균 ORAC 값으로부터 개개의 화합물에 대한 평균 ORAC 값의 합계를 뺌으로써 계산하였다(식 6).
차 = (배합물 ab) - (개개의 a + 개개의 b). (6)
마찬가지로, 3 및 4개 화합물의 배합물의 경우, 차는 배합물로부터 개개의 3 또는 4개 화합물의 평균을 뺌으로써 계산하였다. 이런 방식으로 결과를 제시함으로써 통계 분석 소프트웨어 통계 패키지(버전 9.1, 미국 노스 캐롤라이나 캐리 소재의 SAS 인스티튜트 인코포레이티드)에서 혼합된 모델 ANOVA 추정을 사용하여 배합물이 그 부분의 합계보다 더 큰 지 또는 더 작은 지를 용이하게 구별할 수 있게 하였다.
추가적으로, 3 및 4개 화합물의 배합물의 경우, 차는 모든 3 또는 4개 화합물의 배합물의 결과적인 평균 ORAC 값으로부터 2 또는 3개 화합물의 배합물과 1개의 개별 화합물 합에 대한 평균 ORAC 값의 합계를 뺌으로써 계산하였다(식 7 및 8).
차 = (배합물 abc) - (배합물 ab + 개개의 c). (7)
차 = (배합물 abcd) - (배합물 abc + d). (8)
SAS를 사용하여, 데이터를 조합할 때 오차 조건을 고려하는 혼합 모델 ANOVA 추정을 사용하여 배합물의 유의 수준을 결정하였다. 전술한 차는 개별 화합물의 ANOVA 및 ORAC 값의 조합 결과를 통해 그리고 개개의 화합물 및 배합물을 조합하는 효과를 측정하기 위한 사후검정으로서 차를 형성하면서 SAS에서 비교하였다.
본 실시예에 대한 결과 및 검토
화합물 및 배합물 선택
본 발명자가 선택한 7개 화합물이 딸기에서 모든 페놀 화합물을 대표하지는 않지만, 이들의 선택은 가장 고도로 집중되고 상업적으로 이용 가능하다. 본 발명자가 선택한 양은 다중 연구를 대표하며 (Aaby et al., 2005; 2007 USDA 플라보노이드 데이터베이스; Zhao, 2007), (엘라그산의 경우에 탄닌은 아니고 퀘르세틴-3-글루코시드는 예외이지만) 글리코시드의 완전한 가수분해를 가정하면 최대량을 대표한다. 이것은 딸기에서 페놀 화합물의 상당한 부분이 글리코시드로서 소모되며, 동시에 존재할 수 있는 효소 활성, 소화 인자 및 다른 음식은 상호작용에 영향을 끼칠 것이기 때문에 반드시 소화관에서의 반응용으로 이용 가능한 전체를 반영하는 것은 아니다 (Halliwell et al., 2000). 그것은 다수의 계절에 걸쳐 딸기에서 발견되고 다수의 실험실에서 검토되는 평균 분석량을 나타내는 것이다. 딸기 기원은 검토되는 화학 성질에 대한 골격을 제공한다.
하나의 화합물을 배합물에 한번에 첨가하는 것을 평가함으로써 본 발명자는 언제 정지할 지를 결정하는데, 즉 4개 화합물의 3+1 배합물이 3개 화합물의 2+1 배합물보다 더 유의 수준이 높지 않기 때문에 본 발명자는 5개 화합물의 4+1 배합물 역시 3개 화합물의 배합물보다 더 유의 수준이 높지는 않을 것임을 예측할 수 있다. 이러한 예측을 확인하기 위해, 본 발명자는 모든 7개 화합물의 배합물을 함께 시험하였다(11045 ± 458μmol TE/L). ORAC 값의 크기는 4개 화합물의 배합물의 경우 확인된 것보다 더 크지 않았다.
첨가적 및 단계적 분석
2개 화합물의 통계적으로 유의 수준의 배합물의 ORAC를 표 5에 제시한다. 통계적인 방법은 2, 3 및 4개 화합물의 모든 배합물에 대해 식 6 또는 그 등가물을 사용하여 수행하였으며; 통계적으로 유의 수준의 결과는 도면에 포함된 2개 화합물의 배합물에 대해서만 확인되었다. 2, 3 또는 4개 화합물의 모든 다른 배합물은 유의 수준이 아니었으며, 첨가적인 것으로 간주되었다. 단계적 분석(식 7 및 8)에서, 3 및 4개 화합물의 모든 배합물은 표 5에 포함된 것들을 제외하고는 첨가적이었다.
페놀 구조
구조는 항산화 전위의 중요한 결정인자이다(Rice-Evans et al., 1996). B 고리 중의 o-디히드록시기(카테콜 구조)는 라디칼 형태에 더 큰 안정성 및 전자 탈지역화에의 참가를 허용한다(도 5). C 고리 중의 4-옥소와 공액 상태의 2, 3 이중결합과 A 및 C 고리 중의 4-옥소기와 3- 및 5-OH 기는 최대 라디칼 켄칭 잠재력에 필수적이다. 히드록실화의 정도 역시 항산화 활성에 중요하다.
페놀 화합물의 통계적으로 유의 수준의 배합물에 대한 평균 ORAC 차a
배합물 b ORAC 차 c 표준오차 p-값 d
PcCa 531 205 0.01
PcQu 521 239 0.03
PcPe -883 219 <0.01
CyQu 513 239 0.03
CyPe -868 219 <0.01
PcCa + Pe -976.6 282 0.001
PcPe + Qu 1333 305 <0.001
CyPe + Qu 1027 305 <0.001
CyEl + Qu 636.7 305 0.04
QuEl + Pc 849.4 299 0.01
QuEl + Cy 747.5 299 0.01
a. 2개 화합물의 배합물이 통계 분석을 위해 식 6에 따라 계산되었다. 3개 화합물의 배합물은 식 7에 따라 계산되었다. 간단히, 비유의 수준의 배합물은 첨가적이며 표에 포함되지 않는 것으로 가정되었다. b. Pc-p-쿠마르산, Cy-시아니딘, Ca-(+)-카테킨, Qu-퀘르세틴-3-글루코시드, Ka-캠패롤, Pe-펠라고니딘, El-엘라그산. c. 값은 혼합 모델 ANOVA 추정을 사용하여 p<0.05에서 유의 수준인 것으로 간주되었다. d. μmol TE/L로 기록됨.
항산화제 배합물의 상승적 및 길항적 효과를 설명하기 위한 몇 가지 가설이 개발되어 왔다. Peyrat-Maillard 외 공저(2003)는 더 강하거나 더 약한 항산화제가 다른 것을 재생하면서, 다른 인자와 함께 배합물내 일부 항산화제는 재생하는 방식으로 작용한다는 것을 제안하였다. 이것은 더 약한 항산화제가 더 강한 항산화제를 재생하는 경우에 전체적인 양의 (상승적) 효과를 가질 수 있으며, 반대 상황이 일어나는 경우에는 전체적인 음의 (길항적) 효과를 가질 수 있다. 항산화제의 상호작용을 설명하기 위해 제시된 다른 공준은 항산화제의 반응 속도, 상호작용 분자의 극성 및 산화 부위에서의 항산화제의 효과적인 농도를 포함한다(Frankel et al., 1994; Koga 및 Terao 1995, Cuvelier et al., 2000).
환원 전위
예측된 상호작용은 페놀 항산화제의 1-전자 환원 전위를 사용함으로써 이론적으로 측정할 수도 있다. 환원 전위가 낮을수록 분자는 그 전자를 공여할 가능성이 더 크다. 또한, 그 전자를 다음 최고 E 값을 가진 분자에 공여할 가능성이 더 크다. 이것은 Peyrat-Maillard et al., 공저(2003)에 제공된 설명에 정량적인 기준을 추가한다. 이용 가능한 공개된 환원 전위에 기초하여 (J
Figure pct00003
rgensen 및 Skibsted, 1998; Foley 등, 1999), 사용된 7개 화합물은 다음과 같이 순서를 정할 수 있다: 시아니딘 > 엘라그산 > 퀘르세틴-3-글루코시드(퀘르세틴에 대해 0.29V; 디글루코시드인 루틴은 0.4V) > 카테킨(0.36V) > 펠라고니딘 > 캠퍼롤(0.39V) > p-쿠마르산(0.59V). 공개된 환원 전위는 시아니딘, 엘라그산 또는 펠라고니딘에 대해서는 발견될 수 없다. 이들은 환원 전위를 예측하는 구조 성분에 기초하여 순위를 부여한다.
AAPH(E = 약 1V; Buettner 1993)에 의해 생성된 퍼옥실 라디칼을 p-쿠마르산 다음에 첨가한다. 이것은 동등한 몰 농도에서 시아니딘은 항상 그 전자를 엘라그산, 이어서 퀘르세틴-3-글루코시드, 그리고 퍼옥실 라디칼에 (재활용하기 위해) 공여할 것임을 시사한다. 그러나, 딸기 페놀 농도를 사용하면, 상대 농도에서 유의 수준의 차가 있다. 엘라그산 및 펠라고니딘은 분석된 다른 5개 페놀 화합물보다 상당히 더 높은 상대 농도에서 확인된다.
이론적으로, 2개의 화합물의 모든 배합물은 2개 종 중의 하나가 그 전자를 다른 것에 공여하여 AAPH에 의해 생성된 퍼옥실 라디칼을 더 효과적으로 제거할 수 있게 한다면 상승적일 수 있다. 공여의 위계 역시 환원 전위에 근거하여 명백하다. 예컨대, 캠퍼롤 및 p-쿠마르산의 배합물에서, 캠퍼롤은 전자를 p-쿠마르산에 공여하고, p-쿠마르산은 퍼옥실 라디칼에 공여할 것이다. 그러나, 이것은 정확한 예측을 야기하지 않는다. 전부가 아니라 단지 몇 개의 배합물만이 유의 수준이었다.
ORAC 분석 반응 기작이 수소 원자 전이(HAT)에 기초하지만, 환원 전위는 단일 전자 전이(SET)의 척도이다. 불행하게도, 페놀 화합물에 이용되는 HAT의 볼트 척도는 없다. 그러나, 최종 결과는 여전히 동일하다 (Ou et al., 2002). SET 및 HAT 둘다에서, 퍼옥실 라디칼이 결국 과산화물이 되며, 항산화제는 전자를 상실하고, 이때 생성되는 약반응성의 비공유 전자가 그 구조에 존재한다. 전자는 두 기작 모두에서 추출되어야 한다. 따라서, 페놀 반응성의 순서는 2 기작 사이에서 유사한 것으로 추정될 수 있다. 이 추청은 정량적 기준을 가진 모델을 개발하기 위해 이루어졌다.
모델
임의의 이론에 구속되는 것은 아니지만, 세 가지 인자인 상대 농도, 환원 전위 및 카테콜기의 존재 또는 부재를 조합하면서 그 결과를 설명하기 위한 모델이 개발되었다고 생각된다. 선택된 페놀 화합물은 다음 농도의 순서로 제조되었다:
엘라그산>펠라고니딘>p-쿠마르산>카테킨>시아니딘>퀘르세틴-3-글루코시드>캠퍼롤(표 4 참조).
1-전자 환원 전위는 그들을 다음 순서로 배치한다:
시아니딘≥엘라그산>퀘르세틴-3-글루코시드>카테킨>펠라고니딘>캠퍼롤>p-쿠마르산.
7개 화합물 중 다음 4개는 카테콜 기를 포함한다:
엘라그산, 시아니딘, 카테킨, 퀘르세틴-3-글루코시드.
통계적으로 유의 수준인 2개 화합물의 상기 배합물들의 경우(표 4), p-쿠마르산은 카테킨보다 더 농축되었다. 카테콜기와 더 낮은 환원 전위를 가진 카테킨은 강력한 전자 공여자이며, 더 많은 농축된 p-쿠마르산의 재생을 도와 상승작용을 생성하였다. p-쿠마르산과 퀘르세틴-3-글루코시드는 유사하게 상호작용하였다. 시아니딘 및 퀘르세틴-3-글루코시드는 둘다 카테콜기를 보유하고, 시아니딘은 유사한 농도로 존재하며, 둘다 카테콜기를 보유하여 시아니딘이 퀘르세틴-3-글루코시드 (환원 전위에 기초하여)를 재활용하게 하면서 상승적 결과를 위한 환경을 생성시킨다. 길항작용 측면에서, 펠라고니딘과 배합된 p-쿠마르산은 카테콜기의 중요성을 입증한다. 그것이 없으면 펠라고니딘은 p-쿠마르산(환원 전위에 기초하여 예측됨)의 효과적인 재활용체가 아니며, 펠라고니딘의 훨씬 더 높은 농도의 경우 p-쿠마르산의 존재는 전자들을 유인하지만 전자들을 AAPH 라디칼에 쉽게 공여하지 않음으로써 펠라고니딘 항산화 활성을 방해하는 것으로 보인다. 이것은 펠라고니딘의 E 값이 p-쿠마르산의 E 값과 가까울 수 있음을 시사할 것이다. 마지막으로, 시아니딘 및 펠라고니딘은 또한 길항적으로 상호작용하였다. 시아니딘의 카테콜기 및 환원 전위에 기초하여 상승작용을 예측할 것이다. 구조 또는 상대 농도차의 유사성은 길항작용을 설명할 수 있으며, 이 상호작용은 이 모델을 적합하게 하지 못하나, 3 및 4개 화합물의 배합물에서 지속된다. 다시, 추정된 E 값 순서는 부정확할 수 있다.
3개 화합물의 배합물의 경우, 통계적으로 상승적 또는 길항적 결과는 첨가적 배합물에 대해 발견되지 않았다(식 6). 그러나, 단계적 방식으로 분석할 때(식 7), 유의 수준의 결과가 전술한 모델에 의해 설명될 수 있다. 퀘르세틴-3-글루코시드/엘라그산 + p-쿠마르산의 경우, 카테콜기 및 더 낮은 E 값을 가진 두 화합물은 p-쿠마르산이 첨가될 때 더 상승적이었다. 이것은 p-쿠마르산/(+)-카테킨 및 p-쿠마르산/퀘르세틴-3-글루코시드의 경우 일어났던 것과 유사하다. 퀘르세틴-3-글루코시드/엘라그산 + 시아니딘 및 시아니딘/엘라그산 + 퀘르세틴-3-글로코시드의 경우, 카테콜기를 보유하는 또 다른 낮은 E 값 화합물의 첨가는 배합물의 상승작용을 증가시켰다. p-쿠마르산/펠라고니딘 + 퀘르세틴-3-글루코시드의 경우, 카테콜기를 보유하는 더 낮은 E 값 퀘르세틴-3-글루코시드는 다른 두 화합물의 단일의 히드록실기 항산화 효능을 유의 수준으로 개선시켰다. 그리고 마지막으로, 시아니딘/펠라고니딘 + 퀘르세틴-3-글루코시드의 경우, 이용 가능한 카테콜기 (퀘르세틴-3-글루코시드 및 시아니딘은 유사한 농도를 가짐)가 거의 2배가 되면 시아니딘/펠라고니딘 배합물에 상당한 상승을 제공한다.
길항적 측면에서는, 하나의 배합물이 유의 수준이었다: p-쿠마르산/카테킨 + 펠라고니딘. 이 경우에, 전자를 p-쿠마르산으로 공여하는 카테킨과 함께 발견된 상당한 상승작용(표 5 참조)은 펠라고니딘의 큰 농도 및 카테콜기의 부재에 의해 방해된다. 이것은 카테킨의 효능을 최소화하여 길항작용을 초래한다.
4개 화합물의 배합물의 경우(데이터는 도시하지 않음), 첨가적 또는 단계적 분석에서 유의 수준의 값이 없었지만, 경향은 동일한 패턴을 따르며, 상기 모델에 의해 설명된다. 예컨대, p-쿠마르산/(+)-카테킨/퀘르세틴-3-글루코시드 + 엘라그산, p-쿠마르산/(+)-카테킨/펠라고니딘 + 퀘르세틴-3-글루코시드, 및 시아니딘/퀘르세틴-3-글루코시드/캠페롤 + 엘라그산은 모두 양의 ORAC 값을 가졌으며, 모두 그 환원 전위와 일치되게 전자들을 서로에게 공여할 수 있는 카테콜 보유 및 카테콜 비보유 화합물 둘다로 이루어졌다. 두 배합물은 상대적으로 높은 길항적 ORAC 값, p-쿠마르산/시아니딘/퀘르세틴-3-글루코시드 + 펠라고니딘 및 p-쿠마르산/퀘르세틴-3-글루코시드/펠라고니딘 + 시아니딘을 가졌다. 이들의 경우에, 카테콜 부재의 화합물의 상대 농도가 높을수록 더 낮은 환원 전위의 펠라고니딘이 상기 배합물의 항산화능을 감소시켰다.
기타 고려 사항
한 가지 유력한 관심은 시아니딘과 펠라고니딘이 포함되는 안토시아니딘에 대한 pH의 영향이다(Delgado-Vargas et al., 2000). 안토시아니딘은 pH 2에서 가장 안정하다. pH가 증가함에 따라, 안토시아니딘은 물과 더 쉽게 반응하여 그 색을 잃고 칼콘으로 전환된다. 빛은 분해를 증가시키고, 기타 페놀 화합물의 존재는 안토시아니딘의 분해를 지연시킨다. 본 실시예에서, 화합물들은 메탄올에 용해시키는데, 그러므로 물은 존재하지 않으며, 모든 단계는 어둠 속에서 수행하고, 용액을 수성 ORAC 혼합물에 첨가할 때, 반응은 1 시간 이내에 완료된다. Osmani et al.,(2009)은 시아니딘 글루코시드가 pH 7의 완충제에서 1 시간 후에 본래의 색의 70%를 유지하였음을 발견하였다. 따라서, 시아니딘 및 펠라고니딘의 일부 분해가 가능한한 최소화되었지만, 일어날 가능성이 있다. 또 다른 관심은 페놀 화합물들 사이의 착물 형성의 가능성이다(Hidalgo et al., 2010). 형성될 수 있었던 어떤 것도 직접적으로 측정되기 않았기 때문에, 본 결과에 미치는 상기 상호작용 또는 그 효과의 가능성은 무시될 수 없다. 이와 관계 없이, 그러한 착물이 형성되고 상승적 또는 길항적 결과에 기여한다면, 이러한 환경에서 기타 케미칼의 존재에 의해 감소되거나 증가될 수 있지만 방부제로서 상기 배합물이 소모되거나 사용되면 이와 동일한 결과가 예측될 수 있다.
상승작용 또는 길항작용을 정확히 측정하는 통계 분석을 사용할 때, 화합물이 첨가되어 샘플링의 오차 범위 내에서 상승적 효과를 나타내는 것이 점점 어려워짐에 따라 표준 오차는 더 커진다. 이것은 잠재적으로 상승적인 배합물(4개 화합물의 배합물에서) 조차 통계적으로 유의 수준이 아닌 이유를 설명할 것이다. 본 실시예에서는, 7개의 화합물만이 평가되었고 초점은 주로 아글리콘에 모아졌다. 분석은 예컨대 포함된 다수의 화합물(예, 펠라고니딘 및 시아니딘 글리코시드), 기타 카테킨 유도체, (에피카테킨 등), 기타 계피산 유도체 및 플라보놀 및 엘라기탄닌의 여러 가지 글리코시드 형태로 확장될 수 있다. Bravo(1998)는 글리코시드 형태가 상당히 더 낮은 항산화 활성을 가졌다고 결론 내렸다. 주로 아글리콘을 사용함으로써, 코어 페놀 구조의 구조 요소를 검사할 수 있었다. 이것은 모델에 사용된 카테콜기를 차단하지 않고 플라보노이드 화학 성질을 사용하여 관찰된 결과를 설명하기 위한 모델을 개발하는 것을 가능하게 하였다. 이것은 최적화된 과일 유래의 항산화제 방부제의 개발의 기초를 설정하지만, 실제 과일로 그 결과를 외삽하는 것을 제한한다.
본 실시예에 대한 결론
본 발명자의 결과는 분석된 대부분의 상호작용이 첨가적이지만, 일부는 상당한 상승작용을 나타냈으며, 다른 상호작용은 상당한 길항작용을 입증하였다. 환원 전위, 상대 농도 및 카테콜기의 존재 또는 부재를 고려한 모델이 이러한 결과의 거의 모두를 설명하였다. 이것은 음식 보존과 같은 배합물의 잠재적 이점을 더 잘 이해하기 위해 진일보한, 복합 환경에서 일어날 수 있는 일부 상호작용의 이해를 개선시킨다.
실시예 4
딸기에서 발견되는 상승적 광화학적 배합물
하기 표 6은 딸기에서 발견되는 광화학 물질의 배합물을 나타낸다. 또한, 비교를 위해, 높은 ORAC 값을 위해 현재 시판되는 개별 항산화제 및 4개 제품이 포함되었다. 표 6은 최고의 ORAC로부터 최저의 ORAC의 순서로 기재되어 있다. 값은 g당이다. 대부분의 유망한 배합물은 p-쿠마르산 및 카테킨이며, 이들은 양호한 결과를 제공하고 둘다 저비용으로 쉽게 입수 가능하다. 펠라고니딘 및 퀘르세틴-3-글루코시드는 더 비싸지만, 상당히 더 낮은 비용으로 더 다량으로 입수 가능할 수 있다. 퀘르세틴-3-글루코시드와 유사하거나 더 양호한 결과를 나타낼 것으로 예측되는 퀘르세틴은 저렴하다.
상승작용을 나타낸 것으로 제시된 배합물은 보조제의 품질 및 항산화력에서의 상당한 개선을 가져오는 잠재력을 가진다. 미지의 독성을 가진 무작위 또는 생성된 농축 추출물에서 개별 과일을 간단히 배합하기보다는, 상기 데이터는 매우 효과적이고 안전한 용량으로 제공하면서 과일이 제공하는 효력을 입증한다.
예컨대, 보조제에 항산화제 총중량 1g을 사용하는 것은 딸기 약 1000g, 또는 2.2lb에 해당한다. 이것은 소비하기에 비현실적일 것이지만, 이것의 절반 정도를 함유하는 캡슐은 상기 양의 안전성을 보장하면서 하루에 소비될 수 있는 과일의 양을 나타낼 것이다. 캡슐은 또한 편리성, 장기간의 보존 수명을 제공하며, 제품 뒤에 회사를 표시할 수도 있을 것이다.
배합물 /제품명 ORAC 값( mol 트롤록스당량 /혼합물 g 상승작용(개별 화합물의 합 이상의 증가율 %
시아니딘/퀘르세틴-3-글루코시드 42,226 64%
카테킨/퀘르세틴-3-글루코시드 32,377 32%
p-쿠마르산/퀘르세틴-3-글루코시드 30,420 50%
p-쿠마르산/카테킨 30,094 33%
시아니딘 28,821 N/A
카테킨 25,897 N/A
시아니딘/퀘르세틴-3-글루코시드/펠라고니딘 22,545 10%
비노미스 빈듀어 900 21,820 N/A
펠라고니딘 21,710 N/A
p-쿠마르산 20,536 N/A
퀘르세틴-3-글루코시드 20,298 N/A
뉴트라슈틱스RX ORAC -15,000 TM 고성능 항산화제 15,000 N/A
네이쳐스 앤서 ORAC 슈퍼 7 13,917 N/A
p-쿠마르산/카테킨/퀘르세틴-3-글루코시드/엘라그산 11,721 16%
p-쿠마르산/시아니딘/퀘르세틴-3-글루코시드/엘라그산 11,454 16%
시아니딘/퀘르세틴-3-글루코시드/캠페롤/엘라그산 11,014 21%
p-쿠마르산/퀘르세틴-3-글루코시드/캠페롤/엘라그산 10,839 17%
p-쿠마르산/퀘르세틴-3-글루코시드/엘라그산 10,545 16%
엘라그산 7,825 N/A
퓨쳐 바이오틱스 안티옥시던트 슈퍼푸드 4,583 N/A
계피 2,640 N/A
아스코르빈산(비타민 C) 2,000 N/A
딸기(천연) 35 N/A
화학 물질 공급회사 시그마로부터의 현재의 소매 비용
화합물 $ 양 ㎎당
카테킨 300 50g 0.006
퀘르세틴(아글리콘) 155 100g 0.00155
퀘르세틴-3-글루코시드 98 50㎎ 1.96
p-쿠마르산 68.5 25g 0.00274
캠페롤 763 500㎎ 1.526
시아니딘 54 1㎎ 54
펠라고니딘 131 10㎎ 13.1
엘라그산 362 25g 0.01448
실시예 5
블루베리(바시늄 시아노코커스)에서 발견되는 항산화제의 과일 비의 상승적 잠재력
블루베리는 항산화제의 풍부한 공급원이며, 암을 예방하고 심장을 보호하는 것으로 생각된다. 전체 과일은 상호작용할 것 같은 복잡 다양한 항산화제를 제공하지만, 이러한 상호작용은 특히 전체 과일에서는 널리 연구되어 있지 않다.
산소 라디칼 흡광능(ORAC) 분석을 사용하여 개개의 블루베리 페놀 화합물과 이들 화합물의 배합물의 항산화능을 확인하였다.
그 절차는 오렌지 및 딸기에 대해 각각 실시예 1 및 3에 기재된 것과 유사하였다. 블루베리에서 발견된 4개의 페놀 화합물을 선택하였다: 클로로겐산(C), 퀘르세틴(Q), 미리세틴(Y), 및 말비딘(M). ORAC 분석은 4개의 개별 화합물로 이루어졌다(도 6 참조). ORAC 분석은 약 1:1 비 및 과일 비의 4개 화합물들의 배합물로 이루어졌다. 도 7에는 각각의 화합물의 첨가적 효과에 기초하여 예측된 값과 함께 그 결과를 도시하였다. 높은 값일수록 상승 효과를 나타내며, 낮은 값일수록 길항 효과를 나타낸다.
ORAC 분석은 항산화제 또는 항산화제 혼합물에 의한 분해로부터 플루오레세인의 보호를 측정한다. 통계 분석은 배합물의 평균 및 표준 오차와 개별 화합물의 항산화능의 차를 추정한다(도 6 참조).
도 7과 관련하여, 클로로겐산과 말비딘의 배합물 사이, 및 미리세틴과 퀘르세틴의 배합물 사이에서 잠재적인 상승작용이 확인되었다. 추가의 분석은 또한 말비딘, 카테킨, 클로로겐산, 퀘르세틴, 및 미리세틴 중의 3개 및 4개 화합물의 배합물을 포함하였으나, 도 7에는 나타내지 않았다. 그러나, 다수의 이들 천연 발생 블루베리 항산화제들 사이에서 상당한 상승작용이 확인되었다. 이러한 상승작용은 화합물들이 1:1 비로 배합될 때는 확인되지 않았다.
이 데이터로부터, 페놀 화합물이 배합되는 비는 배합물이 상승작용 또는 길항작용을 나타내는지 여부에 중요하다는 것을 알 수 있다. 또한, 식물은 대사 및 UV 노출로부터의 자유 라디칼 손상에 더욱 효과적으로 저항하기 위해 상승적 비를 발전시켜 온 것으로 보인다.
실시예 6
블루베리에서 발견되는 상승적 광화학적 배합물
실시예 1에서와 본질적으로 동일한 절차를 사용하여 블루베리의 화합물들의 배합물에 대한 ORAC 값을 얻었다.
표 8에는 블루베리에서 발견된 광화학 물질의 가장 강력한 배합물을 제시한다. 값은 달리 언급하지 않는 한 과일에서 발견된 비율을 나타낸다. 표 8은 최고 상승작용 비율로부터 최저 비율의 순으로 기재되어 있다. 값은 페놀 화합물의 mmol당이다.
말비딘은 현재 맹 비싸지만, 가장 유의 수준이 높은 배합물은 카테킨/클로로겐산/말비딘/미리세틴이다. 말비딘을 함유하지 않는 가장 상승작용이 높은 수준의 배합물은 1:1 비의 클로로겐산/미리세틴이다. 말비딘을 함유하지 않는 가장 유의 수준이 높은 천연 블루베리 비의 배합물은 카테킨/클로로겐산/퀘르세틴이다.
본 발명자의 연구가 상승작용을 나타낸 것으로 입증한 배합물들은 보조제의 품질 및 항산화력에 있어 상당한 개선을 가져오는 잠재력을 가진다. 미지의 독성을 가진 무작위 또는 생성된 농축 추출물에서 개별 과일을 간단히 배합하기보다는, 본 발명자의 데이터는 과일 및 과일의 항산화제가 제공하는 효력을 입증한다.
배합물 ORAC 값(μ mol 트롤록스당량 /혼합물 mmol 상승작용(개별 화합물의 합 이상의 증가율 %
카테킨/클로로겐산/말비딘/미리세틴 7935 58%
카테킨/클로로겐산/말비딘 7653 53%
카테킨/클로로겐산/말비딘/퀘르세틴 7836 52%
카테킨/말비딘/퀘르세틴 7845 42%
카테킨/말비딘 7697 41%
카테킨/말비딘 1:1 8278 39%
카테킨/말비딘/퀘르세틴/미리세틴 7827 40%
카테킨/말비딘/미리세틴 7553 39%
말비딘/퀘르세틴 1:1 7285 35%
클로로겐산/미리세틴 1:1 5459 28%
클로로겐산/퀘르세틴 1:1 6034 24%
말비딘/미리세틴 1:1 5827 22%
카테킨/클로로겐산/퀘르세틴 7222 21%
카테킨/클로로겐산/퀘르세틴/미리세틴 7157 21%
카테킨/클로로겐산/미리세틴 6971 21%
카테킨/미리세틴 1:1 7910 21%
카테킨/클로로겐산 6767 16%
카테킨/클로로겐산 1:1 6294 16%
클로로겐산/말비딘/퀘르세틴 9122 15%
말비딘/퀘르세틴 9281 12%
말비딘/퀘르세틴/미리세틴 9127 12%
말비딘/미리세틴 8386 10%
클로로겐산/말비딘/퀘르세틴/미리세틴 8572 9%
클로로겐산/말비딘/미리세틴 7979 8%
비율 시리즈:
클로로겐산/말비딘 1:9 4778 16%
클로로겐산/말비딘 5:13(블루베리 비, 실시예 1) 8524 14%
클로로겐산/말비딘 5:13(블루베리 비, 실시예 2) 4630 17%
클로로겐산/말비딘 1:1 4958 34%
클로로겐산/말비딘 13:5 4578 32%
클로로겐산/말비딘 9:1 4235 29%

Claims (10)

  1. (a) 식품에서 항산화제 화합물을 확인하는 단계;
    (b) 식품에서 확인된 항산화제 화합물의 2종 이상의 식품비를 측정하는 단계로서, 이 때 식품비는 2종 이상의 화합물 각각의 서로에 대한 비인 단계;
    (c) 2종 이상의 항산화제 화합물의 항산화능을 측정하는 단계;
    (d) 2종 이상의 항산화제 화합물의 혼합물을 그 식품비로 형성하는 단계;
    (e) 혼합물의 항산화능을 측정하는 단계;
    (f) 혼합물내 항산화제 화합물의 별개의 항산화능 값의 합계를 기준으로 혼합물의 항산화능을 예측된 항산화능과 비교함으로써 혼합물이 상승적 항산화성을 가지는지를 측정하는 것을 포함하는 단계로서, 이때 상승작용은 항산화능이 예측된 항산화능보다 더 클 때 나타나는 단계;
    를 포함하는, 상승적 항산화능을 가진 영양 보조제 조성물을 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 2종 이상의 항산화제 화합물의 하나 이상이 상이한 경우에 2종 이상의 항산화제로 확인된 화합물에 대해 (b), (c), (d), (e) 및 (f)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 4종 이상의 항산화제 화합물이 확인되고, 혼합물은 3종 이상의 항산화제 화합물의 배합물을 포함하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 3종 이상의 항산화제 화합물이 확인되고, 반복 단계가 2 또는 3종의 항산화제 화합물의 가능한 배합물의 추가적인 혼합물에 대해 수행되는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 반복 단계는 2 또는 3종의 항산화제 화합물의 모든 가능한 혼합물에 대해 수행되는 방법.
  6. 상승적 항산화성을 제공하는 서로에 대한 비율로 본질적으로 2 또는 3종의 항산화제 화합물로 구성되는 항산화제 화합물을 포함하는 영양 보조제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 2 또는 3종의 항산화제 화합물은,
    (a) 식품에서 항산화제 화합물을 확인하는 단계;
    (b) 식품에서 확인된 항산화제 화합물의 2종 이상의 식품비를 측정하는 단계로서, 이 때 식품비는 2종 이상의 화합물 각각의 서로에 대한 비인 단계;
    (c) 2종 이상의 항산화제 화합물의 항산화능을 측정하는 단계;
    (d) 2종 이상의 항산화제 화합물의 혼합물을 그 식품비로 형성하는 단계;
    (e) 혼합물의 항산화능을 측정하는 단계;
    (f) 혼합물내 항산화제 화합물의 별개의 항산화능 값의 합계를 기준으로 혼합물의 항산화능을 예측된 항산화능과 비교함으로써 혼합물이 상승적 항산화성을 가지는 지를 측정하는 것을 포함하는 단계로서, 이때 상승작용은 항산화능이 예측된 항산화능보다 더 클 때 나타나는 단계;
    에 의해 특정되는 서로에 대한 비율로 존재하는 영양 보조제.
  8. 제1항에 있어서, 식품이 과일인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 항산화능은 산소 라디칼 흡광능 분석(ORAC), 퍼옥시나이트라이트 ORAC 분석(NORAC), 히드록실 ORAC 분석(HORAC), 산소 라디칼 흡광능 피로갈롤 레드 분석(ORAC-PG), 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질 라디칼 분석(DPPH), 플라즈마의 페릭 환원능 분석(FRAP), 트롤록스 당량 항산화능 분석(TEAC), 비타민 C 당량 항산화능 분석(VCEAC), 2'-아지노비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산) 분석(ABTS), 큐프릭 환원 항산화능 분석(CUPRAC), 총 라디칼 트래핑 항산화제 파라미터 분석(TRAP), 또는 세포의 항산화 활성 분석(CAA)에 의해 측정되는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 항산화능이 ORAC에 의해 측정되는 방법.
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