CN102665758A - 用于递送干扰rna的对接锁定(dnl)复合物 - Google Patents
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Abstract
本文描述用于将siRNA递送到疾病相关细胞、组织或病原体的靶向递送复合物的组合物和使用方法。所述靶向递送复合物包含与一个或多个siRNA载体偶联的靶向分子,如抗体或其片段。在优选实施方案中,所述siRNA载体是树枝状聚合物或鱼精蛋白并且所述靶向分子是抗癌抗体,如hRS7。更优选地,所述抗体或片段迅速内化至所述靶细胞中以促进所述siRNA的吸收。最优选地,所述靶向递送复合物是通过DNL技术制备。所述组合物和方法是用于治疗多种疾病病况,如癌症、自体免疫性疾病、免疫功能障碍、心脏病、神经疾病、炎症性疾病或感染性疾病。
Description
相关申请
本申请要求11/18/2010提交的美国专利申请No.12/949,536;10/29/2010提交的美国专利申请No.12/915,515;8/30/2010提交的美国专利申请No.12/871,345;8/27/2010提交的美国专利申请No.12/869,823;4/6/2010提交的美国专利申请No.12/754,740;4/1/2010提交的美国专利申请No.12/752,649;3/25/2010提交的美国专利申请No.12/731,781;12/22/2009提交的美国专利申请No.12/644,146的优先权。
本申请还要求2009年12月9日提交的美国临时专利申请No.61/267,877、2010年2月8日提交的美国临时专利申请No.61/302,682和2010年11月17日提交的美国临时专利申请No.61/414,592的权益。各优先权申请的正文全部以引用的方式并入本文。
发明背景
发明领域
本发明涉及用于靶向递送RNAi物质(如siRNA)的组合物和方法。优选地,靶向递送复合物包含与siRNA的载体分子偶联的抗体、抗体片段或其它靶向分子,如鱼精蛋白或树枝状聚合物。更优选地,靶向递送复合物是通过对接锁定(dock-and-lock;DNL)技术制备。靶向递送复合物可包含一个或多个用于递送到靶细胞或组织的siRNA物质。最优选地,递送siRNA可有效治疗疾病、综合症或病症,如癌症、自体免疫性疾病、免疫功能障碍(例如移植物抗宿主疾病或器官移植排斥反应)、炎症、感染性疾病、心血管疾病、内分泌或代谢性疾病或神经退化性疾病。对于疾病疗法,抗体或其它靶向分子结合由患病细胞或组织产生或以其它方式与疾病病况相关的靶抗原。DNL复合物可包含多个拷贝的载体分子以有效将治疗性siRNA递送至靶细胞。抗体或其它靶向分子可为快速内化的物质以促进siRNA的细胞内吸收。
相关领域
RNA干扰(RNAi)是天然存在的控制细胞内基因表达的调控机制(Fire等,1998,Nature 391:806-11)。RNAi由RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex;RISC)介导并且由与催化性RISC组分argonaute相互作用的短双链RNA分子起动(Rand等,2005,Cell123:621-29)。RNAi分子的类型包括微RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)。RNAi物质可与信使RNA(mRNA)通过互补碱基配对进行结合并且通过转录后基因沉默来抑制基因表达。与互补mRNA物质结合后,RNAi通过RISC的argonaute组分诱导mRNA分子的裂解。miRNA与siRNA在对特定基因标靶的特异性程度以及其它特征方面不同,其中siRNA对于特定靶基因相对更具特异性,而miRNA抑制多种mRNA物质的翻译。
已尝试利用RNAi通过抑制所选基因表达而在治疗上用于多种疾病病况,如黄斑退化和呼吸道合胞体病毒感染(Sah,2006,Life Sci 79:1773-80)。已提出siRNA在针对病毒感染的宿主细胞防御中起作用并且已将siRNA作为抗病毒疗法的方法进行了广泛研究(参见例如Zhang等,2004,Nature Med 11:56-62;Novina等,2002,Nature Med8:681-86;Palliser等,2006,Nature 439:89-94)。还尝试了使用siRNA用于癌症治疗。Fujii等(2006,Int J Oncol 29:541-48)用于针对HPV E6和E7的siRNA转染HPV阳性子宫颈癌细胞并且抑制了肿瘤生长。据报导乳癌细胞中siRNA介导的异粘蛋白(metadherin)表达阻断可抑制实验性肺转移(Brown和Ruoslahti,2004,Cancer Cell 5:365-74)。
基于siRNA的疗法的难处包括外源性siRNA的细胞吸收不良和对其它基因的潜在脱靶作用(参见例如Kim等,2009,Trends MolecMed 15:491-500)。Jackson等(2003,Nat Biotechnol 21:635-37)设计了靶向IGF-1R和MAPK14的不同siRNA并且显示含有少至十一个与siRNA物质相同的连续核苷酸的非靶基因的沉默。
已尝试提供siRNA的靶向递送以降低脱靶毒性的可能性。Song等(2005,Nat Biotechnol 23:709-17)使用偶联鱼精蛋白的针对HIV包膜蛋白的Fab片段来将siRNA递送至循环细胞。Schiffelers等(2004,NuclAcids Res 32:e149)将RGD肽偶联至纳米粒子以将抗VEGF R2siRNA递送至肿瘤并且抑制了裸小鼠中的肿瘤血管生成和生长速率。Dickerson等使用以抗EphA2受体肽官能化的纳米凝胶以增强卵巢癌细胞对针对EGFR的siRNA的化学敏感性。偶联树枝状聚合物的磁性纳米粒子已应用于靶向递送反义存活素寡脱氧核苷酸(Pan等,2007,Cancer Res 67:8156-63)。
尽管最近已取得进展,但在本领域中仍对靶向递送治疗性siRNA的更有效方式存在需要,以增加细胞吸收并且使与siRNA相关的毒性副作用降至最低(Kim等,2009)。
概述
本发明涉及用于将siRNA物质有效递送至疾病相关靶细胞、组织或病原体的方法和组合物。优选地,通过使用靶向递送复合物促进递送,所述靶向递送复合物包含与siRNA的载体分子偶联的抗体、抗体片段或其它靶向分子,如鱼精蛋白、树枝状聚合物或纳米粒子。更优选地,靶向分子使治疗性siRNA高度选择性或特异性地递送至患病细胞或组织。更优选地,靶向递送复合物促进靶细胞中siRNA的细胞内吸收。
待递送的siRNA物质和靶向分子的相应特异性将由待治疗的疾病病况决定。如下文更详细论述,千分之十的针对与广泛多种疾病病况相关的mRNA的siRNA序列在本领域中是已知的并且可从公共数据库获得,如位于斯德哥尔摩生物信息学中心(StockholmBioinformatics Centre)的siRNAdb数据库、MIT/ICBP siRNA数据库、位于博德学院(Broad Institute)的RNAi联合shRNA文库(RNAiConsortium shRNA Library)和位于NCBI的探针数据库(Probedatabase)。许多siRNA物质还可从商业供应商购得,如Sigma-Aldrich(St Louis,MO)、Invitrogen(Carlsbad,CA)、Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz,CA)、Ambion(Austin,TX)、Dharmacon(Thermo Scientific,Lafayette,CO)、Promega(Madison,WI)、Mirus Bio(Madison,WI)和Qiagen(Valencia,CA)。
多种用于siRNA的载体部分已有报导并且任何所述已知载体都可并入靶向递送复合物中以供使用。载体的非限制性实例包括鱼精蛋白(Rossi,2005,Nat Biotech 23:682-84;Song等,2005,Nat Biotech23:709-17);树枝状聚合物,如PAMAM树枝状聚合物(Pan等,2007,Cancer Res.67:8156-8163);聚乙烯亚胺(Schiffelers等,2004,NuclAcids Res 32:e149);聚丙烯亚胺(Taratula等,2009,J Control Release140:284-93);聚赖氨酸(Inoue等,2008,J Control Release 126:59-66);含组氨酸的可还原聚阳离子(Stevenson等,2008,J Control Release130:46-56);组蛋白H1蛋白(Haberland等,2009,Mol Biol Rep 26:1083-93);阳离子性梳型共聚物(Sato等,2007,J Control Release122:209-16);聚合物胶束(美国专利申请公布No.20100121043);和壳聚糖-硫胺素焦磷酸盐(Rojanarata等,2008,Pharm Res 25:2807-14)。熟练技术人员将认识到,一般来说,使用聚阳离子性蛋白质或聚合物作为siRNA载体。熟练技术人员将进一步认识到,siRNA载体还可用于承载其它寡核苷酸或核酸物质,如反义寡核苷酸或短DNA基因。
各种实施方案可能涉及使用靶向递送复合物来治疗疾病,包括但不限于非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphomas)、B细胞急性和慢性淋巴性白血病、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞白血病、急性和慢性骨髓性白血病、T细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、癌瘤、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤和皮肤癌。癌瘤可选自由口腔癌、胃肠道癌、结肠癌、胃癌、肺气管癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、肾癌、皮肤癌和睾丸癌组成的组。
此外,可使用靶向递送复合物来治疗自体免疫性疾病,例如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合症、大疱性类天包疮、糖尿病、亨诺克-斯奇赖恩紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、爱迪生氏病(Addison's disease)、类风湿性关节炎、多发性硬化症、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘综合症(Goodpasture's syndrome)、血管闭塞性脉管炎、休格伦氏综合症(Sjogren's syndrome)、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、甲状腺素症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨(tabes dorsalis)、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣或纤维性肺泡炎。
本发明的组合物还适用于治疗感染,其中靶向递送复合物的抗体组分特异性结合致病微生物。在本发明的上下文中,致病微生物包括病原性细菌、病毒、真菌和多种寄生虫,并且抗体可靶向这些微生物、其产物或与其病变相关的抗原。微生物的实例包括但不限于:无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、流感嗜血杆菌B(Haemophilusinfluenzae B)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆病螺旋体(Lymedisease spirochetes)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布氏杆菌(Brucella abortus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、破伤风毒素(Tetanus toxin)、HIV-1、HIV-2、HIV-3、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、狂犬病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I和II、人血清细小病毒样病毒、乳头状瘤病毒、多瘤病毒、呼吸道合胞体病毒、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、乳头状瘤病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞淋巴瘤病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)、鼠类白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德毕斯病毒(Sindbisvirus)、淋巴细胞性脉络从脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病病毒(Bluetongue virus)、仙台病毒(Sendai virus)、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、猿病毒40、小鼠乳腺肿瘤病毒、登革热病毒、风疹病毒、原生动物、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、港丽锥虫(Trypanosoma rangeli)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、罗德西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiense)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、牛巴贝虫(Babesia bovis)、柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、热带利什曼虫(Leishmania tropica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、小泰雷尔梨浆虫(Theileria parva)、有缘绦虫(Taenia hydatigena)、羊绦虫(Taenia ovis)、牛肉绦虫(Taenia saginata)、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、科氏中殖孔绦虫(Mesocestoides corti)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritidis)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、拉氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)、唾液支原体(M.salivarium)和肺炎支原体(M.pneumoniae)。结合这些病原性微生物的单克隆抗体在本领域中是已知的。
在一个实施方案中,可使用本发明的药物组合物来治疗患有代谢性疾病(如淀粉样变性病)或神经退化性疾病(如阿兹海默氏病)的受试者。巴匹珠单抗(Bapineuzumab)正处于阿兹海默氏病疗法的临床试验中。其它提出用于治疗阿兹海默氏病的抗体包括Alz50(Ksiezak-Reding等,1987,J Biol Chem 263:7943-47)、甘替鲁单抗(gantenerumab)和索兰珠单抗(solanezumab)。已报导抗TNF-α抗体英利昔单抗(Infliximab)减少淀粉样斑块并且改良认知。已提出抗CD3抗体用于治疗1型糖尿病(Cernea等,2010,Diabetes Metab Rev26:602-05)。另外,可使用本发明的药物组合物来治疗患有免疫失调病症的受试者,如移植物抗宿主疾病或器官移植排斥反应。
在一优选实施方案中,可使用所主张的组合物和方法治疗的疾病包括心血管疾病,如纤维蛋白凝块、动脉粥样硬化、心肌缺血和梗塞。纤维蛋白抗体(例如scFv(59D8);T2G1s;MH1)是已知的并且正作为显露所述凝块和肺栓塞的成像剂进行临床试验,而抗粒细胞抗体(如MN-3、MN-15、抗NCA95和抗CD15抗体)可靶向心肌梗塞和心肌缺血。(参见例如美国专利No.5,487,892;5,632,968;6,294,173;7,541,440,各专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。可使用抗巨噬细胞、抗低密度脂蛋白(LDL)和抗CD74(例如hLL1)抗体来靶向动脉粥样硬化斑。阿昔单抗(Abciximab)(抗糖蛋白IIb/IIIa)已批准在经皮冠状动脉介入干预和治疗不稳定型心绞痛中辅助用于预防再狭窄(Waldmann等,2000,Hematol 1:394-408)。已报导抗CD3抗体减少动脉粥样硬化的发生和发展(Steffens等,2006,Circulation 114:1977-84)。针对氧化型LDL的抗体在小鼠模型中诱导已建立的动脉粥样硬化的好转(Ginsberg,2007,J Am Coll Cardiol 52:2319-21)。已显示抗ICAM-1抗体在大鼠中减少脑动脉闭塞后的缺血性细胞损伤(Zhang等,1994,Neurology 44:1747-51)。针对白细胞抗原的市售单克隆由以下代表:OKT抗T细胞单克隆抗体(可获自Ortho PharmaceuticalCompany),其结合正常T淋巴细胞;由具有ATCC保藏编号HB44、HB55、HB12、HB78和HB2的杂交瘤产生的单克隆抗体;G7E11、W8E7、NKP15和GO22(Becton Dickinson);NEN9.4(New EnglandNuclear);和FMC11(Sera Labs)。针对纤维蛋白和血小板抗原的抗体的描述含于Knight,Semin.Nucl.Med.,20:52-67(1990)中。
所使用的抗体或其它靶向分子可结合本领域中已知的任何疾病相关抗原。举例来说,在疾病病况是癌症的情况下,由肿瘤细胞表达或以其它方式与肿瘤细胞相关的许多抗原在本领域中是已知的,包括但不限于:碳酸酐酶IX、α-胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GROB、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和其亚基、HER2/neu、HMGB-1、低氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、对PAM-4抗体具特异性的抗原、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、IGF、IGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、肌腱蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原(Thomson-Friedenreich antigens)、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤维连接蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、致癌基因标志和致癌基因产物(参见例如Sensi等,Clin Cancer Res 2006,12:5023-32;Parmiani等,J Immunol 2007,178:1975-79;Novellino等CancerImmunol Immunother 2005,54:187-207)。
可利用的示例性抗体包括但不限于:hR1(抗IGF-1R,3/12/10提交的美国专利申请No.12/722,645)、hPAM4(抗粘蛋白,美国专利No.7,282,567)、hA20(抗CD20,美国专利No.7,251,164)、hA19(抗CD19,美国专利No.7,109,304)、hIMMU31(抗AFP,美国专利No.7,300,655)、hLL1(抗CD74,美国专利No.7,312,318)、hLL2(抗CD22,美国专利No.7,074,403)、hMu-9(抗CSAp,美国专利No.7,387,773)、hL243(抗HLA-DR,美国专利No.7,612,180)、hMN-14(抗CEACAM5,美国专利No.6,676,924)、hMN-15(抗CEACAM6,美国专利No.7,541,440)、hRS7(抗EGP-1,美国专利No.7,238,785)和hMN-3(抗CEACAM6,美国专利申请No.7,541,440),各引用专利或申请的实施例部分以引用的方式并入本文。
所使用的抗体或抗原结合片段可以是嵌合、人源化或人的。对于亲本鼠类抗体,优选使用嵌合抗体,因为其具有人抗体恒定区序列并且因此不会引发同鼠类抗体一样强的人抗小鼠抗体(HAMA)反应。甚至更优选使用人源化抗体,以便进一步降低诱发HAMA反应的可能性。如下文所论述,通过将鼠类框架区和恒定区序列置换为相应人抗体框架区和恒定区序列对鼠类抗体进行人源化的技术在本领域中是熟知的并且已应用于众多鼠类抗癌抗体。抗体人源化还可能涉及将一个或多个人框架氨基酸残基取代为来自亲本鼠类框架区序列的相应残基。同样如下文所论述,制造人抗体的技术也是熟知的。
在某些优选实施方案中,靶向递送复合物可使用对接锁定(DNL)技术制造(参见例如美国专利No.7,550,143;7,521,056;7,534,866;7,527,787和7,666,400,各专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。DNL技术利用来自蛋白激酶A的二聚化与对接结构域(DDD部分)与来自多种已知A激酶锚定蛋白(AKAP)中任一种的锚定结构域(AD部分)之间发生的特异性结合相互作用。DDD部分自发地形成二聚体,其接着结合AD部分。通过将适当效应部分(如抗体或其片段和siRNA载体)连接于AD和DDD部分,DNL技术允许特异性共价形成任何期望靶向递送复合物。在效应部分为蛋白质或肽(如抗体片段、鱼精蛋白或聚赖氨酸)的情况下,AD和DDD部分可并入与效应部分偶联的融合蛋白中。在利用非蛋白质效应部分的情况下,可利用化学偶联来连接AD或DDD部分。
在某些实施方案中,通过靶向递送siRNA实施的疾病疗法可通过与一种或多种其它治疗剂的组合疗法来增强。所使用的已知治疗剂包括毒素、免疫调节剂(如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子和肿瘤坏死因子)、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸(如siRNA或RNAi)、光敏治疗剂、抗血管生成剂和促细胞凋亡剂。治疗剂可通过与相同或不同抗体或其它靶向分子偶联进行递送或可以未偶联形式递送。其它治疗剂可在siRNA靶向递送复合物之前、同时或之后施用。
在一优选实施方案中,治疗剂是细胞毒性剂,如药物或毒素。同样优选的是,药物选自由以下组成的组:氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、吉西他滨(gemcitabine)、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑素、紫杉酚、喜树碱、SN-38、阿霉素(doxorubicins)和其类似物、抗代谢物、烷基化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、促细胞凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-11、卡奇霉素(calicheamicin)和其组合。
在另一优选实施方案中,治疗剂是选自由以下组成的组的毒素:蓖麻毒素(ricin)、相思豆毒素(abrin)、α毒素(alpha toxin)、皂草素(saporin)、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A(Staphylococcal enterotoxin-A)、美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweedantiviral protein)、白树毒素(gelonin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)和假单胞菌内毒素(Pseudomonas endotoxin)以及其组合。或者选自由以下组成的组的免疫调节剂:细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、群落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素和其组合。
在其它优选实施方案中,治疗剂是选自由以下组成的组的放射性核素:111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。随俄歇发射粒子实质上衰变的放射性核素也是优选的。例如Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。适用β粒子发射核素的衰变能优选为<1,000keV,更优选为<100keV,并且最优选为<70keV。随着α粒子产生而实质上衰变的放射性核素也是优选的。所述放射性核素包括但不限于:Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。适用α粒子发射放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV,更优选为3,000-8,000keV,并且最优选为4,000-7,000keV。其它潜在适用放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。在其它实施方案中,治疗剂是选自由色原体和染料组成的组的光敏治疗剂。
或者,治疗剂是选自由以下组成的组的酶:苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。所述酶可与例如以相对无毒形式施用且在靶位点由酶转化成细胞毒性剂的前药组合使用。在其它替代方案中,药物可在受试者体内由内源性酶转化成毒性较低形式,但可能由治疗性酶再转化成细胞毒性形式。
附图简述
图1.用于siRNA递送的E1-L-thP1DNL复合物的合成。(A)制造具有AD2部分连接于各抗体重链的C-末端的抗Trop-2hRS7抗体。(B)合成具有人鱼精蛋白1的截短区段和DDD2部分分别连接于人源化抗体轻链的C-末端和N-末端的DDD2-L-thP 1构建体。(C)在弱还原性条件下孵育hRS7-IgG-AD2和DDD2-L-thP 1导致形成偶联鱼精蛋白的hRS7DNL复合物,命名为E1-L-thP1。
图2.E1-L-thP1的DNA结合的凝胶迁移测定。
图3.由E1-L-thP1结合介导的siRNA的内化。
图4.由siRNA的E1-L-thP1内化诱导的细胞凋亡。
详细描述
定义
除非另外规定,否则一(“a/an)意指一个(种)或多个(种)。”
如本文所用,“约”意指加或减10%。例如,约“100”将包括90与110之间的任何数值。
如本文所述,抗体是指全长(即,天然存在的或通过免疫球蛋白基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即,特异性结合)部分,如抗体片段。
抗体片段是抗体的一部分,如F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、sFv等。与结构无关,抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”也包括由抗体的可变区组成的分离片段,如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段,和重链和轻链可变区由肽连接子连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。
嵌合抗体是一种重组蛋白,其含有来源于一个物种的抗体,优选啮齿动物抗体的可变结构域,包括互补决定区(CDRs),而抗体分子的恒定结构域是来源于人抗体的恒定结构域。对于兽医学应用,嵌合抗体的恒定结构域可来源于其它物种,如猫或狗的恒定结构域。
人源化抗体是一种重组蛋白,其中将来自一个物种的抗体,例如啮齿动物抗体的CDRs从啮齿动物抗体的可变重链和可变轻链转移到人重链和轻链可变结构域(例如框架区序列)中。抗体分子的恒定结构域是来源于人抗体的恒定结构域。在某些实施方案中,可将有限数量的亲本(啮齿动物)抗体的框架区氨基酸残基取代成人抗体框架区序列。
人抗体是例如从已进行“工程改造”以回应于抗原激发产生特定人抗体的转基因小鼠获得的抗体。在此技术中,将人重链和轻链基因座的元件引入由胚胎干细胞系获得的小鼠品系中,所述品系含有内源性鼠类重链和轻链基因座的靶向破坏。转基因小鼠可合成对特定抗原具特异性的人抗体,并且所述小鼠可用于产生分泌人抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等,Nature Genet.7:13(1994);Lonberg等,Nature 368:856(1994);和Taylor等,Int.Immun.6:579(1994)描述。还可通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建完全人抗体,所述方法和技术在本领域中都是已知的。参见例如McCafferty等,Nature 348:552-553(1990),其描述从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因谱系体外产生人抗体和其片段。在此技术中,将抗体可变结构域基因同框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中,并在噬菌体粒子的表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝,所以基于抗体的功能性质进行选择也导致选择编码呈现所述性质的抗体的基因。以此方式,噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示可以多种格式执行,关于综述,请参见例如Johnson和Chiswell,Current Opinionin Structural Biology 3:5564-571(1993)。人抗体也可由体外活化B细胞产生。参见美国专利No.5,567,610和5,229,275,其实施例部分以引用的方式并入本文。
治疗剂是与抗体部分分开、同时或依序施用或者与抗体部分(即,抗体或抗体片段,或子片段)偶联并且适用于治疗疾病的化合物、分子或原子。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、促细胞凋亡剂、抗血管生成剂、硼化合物、光敏剂或染料以及放射性同位素。所使用的治疗剂在下文进一步详细描述。
免疫偶联物是与至少一种治疗剂和/或诊断剂偶联的抗体、抗体片段或融合蛋白。
干扰RNA
熟练技术人员将认识到,任何siRNA或干扰RNA物质都可连接至靶向递送复合物以供递送到靶组织。针对多种标靶的许多siRNA物质在本领域中是已知的,并且在所主张的方法和组合物中可利用任何所述已知siRNA。
有可能使用的已知siRNA物质包括对以下具有特异性者:IKK-γ(美国专利7,022,828);VEGF、Flt-1和Flk-l/KDR(美国专利7,148,342);Bcl2和EGFR(美国专利7,541,453);CDC20(美国专利7,550,572);转导蛋白(β)样蛋白3(美国专利7,576,196);KRAS(美国专利7,576,197);碳酸酐酶II(美国专利7,579,457);补体组分3(美国专利7,582,746);白介素-1受体相关激酶4(IRAK4)(美国专利7,592,443);存活素(美国专利7,608,7070);超氧化物歧化酶1(美国专利7,632,938);MET原癌基因(美国专利7,632,939);淀粉样蛋白β前驱体蛋白(APP)(美国专利7,635,771);IGF-1R(美国专利7,638,621);ICAM1(美国专利7,642,349);补体因子B(美国专利7,696,344);p53(7,781,575)和载脂蛋白B(7,795,421),各参考专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
其它siRNA物质可从已知商业来源获得,如Sigma-Aldrich(StLouis,MO)、Invitrogen(Carlsbad,CA)、Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz,CA)、Ambion(Austin,TX)、Dharmacon(Thermo Scientific,Lafayette,CO)、Promega(Madison,WI)、Mirus Bio(Madison,WI)和Qiagen(Valencia,CA)以及许多其它来源。siRNA物质的其它可公开获得的来源包括位于斯德哥尔摩生物信息学中心的siRNAdb数据库、MIT/ICBP siRNA数据库、位于博得研究院的RNAi联合shRNA文库和位于NCBI的探针数据库。例如,在NCBI探针数据库中存在30,852种siRNA物质。熟练技术人员将认识到,对于任何目标基因,或者siRNA物质已进行了设计,或者其可容易地使用可公开获得的软件工具进行设计。任何所述siRNA物质都可使用标的DNL复合物进行递送。
本领域中已知的示例性siRNA物质列于表1中。尽管siRNA是作为双链分子递送,但出于简单性的原因,表1中仅示出有义链序列。
表1.示例性siRNA序列
熟练技术人员将认识到,表1呈示本领域中已知的siRNA物质总数中的极少量样本,并且任何所述已知siRNA都可用于所主张的方法和组合物中。
抗体制备
在某些实施方案中,靶向递送复合物可包含单克隆抗体(MAb)或抗原结合抗体片段。MAb可通过多种已确立的技术从杂交瘤培养物分离和纯化。所述分离技术包括蛋白质A或蛋白质G琼脂糖亲和色谱、尺寸排阻色谱和离子交换色谱。参见例如Coligan的第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。另外参见Baines等,"Purification ofImmunoglobulin G(IgG),"METHOD S IN MOLECULAR BIOLOGY,第10卷,第79-104页(The Humana Press,Inc.1992)。初始产生了针对免疫原的抗体之后,可对抗体进行测序并随后通过重组技术进行制备。鼠类抗体和抗体片段的人源化和嵌合为本领域的技术人员所熟知,如下文所论述。
嵌合抗体
嵌合抗体是一种重组抗体,其中人抗体的可变区已置换为例如小鼠抗体的可变区,包括小鼠抗体的互补决定区(CDR)。嵌合抗体在施用至受试者时显示降低的免疫原性和增强的稳定性。克隆鼠类免疫球蛋白可变结构域的通用技术公开于例如Orlandi等,Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 6:3833(1989)中。构建嵌合抗体的技术为本领域的技术人员所熟知。举例来说,Leung等,Hybridoma 13:469(1994)通过将编码鼠类抗CD22抗体LL2的Vκ和VH结构域与相应人κ和IgG1恒定区结构域的DNA序列组合产生了LL2嵌合体。
人源化抗体
产生人源化MAb的技术在本领域中是熟知的(参见例如Jones等,Nature 321:522(1986);Riechmann等,Nature 332:323(1988);Verhoeyen等,Science 239:1534(1988);Carter等,Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89:4285(1992);Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437(1992);和Singer等,J.Immun.150:2844(1993))。嵌合或鼠类单克隆抗体可通过将来自小鼠免疫球蛋白的可变重链和轻链的小鼠CDR转移到人抗体的相应可变结构域中来进行人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也可置换为人FR序列。因为简单地将小鼠CDR转移到人FR中通常导致抗体亲和力降低或甚至丧失,所以可能需要进行额外修饰以恢复鼠类抗体的初始亲和力。此举可通过将FR区中的一个或多个人残基置换为其鼠类对应物以获得对其表位具有良好结合亲和力的抗体来实现。参见例如Tempest等,Biotechnology 9:266(1991)和Verhoeyen等,Science 239:1534(1988)。用于取代的优选残基包括位于CDR残基侧链的1、2或3埃以内、位于CDR序列附近或预测与CDR残基相互作用的FR残基。
人抗体
使用组合方法或经过人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物产生完全人抗体的方法在本领域中是已知的(例如Mancini等,2004,New Microbiol 27:315-28;Conrad和Scheller,2005,Comb.Chem.HighThroughput Screen.8:117-26;Brekke和Loset,2003,Curr.Opin.Pharmacol.3:544-50)。还可通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建完全人抗体,所述方法和技术在本领域中都是已知的。参见例如McCafferty等,Nature 348:552-553(1990)。预期所述完全人抗体表现比嵌合或人源化抗体甚至更少的副作用并且在体内起基本上内源性人抗体的作用。
在一个替代方案中,可使用噬菌体展示技术来产生人抗体(例如Dantas-Barbosa等,2005,Genet.Mol.Res.4:126-40)。人抗体可由正常人或由表现特定疾病病况(如癌症)的人产生(Dantas-Barbosa等,2005)。由患病个体构建人抗体的优势在于循环抗体谱系可能偏向针对疾病相关抗原的抗体。
在此方法的一个非限制性实例中,Dantas-Barbosa等(2005)由骨肉瘤患者构建了人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般来说,从循环血液淋巴细胞获得总RNA(同上)。从μ、γ和κ链抗体谱系克隆重组Fab并插入噬菌体展示文库中(同上)。将RNA转变成cDNA并用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物制备Fab cDNA文库(Marks等,1991,J Mol.Biol.222:581-97)。文库构建是根据Andris-Widhopf等进行(2000:Phage Display Laboratory Manual,Barbas等(编著),第1版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY第9.1至9.22页)。最终Fab片段用限制性核酸内切酶消化并插入噬菌体基因组中以制备噬菌体展示文库。可如本领域中所已知,通过标准噬菌体展示方法对所述文库进行筛选。噬菌体展示可以多种格式执行,关于其综述,请参见例如Johnson和Chiswell,Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)。
人抗体也可由体外活化B细胞产生。参见美国专利No.5,567,610和5,229,275,其以引用的方式整体并入本文。熟练技术人员将认识到,这些技术是作为示例并且可利用制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。
在另一替代方案中,可使用已进行遗传工程改造以产生人抗体的转基因动物来使用标准免疫方案产生针对基本上任何免疫原性标靶的抗体。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等,NatureGenet.7:13(1994);Lonberg等,Nature 368:856(1994);和Taylor等,Int.Immun.6:579(1994)公开。所述系统的非限制性实例为来自Abgenix(Fremont,CA)的(例如Green等,1999,J.Immunol.Methods 231:11-23,以引用的方式并入本文)。在和类似动物中,已使小鼠抗体基因失活并置换为功能性人抗体基因,而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。
将用含有部分人IgH和Igκ基因座,包括大部分可变区序列连同辅助基因和调控序列的生殖系构型YACs(酵母人工染色体)转化。可使用人可变区谱系来产生抗体产生B细胞,其可通过已知技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的将通过正常免疫反应产生人抗体,其可通过上文所论述的标准技术进行收集和/或制造。可获得的多种品系,其各自能够产生不同类别的抗体。已证明转基因产生的人抗体具有治疗潜能,同时保留正常人抗体的药物动力学性质(Green等,1999)。熟练技术人员将认识到,所主张的组合物和方法不限于使用系统,而是可利用已进行遗传工程改造以产生人抗体的任何转基因动物。
已知的抗体和靶抗原
如上文所论述,在优选实施方案中,靶向递送复合物是用于治疗恶性疾病、心血管疾病、感染性疾病、炎症性疾病、自体免疫性疾病、代谢性疾病、免疫功能障碍疾病(例如移植物抗宿主疾病或器官移植排斥反应)或神经(例如神经退化性)疾病。用于治疗所述疾病的示例性靶抗原包括碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM6、c-met、B7、纤维连接蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、低氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、肌腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、P1GF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、PLAGL2和致癌基因产物。
在某些实施方案中,如治疗肿瘤,所使用的抗体可靶向肿瘤相关抗原。这些抗原性标志可为肿瘤所产生的物质或者可为在肿瘤部位、在肿瘤细胞表面上或在肿瘤细胞内部积累的物质。所述肿瘤相关标志部分由以下公开:Herberman,"Immunodiagnosis of Cancer",Fleisher编著,"The Clinical Biochemistry of Cancer",第347页(美国临床化学家协会(American Association of Clinical Chemists),1979)和美国专利No.4,150,149;4,361,544;和4,444,744,所述各文献的实施例部分以引用的方式并入本文。关于肿瘤相关抗原(TAAs)的报导包括Mizukami等,(2005,Nature Med.11:992-97);Hatfield等,(2005,Curr.Cancer Drug Targets 5:229-48);Vallbohmer等(2005,J Clin.Oncol.23:3536-44);和Ren等(2005,Ann.Surg.242:55-63),关于所鉴别的TAA的各文献以引用的方式并入本文。
肿瘤相关标志已由Herberman,同上归类于多种类别中,包括癌胚抗原、胎盘抗原、致癌或肿瘤病毒相关抗原、组织相关抗原、器官相关抗原、异位激素和正常抗原或其变体。有时候,有利地使用肿瘤相关标志的亚基来产生具有较高肿瘤特异性的抗体,例如人绒毛膜促性腺激素(HCG)的β亚基或癌胚抗原(CEA)的γ区,其刺激与非肿瘤物质的交叉反应性显著降低的抗体产生,如美国专利No.4,361,644和4,444,744中所公开。
另一目标标志是跨膜活化因子和CAML-交互因子(TACI)。参见Yu等Nat.Immunol.1:252-256(2000)。简单地说,TACI是B细胞恶性疾病(例如淋巴瘤)的标志。TACI和B细胞成熟抗原(BCMA)由肿瘤坏死因子同源物增殖诱导配体(APRIL)结合。APRIL刺激初级B细胞和T细胞的体外增殖并且在体内因积累B细胞而使脾重量增加。APRIL还与TALL-I(也称为BLyS或BAFF)竞争受体结合。可溶性BCMA和TACI特异性阻止APRIL的结合并且阻断初级B细胞的APRIL刺激的增殖。BCMA-Fc在小鼠体内还抑制针对钥孔螺血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)和肺炎疫苗(Pneumovax)的抗体的产生,表明通过BCMA和/或TACI进行的APRIL和/或TALL-I信号转导为产生体液免疫所需。因此,APRIL-TALL-I和BCMA-TACI形成参与刺激B细胞和T细胞功能的双配体-双受体路径。
在疾病包括淋巴瘤、白血病或自体免疫性疾病的情况下,靶抗原可选自由以下组成的组:CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、CXCR4、B7、MUC1、Ia、Ii、HM1.24、HLA-DR、肌腱蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纤维连接蛋白、致癌基因(例如c-met或PLAGL2)、致癌基因产物、CD66a-d、坏死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)。
熟练技术人员将认识到,可利用本领域中已知的对与疾病病况或病状相关的靶抗原具有结合特异性的任何抗体或片段。所述已知抗体包括但不限于:hR1(抗IGF-1R,3/12/10提交的美国专利申请No.12/772,645)、hPAM4(抗胰腺癌粘蛋白,美国专利No.7,282,567)、hA20(抗CD20,美国专利No.7,251,164)、hA19(抗CD19,美国专利No.7,109,304)、hIMMU31(抗AFP,美国专利No.7,300,655)、hLL1(抗CD74,美国专利No.7,312,318)、hLL2(抗CD22,美国专利No.7,074,403)、hMu-9(抗CSAp,美国专利No.7,387,773)、hL243(抗HLA-DR,美国专利No.7,612,180)、hMN-14(抗CEACAM5,美国专利No.6,676,924)、hMN-15(抗CEACAM6,美国专利No.7,662,378,7/29/10提交的美国专利申请No.12/846,062)、hRS7(抗EGP-1,美国专利No.7,238,785)、hMN-3(抗CEACAM6,美国专利申请No.7,541,440)、Ab124和Ab125(抗CXCR4,美国专利No.7,138,496),各引用专利或申请的实施例部分以引用的方式并入本文。
所使用的各种其它抗体在本领域中是已知的(例如美国专利No.5,686,072;5,874,540;6,107,090;6,183,744;6,306,393;6,653,104;6,730.300;6,899,864;6,926,893;6,962,702;7,074,403;7,230,084;7,238,785;7,238,786;7,256,004;7,282,567;7,300,655;7,312,318;7,585,491;7,612,180;7,642,239和美国专利申请公布No.20060193865;各自以引用的方式并入本文。)
所使用的抗体可从多种已知来源购得。例如,多种分泌抗体的杂交瘤细胞系可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection;ATCC,Manassas,VA)获得。大量针对各种疾病标靶(包括但不限于肿瘤相关抗原)的抗体已保藏于ATCC和/或已公布可变区序列并且可获得以用于所主张的方法和组合物中。参见例如美国专利No.7,312,318;7,282,567;7,151,164;7,074,403;7,060,802;7,056,509;7,049,060;7,045,132;7,041,803;7,041,082;7,041,293;7,038,018;7,037,498;7,012,133;7,001,598;6,998,468;6,994,976;6,994,852;6,989,241;6,974,863;6,965,018;6,964,854;6,962,981;6,962,813;6,956,107;6,951,924;6,949,244;6,946,129;6,943,020;6,939,547;6,921,645;6,921,645;6,921,533;6,919,433;6,919,078;6,916,475;6,905,681;6,899,879;6,893,625;6,887,468;6,887,466;6,884,594;6,881,405;6,878,812;6,875,580;6,872,568;6,867,006;6,864,062;6,861,511;6,861,227;6,861,226;6,838,282;6,835,549;6,835,370;6,824,780;6,824,778;6,812,206;6,793,924;6,783,758;6,770,450;6,767,711;6,764,688;6,764,681;6,764,679;6,743,898;6,733,981;6,730,307;6,720,15;6,716,966;6,709,653;6,693,176;6,692,908;6,689,607;6,689,362;6,689,355;6,682,737;6,682,736;6,682,734;6,673,344;6,653,104;6,652,852;6,635,482;6,630,144;6,610,833;6,610,294;6,605,441;6,605,279;6,596,852;6,592,868;6,576,745;6,572,856;6,566,076;6,562,618;6,545,130;6,544,749;6,534,058;6,528,625;6,528,269;6,521,227;6,518,404;6,511,665;6,491,915;6,488,930;6,482,598;6,482,408;6,479,247;6,468,531;6,468,529;6,465,173;6,461,823;6,458,356;6,455,044;6,455,040;6,451,310;6,444,206;6,441,143;6,432,404;6,432,402;6,419,928;6,413,726;6,406,694;6,403,770;6,403,091;6,395,276;6,395,274;6,387,350;6,383,759;6,383,484;6,376,654;6,372,215;6,359,126;6,355,481;6,355,444;6,355,245;6,355,244;6,346,246;6,344,198;6,340,571;6,340,459;6,331,175;6,306,393;6,254,868;6,187,287;6,183,744;6,129,914;6,120,767;6,096,289;6,077,499;5,922,302;5,874,540;5,814,440;5,798,229;5,789,554;5,776,456;5,736,119;5,716,595;5,677,136;5,587,459;5,443,953;5,525,338。其仅为示例性的且多种其它抗体和其杂交瘤在本领域中是已知的。熟练技术人员将认识到,可通过简单搜索ATCC、NCBI和/或USPTO资料库中针对所选目标疾病相关标靶的抗体获得针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌杂交瘤。所克隆抗体的抗原结合结构域可使用本领域中熟知的标准技术进行扩增、切除、连接至表达载体中、转染至适应宿主细胞中和用于蛋白质产生。
抗体片段
抗体片段是抗体的抗原结合部分,如F(ab')2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv、scFv等。可通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。F(ab')2片段例如可通过用胃蛋白酶消化抗体分子产生。这些和其它方法由Goldenberg,美国专利No.4,036,945和4,331,647以及其中所含的参考文献描述。还参见Nisonoff等,Arch Biochem.Biophys.89:230(1960);Porter,Biochem.J.73:119(1959);Edelman等,METHODS INENZYMOLOGY第1卷,第422页(Academic Press 1967);和Coligan第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。或者,可构建Fab'表达文库(Huse等,1989,Science,246:1274-1281)以允许快速且容易地鉴别具有期望特异性的单克隆Fab'片段。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合形成标靶结合位点。这两个结构域由肽连接子(L)进一步共价连接。scFv分子在VL结构域是scFv分子的N端部分的情况下表示为VL-L-VH,或者在VH结构域是scFv分子的N端部分的情况下表示为VH-L-VL。制备scFv分子和设计适合肽连接子的方法描述于以下文献中:美国专利No.4,704,692;美国专利No.4,946,778;R.Raag和M.Whitlow,"Single Chain Fvs."FASEB第卷:973-80(1995)和R.E.Bird和B.W.Walker,"Single Chain Antibody Variable Regions,"TIBTECH,第9卷:132-137(1991)。
其它抗体片段,例如单结构域抗体片段,在本领域中是已知的并且可用于所主张的构建体中。单结构域抗体(VHH)可通过标准免疫技术从例如骆驼、羊驼或美洲驼获得。(参见例如Muyldermans等,TIBS26:230-235,2001;Yau等,J Immunol Methods 281:161-75,2003;Maass等,J Immunol Methods 324:13-25,2007)。VHH可具有有效抗原结合能力并且可与常规VH-VL对不可接近的新颖表位相互作用。(Muyldermans等,2001)。羊驼血清IgG含有约50%仅有重链的骆驼IgG抗体(HCAb)(Maass等,2007)。羊驼可用已知抗原(如TNF-α)免疫并且可分离结合并中和靶抗原的VHH(Maass等,2007)。已鉴别出扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物并且可用于构建羊驼VHH噬菌体展示文库,所述文库可用于通过本领域中熟知的标准生物淘选技术分离抗体片段(Maass等,2007)。
抗体片段还可通过对全长抗体进行蛋白水解或通过在大肠杆菌或另一宿主中表达编码所述片段的DNA来制备。抗体片段可通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体来获得。例如,抗体片段可通过用胃蛋白酶酶促裂解抗体来产生以提供约100Kd的片段,称为F(ab')2。此片段可使用硫醇还原剂和任选地用于由二硫键裂解产生的巯基的阻断基团进行进一步裂解以产生约50Kd的Fab'单价片段。
或者,使用木瓜蛋白酶进行酶促裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。
还可使用裂解抗体的其它方法,如分离重链以形成单价轻-重链片段、进一步裂解片段,或其它酶促、化学或遗传技术,只要所述片段结合由完整抗体识别的抗原即可。
用于抗体克隆和制造的一般技术
各种技术,如制造嵌合或人源化抗体,可能涉及抗体克隆和构建的程序。目标抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可通过多种分子克隆程序获得,如RT-PCR、5'-RACE和cDNA文库筛选。来自表达鼠类MAb的细胞的MAb的V基因可通过PCR扩增进行克隆并测序。为证实其可靠性,可使克隆的VL和VH基因在细胞培养物中表达为嵌合Ab,如Orlandi等所述(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:3833(1989))。基于V基因序列,接着可如Leung等(Mol Immunol,32:1413(1995))所述设计和构建人源化MAb。
可通过一般分子克隆技术从产生鼠类MAb的任何已知杂交瘤细胞系或转染细胞系制备cDNA(Sambrook等,Molecular Cloning,Alaboratory manual,第2版(1989))。MAb的Vκ序列可使用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等,1989)或Leung等(Bio Techniques,15:286(1993))所述的扩展引物组进行扩增。VH序列可使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等,1989)或Leung等(Hybridoma,13:469(1994))所述的与鼠类IgG恒定区退火的引物进行扩增。可如Leung等(Mol.Immunol,32:1413(1995))所述通过组合长寡核苷酸模版合成和PCR扩增来构建人源化V基因。
Vκ的PCR产物可亚克隆到支架载体中,如基于pBR327的支架载体VKpBR,其含有Ig启动子、信号肽序列和适宜的限制性位点。VH的PCR产物可亚克隆到类似支架载体中,如基于pBluescript的VHpBS。含有Vκ和VH序列连同启动子和信号肽序列的表达盒可从VKpBR和VHpBS切除并分别连接至适当表达载体中,如pKh和pG1g(Leung等,Hybridoma,13:469(1994))。所述表达载体可共转染至适当细胞中并监测上清液的嵌合、人源化或人MAb产生。或者,可切除Vκ和VH表达盒并亚克隆至单一表达载体中,如pdHL2,如Gillies等所述(J Immunol.Methods 125:191(1989),并且还在Losman等,Cancer,80:2660(1997)中示出)。
在一替代实施方案中,可将表达载体转染至已预先适应在无血清培养基中转染、生长和表达的宿主细胞中。可使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见例如美国专利No.7,531,327;7,537,930和7,608,425;各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。这些示例性细胞系是基于以突变型Bcl-EEE基因转染、暴露于甲氨蝶呤以扩增所转染基因序列并且预先适应无血清细胞系以供蛋白质表达的Sp2/0骨髓瘤细胞系。
对接锁定(DNL)
在某些实施方案中,靶向递送复合物可使用对接锁定技术制造(参见例如美国专利No.7,550,143;7,521,056;7,534,866;7,527,787和7,666,400,各专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。DNL方法利用cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)的调控(R)亚基与A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间发生的特异性蛋白质/蛋白质相互作用(Baillie等,FEBS Letters.2005;579:3264。Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004;5:959)。在研究最多的通过第二信使cAMP结合于R亚基触发的信号转导路径之一中起中枢作用的PKA于1968年首先从兔骨骼肌分离出(Walsh等,J.Biol.Chem.1968;243:3763)。全酶的结构由两个通过R亚基保持为非活性形式的催化亚基组成(Taylor,J.Biol.Chem.1989;264:8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RI和RII),并且各类型具有α和β亚型(Scott,Pharmacol.Ther.1991;50:123)。R亚基仅分离为稳定二聚体并且显示二聚化结构域由前44个氨基端残基组成(Newlon等,Nat.Struct.Biol.1999;6:222)。cAMP与R亚基结合导致释放广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基,其通过使PKA与AKAP对接而使PKA区室化来限定于所选底物(Scott等,J.Biol.Chem.1990;265;21561)。
自从第一种AKAP微管相关蛋白-2于1984年表征以来(Lohmann等,Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984;81:6723),又在从酵母到人范围内的物种中鉴别出具有多种结构的超过50种AKAP,其定位于各种亚细胞位点,包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网(Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004;5:959)。AKAP中用于PKA的AD是具有14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等,J.Biol.Chem.1991;266:14188)。AD的氨基酸序列在个别AKAP之间十分不同,其中针对RII二聚体所报导的结合亲和力在2至90nM范围内(Alto等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003;100:4445)。AKAP仅结合二聚R亚基。对于人RIIα,AD结合由23个氨基端残基形成的疏水性表面(Colledge和Scott,Trends Cell Biol.1999;6:216)。因此,人RIIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域都定位在N端同一44氨基酸的序列内(Newlon等,Nat.Struct.Biol.1999;6:222;Newlon等,EMBO J.2001;20:1651),其在本文被称为DDD。
我们已发展出一种平台技术,其利用人RIIα的DDD和AKAP的AD作为一对优良的连接子模块用于将任何两个实体(在下文称为A与B)对接成非共价复合物,所述复合物可通过在DDD与AD的至关重要的位置中引入半胱氨酸残基以促进形成二硫键而进一步锁定为稳定系栓结构。“对接锁定”法的一般方法如下。实体A通过将DDD序列连接至A的前驱体进行构建,产生下文称为a的第一组分。因为DDD序列将实现二聚体的自发形成,因此A将由a2构成。实体B通过将AD序列连接至B的前驱体进行构建,产生下文称为b的第二组分。a2中所含的DDD的二聚基元将产生用于结合b中所含的AD序列的对接位点,由此促进a2与b容易地缔合形成由a2b构成的二元三聚复合物。利用通过二硫桥共价固定两个实体的后续反应使此结合事件不可逆转,基于有效局部浓度的原理,此反应极其有效地发生,因为初始结合相互作用应使安置于DDD与AD两者上的反应性硫醇基接近(Chmura等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001;98:8480)从而位点特异性连接。使用连接子、接头模块和前驱体的各种组合,可产生和使用不同化学计量的多种DNL构建体,包括但不限于二聚、三聚、四聚、五聚和六聚DNL构建体(参见例如U.S.No.7,550,143;7,521,056;7,534,866;7,527,787和7,666,400。)
通过远离两个前驱体的官能团连接DDD和AD,预期所述位点特异性连接还将保留两个前驱体的原始活性。此方法在性质上是模块化的并且可潜在应用于位点特异性共价连接多种物质,包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和具有多种活性的其它效应部分。利用构建以下实施例中所述的偶联AD和DDD的效应物的融合蛋白法,可将几乎任何蛋白质或肽并入DNL构建体中。然而,所述技术并不具限制性并且可利用其它偶联方法。
已知用于制备融合蛋白的多种方法,包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。可通过标准分子生物学技术将所述双链核酸插入用于制造融合蛋白的表达载体中(参见例如Sambrook等,Molecular Cloning,A laboratory manual,第2版,1989)。在所述优选实施方案中,AD和/或DDD部分可连接于效应蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而,熟练技术人员将认识到,AD或DDD部分连接于效应部分的位点可根据效应部分的化学性质和效应部分中参与其生理活性的部分而改变。多种效应部分的位点特异性连接可使用本领域中已知的技术执行,如使用二价交联试剂和/或其它化学偶联技术。
免疫偶联物
在优选实施方案中,可将如siRNA载体部分等部分共价连接至抗体或抗体片段以形成免疫偶联物。可将载体部分连接至例如经过还原的SH基团和/或碳水化合物侧链。载体部分可通过形成二硫键连接于经过还原的抗体组分的铰链区。或者,所述药剂可使用异双官能交联剂(如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰酯(SPDP))连接。Yu等,Int.J.Cancer 56:244(1994)。所述偶联的一般技术在本领域中是熟知的。参见例如Wong,CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION ANDCROSS-LINKING(CRC Press 1991);Upeslacis等,"Modification ofAntibodies by Chemical Methods,"MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS,Birch等(编著),第187-230页(Wiley-Liss,Inc.1995);Price,"Production and Characterization ofSynthetic Peptide-Derived Antibodies,"MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION,Ritter等(编著),第60-84页(Cambridge University Press 1995)。或者,可通过抗体Fc区中的碳水化合物部分偶联载体部分。
通过抗体碳水化合物部分偶联官能团与抗体的方法为本领域的技术人员所熟知。参见例如Shih等,Int.J.Cancer41:832(1988);Shih等,Int.J.Cancer 46:1101(1990);和Shih等,美国专利No.5,057,313,所述文献的实施例部分以引用的方式并入本文。一般方法涉及使具有氧化碳水化合物部分的抗体与具有至少一个游离胺官能团的载体聚合物反应。此反应产生初始希夫碱(Schiff base)(亚胺)键联,其可通过还原成仲胺而稳定以形成最终偶联物。
在免疫偶联物的抗体组分是抗体片段的情况下可能不存在Fc区。然而,有可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见例如Leung等,J.Immunol.154:5919(1995);美国专利No.5,443,953和6,254,868,所述文献的实施例部分以引用的方式并入本文。使用经过工程改造的碳水化合物部分来连接治疗剂或诊断剂。
连接载体部分与靶向分子的替代方法涉及使用点击化学反应。点击化学法最初构想成通过以模块化方式将小亚基接合在一起快速产生复杂物质的方法。(参见例如Kolb等,2004,Angew Chem Int Ed40:3004-31;Evans,2007,Aust J Chem 60:384-95。)各种形式的点击化学反应在本领域中是已知的,如胡伊斯根(Huisgen)1,3-偶极环加成铜催化反应(Tornoe等,2002,J Organic Chem 67:3057-64),其通常称为“点击反应”。其它替代方案包括环加成反应,如狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)、亲核取代反应(尤其与如环氧和环乙亚胺化合物等小应变环反应)、脲化合物的羰基化学形成和涉及碳碳双键的反应,如硫醇-炔反应中的炔。
叠氮化物炔胡伊斯根环加成反应使用还原剂存在下的铜催化剂来催化连接于第一分子的末端炔基的反应。在包含叠氮化物部分的第二分子存在下,叠氮化物与活化炔反应形成1,4-取代的1,2,3-三唑。铜催化的反应在室温下进行并且具有足够特异性,从而通常不需要对反应产物进行纯化。(Rostovstev等,2002,Angew Chem Int Ed41:2596;Tornoe等,2002,J Org Chem 67:3057。)叠氮和炔官能团对水性介质中的生物分子基本上呈惰性,从而允许反应在复杂溶液中进行。形成的三唑在化学上为稳定的并且不经历酶促裂解,使得点击化学产物在生物系统中高度稳定。尽管铜催化剂对活细胞有毒,但可在体外使用基于铜的点击化学反应形成免疫偶联物。
已提出无铜点击反应用于生物分子的共价修饰。(参见例如Agard等,2004,J Am Chem Soc 126:15046-47。)无铜反应使用环应变替代铜催化剂来促进[3+2]叠氮化物-炔环加成反应(同上)。例如,环辛炔是包含内部炔键的8碳环结构。闭合环结构诱发乙炔的实质性键角变形,其极易与叠氮基反应形成三唑。因此,环辛炔衍生物可用于无铜点击反应(同上)。
另一类型的无铜点击反应由Ning等报导(2010,Angew Chem IntEd 49:3065-68),其涉及应变促进的炔-硝酮环加成。为解决原始环辛炔反应速率缓慢的问题,与三键相邻连接吸电子基团(同上)。所述经过取代的环辛炔的实例包括二氟化环辛炔、4-二苯并环辛炔醇和氮杂环辛炔(同上)。一替代无铜反应涉及应变促进的炔-硝酮环加成来得到N-烷基化异恶唑啉(同上)。所述反应据报导具有特别快的反应动力学并且用于一锅式三步方案中以供对肽和蛋白质进行位点特异性修饰(同上)。硝酮是通过使适当醛与N-甲基羟胺缩合来制备并且环加成反应在乙腈与水的混合物中进行(同上)。可使用这些和其它已知点击化学反应来在体外将载体部分连接至抗体。
治疗性治疗的方法
各种实施方案涉及治疗受试者的癌症的方法,其包括施用治疗有效量的靶向递送复合物,如与siRNA载体偶联并且负载siRNA分子的抗体。
靶向递送复合物可补充以同时或依序施用至少一种其它治疗剂。多模式疗法可包括利用其它抗体的疗法,如呈裸抗体、融合蛋白或免疫偶联物形式的抗CD22、抗CD19、抗CD20、抗CD21、抗CD74、抗CD80、抗CD23、抗CD45、抗CD46、抗MIF、抗EGP-1、抗CEACAM5、抗CEACAM6、抗胰腺癌粘蛋白、抗IGF-1R或抗HLA-DR(包括恒定链)抗体。所使用的各种抗体,如抗CD19、抗CD20和抗CD22,为本领域的技术人员所已知。参见例如Ghetie等,CancerRes.48:2610(1988);Hekman等,Cancer Immunol.Immunother.32:364(1991);Longo,Curr.Opin.Oncol.5:353(1996);美国专利No.5,798,554;6,187,287;6,306,393;6,676,924;7,109,304;7,151,164;7,230,084;7,230,085;7,238,785;7,238,786;7,282,567;7,300,655;7,312,318;7,612,180;7,501,498;各自的实施例部分以引用的方式并入本文。
在多模式疗法的另一形式中,受试者接受靶向递送复合物与标准癌症化学疗法的联合。例如,“CVB”(1.5g/m2环磷酰胺、200-400mg/m2依托泊苷和150-200mg/m2卡莫司汀)是用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的方案。Patti等,Eur.J.Haematol.51:18(1993)。其它适合组合化学治疗方案为本领域的技术人员所熟知。参见例如Freedman等,"Non-Hodgkin's Lymphomas,"CANCER MEDICINE,第2卷,第3版,Holland等(编著),第2028-2068页(Lea&Febiger 1993)。举例来说,用于治疗中间级非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和泼尼松)和CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)。适用第二代化学治疗方案为m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰四氢叶酸),而适合第三代方案为MACOP-B(甲氨蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。其它适用药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀和苔藓虫素-1。
在一优选多模式疗法中,化学治疗药物与细胞因子同时与靶向递送复合物共同施用。细胞因子、化学治疗药物和靶向递送复合物可以任何次序或一起施用。
靶向递送复合物可根据已知方法进行配制以制备药学上适用的组合物,由此将靶向递送复合物与药学上适合的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一个实例。其它适合赋形剂为本领域的技术人员所熟知。参见例如Ansel等,PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS,第5版(Lea & Febiger 1990),和Gennaro(编著),REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版(MackPublishing Company 1990)和其修订版。
本发明的靶向递送复合物可配制成用于通过例如推注或连续输注进行静脉内施用。优选地,靶向递送复合物输注持续少于约4个小时的时间,并且更优选持续少于约3个小时的时间。例如,前25-50mg可在30分钟,优选甚至15分钟内输注,并且其余部分接着输注持续2-3小时。用于注射的制剂可以单位剂型,例如于添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中提供。组合物可采用诸如于油性或水性媒剂中的混悬液、溶液或乳液等形式,并且可含有配方剂,如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者,活性成分可呈在使用前用适合媒剂(例如无菌无热原质水)复原的粉末形式。
靶向递送复合物还可通过皮下或甚至通过其它胃肠外途径施用至哺乳动物。此外,可通过连续输注或通过单次或多次推注进行施用。优选地,靶向递送复合物输注持续少于约4个小时的时间,并且更优选持续少于约3个小时的时间。
更一般来说,用于人的所施用靶向递送复合物的剂量将根据以下因素而变化,如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医疗条件和先前医学病史。需要向接受者提供的靶向递送复合物的剂量在作为单次静脉内输注时在约1mg/kg至25mg/kg范围内,不过还可根据环境要求施用较低或较高剂量。对于70kg患者1-20mg/kg的剂量例如为70-1,400mg,或对于1.7-m患者为41-824mg/m2。需要时剂量可重复,例如每周一次持续4-10周,每周一次持续8周,或每周一次持续4周。在维持疗法中需要时,其还可以较低频率给予,如每隔一周一次持续若干个月,或每月或每季度一次持续许多个月,
或者,靶向递送复合物可每2或3周施用一次剂量,重复总共至少3次剂量。或者,靶向递送复合物可每周施用两次持续4-6周。如果使剂量降至约200-300mg/m2(对于1.7-m患者为每剂340mg,或者对于70kg患者为4.9mg/kg),那么其可每周施用一次或甚至两次持续4至10周。或者,给药时程可减少,即每2或3周一次持续2-3个月。然而已经确定,甚至可通过缓慢静脉内输注根据重复给药循环施用甚至更高的剂量,如20mg/kg每周一次或每2-3周一次。给药时程可任选地以其它时间间隔重复,并且剂量可在对剂量和时程进行适当调整下通过各种胃肠外途径给予。
在优选实施方案中,标的靶向递送复合物是用于治疗癌症。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病、骨髓瘤或淋巴恶性疾病。所述癌症的更特定实例如下所述并且包括:鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、尤因氏肉瘤(Ewingsarcoma)、韦尔姆斯氏瘤(Wilms tumor)、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌瘤、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺分化癌、乳癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、阴门癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如细胞未迁移至受试者体内原始恶性疾病或肿瘤部位以外的部位的肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移产生的肿瘤,转移为恶性细胞或肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的次级部位)。
癌症或恶性疾病的其它实例包括但不限于:急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性淋巴瘤、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关性淋巴瘤、AIDS相关性恶性疾病、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外胚细胞瘤、儿童霍奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、戈谢氏病(Gaucher's Disease)、胆囊癌、胃部癌、胃肠良性肿瘤、胃肠肿瘤、胚细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波济氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、肾癌、喉癌、唇口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓发育不良综合症、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、原发灶隐匿性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨骼的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢胚细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、真性红细胞增多症、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉状瘤病肉瘤、塞扎里综合症(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养层细胞瘤、输尿管和肾盂细胞癌、输尿管癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、韦尔姆斯氏瘤,和除赘瘤以外位于上列器官系统中的任何其它过度增生性疾病。
本文描述和主张的方法和组合物可用于治疗恶性或恶变前病状以及用于预防发展成赘生性或恶性状态,包括但不限于上文所述的那些病症。所述用途适用于已知或怀疑提前发展成赘瘤或癌症的病状,尤其是在已发生由增生、转化或最特别是发育异常组成的非赘生性细胞生长的情况下(关于所述异常生长病状的综述,请参见Robbins和Angell,Basic Pathology,第2版,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,第68-79页(1976))。
发育异常常常是癌症的前兆,并且主要发现于上皮中。其是非赘生性细胞生长的最无序形式,涉及个别细胞一致性和细胞结构定向的丧失。在存在慢性刺激或炎症的情况下,发育异常特征性地发生。可治疗的发育异常病症包括但不限于:无汗性外胚层发育不良、前面部发育不良、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良、支气管肺发育不良、大脑发育不良、子宫颈非典型增生、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨干发育不良、颅腕跗发育不良、颅骨干骺端发育不良、牙本质发育异常、骨干结构不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮异常增生、面指生殖器发育异常、家族性颌骨纤维性发育异常、家族性白色皱褶性发育异常、纤维肌肉发育异常、骨纤维性结构不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾视网膜发育不良、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌骨颜面发育不良、干骺端发育不良、蒙蒂尼氏发育异常(Mondinidysplasia)、单骨纤维性骨发育不良、粘液上皮发育异常、多发性骨骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼椎骨发育不全、牙原性发育不良、眼下颌骨发育不良、根尖周牙骨质异常增生、多骨纤维性结构不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良、视网膜发育不良、中隔-眼发育不良、脊椎骨骺发育不良和脑室径向发育不良。
可治疗的其它赘生前病症包括但不限于良性异常增生性病症(例如良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉或腺瘤以及食道异常增生)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病(Bowen's disease)、农夫皮肤(Farmer's Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选实施方案中,使用本发明的方法抑制癌症,特别是上文所列癌症的生长、发展和/或转移。
其它过度增生性疾病、病症和/或病状包括但不限于恶性疾病和相关病症的进展和/或转移,如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓细胞性白血病(包括成骨髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体肿瘤,包括但不限于肉瘤和癌瘤,如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、韦尔姆斯氏瘤、子宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
其它治疗剂
多种治疗性试剂可与靶向递送复合物同时或依序施用。例如药物、毒素、寡核苷酸、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、放射性核素、血管生成抑制剂等。此处所述的治疗剂是还适用于与如上所述的靶向递送复合物分开施用的那些药剂。治疗剂包括例如化学治疗药物,如长春花生物碱、蒽环霉素、吉西他滨、紫杉烷、抗代谢物、烷基化剂、抗生素、SN-38、COX-2抑制剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和促细胞凋亡剂,特别是阿霉素、甲氨蝶呤、紫杉酚、CPT-11、喜树碱、蛋白酶体抑制剂、mTOR抑制剂、HDAC抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和其它药物。
其它适用癌症化学治疗药物包括氮芥、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、COX-2抑制剂、抗代谢物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、mTOR抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、喜树碱、激素等。适合化学治疗剂描述于以下文献中:REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第19版(Mack Publishing Co.1995)和GOODMAN AND GILMAN'S THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS,第7版(MacMillan Publishing Co.1985),以及这些出版物的修订版。其它适合化学治疗剂(如实验性药物)为本领域的技术人员所已知。
在一优选实施方案中,可将喜树碱和相关化合物(如SN-38)与抗癌抗体偶联,例如如美国专利No.7,591,994;和2006年3月23日提交的USSN 11/388,032中所公开,所述各文献的实施例部分以引用的方式并入本文。
毒素可具有动物、植物或微生物来源。毒素(如假单胞菌外毒素)还可与免疫偶联物的治疗剂部分复合或形成免疫偶联物的治疗剂部分。其它毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、抗肿瘤核糖核酸酶(onconase)、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。参见例如Pastan等,Cell 47:641(1986),Goldenberg,CA--ACancer Journal for Clinicians 44:43(1994);Sharkey和Goldenberg,CA--A Cancer Journal for Clinicians 56:226(2006)。适合使用的其它毒素为本领域的技术人员所已知并且公开于美国专利No.6,077,499中,所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
如本文所用,术语“免疫调节剂”包括细胞因子、淋巴因子、单核因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、群落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN、副甲状腺素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子(IGF)、红细胞生成素、血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、苗勒管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)、小鼠促性腺素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、白介素(IL)、粒细胞群落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、S1因子、IL-1、IL-1cc、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21和IL-25、LIF、kit-配体、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素和LT等。
靶向递送复合物可与包含一种或多种适用于治疗患病组织的放射性同位素的免疫偶联物一起施用。特别适用的治疗性放射性核素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。治疗性放射性核素优选具有20至6,000keV范围内的衰变能,优选对于俄歇发射体在60至200keV范围内,对于β发射体在100-2,500keV范围内,并且对于α发射体在4,000-6,000keV范围内。适用β粒子发射核素的最大衰变能优选为20-5,000keV,更优选为100-4,000keV,并且最优选为500-2,500keV。随俄歇发射粒子实质上衰变的放射性核素也是优选的。例如Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。适用β粒子发射核素的衰变能优选为<1,000keV,更优选为<100keV,并且最优选为<70keV。随着α粒子产生而实质上衰变的放射性核素也是优选的。所述放射性核素包括但不限于:Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。适用α粒子发射放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV,更优选为3,000-8,000keV,并且最优选为4,000-7,000keV。
其它潜在治疗性放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。
药学上适合的赋形剂
欲递送至受试者的靶向递送复合物可包含一种或多种药学上适合的赋形剂、一种或多种其它成分或其一些组合。靶向递送复合物可根据已知方法进行配制以制备药学上适用的组合物,由此将靶向递送复合物与药学上适合的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一个实例。其它适合赋形剂为本领域的技术人员所熟知。参见例如Ansel等,PHARMACEUTICAL DOSAGEFORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第5版(Lea & Febiger1990),和Gennaro(编著),REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES,第18版(Mack Publishing Company 1990)和其修订版。
靶向递送复合物可配制成用于通过例如推注或连续输注进行静脉内施用。用于注射的制剂可以单位剂型,例如于添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中提供。组合物可采用诸如于油性或水性媒剂中的混悬液、溶液或乳液等形式,并且可含有配方剂,如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者,活性成分可呈在使用前用适合媒剂(例如无菌无热原质水)复原的粉末形式。
试剂盒
各种实施方案可涉及含有适于治疗或诊断患者的患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可含有至少一种如本文所述的靶向递送复合物。如果含有用于施用的组分的组合物未配制成通过消化道递送,如通过口服递送,那么可包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的装置。用于如肠胃外递送等应用的一种类型装置是注射器,其用于将组合物注射至受试者体内。还可使用吸入装置。在某些实施方案中,靶向递送复合物可以含有抗体的无菌液体制剂或冻干制剂的预填充注射器或自动注射笔形式提供(例如Kivitz等,Clin.Ther.2006,28:1619-29)。
试剂盒组分可包装于一起或分隔于两个或多个容器中。在一些实施方案中,容器可为容纳适于复原的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。试剂盒还可含有一种或多种适于复原和/或稀释其它试剂的缓冲液。可使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可无菌包装和保持于容器中。可包括的另一组分为试剂盒的使用说明书。
实施例
以下实施例说明本发明的实施方案并且不对权利要求书的范围构成限制。
实施例1.制备对接锁定(DNL)构建体
DDD和AD融合蛋白
可使用DNL技术来制备包含几乎任何抗体、抗体片段、siRNA载体或其它效应部分的二聚体、三聚体、四聚体、六聚体等。对于某些优选实施方案,标的靶向递送复合物的抗体和载体部分可制造为包含二聚化与对接结构域(DDD)或锚定结构域(AD)序列的融合蛋白。尽管在优选实施方案中,DDD和AD部分可与靶向分子和siRNA载体接合成融合蛋白,但熟练技术人员将认识到,存在其它偶联方法,特别是对于非蛋白质siRNA载体,如化学交联、点击化学反应等。
所述技术不具限制性并且可将所使用的任何蛋白质或肽制造为AD或DDD融合蛋白以供并入到DNL构建体中。在利用化学交联的情况下,AD和DDD偶联物可包含可使用本领域中已知的任何交联技术与AD或DDD序列交联的任何分子。在某些示例性实施方案中,可将树枝状聚合物或其它聚合部分(如聚乙烯亚胺或聚乙二醇(PEG))并入DNL构建体中,如下文进一步详细描述。
对于不同类型的DNL构建体,可利用不同AD或DDD序列。示例性DDD和AD序列提供于下文中。
DDD1:SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ IDNO:33)
DDD2:CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ IDNO:34)
AD1:QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:35)
AD2:CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ IDNO:36)
熟练技术人员将认识到,DDD1和DDD2包含蛋白激酶A的人RIIα形式的DDD序列。然而,在替代实施方案中,DDD和AD部分可以基于蛋白激酶A的人RIα形式的DDD序列和相应AKAP序列,如下文DDD3、DDD3C和AD3中所例示。
DDD3
SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ IDNO:37)
DDD3C
MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO:38)
AD3
CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC(SEQ ID NO:39)
表达载体
已使用质粒载体pdHL2来产生多种抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等,JImmunol Methods(1989),125:191-202;Losman等,Cancer(Phila)(1997),80:2660-6。所述双顺反子哺乳动物表达载体引导IgG的重链和轻链的合成。许多不同IgG-pdHL2构建体的载体序列基本上相同,仅有的差异存在于可变结构域(VH和VL)序列中。使用本领域的技术人员已知的分子生物学工具,可将这些IgG表达载体转化成Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为产生Fab-DDD表达载体,将重链的铰链、CH2和CH3结构域的编码序列置换成编码铰链的前4个残基、14个残基的Gly-Ser连接子和人RIIα的前44个残基(称为DDD1)的序列。为产生Fab-AD表达载体,将IgG的铰链、CH2和CH3结构域的序列置换成编码铰链的前4个残基、15个残基的Gly-Ser连接子和称为AKAP-IS的17个残基的合成AD(称为AD1)的序列,所述合成AD是使用生物信息学和肽阵列技术产生并且证实以极高亲和力(0.4nM)结合RIIα二聚体。参见Alto等Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A(2003),100:4445-50。
设计两个穿梭载体以促进IgG-pdHL2载体向Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体的转化,如下文所述。
制备CH1
使用pdHL2质粒载体作为模版通过PCR扩增CH1结构域。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5')端和SacII限制性核酸内切酶位点(其为CH1编码序列的5')组成。右侧引物由编码铰链的前4个残基(PKSC)接着四个甘氨酸和丝氨酸组成,其中最后两个密码子(GS)构成Bam HI限制性位点。将410bp PCR扩增物克隆到PCR克隆载体(Inc.)中并根据T7(5')方向上的插入物对克隆进行筛选。
合成双链体寡核苷酸以编码前有11个连接子肽残基的DDD1氨基酸序列,其中前两个密码子构成BamHI限制性位点。终止密码子和EagI限制性位点接附于3'端。所编码的多肽序列于下文示出。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO:40)
合成在3'端上有30个碱基对重叠的两个寡核苷酸,命名为RIIA1-44top和RIIA1-44bottom,并将其组合以构成174bp DDD1序列的中心154个碱基对。使所述寡核苷酸退火并用Taq聚合酶进行引物延伸反应。引物延伸后,通过PCR扩增双链体。将扩增物克隆到中并根据T7(5')方向上的插入物进行筛选。
合成双链体寡核苷酸以编码前有11个连接子肽残基的AD1氨基酸序列,其中前两个密码子构成BamHI限制性位点。终止密码子和EagI限制性位点接附于3'端。所编码的多肽序列于下文示出。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:41)
连接DDD1与CH1
连接AD1与CH1
将CH1-DDD1或CH1-AD1克隆到基于pdHL2的载体中
根据此模块化设计,可将CH1-DDD1或CH1-AD1并入pdHL2载体中的任何IgG构建体中。通过从pdHL2移除SacII/EagI限制性片段(CH1-CH3)并将其置换为从相应pGemT穿梭载体切除的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI限制性片段将整个重链恒定结构域置换为上述构建体之一。
构建h 679-Fd-AD1-pdHL2
h679-Fd-AD1-pdHL2是用于制造有AD1通过由14个氨基酸残基构成的柔性Gly/Ser肽间隔子偶合于Fd的CH1结构域的羧基末端的h679Fab的表达载体。通过将SacII/EagI片段置换为用SacII和EagI从CH1-AD1-SV3切除的CH1-AD1片段将含有h679的可变结构域的基于pdHL2的载体转化为h679-Fd-AD1-pdHL2。
构建C-DDD 1-Fd-hMN-14-pdHL2
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于制造包含两个拷贝的融合蛋白C-DDD1-Fab-hMN-14的稳定二聚体的表达载体,其中DDD1通过柔性肽间隔子连接于hMN-14Fab上CH1的羧基端。通过用SacII和EagI限制性核酸内切酶消化以移除CH1-CH3结构域并插入用SacII和EagI从CH1-DDD1-SV3穿梭载体切除的CH1-DDD1片段将已用于制造hMN-14IgG的质粒载体hMN-14(I)-pdHL2转化成C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2。
已利用相同技术来制造用于多种已知抗体的Fab表达的质粒,所述抗体如hLL1、hLL2、hPAM4、hR1、hRS7、hMN-14、hMN-15、hA19、hA20和许多其它抗体。一般来说,抗体可变区编码序列存在于pdHL2表达载体中并且如上所述转化表达载体用于制造AD或DDD融合蛋白。可按每一个AD融合蛋白对应两个DDD融合蛋白的大致比率组合包含任何所述抗体的Fab片段的AD和DDD融合蛋白,以产生包含第一抗体的两个Fab片段与第二抗体的一个Fab片段的三聚DNL构建体。
构建N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2
N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于制造包含两个拷贝的融合蛋白N-DDD1-Fab-hMN-14的稳定二聚体的表达载体,其中DDD1通过柔性肽间隔子连接于hMN-14Fab上VH的氨基端。表达载体如下进行工程改造。通过PCR扩增DDD1结构域。
作为PCR的结果,分别将NcoI限制性位点和含有BamHI限制性的连接子的部分编码序列接附于5'和3'端。将170bp PCR扩增物克隆到pGemT载体中并根据T7(5')方向上的插入物对克隆进行筛选。用NcoI和SalI限制酶从pGemT载体切除194bp插入物并克隆到通过用相同酶消化制备的SV3穿梭载体中以产生中间载体DDD1-SV3。
通过PCR扩增hMN-14Fd序列。作为PCR的结果,将BamHI限制性位点和部分连接子的编码序列接附于扩增物的5'端。终止密码子和EagI限制性位点接附于3'端。将1043bp扩增物克隆到pGemT中。用BamHI和EagI限制酶从pGemT切除hMN-14-Fd插入物并接着与通过用相同酶消化制备的DDD1-SV3载体连接以产生构建体N-DDD 1-hMN-14Fd-SV3。
用XhoI和EagI限制酶切除N-DDD1-hMN-14Fd序列并将1.28kb插入物片段与通过用相同酶消化C-hMN-14-pdHL2制备的载体片段连接。最终表达载体是N-DDD 1-Fd-hMN-14-pDHL2。N-连接型Fab片段显示与C-连接型Fab片段类似的DNL复合物形成和抗原结合特征(未示出)。
CDDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于制造具有DDD2的二聚化与对接结构域序列通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接子接附于hMN-14的Fd的羧基端的C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体。所分泌的融合蛋白由通过DDD2结构域的非共价相互作用保持在一起的两个相同拷贝的hMN-14Fab构成。
表达载体如下进行工程改造。合成制备包含部分连接子肽和DDD2的残基1-13的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸。将所述寡核苷酸退火并用T4PNK磷酸化,从而在5'和3'端上产生适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接的悬突。
将双链体DNA与通过用BamHI和PstI消化制备的穿梭载体连接以产生穿梭载体用SacII和EagI从切除507bp片段并与通过用SacII和EagI消化制备的IgG表达载体hMN-14(I)-pdHL2连接。最终表达构建体命名为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。已利用类似技术来产生多种不同人源化抗体的Fab片段的DDD2融合蛋白。
h679-Fd-AD2-pdHL2
设计h679-Fab-AD2作为B与作为A的C-DDD2-Fab-hMN-14配对。h679-Fd-AD2-pdHL2是用于制造具有AD2的锚定结构域序列通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接子接附于CH1结构域的羧基末端的h679-Fab-AD2的表达载体。AD2在AD1的锚定结构域序列之前具有一个半胱氨酸残基并且在其后具有另一个半胱氨酸残基。
表达载体如下进行工程改造。合成制备包含AD2和部分连接子序列的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸(AD2Top和AD2Bottom)。将所述寡核苷酸退火并用T4PNK磷酸化,从而在5'和3'端上产生适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接的悬突。
实施例2.产生TF1DNL构建体
如下进行称为TF1的DNL构建体的大规模制备。首先将N-DDD2-Fab-hMN-14(蛋白质L纯化)和h679-Fab-AD2(IMP-291纯化)以大致化学计量浓度于1mM EDTA、PBS(pH 7.4)中混合。添加TCEP前,SE-HPLC未显示任何a2b形成的迹象(未示出)。而是存在代表a4(7.97min;200kDa)、a2(8.91min;100kDa)和B(10.01min;50kDa)的峰。添加5mM TCEP快速引起a2b复合物形成,如8.43min时与150kDa蛋白质一致的新峰所证明(未示出)。在此实验中显然存在过量B,因为归属于h679-Fab-AD2的峰(9.72min)仍然明显而并未观察到对应于a2或a4的明显峰。还原一小时后,通过若干次改变PBS透析过夜将TCEP移除。使所得溶液达到10%DMSO并在室温下保持过夜。
当通过SE-HPLC进行分析时,代表a2b的峰似乎更尖锐,其中滞留时间稍降0.1min成为8.31min(未示出),根据我们先前的发现结果,这表明结合亲和力增加。复合物通过IMP-291亲和色谱进一步纯化以移除κ链污染物。如所预期,共纯化出过量h679-AD2并在稍后通过制备型SE-HPLC移除(未示出)。
TF1是高度稳定的复合物。当测试TF1与HSG(IΜΡ-239)感测芯片的结合时,在样品注射结束时所观测到的反应并无明显下降。相反,当在类似条件下测试含有C-DDD1-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD1两者的等摩尔浓度混合物的溶液时,在样品注射期间和紧接其后观测到反应单位增加时伴随明显下降,表明最初形成的a2b结构不稳定。此外,尽管后续注射WI2使TF1的反应单位获得实质性增加,但C-DDD1/AD1并无明显增加。
由WI2与固定于感测芯片上的TF1结合引起的反应单位的额外增加与各自由N-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基促成的两个完全功能性结合位点相符。此由TF1结合WI2的两个Fab片段的能力所证实(未示出)。当通过BIAcore分析含有已还原并精确氧化成TF1的h679-AD2和N-DDD1-hMN14的混合物时,存在极少WI2的额外结合(未示出),表明二硫键稳定的a2b复合物(如TF1)可能仅通过DDD2与AD2的相互作用形成。
实施方法的两处改良以减少方法的时间和效率。首先,使用稍微摩尔过量的以a4/a2结构混合物形式存在的N-DDD2-Fab-hMN-14来与h679-Fab-AD2反应,以使得无游离h679-Fab-AD2残留并且未系栓于h679-Fab-AD2的任何a4/a2结构以及轻链将通过IMP-291亲和色谱移除。第二,用疏水性相互作用色谱(HIC)替代透析或渗滤作为还原后移除TCEP的手段,其将不仅减少方法时间,而且还增加潜在病毒移除步骤。混合N-DDD2-Fab-hMN-14与679-Fab-AD2并在室温下用5mM TCEP还原1小时。使溶液达到0.75M硫酸铵并接着加载至丁基FF HIC管柱上。管柱用0.75M硫酸铵、5mM EDTA、PBS洗涤以移除TCEP。还原的蛋白质用PBS从HIC管柱洗脱并使其达到10%DMSO。在室温下孵育过夜后,通过IMP-291亲和色谱分离高度纯化的TF1(未示出)。不需要如凝胶过滤等额外纯化步骤。
实施例3.产生TF2DNL构建体
通过使C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应获得三聚DNL构建体,命名为TF2。如下以>90%产率产生TF2的试验批次。将蛋白质L纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4:1摩尔比混合。总蛋白质浓度为于含1mM EDTA的PBS中1.5mg/ml。后续步骤包括TCEP还原、HIC色谱、DMSO氧化和IMP 291亲和色谱。添加TCEP前,SE-HPLC未显示任何a2b形成的迹象。添加5mM TCEP快速引起与针对二元结构预期的157kDa蛋白质一致的a2b复合物形成。通过IMP 291亲和色谱将TF2纯化至接近均质(未示出)。IMP 291是含有679Fab所结合的HSG半抗原的合成肽(Rossi等,2005,Clin Cancer Res 11:7122s-29s)。IMP 291未结合部分的SE-HPLC分析证明a4、a2和游离κ链从产物的移除(未示出)。
通过测定法测定TF2的功能性。将TF2、C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a2b复合物的对照样品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作未还原a2和b组分的对照样品)稀释至1μg/ml(总蛋白质)并流经固定有HSG的感测芯片。TF2的反应约为两个对照样品的反应的两倍,表明对照中仅h679-Fab-AD组分结合并保留于感测芯片上。后续注射hMN-14的抗个体基因型抗体WI2IgG证明,仅TF2具有与h679-Fab-AD紧密缔合的DDD-Fab-hMN-14组分,如另一信号反应所指示。由WI2与固定于感测芯片上的TF2结合引起的反应单位的额外增加与各自由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基促成的两个完全功能性结合位点相符。此由TF2结合WI2的两个Fab片段的能力所证实(未示出)。
实施例4.制造TF10双特异性抗体
使用类似方案产生包含两个拷贝C-DDD2-Fab-hPAM4和一个拷贝C-AD2-Fab-679的三聚TF10DNL构建体。TF10中的癌症靶向抗体组分是来源于hPAM4,其为已作为放射性MAb详细研究的人源化抗胰腺癌粘蛋白MAb(例如Gold等,Clin.Cancer Res.13:7380-7387,2007)。半抗原结合组分是来源于h679,其为人源化抗组氨酰基-琥珀酰基-甘氨酸(HSG)MAb。使用如上所述关于制造(抗CEA)2×抗HSGbsAb TF2所公开的方法制造TF10双特异性([hPAM4]2×h679)抗体。TF10带有两个人源化PAM4Fab和一个人源化679Fab。
在稳定转染的骨髓瘤细胞中独立地表达两个融合蛋白(hPAM4-DDD和h679-AD2)。组合组织培养上清液,得到两倍摩尔过量的hPAM4-DDD。反应混合物在室温下在使用1mM还原型谷胱甘肽的弱还原性条件下孵育24小时。还原后,DNL反应通过使用2mM氧化型谷胱甘肽弱氧化而完成。通过亲和色谱使用IMP 291-affigel树脂分离TF10,所述树脂以高特异性结合h679Fab。
熟练技术人员将认识到,可使用上文公开的DNL技术制造包含抗体、免疫偶联物、siRNA载体部分或可连接于AD或DDD部分的其它效应部分的任何组合的复合物。
实施例5.由多种抗体制造AD和DDD连接的Fab和IgG融合蛋白
使用前述实施例中描述的技术,构建表2中所示的IgG和Fab融合蛋白并且并入DNL构建体中。融合蛋白保留亲本抗体的抗原结合特征并且DNL构建体显示所并入抗体或抗体片段的抗原结合活性。
表2.包含IgG或Fab的融合蛋白
融合蛋白 | 结合特异性 |
C-AD1-Fab-h679 | HSG |
C-AD2-Fab-h679 | HSG |
C-(AD)2-Fab-h679 | HSG |
C-AD2-Fab-h734 | 铟-DTPA |
C-AD2-Fab-hA20 | CD20 |
C-AD2-Fab-hA20L | CD20 |
C-AD2-Fab-hL243 | HLA-DR |
C-AD2-Fab-hLL2 | CD22 |
N-AD2-Fab-hLL2 | CD22 |
C-AD2-IgG-hMN-14 | CEACAM5 |
C-AD2-IgG-hR1 | IGF-1R |
C-AD2-IgG-hRS7 | EGP-1 |
C-AD2-IgG-hPAM4 | MUC |
C-AD2-IgG-hLL 1 | CD74 |
C-DDD1-Fab-hMN-14 | CEACAM5 |
C-DDD2-Fab-hMN-14 | CEACAM5 |
C-DDD2-Fab-h679 | HSG |
C-DDD2-Fab-hA19 | CD19 |
C-DDD2-Fab-hA20 | CD20 |
C-DDD2-Fab-hAFP | AFP |
C-DDD2-Fab-hL243 | HLA-DR |
C-DDD2-Fab-hLL1 | CD74 |
C-DDD2-Fab-hLL2 | CD22 |
C-DDD2-Fab-hMN-3 | CEACAM6 |
C-DDD2-Fab-hMN-15 | CEACAM6 |
C-DDD2-Fab-hPAM4 | MUC |
C-DDD2-Fab-hR1 | IGF-1R |
C-DDD2-Fab-hRS7 | EGP-1 |
N-DDD2-Fab-hMN-14 | CEACAM5 |
实施例6.DNL的序列变体
在某些优选实施方案中,并入DNL构建体中的AD和DDD序列包含如上文所公开的AD1、AD2、AD3、DDD1、DDD2、DDD3或DDD3C的氨基酸序列。然而,在替代实施方案中,在DNL复合物的构建中可利用AD和/或DDD部分的序列变体。例如,人PKADDD序列仅存在四种变体,对应于PKA RIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分。RIIαDDD序列是上文公开的DDD1和DDD2的基础。四种人PKA DDD序列于下文示出。DDD序列代表RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。(应注意,DDD1的序列与人PKA RIIαDDD部分相比稍有改变。)
PKA RIα
SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK(SEQID NO:42)
PKA RIβ
SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHFEKLEKEENRQILA(SEQ ID NO:43)
PKA RIIα
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ(SEQ ID NO:44)
PKA RIIβ
SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER(SEQ ID NO:45)
已对AD和DDD结构域的结构功能关系进行了研究。(参见例如Burns-Hamuro等,2005,Protein Sci 14:2982-92;Carr等,2001,J BiolChem 276:17332-38;Alto等,2003,Proc Natl Acad Sci USA100:4445-50;Hundsrucker等,2006,Biochem J 396:297-306;Stokka等,2006,Biochem J 400:493-99;Gold等,2006,Mol Cell 24:383-95;Kinderman等,2006,Mol Cell 24:397-408,所述各文献的整个正文以引用的方式并入本文。)
例如,Kinderman等(2006)检查了AD-DDD结合相互作用的晶体结构并且得出结论,人DDD序列含有多个在二聚体形成或AKAP结合中重要的保守氨基酸残基,在下文SEQ ID NO:33中加下划线显示。(参见Kinderman等,2006的图1,以引用的方式并入本文。)熟练技术人员将认识到,在设计DDD序列的序列变体时,将希望避免改变任何加下划线残基,而对于二聚化和AKAP结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO:33)
Alto等(2003)对各种AKAP蛋白的AD序列进行了生物信息学分析以设计RII选择性AD序列,称为AKAP-IS(SEQ ID NO:35),对DDD的结合常数为0.4nM。AKAP-IS序列设计成AKAP与PKA结合的肽拮抗剂。AKAP-IS序列中取代倾向于使与DDD的结合减弱的残基在SEQ ID NO:35中加下划线显示。熟练技术人员将认识到,在设计AD序列的序列变体时,将希望避免改变任何加下划线残基,而对于DDD结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。
AKAP-IS序列
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:35)
Gold(2006)利用结晶学和肽筛选来开发SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO:46),显示对于PKA的RII亚型的选择性高达RI亚型的5个量级。加下划线的残基指示相对于AKAP-IS使得与RIIα的DDD部分的结合增强的氨基酸取代的位置。在此序列中,N-端Q残基编号为残基编号4并且C-端A残基为残基编号20。可进行取代以影响对于RIIα的亲和力的残基是残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等,2006)。预期在某些替代实施方案中,可用SuperAKAP-IS序列取代AKAP-IS AD部分序列来制备DNL构建体。可用来取代AKAP-ISAD序列的其它替代序列于SEQ ID NO:47-49中示出。相对于AKAP-IS序列的取代加下划线显示。预期如同SEQ ID NO:46中所示的AD2序列,AD部分还可包括额外N-端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C-端残基甘氨酸和半胱氨酸。
SuperAKAP-IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQID NO:46)
替代性AKAP序列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:47)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID N O:48)
QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:49)
Gold等的图2公开来自多种AKAP蛋白的其它DDD结合序列,如下所示。
RII特异性AKAPs
AKAP-KL
PLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQ ID NO:5O)
AKAP79
LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQ ID NO:51)
AKAP-Lbc
LIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQ ID NO:52)
RI特异性AKAPs
AKAPce
ALYQFADRFSELVISEAL(SEQ ID NO:53)
RIAD
LEQVANQLADQIIKEAT(SEQ ID NO:54)
PV38
FEELAWKIAKMIWSDVF(SEQ ID NO:55)
双重特异性AKAPs
AKAP7
ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQ ID NO:56)
MAP2D
TAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQ ID NO:57)
DAKAP1
QIKQAAFQLISQVILEAT(SEQ ID NO:58)
DAKAP2
LAWKIAKMIVSDVMQQ(SEQ ID NO:59)
Stokka等(2006)还开发了AKAP与PKA的结合的竞争剂,如SEQID NO:60-62中所示。肽拮抗剂命名为Ht31(SEQ ID NO:60)、RIAD(SEQ ID NO:61)和PV-38(SEQ ID NO:62)。Ht-31肽对于PKA的RII亚型显示较高亲和力,而RIAD和PV-38对于RI显示较高亲和力。
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQID NO:6O)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO:61)
PV-38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ IDNO:62)
Hundsrucker等(2006)开发了AKAP与PKA的结合的其它肽竞争剂,与PKA的RII形式的DDD的结合常数低至0.4nM。各种AKAP拮抗性肽的序列提供于Hundsrucker等的表1中,复制于下文表3中。AKAPIS代表一种合成RII亚基结合肽。所有其它肽都来源于所指定AKAP的RII结合结构域。
表3.AKAP肽序列
肽序列
AKAPIS QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:35)
AKAPIS-P QIEYLAKQIPDNAIQQA(SEQ ID NO:63)
Ht31 KGADLIEEAASRIVDAVIEQVKAAG(SEQ ID NO:64)
Ht31-P KGADLIEEAASRIPDAPIEQVKAAG(SEQ ID NO:65)
AKAP7δ-wt-pep PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO:66)
AKAP7δ-L304T-pep PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQID NO:67)
AKAP7δ-L308D-pep PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO:68)
AKAP7δ-P-pep PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY(SEQ ID NO:69)
AKAP7δ-PP-pep PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY(SEQ ID NO:70)
AKAP7δ-L314E-pep PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY(SEQ ID NO:71)
AKAP1-pep EEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA(SEQ ID NO:72)
AKAP2-pep LVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ(SEQ ID NO:73)
AKAP5-pep QYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL(SEQ ID NO:74)
AKAP9-pep LEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA(SEQ ID NO:75)
AKAP10-pep NTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA(SEQ ID NO:76)
AKAP11-pep VNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL(SEQ ID NO:77)
AKAP12-pep NGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF(SEQ ID NO:78)
AKAP14-pep TQDKNYEDELTQVALALVEDVINYA(SEQ ID NO:79)
Rab32-pep ETSAKDNINIEEAARFLVEKILVNH(SEQ ID NO:80)
在不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基在下文通过参考AKAP IS序列(SEQ ID NO:35)加下划线显示。残基与Alto等(2003)所观察到者相同,其中添加有C-端丙氨酸残基。(参见Hundsrucker等(2006)的图4,以引用的方式并入本文。)对于RII DDD序列具有极高亲和力的肽拮抗剂的序列为AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的序列。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:35)
Carr等(2001)检查了来自人和非人蛋白质的不同AKAP结合DDD序列之间序列同源性的程度,并且鉴别出DDD序列中似乎在不同DDD部分中最高度保守的残基。其在下文通过参考SEQ ID NO:33的人PKA RIIαDDD序列加下划线表示。特别保守的残基进一步以斜体表示。所述残基与由Kinderman等(2006)提出对于与AKAP蛋白结合来说重要的残基重叠但不相同。熟练技术人员将认识到,在设计DDD的序列变体时,最优选的是避免改变最保守的残基(斜体),并且优选还避免改变保守残基(加下划线),而既未加下划线也不是斜体的残基可考虑进行保守氨基酸取代。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO:33)
熟练技术人员将认识到,DNL构建体的抗体部分或连接子部分中的这些和其它氨基酸取代可用来增强所得DNL构建体的治疗和/或药物动力学性质。
实施例7.用于siRNA的抗体-树枝状聚合物DNL复合物
阳离子性聚合物,如基于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺或聚酰胺-胺(PAMAM)的树枝状聚合物,与核酸形成复合物。然而,其作为用于递送治疗性基因或siRNA的非病毒载体的潜在应用仍存在挑战。一种改良树枝状聚合物纳米粒子的选择性和效能的方法可通过与在结合靶细胞时内化的抗体偶联而达成。
我们合成并表征了一种新颖免疫偶联物,命名为E1-G5/2,其是通过DNL方法制备以包含一半第5代(G5)PAMAM树枝状聚合物(G5/2)位点特异性连接于来源于在结合至表达于各种实体肿瘤上的Trop-2抗原时快速内化的人源化抗体hRS7的Fab的稳定化二聚体。
方法
通过在弱氧化还原条件下组合两个自组装模块AD2-G5/2和hRS7-Fab-DDD2,接着在蛋白质L管柱上进行纯化来制备E1-G5/2。为制备AD2-G5/2,我们用马来酰亚胺基对AD2肽进行衍生化以与通过用胱胺核心还原G5PAMAM产生的单个硫醇反应,并且使用逆相HPLC来分离AD2-G5/2。我们在骨髓瘤细胞中将hRS7-Fab-DDD2制造为融合蛋白,如上文实施例中所述。
通过尺寸排阻HPLC、SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹分析E1-G5/2的分子大小、纯度和组成。通过与针对hRS7的抗个体基因型抗体的结合、凝胶阻滞测定和DNA酶保护测定来评估E1-G5/2的生物功能。
结果
通过尺寸排阻HPLC证实E1-G5/2由侧接有若干次要峰的主峰(>90%)组成。E1-G5/2的三个主要组分(Fd-DDD2、轻链和AD2-G5/2)通过还原性SDS-PAGE检测到并通过蛋白质免疫印迹得到证实。抗个体基因型结合分析揭示E1-G5/2含有一群不同大小的抗体-树枝状聚合物偶联物,均能够识别抗个体基因型抗体,因此表明所购得G5树枝状聚合物具有大小的结构变化性。凝胶阻滞测定显示E1-G5/2能够以6:1(+/-)的配料比最大程度地浓缩质粒DNA,其中所得树枝状聚合物复合物(dendriplex)完全保护所复合的DNA免遭DNA酶I降解。
结论
可使用DNL技术来建立可用抗体靶向的基于树枝状聚合物的纳米粒子。所述药剂作为用于在体外和体内应用的药物、质粒或siRNA的载体具有改良的性质。
实施例8.DNL树枝状聚合物的马来酰亚胺AD2偶联物
IMP 498(SEQ ID NO:35)
利用Protein Technologies PS3肽合成仪通过Fmoc方法在西伯尔酰胺树脂(Sieber Amide resin)上合成肽IMP 498直至并包括PEG部分(0.1mmol规模)。通过混合含二异丙基乙胺的β-马来酰亚胺基丙酸NHS酯和含树脂的DMF持续4小时手动添加马来酰亚胺。用15mLTFA、0.5mL H2O、0.5mL三异丙基硅烷和0.5mL硫代苯甲醚使肽从树脂裂解。通过逆相HPLC使用H2O/CH3CN TFA缓冲液纯化肽,冻干后获得约90mg纯化产物。
合成还原型G5树枝状聚合物(G5/2)
用0.1426TCEP.HCl 1:1MeOH/H2O(约4mL)还原2.03g7.03×10-6mol G-5树枝状聚合物(MeOH中10%,DendriticNanotechnologies)并且在室温下搅拌过夜。通过逆相HPLC在C-18管柱上用0.1%TFA H2O/CH3CN缓冲液洗脱对反应混合物进行纯化,冻干后获得0.0633g期望产物。
合成G5/2树枝状聚合物-AD2偶联物
将0.0469g(3.35×10-6mol)G5/2树枝状聚合物与0.0124g(4.4×10-6mol)IMP 498混合并溶解于1:1MeOH/1M NaHCO3中并且在室温下混合19小时,接着用0.0751g二硫苏糖醇和0.0441g TCEP HCl处理。溶液在室温下混合过夜并在C4逆相HPLC管柱上使用0.1%TFAH2O/CH3CN缓冲液纯化,根据凝胶电泳和蛋白质免疫印迹判断获得0.0033g含有偶联的AD2和树枝状聚合物的物质。
实施例9.使用连接鱼精蛋白的抗体靶向递送siRNA
概述
在临床前研究中已显示RNA干扰(RNAi)下调如HER2、VEGF、Raf-1、bcl-2、EGFR和众多其它蛋白质等各种蛋白质的表达。尽管RNAi具有沉默特定基因的潜能,RNAi的全部治疗潜能仍因缺乏用于在体内递送至靶细胞的有效递送系统而有待实现。
为解决此关键需要,我们开发了具有多个拷贝的人鱼精蛋白系栓于肿瘤靶向内化hRS7(抗Trop-2)抗体的新颖DNL构建体以供在体内靶向递送siRNA。制造包含截短人鱼精蛋白(thP1,人鱼精蛋白1的残基8至29)的DDD2-L-thP1模块,其中DDD2和thP1的序列分别融合于人源化抗体轻链的N-末端和C-末端(图1)。截短hP1(thP1)的序列在下文示出。如以上实施例中所述,DDD2-L-thP1与抗体hRS7-IgG-AD2在弱氧化还原条件下反应导致形成包含四个拷贝的thP1连接于hRS7重链的羧基端的E1-L-thP1复合物(图1)。
tHP1
RSQSRSRYYRQRQRSRRRRRRS(SEQ ID NO:81)
通过尺寸排阻HPLC和SDS-PAGE测定蛋白质A纯化后E1-L-thP1的纯度和分子完整性(未示出)。此外,通过凝胶迁移测定证明E1-L-thP1结合质粒DNA或siRNA的能力(图2)。E1-L-thP1有效结合短双链寡核苷酸(图2)和保护所结合的DNA免遭添加至样品中或存在于血清中的核酸酶消化(未示出)。
通过荧光显微术使用偶联FITC的siRNA和人Calu-3肺癌细胞系证实E1-L-thP1构建体使siRNA内化至表达Trop-2的癌细胞中的能力(图3)。
方法
采用DNL技术来产生E1-L-thP1(图1)。在骨髓瘤细胞中表达如以上实施例中所述构建的hRS7IgG-AD模块(图1A)并使用蛋白质A亲和色谱从培养物上清液纯化。DDD2-L-thP1模块(图1B)在骨髓瘤细胞中表达为融合蛋白并通过蛋白质L亲和色谱进行纯化。因为CH3-AD2-IgG模块具有两个AD2肽并且各自可结合DDD2二聚体,其中各DDD2单体连接于鱼精蛋白部分,所以所得E1-L-thP1偶联物包含四个鱼精蛋白基团(图1C)。E1-L-thP1由组分模块以接近定量产率形成并且用蛋白质A纯化至接近均质(未示出)。
使用蛋白质L亲和色谱纯化DDD2-L-thP1并通过尺寸排阻HPLC分析和还原与非还原条件下的SDS-PAGE进行测定(数据未示出)。在9.6min观测到主峰(未示出)。SDS-PAGE显示在还原性凝胶中主条带在30与40kDa之间,而在非还原性凝胶中主条带为约60kDa(指示DDD2-L-thP1的二聚体形式)(未示出)。蛋白质免疫印迹的结果证实在用抗DDD抗体探测时存在单体DDD2-L-tP1和二聚体DDD2-L-tP1(未示出)。
为制备E1-L-thP1,将hRS7-IgG-AD2与DDD2-L-thP1以大致相等的量组合并添加还原型谷胱甘肽(最终浓度1mM)。在室温下孵育过夜后,添加氧化型谷胱甘肽(最终浓度2mM)并再继续孵育24小时。通过蛋白质A管柱色谱从反应混合物纯化E1-L-thP1并用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5)洗脱。中和产物峰,浓缩,用PBS透析,过滤并在2至8℃下储存于含有5%甘油的PBS中。通过还原性SDS-PAGE证实E1-L-thP1的组成(未示出),显示存在所有三种组分(附接AD2的重链、DDD2-L-htP1和轻链)。
通过凝胶迁移测定评估DDD2-L-thP1(未示出)和E1-L-thP1(图2)结合DNA的能力。DDD2-L-thP1在摩尔比为6或更高时阻滞1%琼脂糖中500ng线性形式3-kb DNA的迁移(未示出)。图2示出E1-L-thP1在摩尔比为4或更高时阻滞2%琼脂糖中250ng线性200-bpDNA双链体的迁移(图2,泳道d-g),而在仅有hRS7-IgG-AD2时未观察到所述效应(图2,泳道a)。E1-L-thP1保护所结合DNA免遭内源性DNA酶和血清核酸酶降解的能力也得到证明(未示出)。
在表达Trop-2的ME-180子宫颈细胞系中检查E1-L-thP1促进所结合siRNA内化的能力(图3)。E1-L-thP1复合物的内化使用偶联FITC的山羊抗人抗体进行监测(图3,左下)。单独细胞不显示荧光(图3,左上)。单独添加经过FITC标记的siRNA导致siRNA最低程度的内化(图3,右上)。单独E1-L-thP1的内化在37℃下在60分钟内观察到(图3,左下)。E1-L-thP1能够有效促进所结合的偶联FITC的siRNA的内化(图3,右下)。将E1-L-thP1(10μg)与FITC-siRNA(300nM)混合并让其形成E1-L-thP1-siRNA复合物,接着添加至表达Trop-2的Calu-3细胞中。在37℃下孵育4小时后,通过荧光显微术检查细胞的siRNA内化(图3,右下)。
检验E1-L-thP1通过siRNA内化诱导细胞凋亡的能力(图4)。将E 1-L-thP1(10μg)与不同量的siRNA(AllStars Cell Death siRNA,Qiagen,Valencia,CA)混合。将E1-L-thP1-siRNA复合物添加至ME-180细胞中。孵育72小时后,细胞用胰蛋白酶处理并且进行膜联蛋白V染色(annexin V staining)以评估细胞凋亡(图4)。单独Cell Death siRNA或单独E1-L-thP1对细胞凋亡无影响(图4)。添加递增量的E1-L-thP1-siRNA导致细胞凋亡剂量依赖性增加(图4)。结果表明E1-L-thP1可有效将siRNA分子递送至细胞中并诱导靶细胞的细胞凋亡。
结论
DNL技术提供有效将多个鱼精蛋白分子系栓于抗Trop-2hRS7抗体从而产生新颖分子E1-L-thP1的模块化方法。
SDS-PAGE显示E1-L-thP1的均质性和纯度。DNA酶保护和凝胶迁移测定显示E1-L-thP1的DNA结合活性。E1-L-thP1同亲本hRS7抗体一样内化于细胞中并能够有效使siRNA分子内化至表达Trop-2的细胞中,如ME-180和Calu-3。
熟练技术人员将认识到,DNL技术并不限于任何特定抗体或siRNA物质。而是,可使用与本文所示相同的方法和组合物来制备包含任何抗体、任何siRNA载体和任何siRNA物质的靶向递送复合物。在靶向递送复合物中使用二价IgG将产生延长的循环半衰期和较高的对靶细胞的结合亲合性,从而使得吸收增加和功效改良。siRNA介导细胞死亡的此方法特别适于如胰腺癌等当前疗法无效的疾病。已知胰腺癌表达CEACAM6和CD74,这两者都与胰腺癌的侵袭力有关。已报导通过RNAi抑制CD74或CEACAM6的表达可阻止培养物和实验性动物中的肿瘤生长。
实施例10.使用针对CD74和CEACAM6的siRNA使胰腺癌发生细胞凋亡
针对CD74(sc-35023,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)和CEACAM6[有义链5'-CCGGACAGUUCCAUGUAUAdTdT-3'(SEQID NO:82)]的siRNA是从商业来源获得。将有义和反义siRNA溶解于30mM HEPES缓冲液中至20μΜ的最终浓度,加热至90℃维持1分钟并且在37℃下孵育60分钟以形成双链体siRNA。将双链体siRNA与E1-L-thP1混合并且与BxPC-3(CEACAM6-siRNA)和Capan2(CD74-siRNA)细胞一起孵育。24小时后,通过实时定量PCR分析测定相应蛋白质的mRNA的含量变化。通过蛋白质免疫印迹分析和免疫组织化学测定CD74和CEACAM6蛋白的水平。对照包括非特异性siRNA和非靶向DNL复合物20-L-thP1,其含有人源化抗CD20抗体(hA20)。
使用产克隆测定法对CD74和CEACAM6表达减少对胰腺癌细胞生长的影响进行测定。涂铺约1×103个BxPC-3细胞并用携带CEACAM6-siRNA的E1-L-thP1处理。每3-4天更换培养基并且在14天后将群落用4%三聚甲醛溶液固定,用0.5%台盼蓝(trypan blue)染色并进行计数。使用携带CD74-siRNA的E1-L-thP1对Capan2细胞进行类似实验。测定携带CEACAM6-siRNA和CD74-siRNA两者的E1-L-thP1对抑制BxPC-3和Capan2细胞生长的影响。通过MTS测定对细胞增殖进行检测。
在雌性无胸腺nu/nu小鼠(5周龄,体重18-20g)中建立两个异种移植物模型。皮下模型具有BxPC-3(ATCC No.CRL-1687)和Capan2(ATCC No.HTB-80)植入各动物的相对侧腹,一旦肿瘤达到50mm3,即起始处理。正位模型仅带有BxPC-3细胞并且在植入后2周开始处理。
对于皮下模型,评估E1-L-thP1递送CEACAM6-siRNA与CD74-siRNA的混合物的功效并且与E1-L-thP1个别地递送CEACAM6-siRNA、CD74-siRNA或对照siRNA的功效进行比较。其它对照为盐水并且使用20-L-thP1替代E1-L-thP1来递送特异性siRNA和对照siRNA。剂量、时程和施用为按siRNA计150μg/kg、每周两次持续6周和通过尾静脉注射(表4)。细胞于组织培养物中扩增,利用胰蛋白酶/EDTA收集,并且用基质胶再混悬(1∶1)以于300μL中递送5×106个细胞。
每天监测动物的毒性迹象并且每周称重两次。每周测量肿瘤尺寸并且计算肿瘤体积。
如下建立正位模型。简单地说,麻醉裸小鼠并且制造左侧腹切口。用镊子取出脾和附着的胰腺。接着将50μL BxPC-3细胞混悬液(2×106个细胞)注射至胰腺中。将脾和胰腺放回腹腔中并闭合切口。植入两周后开始疗法。小鼠用与皮下模型相同的给药时程和途径以结合于E1-L-thP 1或20-L-thP 1的CEACAM6-siRNA或对照siRNA全身性处理。每天检测动物并且每周称重。
表4.具有双重肿瘤的皮下模型
研究结果表明,CEACAM6和CD74siRNA均通过E1-L-thP1DNL构建体内化至胰腺癌细胞中并且诱导胰腺癌的细胞凋亡,而具有非靶向抗CD20抗体的对照DNL构建体未能诱导siRNA吸收和癌细胞死亡。
***
本领域的技术人员显而易知,可对本发明的产物、组合物、方法和过程进行各种修改和变更。因此,意欲本发明涵盖所述修改和变更,只要其属于随附权利要求书和其均等物的范围内。
Claims (39)
1.一种靶向递送复合物,其包含:
a)连接于一个或多个来自AKAP蛋白的锚定结构域(AD)部分或与一个或多个来自蛋白激酶A(PKA)的二聚化与对接结构域(DDD)部分的抗体或其抗原结合片段;和
b)一个或多个siRNA载体部分,各siRNA载体连接于来自PKA的DDD部分或来自AKAP蛋白的AD部分;
其中两个拷贝的所述DDD部分形成二聚体并且结合所述AD部分以形成所述靶向递送复合物,并且其中当所述抗体或片段连接于一个或多个AD部分时,所述siRNA载体连接于DDD部分,或当所述抗体或片段连接于一个或多个DDD部分时,所述siRNA载体连接于AD部分。
2.根据权利要求1所述的靶向递送复合物,其进一步包含一个或多个siRNA。
3.根据权利要求1所述的靶向递送复合物,其进一步包含一个或多个反义寡核苷酸。
4.根据权利要求1所述的靶向递送复合物,其进一步包含一个或多个DNA基因。
5.根据权利要求2所述的靶向递送复合物,其中所述靶向递送复合物包含至少两个不同的siRNA。
6.根据权利要求1所述的靶向递送复合物,其中所述siRNA载体部分选自由以下组成的组:树枝状聚合物、鱼精蛋白、组蛋白、含组氨酸的可还原聚阳离子、阳离子性梳型共聚物、壳聚糖-硫胺素焦磷酸盐、聚乙烯亚胺和聚赖氨酸。
7.根据权利要求6所述的靶向递送复合物,其中所述树枝状聚合物包括选自由以下组成的组的聚合物:PAMAM、聚赖氨酸、聚丙烯亚胺、聚乙烯亚胺、聚乙二醇和碳硅烷。
8.根据权利要求1所述的靶向递送复合物,其中所述siRNA载体部分包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的靶向递送复合物,其中所述AD部分具有选自由以下组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80。
10.根据权利要求1所述的靶向递送复合物,其中所述DDD部分具有选自由以下组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。
11.根据权利要求2所述的靶向递送复合物,其中所述siRNA具有选自由以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:82。
12.一种递送siRNA、反义寡核苷酸或DNA基因的方法,其包括:
a)获得根据权利要求1所述的靶向递送复合物;
b)将至少一个siRNA、反义寡核苷酸或DNA基因连接于所述复合物;和
c)将所述靶向递送复合物施用至受试者。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述siRNA或反义寡核苷酸抑制疾病相关基因的表达。
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述siRNA或反义寡核苷酸抑制癌症相关基因的表达。
15.根据权利要求12所述的方法,其中所述靶向递送复合物包含至少两个不同的siRNA。
16.根据权利要求12所述的方法,其中所述siRNA载体部分选自由以下组成的组:树枝状聚合物、鱼精蛋白、组蛋白、含组氨酸的可还原聚阳离子、阳离子性梳型共聚物、壳聚糖-硫胺素焦磷酸盐、聚乙烯亚胺和聚赖氨酸。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述树枝状聚合物包括选自由以下组成的组的聚合物:PAMAM、聚赖氨酸、聚丙烯亚胺、聚乙烯亚胺、聚乙二醇和碳硅烷。
18.根据权利要求12所述的方法,其中所述siRNA载体部分包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
19.根据权利要求12所述的方法,其中所述AD部分具有选自由以下组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79和SEQ IDNO:80。
20.根据权利要求12所述的方法,其中所述DDD部分具有选自由以下组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。
21.根据权利要求12所述的方法,其中所述siRNA具有选自由以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:82。
22.一种治疗疾病的方法,其包括:
a)获得根据权利要求1所述的靶向递送复合物;
b)将至少一个siRNA、反义寡核苷酸或DNA基因连接于所述复合物;和
c)将所述靶向递送复合物施用至受试者。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述靶向递送复合物包含至少两个不同的siRNA。
24.根据权利要求22所述的方法,其中所述siRNA载体部分选自由以下组成的组:树枝状聚合物、鱼精蛋白、组蛋白、含组氨酸的可还原聚阳离子、阳离子性梳型共聚物、壳聚糖-硫胺素焦磷酸盐、聚乙烯亚胺和聚赖氨酸。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述树枝状聚合物包括选自由以下组成的组的聚合物:PAMAM、聚赖氨酸、聚丙烯亚胺、聚乙烯亚胺、聚乙二醇和碳硅烷。
26.根据权利要求22所述的方法,其中所述siRNA载体部分包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
27.根据权利要求22所述的方法,其中所述AD部分具有选自由以下组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79和SEQ IDNO:80。
28.根据权利要求22所述的方法,其中所述DDD部分具有选自由以下组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。
29.根据权利要求22所述的方法,其中所述siRNA具有选自由以下组成的组的核酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:82。
30.根据权利要求22所述的方法,其中所述疾病选自由以下组成的组:癌症、自体免疫性疾病、免疫功能障碍、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反应、炎症、感染性疾病、心脏病和神经疾病。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述癌症选自由以下组成的组:非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)、B细胞急性淋巴性白血病、B细胞慢性淋巴性白血病、伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom′smacroglobulinemia)、癌瘤、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤、皮肤癌、口腔癌、结肠癌、胃癌、结肠癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、肾癌和睾丸癌。
32.根据权利要求30所述的方法,其中所述自体免疫性疾病选自由以下组成的组:急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham′s chorea)、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合症、大疱性类天包疮、糖尿病、亨诺克-斯奇赖恩紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎(Takayasu′sarteritis)、艾迪生氏病(Addison′s disease)、类风湿性关节炎、多发性硬化症、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘综合症(Goodpasture′s syndrome)、血管闭塞性脉管炎、休格伦氏综合症(Sjogren′s syndrome)、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、甲状腺素症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣和纤维性肺泡炎。
33.根据权利要求22所述的方法,其中所述疾病是癌症并且所述抗体结合选自由以下组成的组的抗原:碳酸酐酶IX、α-胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GROB、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、HER2/neu、HMGB-1、低氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、粘蛋白、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、IGF、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、肌腱蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原(Thomson-Friedenreichantigens)、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤维连接蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET和致癌基因产物。
34.根据权利要求22所述的方法,其中所述疾病是癌症并且所述抗体选自由以下组成的组:hR1(抗IGF-1R)、hPAM4(抗粘蛋白)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、hMu-9(抗CSAp)、hL243(抗HLA-DR)、hMN-14(抗CEACAM5)、hMN-15(抗CEACAM6)、hRS7(抗Trop-2)、hMN-3(抗CEACAM6)、Ab124(抗CXCR4)和AM125(抗CXCR4)。
35.根据权利要求22所述的方法,其进一步包括向所述受试者施用至少一种治疗剂。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述治疗剂是在所述靶向递送复合物之前、与所述靶向递送复合物同时或在所述靶向递送复合物之后施用。
37.根据权利要求35所述的方法,其中所述治疗剂选自由以下组成的组:放射性核素、化学治疗药物、毒素、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、光敏治疗剂、抗血管生成剂和促细胞凋亡剂。
38.一种药物组合物,其包含根据权利要求1所述的靶向递送复合物。
39.一种试剂盒,其包含根据权利要求1所述的靶向递送复合物。
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