CN102660464B - 一种富油海洋微藻及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种富油海洋微藻藻株及应用，微拟球藻HH-1（Nannochloropsis gaditana），保藏编号为CCTCC NO:M2012091。本发明筛选出的耐低pH的富油海洋微藻，可在pH=4.5的环境下正常生长，其油脂含量可达35%，为耦合电厂废气进行生物柴油的开发提供了一个新型藻株，具有很好的应用前景。

Description

一种富油海洋微藻及其应用
技术领域
本发明属于海洋微藻筛选应用技术领域，具体涉及一种富油海洋微藻及其应用，具体涉及一株海洋微拟球藻（Nannochloropsis sp.HH-1）及其耦合电厂废气进行生物柴油开发的应用。
背景技术
近年来，由于全球石化燃料消费量激增，石化储量的减少，引起了世界范围内的能源危机，再加上石化燃料燃烧排放二氧化碳带来的环境问题，因此，寻找一种廉价的绿色可再生能源已成为世界各国政府以及民众广泛关注的科学与社会问题。生物质能作为一类重要清洁能源，其能源蕴藏量和消费量居于当前可再生能源的首位，为我们解决所面临的问题提供了有效的途径。其中生物柴油是最具发展潜力的生物质能利用形式之一，尤其是使用生物柴油可减少温室气体、有害气体的排放，使之应用前景更为广阔。生物柴油的原料多为含油脂较高的油料作物，但07年9月国家发改委发布《可再生能源中长期发展规划》，指出发展可再生能源“不得占用耕地，不得大量消耗粮食，不得破坏生态环境”，这“三不得”原则进一步指明了我国未来生物质能发展的方向，即重点支持以非粮作物来源的生物质能源的发展，这时，海洋微藻显示出其作为生物质能供应原料的独特优势。
海洋微藻因具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、不受气候限制，易于实现大规模生产等优点，目前已经成为海洋生物质能研究的热点，其培养可根据藻细胞特性在盐碱地进行封闭或开放式培养，不占用农用耕地；相对于淡水微藻，海洋微藻的生物多样性更为丰富，其中不乏高油脂含量的优良藻种，特别是利用海水进行培养，不消耗淡水资源的特点，使海洋微藻生物质能更具开发潜力。此外，利用海洋微藻开发生物能源还有另一个优势，海洋藻类可以通过光合作用利用废气（CO2、NOx）和废水，不仅达到CO2减排目的，而且可以通过废水废气利用降低生产成本，具有商业化减排开发的可行性。
国外开展微藻生物能源的开发研究较早，美国在1978年就启动了耗资2500万美元由美国国家可再生能源实验室（NREL）运作的水生物种项目。目前，NREL已从海洋和湖泊中分离到3000多种藻类，从中筛选出生长快、含油高的包括硅藻、绿藻和蓝藻等藻种300多种。现在，国外多家科研机构和能源单位开展了化石燃料产生的废气生产高含脂微藻。2004年以色列锡姆生物公司开发出一项新技术，利用发电厂排放的CO2养殖海藻，进而从中制取生物燃料。美国亚历桑那公用服务公司(APS)在美国能源部国家能源技术实验室(NETL)的支持下，开发了一体化能源流程，该流程组合了从煤产生代用天然气(SNG)、联产生物燃料和发电，并实现了CO2接近零排放。国内在海洋微藻耦合废气进行规模化培养方面还没有开展。目前，主要的问题是缺少能够在废气中生长的藻株。
发明内容
本发明的目的是提供一种富油海洋微藻及其应用，即从海洋中分离筛选到一株耐低pH的海洋微拟球藻（Nannochloropsis sp.HH-1）及其作为耦合电厂废气进行生物质能开发的应用，从而弥补现有技术的不足。
本发明一个方面涉及一种微拟球藻HH-1（Nannochloropsis gaditanaHH-1），已于2012年3月27日保藏于位于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2012091。
本发明另一个方面涉及微拟球藻HH-1的应用，即耦合电厂废气进行生物柴油的生产。
本发明筛选出一株耐低pH的富油海洋微藻，可在pH=4.5的环境下正常生长，其油脂含量可达35%，为耦合电厂废气进行生物柴油的开发提供一新型藻株。
附图说明
图1：本发明微拟球藻HH-1（Nannochloropsis gaditana HH-1）生长曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明。
一、微拟球藻HH-1（Nannochloropsis sp.）的筛选及理化性质
1、微拟球藻HH-1（Nannochloropsis sp.）的筛选
将取自青岛石老人海水浴场排污口处的海水样品，在倒置显微镜下用毛细管挑离单个藻细胞后，放于96孔板中培养，培养所用到的培养基为f/2培养基(Guillard and Ryther 1962,Guillard 1975)。f/2培养基每L过滤灭菌海水中,加入以下成分：
  成分   储备液   加入量
  NaNO3   75g/L dH2O   1mL
  NaH2PO4·H2O   5g/L dH2O   1mL
  微量元素   见(1)   1mL
  维生素   见(2)   0.5mL
(1)微量元素储备液（以下成分定容到1L dH2O中）
  成分   初始储备液   加入量
  FeCl3·6H2O   ---   3.15g
  Na2EDTA·2H2O   ---   4.36g
  CuSO4·5H2O   9.8g/L dH2O   1mL
  Na2MoO4·2H2O   6.3g/L dH2O   1mL
  ZnSO4·7H2O   22.0g/L dH2O   1mL
  CoCl2·6H2O   10.0g/L dH2O   1mL
  MnCl2·4H2O   180.0g/L dH2O   1mL
(2)维生素储备液（以下成分定容到1L dH2O中）
  成分   初始储备液   加入量
  维生素B1(vit.B1)   ---   200mg
  维生素H(vit.H)   0.1g/L dH2O   10mL
  维生素B12(vit.B12)   1.0g/L dH2O   1mL
所述的分离方法为：低pH筛选，设置pH梯度(pH=3,pH=4,pH=5,pH=6),所述的培养条件为：f/2培养基，温度24±1℃，光照强度6000-8000Lux，光暗比14h:10h，每天定时摇动两次。所述的培养用海水经0.45μm的混合纤维滤膜抽滤，及培养容器10%盐酸浸泡、蒸馏水冲洗后均121℃高压灭菌20min，冷却备用。通过低ph筛选和油脂含量检测，筛选到1株耐低pH的海洋微藻——微拟球藻藻株,已于2012年3月27日保藏于位于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2012091。本发明筛选的藻株可在盐度10-30%，温度15-30℃范围内生长（图1）。
2、微拟球藻HH-1的总脂分析
培养微藻至平台期后第三天收集藻液，将冷冻干燥的藻粉称取一定重量（m），液氮研磨，加入甲醇-氯仿的混合溶剂（V:V，2：1），超声5min混匀，离心分离15min，残渣再加1.5ml甲醇-氯仿的混合溶剂（V:V，2：1），离心分离，保留有机相，上述过程重复2次。合并有机相提取液转移到分液漏斗，加入2.5ml氯仿和3.0ml 1%氯化钠溶液，混匀，静置分层，回收下层；加2.5ml氯仿于原上、中层溶液中再萃取一次，合并下层液，上述过程重复一此；合并下层液，置于提脂瓶中（m1），50℃氮气挥干溶剂至恒重，于天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量（m2）。
重量法计算总脂类的含量
ω = m 2 - m 1 m × 100 % 式中
ω---------------脂类质量分数，%；
m---------------试样质量，g;
m1-------------提脂瓶质量，g;
m2-------------提脂瓶与样品所含总脂质量，g;
本发明所得结果为在pH=6的培养基中微拟球藻（Nannochloropsissp.HH-1）油脂产率为0.175g/L·day-1，与其他类微藻相比，能够耐受低pH且油脂含量最高。
表1微拟球藻HH-1总脂含量
Figure BDA00001653055600042
3、脂肪酸分析：
培养容器为容积3000mL的广口瓶，培养体积2000mL。
所述的培养条件为：f/2培养基，温度25±1℃，光照强度6000-8000Lux，光暗比14h∶10h，每天定时摇动两次。
所述的培养用海水经0.45μm的混合纤维滤膜抽滤，及培养容器10%盐酸浸泡、蒸馏水冲洗后均121℃高压灭菌20min，冷却备用。
所述的脂肪酸成分分析方法为：将上述粗脂样品中加入5mL 0.4mol·L-1KOH-CH3OH溶液，60℃水域加热皂化60min（至油珠完全消失）。冷却后，移入离心管中，加入盐酸-甲醇(1:9)溶液4.0ml，混匀，充氮气保护，在60℃水浴甲酯化20min，每隔10min振荡一次；将甲酯化好的样品冷却后加入饱和食盐水3.0ml，加入正己烷1.0ml，充分振荡，静置，取正己烷层用无水硫酸钠脱水后进行GC/MS检测。结果表明HH-1基本上包含了C14:0、C16:0、C17:0、C18:1、和C20:5等脂肪酸，且含量均较高。
表2微拟球藻（Nannochloropsis sp.HH-1）藻株主要脂肪酸组成
Figure BDA00001653055600051
二、微拟球藻HH-1（Nannochloropsis sp.）的应用
首先对本发明筛选到的微拟球藻HH-1进行逐级扩大培养，培养条件为：f/2培养基，温度25±1℃，光照强度6000-8000Lux，光暗比14h∶10h，每天定时摇动两次。
然后再将扩大培养的藻放入初级扩大池中进行初级扩大。
将初级扩大培养的藻放于跑道池中规模化养殖,通入电厂废气，用pH自动控制仪调控池中pH。
培养微藻至平台期后，用重量法测定藻的总脂含量，通过测定有机碳含量确定CO2吸收能力。
结果表明，该藻株通过耦合电厂废气进行规模化养殖，总脂含量可达40%（干重）；CO2吸收能力不低于120g·m-2·d-1；油脂产率不低于30g·m-2·d-1。
上述结果表明本发明筛选到的微拟球藻HH-1能够有效的耦合电厂废气进行生物柴油的生产，具有很好的应用前景。

Claims (2)

1.一种微拟球藻，其保藏编号为CCTCC NO: M 2012091。
2.权利要求1所述的微拟球藻的应用，是耦合电厂废气进行生物柴油的生产。
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