CN102655878A - 舌上疫苗和施用器 - Google Patents

Abstract

使用固体和半固体制剂将疫苗舌上给予动物。通过舌上施用器递送包含分散在固体或半固体基质或糊中的抗原的制剂。设计舌上施用器使得在疫苗递送期间将含有抗原的基质直接放在舌背侧面。在暴露于唾液和暴露于舌的吮吸和/或舔舐动作时，基质溶解并将抗原释放到舌上。在一些实施方案中，抗原是病毒，例如能够感染舌细胞的减毒病毒，例如感染舌基细胞的犬细小病毒。舌上施用器尤其可用于将疫苗递送给新生动物。

Description

舌上疫苗和施用器

发明背景

本发明涉及将疫苗给予动物甚至新生动物的方法、组合物和装置。具体来讲，本发明提供固体和半固体含有抗原的疫苗制剂，使用呈“棒棒糖样”或类似设计的舌上施用器给予所述疫苗制剂。通过动物吮吸或舔舐施用器而舌上递送抗原。

发明背景

犬细小病毒(CPV)是狗的头号杀手。新生幼犬通过用哺育母犬初乳中传给幼犬的抗体哺育(尤其是生命头两天内)而获得针对CPV的被动免疫。对于包括狗在内的许多哺乳动物，由初乳提供的被动免疫在约第5周龄的某个时候失去其保护作用。因此，建议在第6周开始接种以提供幼犬注射的效力。然而，现行幼犬接种系统的一个问题是，早期注射(例如相隔2周给予3-4次注射)常常不会立即诱导主动保护性免疫应答。直到已给予一系列注射(例如在6、9、12和15周)的大多数或全部，保护性免疫应答才可呈现。遗憾的是，幼犬因CPV所致的最高死亡率(80％)是在8周龄，此时母犬的抗体逐渐减少，而幼犬还未建立其自身的主动免疫。CPV感染的这个易感期出现在约7周龄至约11周龄，并且与高CPV相关死亡率相关联。

一个简单答案可能是更早给幼犬接种。然而，但已经证实这是有问题的，因为由母犬提供的抗体还中和现有市售疫苗制品中的CPV，因此在例如2周或3周接种的幼犬不独立地诱导主动免疫应答。在诸如猫和甚至人等其它物种中也观察到母体抗体干扰现象。

发明概述

本发明提供将疫苗舌上给予(即给予至舌表面)哺乳动物的组合物、装置、方法和方案。按照本发明的一个实施方案，通过舌上施用器将抗原递送或施用于舌背侧面，所述施用器通常包含含有一种或多种目标抗原的固体或半固体基质(其可原位胶化或固化)。与舌的唾液接触时，以及受吮吸或舔舐动作促进，基质溶解并释放包覆或部分包覆舌背侧面的抗原。在一些实施方案中，利用新生儿的先天吮吸反射，使用舌上施用器给新生哺乳动物接种。在某些实施方案中，本发明的施用器/装置可以是手持的。在其它实施方案中，施用器/装置可以是悬挂的。在一些实施方案中，舌上施用器将病毒递送到动物舌上，而在具体实施方案中，病毒可以是感染舌基细胞的减毒病毒。

本发明提供一种免疫动物的方法，所述方法包括将至少一种抗原舌上给予动物的步骤。在一个实施方案中，至少一种抗原是减毒病毒，例如感染动物舌细胞的减毒病毒或感染动物舌基细胞的减毒病毒。在一个实施方案中，减毒病毒是犬细小病毒(CPV)。在其它实施方案中，减毒病毒选自口蹄疫病毒、猫杯状病毒、猫泛白细胞减少症病毒和猫细小病毒。在本发明的一个实施方案中，对减毒病毒进行遗传改造以提呈对动物中的一种或多种感染物有特异性的一种或多种抗原。

在该方法的一个实施方案中，舌上给予的步骤包括以制剂形式将至少一种抗原提呈给动物，所述制剂包含具有至少一种抗原分散在固体基质中和具有研磨材料分散在固体基质中的固体基质。在一些实施方案中，舌上给予的步骤包括使动物的舌与固体基质接触选自以下的一段时间的步骤：1分钟、2分钟、3分钟、4分钟和5分钟。

在另一个实施方案中，舌上给予的步骤在数周时间内进行多次。

在又一实施方案中，动物为新生儿，而在一些情况下，舌上给予的步骤在新生儿出生后并且在首次供给新生儿母体初乳前立即进行。在另一些实施方案中，进行舌上给予的步骤后，不允许新生儿吃奶一段时间。

本发明还提供一种用于舌上递送给动物的免疫原性制剂，所述免疫原性制剂包含：基质；和分散在基质中的至少一种抗原。在一些实施方案中，基质是固体；而在一些实施方案中，研磨材料分散在基质中。

在免疫原性制剂的一个实施方案中，至少一种抗原是减毒病毒，例如感染动物舌细胞的减毒病毒或感染动物舌基细胞的减毒病毒。在一个实施方案中，减毒病毒是犬细小病毒(CPV)。在其它实施方案中，减毒病毒选自口蹄疫病毒、猫杯状病毒、猫泛白细胞减少症病毒和猫细小病毒。在本发明的一个实施方案中，对减毒病毒进行遗传改造以提呈对动物中的一种或多种感染物有特异性的一种或多种抗原。

本发明还提供一种用于将免疫原性组合物给予幼犬的舌上施用器。舌上施用器包括：至少包括基质的基材；和分散在基质中的至少一种抗原。在一些实施方案中，基质是固体，该基质可包含分散在其中的研磨材料。在舌上施用器的一些实施方案中，至少一种抗原是减毒病毒，例如选自以下的病毒：CPV、口蹄疫病毒、猫杯状病毒、猫泛白细胞减少症病毒和猫细小病毒。在其它实施方案中，舌上施用器包括位于基质的一个表面上的保护板。

附图简述

图1.幼犬舌纵剖面示意图。

图2A-G.示例性疫苗递送施用器。A，保持结构10与固体制剂球12连接的舌上施用器，固体制剂球12具有掺入制剂13的研磨颗粒；B，具有带硬毛(例如丝瓜络(Luffa bristle))14的保持结构10的递送载体的剖视图，硬毛14从包覆有固体制剂12的支座15上伸出；C，包覆有固体制剂12的指套16的外观图，固体制剂12包含研磨颗粒13；D，“安抚奶嘴”的剖视图，其具有支承结构17和包覆有含研磨颗粒13的固体制剂12的邻接或连接支座18；E，“安抚奶嘴”侧视图，其具有带含研磨颗粒13的连接的固体制剂12的支承结构17；F，具有研磨“齿”的舌上施用器的剖视图；G，具有研磨“凸起”或“块”的舌上施用器的剖视图。在一些实施方案中，抗原也存在于或仅存在于凸起或块上。

图3A-C.递送本发明疫苗制剂的装置的不同实施方案的示意图。A，包括保持结构10和基质12的舌上施用器的“顶”面的示图，其不与舌接触；B，具有保持结构10和基质12的舌上施用器的侧视图；C，舌上施用器“底”面(其与舌接触)及保持结构10和基质12的示图，并具有呈网格形式的沟槽19。

图4A-G.递送本发明疫苗制剂的装置的不同实施方案的示意图。A，显示各表面的基质的示图：B，椭圆形舌上施用器；C，矩形舌上施用器；D，圆锥形舌上施用器；E，大致为正方形的舌上施用器；F，仿形舌上施用器；G，具有基质20和保持结构10的舌上施用器的侧视图。

图5A-D.本发明的示例性实施方案。A，分层基质；B，具有支座或背衬的基质；C，有保护板覆盖基质的舌上施用器；D，示例性舔砖(lick block)。

图6A-D.舌上施用器的有孔实施方案。A，具有垂直通道的基质；B，具有多种不同形状的通道的基质；C和D，具有在基质一面开口的通道[C]和整个穿过基质的通道(D)的基质的实施方案。手柄90通过铰链91连接。

图7A和B.给予疫苗的示例性方案。A，出生时开始；B，在4周开始。LP＝舌上施用器。

图8A和B.A，猫舌示意图，显示丝状乳头具有产生于尾突的尾部定向的角化棘；100＝固有层；101＝支承前乳头(rosta papilla)；B，狗舌示意图，显示丝状乳头具有尾部定向的顶端；200＝顶端；201＝固有层。

图9.饼形图，显示在已研究的提交案例中CPV在舌与肠中的分布。

图10.感染CPV的狗舌中的示例性荧光，其表示基细胞中病毒的存在情况。中心圆形凸起区域为味蕾。

发明详述

本发明提供给哺乳动物舌上施用或给予疫苗的组合物、装置和方法。按照本发明的一个实施方案，通过舌上施用器将抗原递送至舌表面(例如背侧面)，该舌上施用器包括含有一种或多种目标疫苗抗原的固体或半固体基质载体。舌上施用器可为一次性的。舌的吮吸和/或舔舐动作以及与唾液的接触溶解基质，从而将抗原释放到舌上。舌和口的强有力的咀嚼肌发力，并因此在基质和舌之间产生摩擦，这有助于递送疫苗抗原。由于哺乳动物在很小的时候(例如刚出生后)便具有先天的天然吮吸能力，因此甚至可使用本发明的舌上疫苗施用器将疫苗抗原安全有效地递送给新生儿。这种强的吮吸反射还趋于夹住基质，使之保持适当位置。而且，固体和半固体施用器不会出现像口服滴剂/液体剂一样可能发生的吸入风险。动物的主人在不需要使用注射器或其它疫苗递送器的情况下，便可以容易的方式将疫苗递送给动物。因此，舌上递送有助于与接种方案的顺应性，尤其在产后必须立即给予的围产期疫苗，例如在可能缺乏兽医和医疗服务的地方。

在一个实施方案中，方法用来给哺乳动物接种针对能够感染一种或多种舌细胞(例如基细胞或其它舌中和舌周围的靶组织)的病毒的疫苗，即使舌可能不是感染的主要部位，舌感染可能因此不引起明显的感染症状。这种类型的示例性病毒是CPV。感染舌的其它无包膜病毒包括引起牛口蹄疫的病毒和猫杯状病毒。在这个实施方案中，以将减毒病毒直接递送至疫苗接受者舌背(例如在舌/口基细胞或其它靶组织上或附近)的方式，给予疫苗制剂。为此，将舌上疫苗施用器放入动物口内，使得施用器的含减毒病毒的基质部分与动物舌背侧面直接接触。该实施方案甚至可用于新生儿，并且在动物刚出生时，基质与上腭同时接触引出先天吮吸反射，舌肌借此以溶解基质且从制剂中机械性释放病毒的方式卷曲。施用器的形状可随动物种类、品种、动物的大小、口形等而变化。可通过利用模具(例如烧石膏、硬塑料等)设计合适的施用器用于不同类型、大小、年龄等的动物。

虽不受理论束缚，但仍认为在这个实施方案中，舌上疫苗递送的机制如下：通过吮吸、舔舐等从施用器基质释放的病毒通过感染舌胚层而转运，并被舌的免疫细胞吸收。舌中的淋巴细胞启动免疫应答。在一个实施方案中，舌的基细胞被病毒感染，并建立抗原库(例如病毒库)。随时间推移(如果疫苗接受者是新生儿则从非常小的年龄起)，分裂的基细胞逐渐不断地释放病毒和/或病毒抗原到周围组织中。在舌上接种的新生儿中，病毒感染最初受到抑制，且由于所释放的病毒被循环的母体抗体中和而局限于基细胞。然而，母体抗体随时间消退，年幼动物的免疫系统逐渐变为主动免疫，并接替抗体产生。由于在整个这种转换过程中病毒从基细胞库的释放继续进行，细小病毒感染的这种低水平的缓慢释出(smoldering)持续存在，且在早期，动物的成熟免疫系统逐渐产生对病毒的主动免疫应答。因此，本发明提供一种给新生儿接种的方法，该方法使母体抗体起作用的时间与新生儿自身免疫系统有能力产生保护性主动免疫应答的时间之间的间歇连接起来，即使这些时期重叠。这种观点与以下出人意料的观察结果一致：在CPV感染的动物中，病毒不仅位于肠和其它可预测的消化道部位(例如食管)，而且还预料不到地存在于舌的基底层中。该研究结果详述于实施例1。图1表示舌内层(包括基细胞)的侧视图。

定义

给不同类型的疫苗下定义将是有用的。

胃肠外疫苗传统上是最普遍的疫苗类型，其借助针和注射器经皮下或肌内或真皮内给予。疫苗制剂通常呈溶液或液体形式。已经使用这些疫苗200多年(Edward Jenner于1796提出)，一些疫苗一直有效。最成功的疫苗之一是天花疫苗，其通过放泄针在皮肤上递送。因为痘病毒是嗜皮性病毒，所以正确的免疫应答类型提供稳定的终身免疫。通过胃肠外途径给予的大多数针对粘膜感染的疫苗可能不诱导正确的免疫应答类型。因此，这些疫苗有时无效。而且，在许多猫和狗中，胃肠外疫苗可因例如佐剂存在而引起不良反应(例如猫中的注射部位肉瘤)。

口服疫苗：一些口服递送的疫苗(例如脊髓灰质炎滴剂)一直有效。口服递送的疫苗的一个限制是胃酸的低pH对疫苗抗原的降解。

鼻内疫苗：这些是通常用于呼吸病原体的用作例如鼻内滴剂或用作气雾剂的疫苗。虽然有时有效，但由于抗原转运到脑，因此鼻疫苗也可导致不良反应。

舌下疫苗：接种的另一种方法是舌下接种。可使用液体剂或固体片剂在舌下给予来实现。舌下疫苗的一个优势是它可提供针对一些变应原的耐受性，因为放置在舌下的疫苗的体积减小。然而，舌下途径不方便，因为不得不将舌抬起以放入疫苗。

舌上疫苗：本发明的舌上疫苗克服了前述接种途径的限制，允许更容易地施用疫苗。一个目的是允许足够的接触时间以给予足够剂量的抗原，以免疫例如新生哺乳动物。舌上递送制剂与舌充分接触，并持续足够长的时间以供抗原递送。此外，接触是密切的，并具有由颌肌的强大咀嚼力产生的压力，可促使抗原更快地扩散，因此促进抗原递送。这可通过舌上疫苗递送装置即舌上施用器的设计特征来实现和/或促进。舌上方法利用天然吮吸反射和例如舌背(上表面)上天然的机械刷样结构。舌上疫苗作为例如固体、半固体或凝胶(例如原位形成的凝胶)，以缩小的体积原位递送。而且，舌上腔隙大于舌下间隙，这就允许将施用器做成促进均匀施用的形状，例如易在舌上滚动的圆形。舌上方法的另一个优势是较低的口腔温度(低约1-2℃)，这使弱病毒能得到较高稳定性。一些病毒(例如细小病毒)异常稳定，因此易掺入施用器基质中。唾液的蛋白水解但非变性的作用也有助于疫苗的适当完整性。此外，与例如全身性或鼻疫苗给予相比，以这种方式给予导致病毒递送到动物脑的风险降低。此外，不存在佐剂减少成本或生产以及不良反应的发生。而且，目前可获得非常少(如果有的话)的安全的食品级或饲料级佐剂。大多数胃肠外佐剂引起严重炎症，因此对于施用于舌而言是不舒服和不合适的。

舌上接种解决了母体抗体效价(例如抗CPV)变化的问题。实际上，在母体抗体效价低的情况下，舌上接种的动物中可更早地发生主动免疫。可通过若干方法中的任一种实现将疫苗递送到例如舌的背侧面。例如，可使用手持“舌上施用器”递送疫苗。施用器通常包括含有目标抗原的固体或半固体基质/载体，基质呈适于与哺乳动物的舌背面接触的形式或形状。在一个实施方案中，如此形成基质，使之适于以使基质表面位于舌背侧面上的方式放入口中，即例如通过吮吸、舔舐或舌肌的其它卷曲动作使基质的至少一面与舌背侧面直接接触(或可直接接触)。在这个实施方案中，可将手柄或其它保持结构与基质连接以利于或控制给药，并防止吞入基质。在其它实施方案中，基质主要制成用于舔舐的形式，而不一定非要是哺乳动物口可容纳的大小或形状。在一些实施方案中，选择施用器的设计和大小以允许或有利于与舌背侧面最大接触接触，在一些情况下为最大接触(例如舌背面的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或甚至更高)。大多数成年动物具有与生俱来的伸舌本能以品尝和/或舔舐物质。本文所述基质的硬度一般防止咬破，但却促进或鼓励舔舐施用器。基质和/或施用器在真空包装物中的包装有助于保持新鲜滋味并防止腐败。下面对这些和其它实施方案进行详尽论述。

在一些实施方案中，舌上施用器包括可吃的或可食用的(例如食品级或饲料级)基质/载体，其中存在一种或多种目标抗原。基质与动物舌背内或舌背上的唾液接触时，基质溶解或崩解，从而释放抗原至舌背侧面。这种类型的示例性基质包括但不限于：可放在舌上并允许溶解的固体/半固体“棒棒糖”型装置(其可被划痕以使能通过分解成更小的块来缩小尺寸)；当施用于舌时固化或胶化的液体(对于原位形成聚合物药物递送系统的描述例如参见B.Madan，Bajaj等.IndianJournal of Pharmaceutical Sciences 2009.71：242-251；可溶材料的薄片；冻结的“冰棒”型基质等。这种基质一般是完全可消耗的，例如在完成充分的舌接触之后。在这个实施方案中，施用器用于单独的一个动物，因此防止口感染传播给其它动物。可根据例如接受疫苗的动物的品种、口的大小、体重、咀嚼力和喜好，定制施用器的大小、形状和尺寸。

在其它实施方案中，舌上施用器可包括相当耐用的固体或半固体基材或支座，其是不可消耗/不可食用/不可吃的并且与唾液接触时不溶解，但其用作将抗原递送至舌的载体。在这个实施方案中，通过舌的吮吸或舔舐动作从耐用载体释放抗原。基材可以是手柄或保持结构，其一部分(例如一端)嵌入基质中，其另一部分(例如另一端)从基质伸出，并可被施用器用户抓住以便将疫苗给予动物。抗原可存在于固体或半固体基质中，基质与支座连接或者位于支座上或位于支座内，或者基质本身可不存在，含有抗原的疫苗制剂直接包覆(例如干燥)在支座上或者注入或浸入支座。该实施方案的实例包括但不限于：给动物提供的指套或护套的涂层；用疫苗制剂包覆或浸透的硬毛(例如丝瓜络)；用疫苗制剂包覆或浸透的海绵或似海绵的材料；用疫苗制剂包覆或浸透的幼犬安抚奶嘴；用基质或疫苗制剂包覆或浸透的不可溶解的材料片等。基材可为一次性的或可再用的。可再用基材可重复地用基质包覆、给予、清洁、再次包覆、给予、清洁等。

在其它实施方案中，以涂刷或滚到舌上的液体制剂或半固体制剂(例如粘稠液体、糖浆剂或糊剂)给予疫苗制剂。这与立即被咽下且不提供抗原与舌背侧面充分接触时间的滴剂不一样。

给予本发明的抗原通过与舌表面(例如背侧面)直接接触并在一段时间内发生。一般来讲，接触时间大于1分钟，可为5分钟以上，例如通常约10分钟，并可长至15-20分钟。可通过调节基质的硬度，和/或通过限制基质与舌接触的时间(抽出施用器)等，来调整接触时间。

在一些实施方案中，固体或半固体制剂含有促进舌的轻度擦伤或磨伤的研磨材料或颗粒，例如“砂粒”或“晶体”。这类物质的实例包括但不限于：结晶砂糖、盐、矿物质等；细碎的粗粒或硬化例如脱水(例如烘烤或以别的方式加热)直到极硬的稠度的其它可食用物质等。注意只利用不能伤害动物的物质(例如用于靶物种的食品级或饲料级组分)。在其它实施方案中，当舌上施用器包括耐用的基材或支座时，支座本身可包括在动物的舌吮吸或舔舐时轻轻擦伤舌的突出物，例如短的(例如1-5mm)硬毛或轻轻摩擦舌表面的其它硬表面。当要递送的抗原是病毒时，轻轻损伤、擦伤或以别的方式刺激或磨伤舌(然而是在无疼痛的情况下)的目的是更有效地递送病毒至例如舌的基细胞。基细胞通常位于约10个细胞层深的位置，一般将固体疫苗制剂设计成响应动物的吮吸动作时在基细胞层附近(例如2-5个细胞层以内)产生递送病毒的途径。

若干示例性疫苗递送装置概略地示于图2，其中图2A描述带有保持结构10的“舌上施用器”，保持结构10与具有研磨颗粒13的固体制剂球12连接；图2B表示递送载体的剖视图，其具有保持结构10和从包覆有固体制剂12的支座15中伸出的硬毛14。保持结构一般为手柄，可以是可拆卸的和/或可例如通过电池驱动的机制振动(颤振、脉动，例如500-30,000次冲击(stroke)/分钟)以提高基质在舌上溶出，而在一些实施方案中，可递送超声波。图2C是包覆有固体制剂12的指套16的外观图，其中固体制剂12包含研磨颗粒13。图2D是“安抚奶嘴”的剖视图，其具有支承结构/保持结构17和包覆有含研磨颗粒13的固体制剂12的邻接或连接支座18。图2E是“安抚奶嘴”的侧视图，具有支承结构/保持结构17与连接的含研磨颗粒13的固体制剂12。其它实施方案见图2F-G，包括在舌上施用器表面上掺入“齿”或“凸起”或“块”，由固体基质材料本身形成，或在基质所固定的支座或基材上提供，并延伸穿过基质以便在舔舐或吮吸装置期间接触舌。在一些实施方案中，抗原存在于擦伤突出物(例如在凸起、块、硬毛等)中，并可只存在于擦伤突出物中。

在其它实施方案中，舌上施用器的一个或多个表面被开槽或划沟痕(例如具有沿舌上施用器表面延伸的凹槽或开放通道)以供舌乳头的某种“截留”。沟槽或通道的边缘可为不规则或粗糙的，以提供适度的擦伤作用。该实施方案见图3A-C，其中沟槽用舌上施用器底面(与舌接触的表面，图3C)上的网格形式描绘。

在一些实施方案中，递送装置是例如为具有韧力和耐久性而由天然橡胶制成的咀嚼玩具，其用疫苗浸透。在某些实施方案中，给咀嚼玩具调味以确保(鼓励)咀嚼玩具或把玩具放到嘴里嚼。在一些实施方案中，玩具或安抚奶嘴上的凸起块有助于轻轻擦伤舌。

疫苗舌上施用器的其它示例性实施方案见图4A-G。例如，舌上施用器可以是任何合适的大小和形状，只要其与动物口舒服地相适，并将病毒递送至舌背侧面即可。例如，参照图4A，基质20可具有顶面22、底面22(其在图中看不见，可视为与纸平面一致)和侧面23。从上方(或下方)观察时，舌上施用器顶(上)面和底(下)面的形状可基本为以下形状，例如：椭圆形(图4B)、圆形；正多边形(例如同图4E一样的大致上的正方形，或同图4C中一样的长方形等)或不规则多边形、或圆锥形(图4D)等。可采用任何合适的形状。在一些实施方案中，设计递送载体，以便适应动物口的大小和解剖结构。在一些实施方案中，设计递送载体用于口内递送，即为了适应动物口的大小和解剖结构。最长尺寸(例如顶面或底面的最长尺寸)的范围一般可为约1-约5cm，通常范围为约1.5-约3cm，例如约1、2、3、4、5cm以上(例如10-20cm以上)，这取决于疫苗接受者口和舌的大小。在成年狗中，舌长可为20cm。对于成年动物可使用较长和较大的施用器。至于厚度，舌上施用器在舌上施用器的最厚部分的范围一般为约0.25-约1.5cm，通常范围为约0.5-约1cm，即约0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1cm。整个舌上施用器可具有基本一致的厚度，即舌上施用器的顶面和底面可基本平行，或者顶面和底面的一个或两个可为弧形的。例如，舌上施用器的总体形状可大致为球形、卵圆形等，在此情况下不存在“面”本身。或者，可对舌上施用器塑形或使舌上施用器成形，以便大致为动物口的内部形状，例如图4F所示，该图表示具有前弧形段30和后弧形段31的舌上施用器的侧视图。在一些实施方案中，舌上施用器包括保持结构(图4G中的10)，例如手柄，以有利于该装置的制造、操作和给药。手柄一般可为笔直的，长度范围为约5-约10厘米，或者有时更短，并且可为刚性或柔性的。然而，各种其它设计是可行的，例如其中保持结构是弯的或弧形的，或缠在给予疫苗的人的手指或手上等。施用器的一次性实施方案防止幼犬间发生交叉污染。例如，狗主人可根据有关品种和怀孕雌性动物乳腺乳头的大小的经验，在幼犬出生前订购正确尺寸的施用器，以便可获得出生不久使用的疫苗施用器。

本发明的舌上疫苗施用器可包含固体或半固体基质，其含有分散或分布在整个基质中的抗原，基质与唾液接触时可溶解。可通过在制造期间使用的温度控制基质的硬度。本领域技术人员应了解的是，可以采用若干合适的基质类型中的任一种。例如，可以使用“棒棒糖”或硬糖型制剂。

像大多数硬糖配方一样，接种施用器可通过煮糖产生。示例性组合为糖(2杯)、淡玉米糖浆(约2/3杯)、3/4杯水和盐(1/3茶匙)。也可加入着色剂和不同的调味品，例如肉或花生。先在煮器不盖盖子的情况下，将各成分煮沸至300℃。应当小心，因为这种混合物有大量潜伏热，并可灼伤皮肤。使混合物冷却。在温度降至约125℃后，接着可均匀混合入抗原以便均匀分散。将混合物倒入模具中硬化。可通过公知的冷水试验和更准确(精确)地用糖果温度计监测糖果的硬度，以达到所需硬度水平。

根据所需硬度或脆度水平，可调整糖果混合物的煮沸时间和所达到的温度，并监测硬度阶段，例如采用本领域已知的且在表1中所述的“冷水试验”进行。然而，另用温度计测量温度是可取的。示例性冷水试验阶段和相应的温度如下：

表1.冷水试验

高于海平面的海拔影响液体的沸点温度，可凭经验使用温度计测量。

在一些实施方案中，含有抗原的基质为固体，即它们具有明确的形状和体积，结实，不摊开，不易延展或者不易表面变形(但是它们可有柔性)。更确切地，它们在下面的温度下保持自身形状：例如动物体内的温度(例如狗＝约37-38.6℃)，例如动物口中的温度(低1-2℃)；室温(例如约25℃)。本领域技术人员应了解的是，基质的硬度程度可随舌上施用器的设计而略有改变。用于制备合适基质和用于分析其物理性质的方法可参见例如美国专利号6,455,096，其完整内容通过引用结合到本文中。

在一个实施方案中，可将疫苗与花生酱混合，加载或浸到市售的橡胶装置(例如Kong玩具或绳索玩具)中。这些玩具最适于幼犬的加强注射。这些玩具可在洗碗机中洗涤。而且，“棒棒糖型”装置更适于新生狗。

其它物质也可包括在制剂中，例如有益的物质，例如维生素、营养品(neutraceuticals)、补铁剂、其它药物、驱虫药例如Ivermectin等。同样，还可包括很可能吸引幼犬的各种调味品或其它可口物质，例如肉、鱼、奶、蔬菜或其它调味品。另外，可包括佐剂，尤其粘膜佐剂例如细菌毒素(例如霍乱毒素)。在一些情况下，在给予疫苗后用含铁盐漱口剂冲洗，以终止残余或残留病毒(例如CPV)的细胞结合和感染，和/或竞争残余或残留病毒(例如CPV)的细胞结合和感染(即与尚未进入细胞的病毒竞争)。

用于包含在疫苗制剂中的其它合适成分包括但不限于：醇、各种控释添加剂(例如羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和聚乙二醇等聚合物)。制剂可含有：已知的药学上可接受的添加剂、矫味剂、表面活性剂(例如非离子表面活性剂)和佐剂；各种稳定剂；抗氧化剂；填充剂；缓冲剂；甘油；糖或其它天然和人工的甜味剂。组合物中特别包含盐，因为它们易于促进分泌唾液，因此有利于抗原从舌上施用器中释放。基质中包含用于保持口服给药和/或适于病毒的合适pH的缓冲剂(例如对于犬细小病毒为约pH 7.2，对于猫泛白细胞减少症病毒为pH 6.5)。通常，制剂中存在的活性成分(例如一种或多种抗原或其它医学上有益的物质)的量的范围为1-99％。如果抗原为病毒，则病毒的量范围一般为约10⁴-约10¹⁰个病毒颗粒/舌上施用器，通常范围为约10⁵-约10⁷个病毒颗粒/舌上施用器。这么多的病毒一般存在于约100ul-200ul细胞培养物上清液中。活病毒(例如CPV)的减毒水平受传代数控制。改进活病毒所需传代范围可为25-100次，25为示例性传代数。胃肠外注射剂中的大多数CPV病毒约为75次传代。

在一些实施方案中，制剂中还存在免疫增强剂。例如乳清蛋白、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、益生菌例如乳酸菌(例如鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhanmous)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus))、双歧杆菌(例如乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis))或各种链球菌菌种。

从上面提供的描述来看显而易见，在给予疫苗期间，可通过动物吮吸和舔舐可溶性基质，而将本发明的递送装置完全消耗，例如整个舌上施用器可溶解。然而，情况不必如此。含疫苗制剂可包覆在基材或支座上或浸入其中，并在被舔舐或吮吸完后，留下基材。在这类实施方案中，例如，可由能够保持疫苗制剂涂层的任何合适的材料塑造基材，或者塑造基材以将疫苗制剂掺入基材中(例如基材内的孔或通道中，或一般浸入基材中)。这类材料的实例包括但不限于各种软柔性纤维(天然和合成的)；布料；皮革或生皮带；“耐嚼”材料，例如制造安抚奶嘴和咀嚼玩具(KONG company，Golden，CO)的耐嚼材料等。此外，可将液体疫苗与花生酱混合并冷冻以允许或鼓励舔舐，而不鼓励快速吞下疫苗。

另外，在本发明的一些实施方案中，疫苗制剂仅存在于舌上施用器的一面上，例如仅包覆或浸入基材的一面，或者分层使得仅舌上施用器的一面含有疫苗，另一面则不含疫苗。在这个实施方案中，将包含疫苗组分的装置的那一面放置在动物舌的背侧面，相对面则保持于动物上腭附近。该实施方案一般用于相对安静的非常幼小的动物，对于这类动物可稳定地操作装置在口内的位置。该实施方案有利地直接将疫苗制剂递送至舌表面，极少量递送到动物口的其它部分。不包含疫苗组分的装置表面可由与含疫苗表面一样、但减去(没有)疫苗的固体或半固体可食用物质形成，例如装置包括至少两层，仅其中一层包含疫苗。该实施方案见图5A-C，其中图5A中的舌上施用器40显示包括惰性(无疫苗)上层41和包含疫苗组分43的下层42。或者，在这个实施方案中，不含疫苗的表面可包括用作递送疫苗制剂的支座或背衬的惰性的不可食用物质，例如纸条或硬纸板、布、合成聚合物等。该实施方案见图5B，其中舌上施用器50显示为由包含疫苗组分53的下层52组成，下层52包覆有基材或背衬51或与之连接。图5C中也描述了这种形式，其概略地示出舌上施用器60的侧视图，舌上施用器60包括含疫苗基质61(其与舌接触)、保持结构62和保护板63，保护板63延伸或伸出于基质61表面上方，舌上施用器60不与舌接触，但通常与上腭接触，防止动物咬住或咀嚼基质。还预期这些的组合，例如还包括基材或背衬的分层舌上施用器结构。

在一些实施方案中，本发明的舌上施用器在结构上是刚性的，即一般保持舌上施用器的形式或结构直到通过与唾液接触而溶解。在其它实施方案中，舌上施用器不是刚性的，而是柔性的。在后一实施方案中，制剂可以是例如凝胶或含有疫苗且通过与唾液接触而溶解的其它物质；或浸有疫苗(根据柔性程度疫苗也包覆或不包覆在支座上)的柔性凝胶样物质(例如各种可食用植物胶或稠糊)，其与唾液接触时不溶解。这类制剂可或可不位于将疫苗递送给动物的支座上。

在一个示例性实施方案中，制备包含减毒CPV病毒和适度磨料糖晶体的固体制剂，并通过吮吸给予不满8周龄的幼犬。幼犬可以是新生儿。通过吮吸动作适度磨伤幼犬舌导致将减毒病毒递送至幼犬舌基底层。减毒CPV感染舌的基细胞，并建立低水平持续感染。从基底层逃逸的病毒诱导针对CPV的免疫应答，导致由幼犬产生的抗CPV抗体产生。

在一些实施方案中，用其中所包含的抗原类型的标志给固体或半固体基质压印或压纹，例如，如果抗原为病毒，则D可用于瘟热，P用于细小病毒，K-9用于犬等。

在一个实施方案中，本发明提供大舔砖(例如盐砖(salt lick)和/或尿素砖(urea block))以促进使用舌上方法给家畜(例如反刍家畜)和野生动物接种。盐砖通常用于为反刍动物提供矿物质，例如磷、钠、钙和镁。可在制备期间将稳定的疫苗组合物掺入舔砖中，或者涂刷在舔砖上或浸入舔砖中。例如，盐砖和矿物质砖一般是多孔的，如果浸入液体疫苗中例如约30分钟，便可吸收液体疫苗。然后可将其给予动物。该实施方案可用于幼年或成年动物，并且可用来给例如以下动物接种：家畜(例如牛、山羊、绵羊、美洲驼、马等)、或保护区或拯救机构(例如动物园、动物公园、动物庇护所等)的动物，或野生动物(例如狐狸、浣熊、鹿等)。舔砖70的示意图见图5D。在该图中，提供任选的孔或通道71以悬挂舔砖。在一个实施方案中，提供具有针对口蹄疫的抗原(例如被杀死的病毒抗原)的舔砖。

在示例性实施方案中，采购市售盐砖，并用含有一种或多种本文所述尤其配制用于舌上给予的疫苗抗原的溶液浸泡。或者，可配制盐砖以包含一种或多种抗原连同诸如粉状的骨(骨粉)、蛋壳、灰分等其它组分，加上各种盐和矿物质(例如岩盐)及一种或多种粘合剂例如粘土、粘固粉等，用足够的液体(例如水)配制以制备糊。例如，在一个实施方案中，通过将2份岩盐、4份骨粉和1份termite粘土、足以产生糊的水和合适剂量的抗原混合来制备盐砖。在另一个实施方案中，盐砖(重10kg)包含6.3kg的盐、1.5kg的骨粉、0.6kg的灰分和1.6kg的粘固粉、形成可模压糊的液体以及合适剂量的本文所述抗原。又一个实施方案包含：盐或矿物盐82％；骨粉4％；石灰(碎贝壳或农用石灰)2％；粘固粉、上等粘土或两者的混合物12％，加上抗原。可加入其它合适的物质(例如糖蜜)甜化并帮助结合混合物。应在水之前加入糖蜜，因为糖蜜也可提供一定水分。在合适的容器(例如充气的木或金属盒、碗、罐等)中模塑糊。一旦干燥，盐砖就备用。将舔砖浸入疫苗溶液中，使能够浸泡以使舔砖浸有疫苗，其通过毛细管作用渗透舔砖。

抗原

设计本发明的舌上施用器以舌上递送抗原。可通过本发明的施用器递送的抗原的实例包括但不限于：抗原蛋白、多肽和肽，例如已知包含或包括致病因子(例如病毒、细菌(即细菌抗原)、各种寄生物等)的表位或抗原区的抗原蛋白、多肽和肽。在一个实施方案中，致病因子为诱发龋牙的致病因子，本发明的制剂包含用作针对龋牙的疫苗的细菌抗原。可通过例如重复给予和/或定时间隔给予来提供合适量的抗原。

在本发明的一个实施方案中，抗原包括需要在疫苗接受者中针对其诱导或激发免疫应答的一种或多种病毒(优选减毒病毒)。“病毒”包括完整病毒(活病毒、活的减毒病毒、被杀死的病毒等)、修饰病毒(例如含有核酸的衣壳)、各种感染性颗粒、病毒亚单位、病毒样颗粒和其它病毒形式。在一些实施方案中，对病毒进行遗传改造以含有并表达编码对一种或多种感染物(例如致病因子)有特异性的一种或多种抗原的核酸。在一些实施方案中，病毒具有感染基细胞或被基细胞吸收的能力。所谓“病毒”或“减毒病毒”，我们意指本领域理解的病毒，例如一般包括包装在蛋白质外壳内的核酸材料(有时为蛋白质)和可含或可不含脂质包膜的病毒粒或病毒颗粒。使用活病毒疫苗的一个优势是通常快速产生针对特定病毒病原体的可检测免疫，例如在约5天-2周内。组合物中所包含的病毒一般是减毒的，即病毒已被修饰使得不会在接受者中引发疾病。然而，这种病毒保持诱导针对病毒的免疫应答的组分和/或结构，例如它们保持接受者对之发动免疫应答的表位、抗原决定簇等。优选免疫应答是保护性免疫应答，即应答产生足够保护以预防不然在疫苗接受者暴露于包含相同或相似抗原的野生型致病病毒或被所述病毒攻击时而引起的疾病症状，或至少降低所述疾病症状的程度。本领域技术人员熟悉使病毒减毒的方法，其包括但不限于以下文献所描述的方法：美国专利申请12/138,085(2008年6月12日提交，并以US 2009-0010955公布)和12/211,174(2008年9月16日提交，并以US 2009-0098152公布)以及美国专利7,744,902，所述所有文献的全部内容通过引用结合到本文中。例如，一种这样的方法包括使病毒在细胞培养物中进行连续传代，例如在逐步降低的减毒温度下。或者，可通过对亲本病毒进行化学诱变而引入特定突变(例如病毒在例如5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、亚硝基胍等诱变剂存在下复制)。还可采用这些技术的组合。优选减毒病毒保持感染舌基细胞的能力，但是在一些实施方案中，也可递送被杀死的病毒。被杀死的化学上失活的病毒与细胞结合，并且内化但在细胞中不复制。

在本发明的一个实施方案中，递送的病毒适于通过在比体核温度略低的温度下(例如低1-2℃；例如在约35-36℃的温度下)体外培养和适应而在这些较低温度下复制。对略低温度的适应还对潜在摄入提供较高的安全性，因为减毒病毒将不会在温度为37-38℃的胃肠道中存活。因此，病毒甚至在以高剂量(高达10⁷-10⁸个病毒/幼犬)递送时也是安全的。大多数胃肠外疫苗递送10⁴-10⁵个/幼犬。在幼犬感染细小病毒的情况下，病毒DNA可在整个接种的幼犬身体中存在，但生产性复制只发生在舌和肠中。因此，在口的略低温度下的病毒稳定性有利于舌上疫苗抗原。另外，在大多数动物种类中非极端的唾液pH可用来稳定活病毒。

在一些实施方案中，组合物中所给予的病毒是细小病毒，例如减毒犬细小病毒，而接受者是犬。然而，本发明还包括针对其它类型的病毒和病原的接种。可通过本发明的组合物递送的示例性病毒包括：

1)无包膜病毒，其包括但不限于：幼犬的犬细小病毒和犬腺病毒；猫和小猫的细小病毒、杯状病毒和猫泛白细胞减少症病毒；小牛的轮状病毒；驹的轮状病毒；食肉野生动物的细小病毒；引起牛和其它偶蹄动物口蹄疫(亦称hoof-and-mouth disease，世界许多地方牛的头号严重病毒疾病)的apthovirus等。

2)包膜病毒，其包括：幼犬的犬瘟热病毒和犬流感(H3N8)；小猫的猫疱疹病毒；小牛的冠状病毒；牛的引起牛病毒性腹泻的病毒和牛疱疹病毒；驹的疱疹病毒；食肉野生动物的瘟热病毒和狂犬病病毒等。

对于无包膜病毒(细小病毒、轮状病毒)的递送，通常在配制基质期间，通常可将病毒掺入(例如混合入或在其中分散)舌上施用器基质(例如本文所述固体或半固体制剂)。因此，病毒是基质的组分，一般相对均匀地分布在整个基质中。另一方面，病毒的分层和/或其它各种不均匀分布形式也包括在本发明中。在这类实施方案中，如果基质是类似于传统舌上施用器的硬化材料，并由沸水和糖例如常规糖(蔗糖)、枫蜜等制备，则加到舌上施用器混合物中的病毒在以下温度范围内一般是稳定的：至少约100-150℃，或至少约110-140℃，或约120-130℃。在将病毒加到冷却的混合物中但在混合物硬化之前，这种稳定性和存活力应持续至少一段短的时间。其它制剂也是可行的，例如其中将具有病毒的基质烘烤或在加热或不加热或者仅最低限度加热时干燥，从而避免对热稳定性的需要。在一些实施方案中，在病毒非常不稳定的情况下，还建议将病毒与花生产品(例如花生酱)混合。

对于包膜病毒的递送，预期图6A-D所示的具有毛细孔的递送载体(装置)(但是这种类型的装置也可用于无包膜病毒，或也可用于其它抗原)。参照图6A，在这个实施方案中，固体或半固体基质81中分布有透过基质的相对均匀的毛细孔81(口)、通道或腔室系列或网络，即基质是有孔的。这些毛细孔或通道的体积大致均匀，范围一般为约1ul-约10ul，每平方厘米基质的孔数范围为约10个-约500个或更多。通道可形成相互连接的网络，或者是切向的(并列的)，并且可以是任何相对或大致均匀的形状，例如大致笔直的、弧形的、有角的形状等。它们可具有任何合适的直径，只要疫苗组合物可进入并充满通道，并被隔离在其中直到给予疫苗即可。孔/通道/腔室的至少一部分朝向基质表面开口，以供液体疫苗制剂进入。可通过任何合适的方法实现基质的孔/通道/腔室的充填，例如在含有病毒抗原的糊(例如花生糊)中浸渍、浸透、涂刷、洗涤、挤压，或者在允许或促进疫苗制剂通过表面上的开口进入孔/通道/腔室的条件下，以其它方式将基质表面暴露于液体疫苗制剂。在一个实施方案中，将舌上施用器浸入含有病毒的液体组合物(例如在冷杯)中)，病毒进入(浸透入)毛细孔中，然后可将舌上施用器用于舌。图6A显示具有通道或毛细口81的基质的顶视图，通道或毛细口81在基质80的表面上开口。图6B描绘基质80内伸出且通过口81与表面连接(在表面上开口)的毛细管82。与滴剂不同，这种施用器可供在几分钟内慢慢地将疫苗施用到舌的上表面。

有利的是，在本发明的这个实施方案中，基质可如图6C和D所示与手柄(其可装铰链)连接，以利于保持和浸渍以及然后给予接受者。正如描述的一样，手柄或保持结构90与包括通道93的基质92连接，通道93可只在一个基质表面(6C)上开口，或可贯穿基质(6D)，或两者的组合。在一些实施方案中，在加载疫苗制剂后，简单洗涤或擦拭基质以除去未连接毛细管(未位于毛细管中)的表面病毒。在其它实施方案中，“加载”有疫苗制剂的舌上施用器可用将疫苗截留在毛细管中的障碍物包覆或密封，例如用油、花生糊衣、糖溶液、奶等轻轻包覆，之后将舌上施用器干燥，在给予前可保存(例如冷冻、冻结、干燥等)。在其它实施方案中，将病毒加入基质后立即或尽早给予接受者。毛细管末端(即在基质表面上的毛细管部分，且其将与疫苗接受者的舌直接接触)可以是平滑的或有锯齿的。平滑末端允许含有病毒的液体慢慢转移，而有锯齿的末端允许含有病毒的液体较快转移。通过控制毛细孔呈大体相似或均匀的大小，并控制每平方厘米基质的孔数，可供病毒剂量的滴定。例如，如果每只幼犬的疫苗剂量为500ul，则50个毛细孔x10ul/孔可递送该剂量。这种类型的舌上施用器递送的液体疫苗是独特的，因为与简单地将疫苗作为滴剂喷射入口中不一样，舌上施用器递送的疫苗在体积方面受到控制，并提供较长的接触时间和缓慢的疫苗递送，因此存在感染时间。相比之下，如果简单地将疫苗作为液体喷射到口中，则被立即吞下。吞入的疫苗一般不耐受暴露于胃液。同样，舌下疫苗递送不像非侵入性可口舌上疫苗一样舒适和易于递送。

在本发明的一个实施方案中，舌上递送的抗原是来自野生动物物种(例如浣熊)的细小病毒。合适的浣熊细小病毒描述于例如Kapil等(Veterinary Record 2010。166，24-25)。

疫苗接受者

本文所述舌上疫苗用来给动物接种，动物通常为哺乳动物(包括人)，尤其是年幼哺乳动物，更尤其是新生儿(初生儿)。在一个示例性实施方案中，哺乳动物是犬，例如幼犬，但是不一定总是这种情况，本文提及幼犬或狗是为示例性目的，因为本发明可用其它动物物种(例如其它哺乳动物，包括人)实施。可以使用疫苗制剂在能够舔舐或吮吸含有疫苗原的组合物的任何动物中诱导粘膜免疫应答。舌上疫苗适用的其它动物物种的实例包括但不限于：猫科动物(包括家养猫科动物)和大型猫科动物例如被关养的大型猫科动物；白鼬；豚鼠；家畜，例如牛、绵羊、山羊等；马；以及本领域技术人员可以想到的其它动物。至于给予新生儿，可将组合物给予出生后不久便能吃奶，并在需要给予疫苗期间保持吮吸一段时间的能力的任何动物。舌是免疫的理想部位，因为它具有易接受的靶上皮、抗原加工细胞、淋巴管系统和微脉管系统、淋巴管，并环绕有和包括强有力的咀嚼肌。

本发明的方法

本发明提供通过将本文所述一种或多种抗原舌上递送给动物而给动物接种的方法。给予一种或多种抗原一般在疫苗接受者中诱导免疫应答，例如接受者产生针对抗原的抗体和/或细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答是保护性的，即在随后用含有与疫苗组合物中的抗原和/或抗原决定簇相同或相似的抗原和/或抗原决定簇的感染原攻击动物时，动物不出现疾病症状，和/或出现的疾病症状与未如上接种的动物发生的疾病症状相比显著较轻。

疫苗方案

在没有本发明的递送系统的情况下，新生动物(例如幼犬)完全依赖母体免疫直到例如在6周龄时启动传统疫苗方案。虽然传统疫苗方案可始于更小的年龄，但是不可能准确测定母体抗体何时将停止干扰疫苗，并且在给予太早时，所涉及的时间和费用被浪费。本发明提供合宜的低成本方法，以在需要传统方案之前甚至由主人在家里给予早期疫苗剂量。实际上，给予的方便合宜鼓励宠物主人自身给低龄动物接种，而不需要安排兽医会面来这样做。

仅3-5％的母体抗体存在于刚出生的新生幼犬中。因此，只有有限量的抗体在新生幼犬中循环。正常初乳抗体吸收的时期在出生后一般不会延续超过24小时。(怀孕母狗的被动免疫后24小时，幼犬血清中不存在抗体，但是母狗效价仍旧高)。摄取后约10小时吸收来自单次喂食的最大量抗体，吸收在15小时时几乎完成。喂食超免疫血清后5小时，在血清中未检出抗体。大分子通过肠上皮移动到血管系统中是一个相当慢的过程。类固醇促进并参与抗体吸收。

因此，在出生后约8小时(例如出生后约2-约10小时，即约2、3、4、5、6、7、8、9或10小时)给予幼犬本发明的制剂时，幼犬将吸收最大量的抗体。在一些实施方案中，为了在新生幼犬中诱导主动免疫，一出生就给予疫苗。对于这种方法类型，在给幼犬喂食母体初乳抗体前完成给予疫苗。接种的这种方法称为疫苗与抗体同时施用。在其它实施方案中，稍后(即在多少哺乳后)递送疫苗，并在给予疫苗后立即鼓励幼犬再次(例如约15分钟)吃奶。

在一个接种方案中，允许幼犬舔舐舌上施用器，然后约过1小时才允许喂给初乳。大多数病毒与表面受体结合，并在20分钟内内化入细胞。一旦进入细胞，病毒就免于被母体抗体中和。因此，停止或推迟哺乳可利于病毒感染舌上皮基细胞。

幼犬出生时没有牙，而乳犬齿(口前每侧的较长牙)在约3-4周龄开始冒出，切牙(前面的小牙)和前磨牙(较大的侧牙)在约4-6周龄时出现。幼犬在8周龄时应共有28颗乳牙。一般可将本发明的疫苗制剂和递送方法用于4周以内的幼犬。此外，幼犬的出牙时间防止咬坏舌上接种装置。在一些实施方案中，例如在2-3周时给予疫苗，接着在4和6周时给予加强剂量。在一些实施方案中，8周后不使用舌上方法，因为然后视需要可采用传统递送方法(例如皮下注射)。可通过测定或测量抗抗原(例如CPV)抗体的效价，以血清学方法确定后续注射的需要。

图7A和B提供给予疫苗的两个示例性方案(时间线)，其中疫苗先通过舌上施用器(LP)给予，然后通过注射给予。图7A表示出生时开始的方案；图7B表示4周龄开始的方案。

将舌上施用器(例如棒棒糖)施用于新生幼犬的方法详情：在将棒棒糖用于新生幼犬之前，必须清洗口和鼻孔，并将幼犬弄干。在幼犬稳定后(例如30分钟内)，用本文所述的大小合适的施用器接种。

免疫惰性是新生的任何物种因其而不能够发动针对新生儿疫苗或抗原的强保护性免疫应答的现象。这种惰性是由于导致需要幼犬系列接种(例如5次疫苗注射)的许多因素引起的。在一个实施方案中，使用这种新的舌上接种可避免对幼犬注射的需要。在一些实施方案中，仅将新生幼犬暴露于舌上施用器疫苗一次便可产生主动免疫，因此克服了免疫惰性。幼犬出生时的确具有免疫系统组分的全部补体。

在疫苗给予的一个示例性方案中，将舌上疫苗给予新生幼犬。1小时后，通过例如哺乳给予初乳。2周后，通过舌上施用器给予加强剂量的疫苗，禁食1小时后恢复正常喂食。在4和8周龄时，对幼犬抽血，并测量(例如通过IFA或ELISA)抗体效价。与未接种对照不同，舌上施用器接种的幼犬具有抗病毒的IgM和IgG。这个结果证明通过舌上途径给予的疫苗的成功“吸收”。

实施例1

被感染的狗的CPV分布

舌由骨骼肌核心组成，骨骼肌核心被舌背上的复层扁平上皮包绕。舌背上的上皮一般厚而角化，而舌腹面上的未角化且薄。舌背被两种类型的舌乳头覆盖：角化的“丝状”乳头和非角化的乳头。最众多的丝状乳头由高度血管化的结缔组织核心支撑，形状像玫瑰刺一样，具有尾部定向的弯曲部分。在狗和猫两者中，丝状乳头很多，并且发育良好。猫的丝状乳头有大小不等的两个突起(图8A)。近尾部的突起大且为尾部定向。狗的丝状乳头有两个或更多个顶端(图8B)。近尾部的顶端最大，而且狗的角质层比其它动物顶端的角质层厚。狗和猫的舌根上存在圆锥形乳头。它们比丝状乳头大，且不是高度角化的。

图9表示对感染CPV的狗或幼犬进行的约158次尸体剖检中CPV病毒分布的现场试验结果。正如可观察到的一样，在所检查的几乎全部CPV感染犬中存在CPV在舌(基细胞)和肠两者中共定位。因此，在自我清洁过程中，仅天然施用便容易感染舌。然而，通过在细胞系中进行病毒分离以从舌中分离活病毒的不断尝试均告失败，而从相同犬的肠中分离活病毒的尝试却获成功。因此，与肠中(肠腺(cyst ofLiberkahn)中)的复制相比，舌中CPV(例如CPV-2)的病毒复制方式不是生产性的。因此，舌允许CPV的低水平病毒持续感染，而非明显的生产性复制。虽然舌和肠显示CPV共定位几乎100％的相关性，但生产性感染的水平和程度(病毒效价)显著不同。

还使用抗CPV荧光素FITC缀合物通过直接荧光抗体试验检查舌切片，图10表示示例性结果。结果发现，仅舌背侧面为CPV抗原阳性；舌的中部肌肉部分和腹面为阴性。实际上，舌背上皮基底层被CPV-2感染，其中在开始因CPV所致的腹泻症状后至少1-2个月病毒持续感染。在正分裂的上皮基底层中，在上皮之下的丝状乳头之间存在CPV抗原。另外，具有分裂细胞的一些未角化乳头核心也被感染。如上所述，丝状乳头是角化的，这个研究结果发明，舌角化区不被感染。更确切地说，感染限于乳头基部处或之间的非角化凹入区。在组织学上已确定丝状乳头周围的3个独特区域。

这个观察结果还解释了狗中CPV自体感染的途径。因在自我清洁期间受感染的直肠上皮细胞的机械剪切和脱落所致很可能发生自体感染。因此，如果狗已经感染肠细小病毒，则角化棘样乳头的存在促进将细小病毒更深地施用到舌和易感的舌基底层中，建立CPV感染。天然感染CPV-2的所有阳性情况下都观察到这种天然的“自体感染”。根据乳头的分布，舌背的前面部分很可能允许更致擦伤的机械作用，而后舌背允许从唾液中更多地吸收病毒。这些相同的机制可供按上文所述将本发明疫苗制剂中的病毒递送给已接种的动物的舌的基细胞。

虽然根据其优选实施方案对本发明进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，用落入随附权利要求书的精神和范围内的修改可实施本发明。因此，本发明不应限于上述实施方案，却还应包括落入本文提供的描述的精神和范围内的其所有修饰和等同物。

Claims (28)

1.一种免疫动物的方法，所述方法包括将至少一种抗原舌上给予所述动物的步骤。

2.权利要求1的方法，其中所述至少一种抗原是减毒病毒。

3.权利要求2的方法，其中所述减毒病毒感染所述动物的舌细胞。

4.权利要求3的方法，其中所述减毒病毒感染所述动物的舌基细胞。

5.权利要求2的方法，其中所述减毒病毒是犬细小病毒(CPV)。

6.权利要求2的方法，其中所述减毒病毒选自口蹄疫病毒、猫杯状病毒、猫泛白细胞减少症病毒和猫细小病毒。

7.权利要求1的方法，其中所述舌上给予的步骤包括以包含固体基质的制剂形式将所述至少一种抗原提呈给所述动物，所述固体基质具有分散在所述固体基质中的所述至少一种抗原并具有分散在所述固体基质中的研磨材料。

8.权利要求1的方法，其中所述舌上给予的步骤在数周时间内进行多次。

9.权利要求1的方法，其中所述动物为新生儿。

10.权利要求9的方法，其中所述舌上给予的步骤在所述新生儿出生后立即进行且在给所述新生儿提供第一次母体初乳之前。

11.权利要求9的方法，其中在进行所述舌上给予的步骤后，不允许所述新生儿吃奶一段时间。

12.权利要求2的方法，其中对所述减毒病毒进行遗传改造以提呈对所述动物中的一种或多种感染物有特异性的一种或多种抗原。

13.权利要求7的方法，其中所述舌上给予的步骤包括使所述动物的舌与所述固体基质接触选自以下的一段时间的步骤：1分钟、2分钟、3分钟、4分钟和5分钟。

14.一种用于舌上递送给动物的免疫原性制剂，其包含：

基质；和

分散于所述基质中的至少一种抗原。

15.权利要求14的免疫原性制剂，其中所述基质是固体。

16.权利要求14的免疫原性制剂，其还包含分散在所述基质中的研磨材料。

17.权利要求14的免疫原性制剂，其中所述至少一种抗原是减毒病毒。

18.权利要求17的免疫原性制剂，其中所述减毒病毒感染所述动物的舌细胞。

19.权利要求17的免疫原性制剂，其中所述减毒病毒感染所述动物的舌基细胞。

20.权利要求17的免疫原性制剂，其中所述减毒病毒是CPV。

21.权利要求17的免疫原性制剂，其中所述减毒病毒选自口蹄疫病毒、猫杯状病毒、猫泛白细胞减少症病毒和猫细小病毒。

22.权利要求17的免疫原性制剂，其中对所述减毒病毒进行遗传改造以提呈对所述动物中的一种或多种感染物有特异性的一种或多种抗原。

23.一种用于将免疫原性组合物给予幼犬的舌上施用器，其包括：

至少包括基质的基材；和

分散在所述基质中的至少一种抗原。

24.权利要求23的舌上施用器，其中所述基质是固体。

25.权利要求23的舌上施用器，其还包含分散在所述固体基质中的研磨材料。

26.权利要求23的舌上施用器，其中所述至少一种抗原是减毒病毒。

27.权利要求26的舌上施用器，其中所述减毒病毒选自CPV、口蹄疫病毒、猫杯状病毒、猫泛白细胞减少症病毒和猫细小病毒。

28.权利要求23的舌上施用器，其还包括位于所述基质一个表面上的保护板。

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