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Abstract

本发明公开了一种药物组合物，其包括一种维生素E衍生物、一种阴离子磷脂结合蛋白、一种阴离子磷脂和一种固醇。此外，本发明还提出了一种制备用于将“待输送物质”运输到受试者的组合物的方法，包括：a)由一种维生素E衍生物，一种阴离子磷脂结合蛋白，例如膜联蛋白，一种阴离子磷脂，例如磷脂酰丝氨酸和一种固醇形成脂质体；b)将“待输送物质”包封在脂质体组合物中。

Description

载体
技术领域
本发明涉及一种将药物或其它药剂运送到眼睛和中枢神经系统的载体。
背景技术
向眼睛局部运送药物一直都是极具吸引力的实施路线，但在寻找能够有效克服药物到达眼睛前部和后部的物理和生理屏障的有效载体方面只取得了有限的成功。在早期的专利申请PCT/GB2008/004233中，发明者描述了使用常规方式向眼睛用药时遇到的问题。进一步地，发明者提出了一种常规药物施药中使用的载体，它能够将药物运输到眼睛后部，而无需直接侵入性的施药方式。
在失明情况下，如AMD(年龄相关的黄斑退化)和DR(糖尿病视网膜病)，随着当前使用眼内(玻璃体)注射治疗靶向VEGF(血管内皮生长因子)的出现，还有一种对非侵入性输送系统的需要。随着老龄化疾病和糖尿病发生率的提高，亟待需要治疗方法，特别是那种不具入侵性的疗法，容易施药且便宜。改进用于药物局部运输的载体，以抑制血管内皮生长因子(VEGF)，治疗AMD(年龄相关的黄斑退化)和DR(糖尿病视网膜病)及其他类似病症，将是非常有用的。
研发针对中枢神经系统(CNS)和眼睛的治疗方法是药物研发中最具挑战性的领域之一，特别是全身用药。这主要是因为眼睛内存在的血视网膜屏障(BRB)，及中枢神经系统(CNS)内存在血脑屏障(BBB)。尽管近期有取得进展，血脑屏障(BBB)仍然是阻碍许多潜在的治疗药剂进入中枢神经系统(CNS)的现实问题。当今的挑战是研发药物载体系统，保证药物以安全且有效地方式穿过血脑屏障(BBB)。
在中枢神经系统(CNS)治疗中使用的药物受到能够以跨膜扩散的方式穿过血脑屏障的小的脂溶性化合物的限制。此外，阿尔茨海默病的治疗利用了被动和主动免疫——其主要的难点在于抗体很难穿过血脑屏障(BBB)，特别是IgG分子因其较大的体积而具有较差的渗透性。
本发明涉及能够使药剂穿过血脑屏障(BBB)和血视网膜屏障(BRB)的载体。这些载体能够以多种方式用于药物施用，例如静脉注射、经鼻骨、经皮肤和常规方式。
发明内容
本发明涉及一种药物组合物，其包括一种维生素E衍生物、一种阴离子磷脂结合蛋白、一种阴离子磷脂和一种固醇。
该组合物可用于运输待输送物质，例如具有生物学或药用活性的化合物，到受试者(subject)身体的区域。尤其是，该组合物可用于将“待输送物质(cargo)”穿过血视网膜屏障(BRB)或血脑屏障(BBB)运输。因此，该组合物还可以包括需要运输的“待输送物质”。
维生素E衍生物、阴离子磷脂和固醇可构成一个类脂膜(脂双层)。阴离子磷脂结合蛋白能够结合到脂双层表面。所述的组合物还可包括能够形成脂双层的组分。
术语维生素E衍生物是指一种母育酚或生育三烯酸衍生物，具有与α-生育酚相似的生物活性。特别地，术语维生素E衍生物是指生育酚和生育三烯酚。维生素E有8种同分异构体分子：4种生育酚具有一个4’，8’，12’-三甲基十三烷基叶绿醇侧链，4种生育三烯酚因侧链上3’，7’和11’位置上是否存在双键而不同。术语维生素E衍生物还包括生育酚和生育三烯酚的衍生物，或者是这些分子的变体，具有轻微的结构差异，但功能相似。
维生素E包括两种生育酚同系物，即“生育酚”和“生育三烯酚”。生育酚是一种单，双或三甲基母育酚，可能具有维生素E的活性。生育酚还包括生育酚衍生物，特别是功能性衍生物，也就是那些保持母体分子载体功能的物质。生育酚衍生物的一个例子是TPGS(D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)。生育三烯酸是一个在侧链上具有三个双键的母育酚，例如在植基中有三个额外双键，因此6-(3’，7’，11’，15’-四甲基-2’，6’，10’，14’-hexadecatetraenyl)-1，4-对苯二酚或2-甲基-2-(4，8，12-三甲基十三碳-3，7，11-三烯)苯并二氢吡喃-6-醇。天然产物在色原烷醇编号为5，7，和8的一个或多个位置上携带甲基，从而与生育酚是相同的，除了类似植基的侧链内具有不饱和键；而且类似的是环化形成一种色原烷醇衍生物，并氧化形成生育三烯酚醌(或色原烷醇)。生育三烯酸这一名词表明了与母育酚和色原烷醇(维生素E类物质)的关系，色原烷醇这一名词表明了与维生素K和辅酶Q类异戊二烯化合物的关系。
如上所述，维生素E衍生物，阴离子磷脂与固醇能够伴随着其他脂双层形成一种类脂膜(脂双层)，该其它脂双层可以是现有的，例如，附加的磷脂。维生素E衍生物的摩尔组成大概介于脂双层组分的0.1到20％之间。更优选地说，该摩尔组成是0.1-15％的维生素E衍生物，甚至是0.1-10％的维生素E衍生物，还可以是0.1-5％的维生素E衍生物，0.1-2％维生素衍生物，甚至是约为1％的维生素E衍生物。在浓度较低的范围内，维生素E衍生物限制了中和氧化胆固醇的能力，此外还会降低其抗氧化活性。然而，在较高浓度时，它会干扰膜相。
阴离子磷脂结合蛋白(APLB)为该技术领域熟知。本发明中使用的APLB蛋白可以是天然的，或是重组的。APLB蛋白可以是完整的片段，或是具有功能的片段，也就是说该蛋白质的一个片段或区域能够如同整个蛋白质那样特异地结合到相同的分子上。还包括这种蛋白质的具有功能的衍生物。特别是，该阴离子磷脂结合蛋白可认为是包含具有功能相似的结合区域的分子。膜联蛋白是APLB蛋白的一种实例。现在可以获得多种膜联蛋白，例如公开号为2006/0134001A的美国专利申请中描述的那些膜联蛋白。首选的一种膜联蛋白是膜联蛋白V，这为该技术领域所熟知。另一种阴离子磷脂结合蛋白包括突触结合蛋白、V因子，VIII因子和乳凝集素(lactadherin)。
APLB蛋白的浓度最好介于100μg/ml到2mg/ml之间；或介于100μg/ml到1mg/ml之间，甚至是200μg/ml到400μg/ml之间，最好约为300μg/ml。
脂双层组分的浓度(例如，伴随着其他附加的脂双层组分的维生素E衍生物、阴离子磷脂和固醇)最好介于0.1mg/ml到30mg/ml之间，或介于0.1mg/ml到20mg/ml之间，或1mg/ml到10mg/ml之间，或介于3mg/ml到7mg/ml之间，甚至约5mg/ml。
阴离子磷脂(APL)也是该技术领域所熟知的。其实例包括磷脂酰丝氨酸。
在该组合物的制备期间，APLB蛋白质的浓度大于阴离子磷脂(APL)。该组合物最好通过形成脂质体制备。在APL含量高于APLB蛋白的位置将会有不完全的脂质体表层。
APL的摩尔组合物与其在生物膜内的正常生理水平相关。例如，磷脂酰丝氨酸，是一种APL，大约占哺乳动物细胞膜中磷脂含量的10％。因此，当APL是磷脂酰丝氨酸时，该组合物最好包括大约10％的磷脂酰丝氨酸。一般，该组合物大约包括10％的阴离子磷脂。其能够由单一的阴离子磷脂组成，或者由一种以上的阴离子磷脂组成。
APL的摩尔组成优选地介于脂双层组分的1至30％，或更优选地介于5至20％，甚至介于5至15％，或8至12％，最优选地甚至是大约10％。
该组合物包含一种固醇，特别是一种胆固醇或类似物，例如6-酮胆甾烷醇。摩尔组成优选地，介于5至40％的固醇，或介于10至30％，或介于10至20％，或介于13至17％，甚至约占脂双层组分的15％。该固醇最好是胆固醇。使用的胆固醇总量可选择地影响待输送物质的释放速率，胆固醇含量越高，待输送物质的释放率越低。
本发明所述的百分比组分按摩尔组成计。
本发明的组合物是在包含所承载的物质以前，以脂质体的形式制备。然后使用电穿孔的方法将所承载的物质包封进该脂质体内，然而也可以选用冻融的方法将所承载的物质封入。
本发明的组合物还包含附加的组分。在一个实施例中，该组合物还包括一种附加的脂质。该组合物还可包含一种或多种磷脂，例如卵磷脂。在一个实施例中，本发明的脂双层组分包括一种维生素E衍生物，例如生育酚，一种阴离子磷脂，例如磷脂酰丝氨酸，一种固醇，例如胆固醇和另一种磷脂，例如卵磷脂，其中，这些组分的比例如下：
维生素E衍生物：0.1-20％
阴离子磷脂：5-20％
固醇：15-30％
磷脂：30-80％。
本发明还提供了一种用于将待输送物质输送到目标位置的组合物的制备方法，该方法包括：
a)由一种维生素E衍生物，一种阴离子磷脂结合蛋白，例如膜联蛋白，一种阴离子磷脂，例如磷脂酰丝氨酸和一种固醇形成脂质体；
b)将待输送物质封进该脂质体组合物内。
优选地，待输送物质在脂质体形成时包封，或通过电穿孔、冻融、超声波或涡流等方法包封。更优选地是，在脂质体形成时包封，或通过电穿孔、冻融或超声波包封。
优选地，当脂质体的脂质浓度相当高时进行包封。这有助于提高包封效率，从而使更多的待输送物质封入在脂质体内。脂质浓度优选为10mg/ml或更多，更优选地，20mg/ml或更多，甚至是30mg/ml，最优选的是40mg/ml或更多。
本发明提供了一种维生素E衍生物，特别是其形成的本发明的组合物，作为一种载体，用于输送药剂穿过血脑屏障或穿过血视网膜屏障的用途。
本发明还提供了一种用于将药剂传递到眼睛较后面的区域的方法，包括将药剂与本发明制药组合物结合的眼睛用药方法。
本发明还提供了一种将药剂输送到中枢神经系统的方法，包括将药剂与维生素E衍生物，特别其形成的本发明相关的组合物结合，施用于需要的患者。
眼睛较后面的部位是指眼睛后部结构，包括水晶体、小梁网状结构、眼色素层(包括睫状体)、玻璃体和视网膜。特别是，本发明提供了向视网膜的改进的输送方式。
本发明的组合物可用于输送其他分子、药剂或组分。因此，该组合物可另外包含一种或多种需要输送的药剂。这些药剂可以包括具有治疗或生物活性的药剂。这些药剂还可能包括神经保护剂(例如，盐酸美金刚)、生长因子和生长因子-拮抗剂(包括抗血管原性分子)、抗体(例如Lucentis(雷珠单抗)和(Avastin)阿瓦斯汀)、适配体(例如，Macugen(哌加他尼钠))、类固醇(例如，Triamcinolone(去炎松))、分子药剂。在一个实施例中，待输送物质是α-金环蛇毒(αBT)。这可特异地标记视网膜内的动脉。因此，它可以用于评估视网膜输送。αBT可以被标记，从而更容易被检测。αBT可由任何适当的成像基元标记。在具体的实施例中，αBT由荧光素标记。
本发明的药品组合物与其预期的实施路线兼容。施药的方法为本领域技术人员所知。例如，静脉注射、腹膜内、肌肉、玻璃体内、内腔、皮下、鼻内、或局部施药。
用于皮肤内或皮下施药的溶液或悬浮液通常包括下列至少一种组分：无菌的稀释液，例如水、生理盐水、固定油类、聚乙烯乙二醇、甘油、丙烯乙二醇，或其它合成溶液；抗菌剂，例如苯甲基乙醇或甲基对羟苯甲酸酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或重亚硫酸钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，例如醋酸盐、柠檬酸盐、或磷酸盐；张度剂，例如氯化钠或右旋糖。其pH值可用酸或碱来调节。这种制剂可密封于安瓿瓶、一次性注射器或多剂量药瓶内。
用于静脉注射或玻璃体内施药的溶液或悬浮液可以包括一种载体，例如生理盐水、抑菌水、CremophorELT″″(BASF，Parsippany，NJ)、乙醇、或多元醇。在所有情况下，该组分必须是经过灭菌且容易注射的液体。使用卵磷脂或表面活性剂通常能够获得合适的流体。在制造和储存条件下，这些组分必须是稳定的。使用抗菌剂或抗真菌剂可预防微生物的生长，例如对羟基苯酸酯、二氯叔丁醇、酚、抗坏血酸、局部抗菌剂(thimerosal)等等。在许多情况下，等渗剂(糖)、多元醇(甘露醇和山梨醇)、或氯化钠可包含在该组分中。该组分的持久吸收可通过添加能够延长吸收作用的试剂实现，例如单硬脂酸酯铝和明胶。
根据本发明的该药品组分最好可以局部施药，也就是说最好以滴眼液或其他局部形式施用于眼球的表面。相应地，药品组分还可包括其他载体、媒介或辅料，例如氯化钠、氯化苯甲烃铵、一水合磷酸二氢钠、无水磷酸二钠和用于注射的水。
本发明还提供了将维生素E衍生物用作把至少一种药剂运输到中枢神经系统(CNS)的载体。维生素E衍生物可与阴离子磷脂结合蛋白结合使用，例如上述的药物组合物可用作载体。这种载体可用于传输治疗、诊断或其他药剂到大脑中。同样提供了输送这种药剂的方法。
本发明还涉及一种用于标记视网膜脉管系统的α-金环蛇毒(αBT)。这是在活体内标记的。已知αBT可结合到尼古丁乙酰胆碱受体(nAChRs)，用于间接体内标记神经肌肉结点的末端板。当用于全身时，因为它具有潜在的神经肌肉抑制作用而不能用于在体内标记。然而，在将它直接用于眼睛时没有出现这种问题。视网膜脉管系统壁，特别是其动脉，是一种包围nAChRs的肌肉环境。因此，αBT特异地标记它们。这种在眼睛内的图案标记有时是非常难以实现的。αBT最好是直接在眼睛的视网膜脉管系统用药，例如，通过玻璃体内注射。αBT可用成像基元标记，例如荧光素。
本发明还涉及将α-金环蛇毒(αBT)用于标记受试者的视网膜脉管系统的药剂制造。
此外，本发明提供了一种用于标记受试者的视网膜脉管系统的方法，该方法包括将αBT施用于受试者的眼睛。优选地，αBT直接施用于眼睛的视网膜脉管系统，例如通过玻璃体内注射。标记可使视网膜脉管系统成像，尤其可生成视网膜动脉。
下面将参考附图，通过示例的方式对本发明进行详细地描述。
附图说明
图1显示了Lucentis(雷珠单抗)成像。基线成像(标记，左侧)显示了微弱的内在488自体荧光，氩激光设置为95％的强度。上面(标记，右侧)显示了经局部的488-标记Lucentis(雷珠单抗)40分钟后，同一眼睛的成像，基线记录的激光强度相同。注意看到的荧光越多，整幅图片越亮。荧光强度的变化反映视网膜上488荧光团的增加——这仅能够归因于488-标记的Lucentis(雷珠单抗)经过眼睛后面的通道。这说明488-标记的Lucentis(雷珠单抗)可经通用药物运输系统(UDDS)载体运输，通过角膜、眼前房&眼后房、水晶体和玻璃体结构到达眼睛的视网膜神经纤维层。
图2显示了Cy3-标记的IgG成像。基线成像(标记，左侧)显示了微弱的内在488自体荧光，氩激光设置为95％的强度。上面(标记，右侧)显示了经局部的Cy3-标记IgG一小时后同一眼睛的成像，基线记录的激光强度相同。注意看到的荧光越多，整幅图片越亮。此外，看到的高荧光的聚集区域(白点)表示IgG结合到视网膜特定的结构上。荧光强度的变化仅能够归因于Cy3-标记的IgG到达眼睛后部的通道。
图3是一个与超速离心的不同样本相关的荧光强度图表。
图4是一个与体积排除的不同样本相关的荧光强度图表。
图5是一个与包封的不同样本相关的荧光强度图表。
图6是使用休珀代克斯75柱对脂质体和FITC-αBT的洗脱图。
图7是图6所示洗脱图相关的荧光图。
图8是显示与吸收率相关的磷酸盐浓度图。
图9是显示与吸收率相关的卵磷脂浓度图。
图10是显示从FPLC休珀代克斯75和休珀代克斯200柱子洗脱的1.5ml部分相关的吸收率图。
图11显示了脂质体荧光和α-BT流出G-50粗提柱的洗脱图；洗脱图分别在600nm测量混浊度，在488nm处测量荧光强度。
图12是显示与超速离心的不同样本相关总蛋白量的图表。
图13是显示不同脂质浓度对包封影响的图表。
图14是显示因脂质浓度增加产生的对光散射的影响。
图15是显示具有不同去垢剂的不同荧光素水平的荧光图表。
图16是眼睛的影像，显示了αBT特异地标记视网膜动脉。
图17显示了αBT和膜联蛋白V-776的成功释放。(A)显示了在脂质体的存在下，膜联蛋白的释放；(B)显示了被压缩的αBT的释放，(C)和(D)显示了1mg/ml的膜联蛋白V-776和50μg/mlαBT经无脂质体注射的作用。
图18是一张表示膜联蛋白V-GST高表达水平的凝胶图。
图19显示了荧光素不能够穿越完整的血视网膜屏障，残留在血管之外，如图D，E和F所示。需要强调的是，用封入的材料(A-C)不能像不用该材料(D-F)那样显示视网膜血管，尽管封入处理的眼睛在34分钟时(B)的动脉壁有轻微荧光。然而，封入材料处理的眼睛视网膜上在7分钟后出现荧光病灶斑或斑点，如图A中圆圈突出显示部分所示。如图B所示，30分钟后，荧光病灶斑的频率达到最大值，如图C所示，在74分钟后开始消散。
图20为荧光素钠(NaFl)渗漏作为室温(RT)和高环境温度(HAT)条件下，缺氧动物的血脑屏障(BBB)分裂的标志。注射了NaFl的对照小鼠切片中额皮质(上部)和顶叶皮层(下部)的脑组织内没有出现渗漏。相对地，1或2天的RT-缺氧小鼠脑组织切片的额皮质和顶叶皮层中出现中等的单病灶渗漏。高环境温度(HAT)及缺氧1或2天的脑组织切片中的脑组织里出现多个NaFl病灶区域；标尺长度为100μm。
图21是为了评估待输送物质从包封的脂质体的治疗剂释放，研发出一种每只眼睛施用500ng重组的人VEGF(rhVEGF165)的VEGF模型，这显示出血管扭曲(A，反射图像)的增加，血管的渗漏和增厚，这在注射过VEGF后24小时拍摄的荧光素血管造影中可见(B，荧光图像)。使用2.5μl治疗级的Lucentis(雷珠单抗)进行玻璃体内注射可将得以逆转这些结果(C-D)。经Lucentis(雷珠单抗)治疗的眼睛显示出与未经治疗的VEGF模型相关的缩小血管的大小恢复正常(C，反射图像)，没有渗漏和正常的血管解剖(D，荧光图像)。
图22是一些左侧玻璃体内注射VEGF-治疗的眼睛在24小时(A，C)和48小时(B，D)获得的荧光素血管造影照片。首先，经VEGF诱导同步Lucentis(雷珠单抗)治疗后24小时出现明显的炎症变化，包括严重的渗漏、随血管加厚出现的扭曲(A，C)。然而，48小时后，用包封的Lucentis(雷珠单抗)治疗动物(B)出现较大的差异，与静脉注射临床级Lucentis(雷珠单抗)的动物体内出现的大量渗漏、血-视网膜屏障破坏和大出血相比，没有出现病灶渗漏，但出现脉管炎(静脉炎)。
图23为经包封的Lucentis(雷珠单抗)治疗的眼睛显示出扭曲度减小、缩小的血管尺寸恢复正常(A，反射图像)，无渗漏和更为正常的血管解剖结构(B，荧光图像)。
图24是来自静脉注射包封的荧光素钠动物大脑中类似区域的图像(A-B)，与一个仅静脉注射荧光素钠的图像(C-D)。显示了荧光(A，C)和发射(B，D)图像。显然，注射包封材料的动物大脑显示有荧光，而仅有荧光素钠静脉注射的大脑则无信号(C)。
具体实施方式
实施例
传输机制
物理屏障，例如角膜上皮和血脑屏障和血视网膜屏障的内皮细胞层由多层紧密粘合的细胞组成。细胞(角膜或血脑屏障BBB)之间的连接受蛋白复合体调节，构成限制化合物运动的紧密连接。这些连接的选择性取决于上皮组织的特异类型，通常亲水性药物或小分子量(100-200Da)的离子能够利用旁细胞途径。亲脂性药物能够通过血脑屏障的内皮细胞层渗透，但其运输仍然仅限于分子量小于400Da。在角膜中，基质成为亲脂性药物的一个额外的屏障，阻止亲脂性药物渗入眼睛较后面的部位。
胞吞转运作用允许分子选择性地穿过上皮细胞。推测该机制是由大分子复合物和病毒能够穿过上皮细胞，具有与脂质体的共性(100nm磷脂包封的结构)。
通过上皮组织表面上的网格蛋白有被小窝或瓶状内陷的胞吞转运作用进行，称为细胞膜穴样内陷。网格蛋白有被小窝依靠受体介导的内吞作用，而细胞膜穴样内陷是由胆固醇和细胞膜蛋白、小窝蛋白介导。细胞膜穴样内陷中胆固醇的本质特性与运载系统内胆固醇有关。
在没有特定的理论限制下，发明人认为本发明的组合物可刺激/利用细胞膜穴样内陷的胞吞转运作用途径，从而能够穿过上皮和内皮细胞。氧化胆固醇的出现也可能与正常胆固醇的作用相反，抑制细胞膜穴样内陷的功能，同时，维生素E衍生物的存在能中和氧化胆固醇的抑制作用。该假说由最近报道的进一步支持，将膜联蛋白V视作一个细胞膜穴样内陷相关蛋白。
穿过血脑屏障
由于大多数药物在活的有机体内不能穿过血脑屏障，能够穿过血脑屏障的仅局限于高脂溶性和小于400-500道尔顿(Da)的低分子量小分子，所以全球脑药物市场是不发达的领域。所有药物的中具有这些化学特性的小分子数量小于2％。其他药物不能穿过血脑屏障。没有解决血脑屏障问题，98％以上具有潜在地治疗大脑的药物还未发展。严重紊乱疾病患者，例如老年痴呆症、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿疾病、帕金森氏综合征、中风、大脑和脊柱损伤、脑癌和多重硬化会发生复发，具有少量新药，包括神经保护剂。传输大分子的能力也允许重组蛋白质、抗体和RNA/DNA分子能够运输到中枢神经系统内的目标位点。
人们认为血脑屏障是一个问题，许多战略已用于从血液传输化合物到大脑。这些包括基于神经外科的策略——通过脑室注射灌输或脑内移植的完全侵入，以及通过注入高渗溶液或生物活性试剂，例如血管舒缓激肽来暂时破坏血管内皮细胞层的紧密连接，但问题是具有传染和神经病理学变化的风险。为了能够运输穿过血脑屏障，使用脂质化穿过具有脂溶性结构的水溶性药物上的极性功能基团的连接，或是通过脂溶性药物载体，或药物再生成为脂溶性药物前体。
本发明的组合物可用于将神经保护剂和其他活性药剂运输穿过血脑屏障。
组合物的制造方法
脂质体的制备
脂质体通过脂质薄膜再水化的方法制备。溶于氯仿∶甲醇(5∶1，v/v)的亲脂的脂质(卵磷脂(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、胆固醇和α-生育酚)在用氮气吹干溶剂前以适当的量混合。工作范围是15-30％的胆固醇(最好是15％)、5-20％的磷脂酰丝氨酸(最好是10％)和0.1-20％的维生素E衍生物(最好是1％)，剩下的部分由卵磷脂组成。获得的脂质薄膜再水化，溶于适当体积的缓冲液中(PBS±荧光团/待输送物质)。配制含储藏液浓度为52mM的脂质体，随后在UDDS中稀释为6.5mM浓度的工作液。
雷珠单抗(Lucentis)或任何蛋白质的荧光标记
雷珠单抗(ranibizumab)是靶向血管内皮生长因子A(VEGF-A)的人单克隆抗体片段。抗体的蛋白质属性允许将荧光染料与特异的氨基酸结合。用0.1M，pH8.3的重碳酸钠缓冲液冲洗Lucentis(雷珠单抗)(10mg/ml)，将浓度调节到约2mg/ml。使用100μg的alexafluor 488(琥珀酰亚胺酯，溶于DMSO)在室温进行标记反应，标记蛋白质的任何主要氨基位点(赖氨酸残基和N-末端)。由于药物仍然受专利保护，所以无法得到蛋白质公共结构域的氨基酸序列，用于标记的主要胺基数量是未知的。通过凝胶过滤移除未结合的染料，标记的Lucentis(雷珠单抗)洗脱入1×PBS pH7.4。通过蛋白质的光谱学分析获得以下结果。
在280nm(0.215AU)和488nm(0.128AU)处的峰代表充分水平的标记。然而，由于缺乏序列信息，所以无法确定标记的实际浓度和化学当量比。
电穿孔包封(首选方法)
为了确定药物是否能利用该组合物被运输到眼睛后端，使用电穿孔的方法由该组合物包封过量的Lucentis-488(雷珠单抗)。常规的包封、冷冻/融化法会导致蛋白质变性。将15μl雷珠单抗(Lucentis)添加到50μl组分中，并转移到一个0.1cm大小缺口的基因电转杯中，后者常用于细菌和哺乳动物细胞的转化。该电转杯在下述条件使用伯乐公司的电转仪进行电脉冲：2.5kV，25μF和200Ω。在常规使用中，电脉冲使小分子(通常是质粒DNA)穿过细胞的磷脂膜。因为脂质体具有与细胞膜相似的结构，所以该方法可能是一种能够成功替代冷冻/融化法的包封方法。
冻融法包封
冻融法包封是在有待输送物质存在的情况下，通过在液氮中冻结载体进行的，然后在固定流速的热水中融化样品。重复10次后，在合理的时间段内可获得最佳的包封。该方法对于单分子样品来说是很好用的，但是会引起复杂分子，例如蛋白质的变性。
去除未包封的荧光团
通过60000×g超速离心45分钟去除未包封的荧光团。弃掉上层清液，将沉淀重溶于新鲜的PBS缓冲液。
添加阴离子磷脂结合蛋白
在操作前，将加载的脂质体与阴离子磷脂结合蛋白膜联蛋白V混合，使脂质体的终浓度为5mg/ml，膜联蛋白V的终浓度为300μg/ml。脂质体和膜联蛋白的浓度变化可用于实现不同的运输水平。由于稳定性问题，可使用的膜联蛋白最大浓度为2mg/ml，20mg/ml浓度的脂质体剂量可提高栓塞发生。
体内成像
使用眼底激光扫描共聚焦(cSLO)对麻醉动物(黑色刺鼠)成像。每个动物拍摄一张荧光基线照片。简单地说，在cSLO前对动物进行定位，然后对眼睛内部成像。一个波长为488nm的氩激光被聚焦成为一个小点，通过一对镜子激发该波长上的荧光团沿视网膜进行扫描。获得的荧光聚集在共聚焦孔上，共聚焦孔具有排除感兴趣的深度平面上方或下方的平面中不想要的荧光。在视网膜神经纤维层平面成像。因此，基线图像仅记录内在的488自发荧光，其氩激光设置为95％的强度。
记录基线图像后，10μl包封的488标记Lucentis(雷珠单抗)局部施用于小鼠眼睛。局部处理40分钟后，在相同基线设置处对眼睛在此拍照——例如，488nm波长处氩激光强度为95％。拍照记录内在488自发荧光(作为基线)，以及任何到达视网膜神经纤维层平面上488-标记的雷珠单抗。
Cy3-标记的IgG成像
将10μl本发明包封的Cy3-标记的IgG局部施用于小鼠眼睛后，记录基线图像。Cy3是一种众所周知的荧光染料，经氩激光激发后能够检测出来。局部施药于眼睛1小时后，在相同设置下对眼睛再此拍照作为基线——例如，488nm波长的氩激光95％强度。然后拍照记录内在的488自发荧光(作为基线)，以及任何到达视网膜神经纤维层平面上的Cy3-标记的IgG。
上述结果说明了用于传输功能性抗体到眼睛较后面部位的系统的潜力，因此证明了抗体衍生的治疗药剂运输的潜力。
A.广谱药物运输系统(UDDS)技术的发展
1.用于运输待输送物质的广谱药物运输系统(UDDS)的改良
用于成功地运输待输送物质的组分包括维生素E衍生物、卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、胆固醇和膜联蛋白。在该过程的改良中，对允许不同的待输送物质/组成比例、纯化与包封方法进行了如下改良：
(i)移除未包封在内的物质
评估成功包封的主要挑战是获得可靠的能有效移除未包封在内的物质的方法。已经筛选了下文列出的几种方法。
a)超速离心
以60000g的速度对脂质体进行超速离心会使脂质体变成小球，与任何包封在内的物质一起落下。而单个分子不能在该离心速度中沉淀下来，保留在上清中。弃上清，用新鲜缓冲液重悬沉淀。重复几次清洗样品的过程，直到上清不含有大量的未包封物质。
每次清洗耗时45分钟，5次清洗后即可去除大量的未包封物质(见图3)。图3中的∞表示荧光团读物是渗透的。
b)体积排除法
柱子
将样品加载到能够根据分子大小分离分子的柱子上。大分子结构，如脂质体，能够快速穿过，而小分子则有延迟。例如，对于荧光素来说，一次性Pd-10柱的截留分子量为5000da。
这些方法的最优化显示了尽管过柱一次后能够移除绝大多数的未包封物质，但仍需要进行二次过柱以提高精确度(见图4)。
透析
将样品加载入具适当分子量的大小的细孔的透析袋中。体积大于孔的颗粒被截留在透析袋中，例如脂质体，而体积小于孔的颗粒则能够自由扩散进入更大体积的溶液中。透析过夜，甚至在两次透析步骤后仍会有相当大的背景荧光。
b)包封
研究确定了最适合的纯化方法，同时还研究了包封低分子量化合物的不同方法。这些方法包括：
(i)将脂质体置于化合物内；
(ii)涡旋；
(iii)超声波降解；
(iv)冻融；及
(v)电穿孔。
由于荧光素具有较高的离子特性，所以在低盐环境中与电穿孔具有不相容性。
涡旋样品产生非常小的包封体，而超声波降解、冻融和预制成型的脂质体都产生显著包封(见图5)。
2.不同待输送物质的优化组分
根据分子质量分级的待输送物质具有三条带：低分子量的荧光组分，例如荧光素钠(Mwt：376.28da)；中等分子量的组分，例如αBT(8000da)和雷珠单抗(48000da)；以及高分子量组分，例如阿瓦斯汀(149000da)。使用体积排阻分离柱系统的一个优点是它可以使用具有特定截留分子量的不同树脂。
为了分离未包封的αBT，发明者选择尝试使用休珀代克斯75柱，它能够分离3000至70000da的蛋白质。最初，使用荧光素包封的脂质体来添加柱子，确定流出柱体的脂质体部分。图6(上)的方框所示的是脂质体的峰。用FITC-αBT装载分离柱。图6(下)的方框表示流出柱体的αBT的部分。
图7所示的结果显示Superdex 75柱具有足以分离包封和未包封的αBT的分辨率。
特别有意义的是，从大分子量的蛋白质中分离脂质体的能力，例如抗体，特别是治疗药剂，如雷珠单抗(48000da)和阿瓦斯汀(149000da)。使用一个休珀代克斯200柱子能够实现分离10000到600000da范围内的分子。
从Pd10重力柱到FPLC的休珀代克斯柱改造体积排阻柱，发明者遇到了样品损失等问题。这可能归因于一系列原因，例如脂质体破裂。为了能够观察这一现象，发明者采用检测磷酸盐水平的方法确定磷脂的水平。
磷脂的定量
用5M的HCl处理样本，用罗丹明B和仲钼酸铵的混合物孵育，以提供一个相对于磷酸盐浓度的吸收值。溶液中磷酸盐的量直接反应了磷脂水平。
发明人优化了磷脂分析法。图8显示了在555nm处的吸收值和相应的磷酸盐浓度。
该方法可用于检测下图所示的磷脂分子“头部”内的磷酸基团。这使得我们能够确定体积排阻柱中的哪部分含有包封的脂质体。因此，该方法可用于检测包封效率(见图9)。
FPLC休珀代克斯-75和休珀代克斯-200柱
脂质体样品流经FPLC休珀代克斯-75和休珀代克斯-200柱，每1.5ml收集一份流出部分。如图10所示，当超速离心和磷脂分析显示与缓冲液对照相比有极微量的磷酸盐时，这些部分都没有产生预期的脂质体颗粒。
图10中所示的吸收值低于FPLC检测柱灵敏度的下限，证实FPLC不适用于脂质体纯化。
G50粗制树脂
重力PD-10柱的局限是截留分子量(MWCO)为5000Da，这意味着不能分离差异大于5000Da的不同化合物。其他树脂，例如G-50粗制树脂的截留分子量(MWCO)大于30000Da，从而能够从脂质体中分离小蛋白，且不会引起脂质体破裂。
一种更精确且不复杂的确定脂质浓度的方法是基于溶液的混浊度，凭借脂质体在600nm处的散射光来确定它们的浓度。
脂质体、荧光素和α-BT的样品穿过G-50粗制树脂柱，洗脱物分别在600nm处检测混浊度，在488nm处检测荧光强度。
图11显示了分离柱分离荧光素的能力，表示柱子正确包装没有泄露，然而脂质体与αBT之间的分辨率是不够的。由于大的色谱柱成本较高，所需昂贵的树脂数量较多，所以需要再次使用超速离心法分离。
超速离心
使用荧光素超速离心会遇到的问题主要是浓度依赖的。足量的染料会限制该过程的效率，α-BT和Lucentis(雷珠单抗)等蛋白质的使用浓度较低，需要较少次数的清洗。
最初的包装方法使用的是超声波降解法，适合最终体积的小球荧光性提供一定量的总包封蛋白。
超速离心法能够移除自由的蛋白质，约1μg的小球内最初附加10μg会获得大约10％的包装(见图12)。
在我们的体内α-BT滴定结果的基础上，取5μl的浓度为50μg/ml的量是最优剂量，代表添加0.25μg。从这些包装的结果可见，200μl里含有1μg，因此需要50μl眼药的100％传输。
包封效率
为了制备更可行传输目标，发明者尝试进一步提高包封效率。其中有三种可能的方法：
提高初始的α-BT浓度
Figure BPA00001479298300162
提高脂质浓度
Figure BPA00001479298300163
采用可选的包封方法，例如冻融和电穿孔。
提高α-BT的浓度仅能轻微提高包封效率。
图13中，从A&B到C&D到E&F的移动差异较A&B，C&D或E&F两个柱形图之间的差异明显，说明脂质浓度的提高会明显增加包封的程度。
光散射
很难计算包封程度的精确值，随着高浓度的脂质溶液的混浊度干扰荧光读数，光散射增加，从而减少荧光信号(见图14)。
图14显示了在较低的脂质值时，光散射对荧光影响较大，说明包封效率可能大于首次提示的10％。
脂质体破裂
为了精确确定包封值，荧光素与缓冲液和脂质体，以及不同去垢剂包括十二烷基磺酸钠(SDS)、NP40、吐温-20(Tween-20)和曲拉通X-100(TritonX-100)一起孵育。
图15可见，去垢剂的存在降低了含有缓冲液和荧光素样本中的整个荧光信号，这是最为明显的高荧光强度的影响。去垢剂的存在，特别是SDS的存在，由于脂质光散射的影响会减少荧光信号的损失。使用1％的SDS并限制荧光产量，在200000AU以下测量，发明者能够精确测量待输送物质的包封效率。
B.通用药物运输系统(UDDS)的体内检测
1.成熟向视网膜输送的新方法
为了评估不同通用药物运输系统(UDDS)组分的功效，发明者确定了一种新型的αBT标签来评估视网膜运输。αBT(购自Sigma(T9641))能够特异地标记视网膜内的动脉，如图16所示，从而是一种极好的标记。
2.待输送物质的释放
为了评估包封材料的释放，通过玻璃体内注射含有包封的αBT和膜联蛋白V-776的脂质体，3小时后对眼睛进行成像。
图17显示了αBT和膜联蛋白V-776的成功释放。(A)显示了在脂质体存在时膜联蛋白的释放，(B)显示了包封的αBT的释放，而(C)和(D)显示了在没有脂质体存在的情况下注射分别1mg/ml的膜联蛋白V-776和50μg/mlαBT的影响。包封的αBT的信号强度较自由的αBT有所减少，但释放效率可引出特异的动脉标记。
3.膜联蛋白的产生
发明者获得了膜联蛋白的密码子优化序列。如图18所示，新系统表达高水平的膜联蛋白V-GST，允许产生大量的膜联蛋白用于静脉输送。
4.静脉输送——用于血脑屏障(BBB)&血视网膜屏障(BRB)
A.血视网膜屏障(BRB)
a)荧光素钠向视网膜的静脉输送
主要目的是为了显示包封的物质穿过血脑屏障和血视网膜屏障的成功输送。已经建立了优化的通用药物运输系统(UDDS)的包封和释放法，已对通用药物运输系统(UDDS)向视网膜和大脑输送荧光素钠的能力进行了评估。
对小鼠经尾静脉注射300μl 5％的荧光素钠或1ml 0.2％包封的荧光素钠，并检测其视网膜。使用上述超速离心法和PD-10柱子分离移除自由的荧光素。
荧光素不能穿过完整的血视网膜屏障，仍隔离在血管外，如图19(D，E和F)所示。需要强调的是具有包封物质(A-C)的视网膜血管和没有包封物质(D-F)一样不可见，尽管在34分钟时包封治疗的眼睛内有细微的动脉壁荧光。然而，如图A中圆圈强调的那样，包封物质治疗的眼睛在7分钟后，视网膜上出现荧光聚焦斑或荧光点。图B中显示了30分钟后，这些荧光斑的频率达到最大值，如图C所示，74分钟后，荧光斑开始消散。在用没有包封的物质治疗的眼睛中没有出现荧光斑。荧光聚焦斑是含有荧光素的完好无损的脂质体。这些荧光斑的本地化说明完好无损的脂质体被运输到视网膜处。还证实了仅被包封的荧光素穿过了血视网膜屏障(BRB)。荧光素钠荧光斑或“单聚焦泄漏”的出现与大脑中血脑屏障的破裂时的情况类似(见图20，参考Natah，S.S.et al.J Appl Physiol 107：1348-1356 2009)。
b)评估治疗剂释放的血管内皮生长因子(VEGF)模型的发展
为了评估从眼睛中包封的脂质体里的治疗剂的释放，研制出一种每只眼睛使用500ng的重组人血管内皮生长因子(VEGF)(rhVEGF165)的VEGF模型。图21显示了经VEGF注射24小时后进行荧光素血管造影(B，荧光成像)的一只血管扭曲度增加(A，反射成像)、渗漏和血管加厚的眼睛。经玻璃体内注射2.5μl的治疗级Lucentis(雷珠单抗)可逆转这些影响(C-D)。与未治疗的VEGF模型有关，经Lucentis(雷珠单抗)治疗的眼睛显示了血管大小归于正常(C，反射图像)、无渗漏和正常的血管解剖结构(D，荧光图像)。
c)雷珠单抗(Lucentis)经静脉注射输送到视网膜
由于Lucentis分子量较大，不能穿过血视网膜屏障，所以不适合静脉注射。该研究是为了观察包封的Lucentis(Lucentis UDDS)能够经静脉注射成功地穿过血视网膜屏障输送到视网膜。实验动物的一只眼睛经VEGF治疗，另一只眼睛不予治疗。当用VEGF治疗时，小鼠静脉注射1ml包封的Lucentis(A，B)或300μl临床级Lucentis(C，D)。由于包装效率，更大体积的包封材料可减少Lucentis的浓度。
图22显示了从左侧玻璃体内VEGF治疗眼睛后24小时(A，C)和48小时(B，D)后拍摄的荧光素血管造影。首先，明显可见Lucentis与VEGF的同步治疗在24小时会诱导产生较强的炎症变化，包括严重的渗漏、血管增厚产生的扭曲(A，C)。然而，在48小时，用包封的Lucentis治疗动物(B)体内则产生较大的差异，没有焦点泄漏区域，但与大量渗漏相比，静脉注射临床级Lucentis的动物会出现脉管炎(静脉炎)、血-视网膜屏障破坏和大出血症状。这有力地表明48小时后包封的Lucentis已经释放，具有逆转性变化的治疗效果。这说明在此期间，Lucentis能够持久地/延时释放，成功穿过血视网膜屏障。
同时还评估了玻璃体内注射VEGF后经静脉注射包封的Lucentis的效果(见图23)。经VEGF注射28小时后进行荧光素血管造影术(B，荧光成像)。实现VEGF作用的逆转。经包封的Lucentis治疗的眼睛中扭曲减少、血管大小也减小到正常水平(A，反射成像)，无渗漏，具有更为正常的血管解剖结构(B，荧光成像)。
这些都说明了包封的Lucentis能够穿过血视网膜屏障，并具有疗效。
B.血脑屏障
静脉注射输送荧光素到大脑
300μl 5％的荧光素钠或1ml 0.2％包封的荧光素钠通过尾静脉注射到小鼠体内，然后检测其视网膜。利用上述超速离心和PD-柱子的方法移去自由的荧光素。2小时后，经常规麻醉术，用4％的仲甲醛固定动物。大脑储存于4％的仲甲醛中固定过夜，然后做800μm厚的切片，在荧光共聚焦显微镜下镜检。
荧光素钠不能穿过完整的血脑屏障；这是一些实验的基础，包括先前Natah.S.S.等提到过的研究(JAppl Physiol 107：1348-1356，2009)。
图24中所示的图片来自静脉注射包封的荧光素钠(A-B)动物大脑相同区域，与仅静脉注射荧光素钠(C-D)的实验动物比较。同时显示了荧光(A，C)与反射(B，D)成像。显而易见的是，仅包封的材料显示出荧光(A)，而仅静脉注射荧光素钠的大脑则无任何信号(C)。这证实了包封能够使荧光素钠穿过血脑屏障。
此外，如典型的荧光图像(E，G)和相应的反射图像(F，H)所示，只有包封的材料具有荧光斑。荧光斑的出现或荧光素钠的“单焦点渗漏”与大脑发生血脑屏障破裂时的情况类似，先前已有讨论(Natah，S.S.et al.J ApplPhysiol 107：1348-1356 2009)。

Claims (21)

1.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含一种维生素E衍生物、一种阴离子磷脂结合蛋白、一种阴离子磷脂和一种固醇。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物还包含需要运输的“待输送物质”。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述的维生素E衍生物为生育酚。
4.如上述任意一项权利要求所述的药物组合物，其特征在于，所述的阴离子磷脂结合蛋白是一种膜联蛋白。
5.如上述任意一项权利要求所述的药物组合物，其特征在于，所述的阴离子磷脂是磷脂酰丝氨酸。
6.如上述任意一项权利要求所述的药物组合物，其特征在于，所述的固醇是胆固醇或6-酮胆甾烷醇。
7.如上述任意一项权利要求所述的药物组合物，其特征在于，所述的维生素E衍生物的量与能够形成脂双层的组分的量相比为0.1-20％。
8.如上述任意一项权利要求所述的药物组合物，其特征在于，所述的阴离子磷脂的量与能够形成脂双层的组分的量相比为5-20％。
9.如上述任意一项权利要求所述的药物组合物，其特征在于，所述的固醇的量与能形成脂双层的组分的量相比为15-30％。
10.如上述任意一项权利要求所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物还包含一种附加的磷脂，其中，该附加的磷脂的量与能形成脂双层的组分的量相比为30-80％。
11.如上述任意一项权利要求所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物还包含一种附加的磷脂，其中，每个组分的量与能形成脂双层的组分的量相比为：
维生素E衍生物：0.1-20％；
阴离子磷脂：   5-20％；
固醇：         15-30％；
附加的磷脂：   30-80％。
12.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的“待输送物质”是α-金环蛇毒。
13.一种用于将“待输送物质”运输到受试者的组合物的制备方法，其特征在于，该方法包含：
a)由一种维生素E衍生物，一种阴离子磷脂结合蛋白，例如膜联蛋白，一种阴离子磷脂，例如磷脂酰丝氨酸和一种固醇形成脂质体；
b)将“待输送物质”包封于上述的脂质体中。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，当“待输送物质”被包封时，磷脂浓度为20mg/ml以上。
15.如权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，所述的待输送物质通过在脂质体形成时包封，或通过电穿孔、冻融、声波降解法或涡流包封。
16.如权利要求1～12中任意一项所述的组合物可用于治疗。
17.如权利要求1～12任意一项所述的维生素E衍生物或组合物作为载体使用，将一种药剂通过血脑屏障或血视网膜屏障输送。
18.一种用于将药剂传递到眼睛较后面的区域的方法，其特征在于，该方法包含将药剂与权利要求1～12所述的药物组合物一起施用于眼睛。
19.一种将药剂输送到中枢神经系统的方法，其特征在于，该方法包含将药剂与权利要求1～12任意一项所述的维生素E衍生物或药物组合物一起对需要的患者用药。
20.用于标记受试者的视网膜内脉管系统的α-金环蛇毒(αBT)。
21.一种标记受试者的视网膜脉管系统的方法，其特征在于，该方法包含将αBT施用于受试者的眼睛。
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