CN102639987A - 细胞观察仪器 - Google Patents

Abstract

一种用于注满液体的待检测样品的细胞观察仪器，该仪器包括一具有容纳样品腔体的流通单元（21），流通单元（21）中设有可供液体流入和流出的腔体，液体从腔体入口（22）流进，流过样品后从腔体出口（23）流出，腔体入口（22）与流体供应线相连，第一流体输送管（24）通过阀门（39）与流体供应线相连通，第一流体输送管（24）用于接受来自压力源的压力，压力源为储蓄容器（29），使得液体能以设定的流速流过腔体。

Description

细胞观察仪器

技术领域

本发明涉及一种细胞观察仪器，尤其是涉及一种在观察时其中营养流体被灌注以维持培养细胞的细胞观察仪器。此外，还涉及一种在流体灌注下观察的方法和一种鉴定药物的方法。

背景技术

灌注系统用于需要营养培养基持续不断的流动的一定范围存活的细胞。

共聚焦显微镜是一种被用来增加显微对比技术和/或通过有效消除样品中聚焦光来重建三维图像的技术，样品厚度大于理论上的焦平面。该技术在需要观察细胞变化的生命科学中很受欢迎。很清楚的是，在传统的显微镜，即具有宽广视野的荧光显微镜中，整个样品中充斥的来自光源的亮光。这种情况下，在焦平面上的样品的所有部分被激发，生产的荧光由光电探测器或摄像机检测到。在聚焦显微镜中，点光源和有效的小孔设置在检测器前的光学共轭平面上，这样可消除焦点信息。在这样的情况下，只有由荧光产生的光接近焦平面才能被检测到。由此得到更优于广角显微镜的图片。然而，使用该项技术过程中，但从样品上发出的荧光很多被遮挡。因此，为了获得足够的光信号强度，通常需要更长时间的曝光。采用更长曝光时间情况下，为了获得好的图像和测量，需要样品在非常稳定的条件下来观察。

当培养细胞被测试时，应该处于相一致的环境条件下，以获得最佳的实验结果。对人工培养细胞提供一个持续的但不规律的新鲜培养基，本身可能在通过聚焦显微镜观察时形成细胞图片的变化或简单删去所形成的图片。可以理解为，不仅提供给人工培养细胞的培养基保持稳定流速很重要，而且恒定的温度、pH值和如与含氧量等方面的组分保持一致是观察的最基本要求。许多向人工培养的细胞输送培养基的方法已知包括使用蠕动泵。不幸的是，蠕动泵会在传送流体过程中产生压力脉冲，因此偏离所期望得到的培养基的稳定的层流。在早期的关于常规观察细胞显微镜仪器的技术中，同样也存在固有的问题，例如利用一个单一重力给及压力系统意味着很难维持培养基处于期望的温度下，施加的压力取决于在容器中培养基的体积，很难将这样一个系统连接到压力泵上。其他技术利用注射泵系统，同样很难通过依靠一个泵来实现控制所有的独立的容器，即所有注射气瓶，每个每个容器内保持相同温度取决于注射气瓶，同样使用注射气瓶的花费会很大。

基于上面所述的观点，意识到很难提供一种用于观察人工培养细胞或类似物质的培养基持续的层流。此外，通常认为渴望观察人工培养细胞向外部变化的反应，比如显示在流向人工培养的细胞的培养基流体中离散药物的数量，而图像上再也没有出现因切换而造成的再次干扰，切换发生在在基本或循环流动和投放剂量药物或其他系统性循环改变之间。

发明内容

根据本发明第一方面，我们提供一种用于灌注待检测样品流体的细胞观察仪器，该仪器包括一具有腔体的流通单元，腔体内用于容纳样品，腔体上设有腔体入口和腔体出口，流通单元被设置用于接受流体从腔体入口到出口穿过所述腔体直接从样品上流动；腔体入口与流体输送线相连，第一流体输送管道通过阀门和流体输送线连通，仪器中还包括一个对第一流体输送管道提供压力的压力源，所述压力源包括一个用于存储加压流体的蓄压器。

其中优点在于将蓄压器作为缓冲区，储藏大量的加压流体用于吸收由泵产生的压力脉冲，例如，压力脉冲将影响流过流通单元的流体的流速。另外，蓄压器有助于维持仪器内处于恒温状态，因为泵入到容器中空气或任意其它流体温度需要时间来达到与已经储蓄在蓄压器中的气体/流体形成平衡。

优选，蓄压器接受来自泵的压力，蓄压器用于充分减少来自泵的压力脉冲。因此，蓄压器的尺寸取决于所需要的流速，也取决于选用的泵。

蓄压器能吸收来自泵的压力脉冲，在完成再注入前，蓄压器中不需要足够用于完成整个检测用的尺寸。因此，流体可以持续几天不间断流入流通单元中，这在特定的测试中是必须的，蓄压器可以在基本上不影响流过流通单元流体流速的情况下，进行再注入。

优选，第一流体输送管道包括第一蓄液容器，所述第一蓄液容器包括隔膜，当接收到来自蓄压器中的压力时，隔膜将推动流体的流动。该隔膜形成了一个“气体加压排代装置”，其独特优点在于，提供了将压力转移到第一蓄液容器中的流体上较经济的方法。进一步，隔膜确保驱动流体，即压缩空气不会污染流体，例如设置在第一蓄液容器中的系统循环流体，因为它提供了一种不会渗水的屏障。

优选，第一流体输送管道包括系统循环供应线和第一蓄液容器，所述第一蓄液容器中容纳系统循环流体。其优点在于，仪器能维持设置在流通单元中人工培养细胞稳定，并使其能被更可靠的观察到。

优选，仪器中设有至少一个以上通过阀门和流体输送线相连接的额外流体供应管，所述一根或一根以上的流体供应管和额外压力源相连接。其优点在于，额外流体供应管可以有选择的将不同流体输送到流通单元中。第一压力源和额外压力源可以包含同样的压力源。优选的，所述一根或每根额外流体供应管用于对额外供应管内容物提供压力。或者，所述一根或每根额外流体供应管包括流体容器和隔膜，隔膜用于当压力源出来的压力作用在其上时候，驱动从流体容器中流出的流体。

优选，所述一个或每个额外流体供应管中包括缓冲井（well）设置在与之相连的阀门和流体输送线之间，所述缓冲井的设置用于降低压力脉冲对阀门驱动装置产生的冲击。其优点在于，缓冲井可以在流体进入流体输送线前将流动流体接收，有助于当打开额外供应管时，确保流体平稳流动。优选的，所述一根或每根额外供应管被设置连接流体输送线，连接角介于90°至180°之间。优选的，额外供应管和流体输送线之间的连接角为120°。可以发现，这样有助于提供平稳的流动。

优选，至少一个额外流体供应管中包括一用于接受即将引入到腔体中的药物的剂量供应管。其优点在于，仪器可以用来观察药物对人工培养的细胞产生的影响和有效药物的鉴别。

优选，蓄压器包括压缩空气存储容器。在仪器中使用压缩空气需要与外部有最基本的连接和供给。例如，隔膜确保空气不会污染系统循环流体。

优选，流通单元包括用于接受检测装置的观察窗；检测装置包括用于检测包含在腔体内的样品的聚焦显微镜，或用于检测包含在腔体内的样品所发出荧光的荧光检测器，以及其它合适的检测器。其优点在于，仪器所提供的稳定的流体流动确保了通过显微镜或其他检测器能进行可靠的观察和/或测量。检测器输出结果可以是一张图片、一系列的图片、测量数据、图表或是其他任何恰当的输出结果或输出结果的组合。应当理解的是，任何合适类型的检测器都可以用于通过观察窗收集到所需的数据，因为该仪器可以使样品很好的持续展示，而不受到流动流体的影响。

优选，其中所述一个或每个流体供应管上设有流量调节装置。其优点在于，流量调节装置确保提供给流体输送线的压力基本稳定不变。

优选，其中额外流体供应管通过公用的多接口歧管被提供压力。这为额外流体供应管提供了一种简单连接，以被安装在仪器上。

优选，流通单元包括设在两个盖片部件之间的圆环。优选，腔体入口具有围绕着腔体边缘间隔设置的多个注射孔。所述多个注射孔的方向指向腔体中心位置或注射孔之间相互平行。注射孔可以是多种不同大小的尺寸。

优选，其中腔体入口用于提供从流通单元的一侧流向另一侧横穿的层流流体。优选，其中腔体为圆形、菱形、或椭圆形。

优选，细胞观察仪器在密封的环境下使用，使得仪器处于近似恒温的状态。其具有优点，因为温度阶梯会对可靠度产生不利的影响。由于仪器中使用压缩空气和预先充入流体的容器，只需要一个和电源连接，这将使得所述仪器在温度控制盒中安装更加简便。

一种使用注满流体的仪器进行观察的方法，包括以下步骤：

a）向第一流体容器加入系统循环流体；

b）向储蓄容器中注入加压流体；

c）将待观察的样品放到流通单元的腔体中；

d）利用来自储蓄容器的加压流体使得流动的流体穿过流通单元的腔体；

e）检测样品。

其优点在于，观察仪器（其具有测量功能、计算功能、成像功能和观察功能）在相对稳定的环境下运行，稳定的环境包括整个系统循环流体稳定地流过流通单元。进一步，加压流体通常选用空气，由于和外界连接最少，故该方法很容易实现。

优选，其中步骤e）中还包括使用共聚焦显微镜观察样品或使用荧光检测器检测样品发出的荧光。

该方法还包括调整至少在第一流体容器中的流体的流速，并作进一步观察。

该仪器中还包括含有剂量流体的额外流体供应管，该方法包括以下步骤：

i）引入剂量流体，以及；

ii）检测剂量流体对样品产生的影响。

优选，方法中还包括在引入剂量流体之前暂时降低系统循环流体的流速，当引入剂量流体的时候，流速增加以提示观察者剂量流体已经被引入。优选，该方法包括将流体流速增加至和暂时降低系统循环流体流速之前的流速相同水平。

优选，该方法中包括将剂量流体加入到系统循环流体中的步骤，在剂量流体加入的过程中，保持流体以恒定流速流过流通单元。

优选，该方法中还包括在引入剂量流体时，同时开启与系统循环流体和剂量流体相连接阀门的步骤。因此，在引入剂量流体时，恒定流速的流体穿过流通单元。

优选，该方法还包括在检测样品前，仅将仪器连通外部供应电源，即电力供应源。

优选，该方法包括当流体流过流通单元时，向储蓄容器中充入加压流体的步骤。该步骤是可行的，因为蓄压器吸收任何由泵或类似设备——其将加压流体充入蓄压器——产生的压力脉冲。

优选，该方法使用本发明第一方面所提及的细胞观察仪器实施。

根据本发明第三个方面，我们提供一种鉴别或研究药物的方法，包括以下步骤：

a）将细胞放置在流通单元中；

b）系统循环流体以基本恒定的第一流速流过细胞；

c）在维持流体以基本恒定的第一流速流过流通单元的情况下，将选用的第一药物剂量流体加入；

d）观察药物对细胞产生的影响；

e）如果药物对细胞产生的影响符合制定的标准，鉴别药物。

 该方法的优点在于，提供了一种可靠的鉴别药物的方法，很容易检测药物和细胞之间的相互作用的影响。

该方法中包括进行动力学测试。尤其是，细胞可能受到化学品或抗体或蛋白质的影响，并且化学品如何与受体结合或分离能测量/观察到。

或者，方法还包括引入第一物质灌注到细胞中，并观察第一物质对细胞所产生的影响；在第一物质基础上，引入第二物质灌注到细胞中，然后观察第二物质对细胞中的第一物质产生的影响。

优选，该方法还包括引入第一物质灌注到细胞中的步骤，在“冲洗”阶段稀释第一物质，并观察其对细胞产生的影响。优选，该方法步骤中还包括在“冲洗”阶段中引入不同于第一物质的第二物质，观察带来的对的细胞变构效应。因此，其中在这个特定的应用中允许进行稀释到无限稀的程度进行应用，以至于可以实时监测将细胞中的第一物质“冲洗”。此外，假设在冲洗阶段中使用了第二物质，在清洗第一物质时，可对物质产生的变构效应（第一物质对细胞的膜蛋白不同位置产生作用，即在变构位置发生作用）进行监测。这个测试独特的优点在于，随着时间的物质可以被引入和排出，使得可以及时观测到变化的过程。第一方面提到的仪器确保了稳定、可靠的进行物质的引入和排出。

优选，方法中还包括在引入剂量流体之前暂时降低系统循环流体的流速，当引入剂量流体时，流速增加以提示观察者剂量流体已经被引入。

优选，选用蓄压器中的压缩空气作为系统循环流体。优选，该方法中还当流体流过流通单元时，对蓄压器充入压缩空气步骤。这一步是可行的，因为蓄压器能吸收任何由压力泵或类似设备——其向蓄压器充入加压流体——而产生的压力脉冲。

应当理解的是，本发明的第二个方面提供的可选技术方案同样适用于本发明的第三个方面。

同样，按照本发明所提供的各个方面，这里提供一种用于显微镜的细胞观察仪器。仪器中包括一个流通单元，流通单元上设有一个具有开口和出口的腔体，流体容器连接该流通单元，容器上设有隔膜推动流体，，并具有相对于腔体的特定尺寸，通过腔体，进口和出口之间的流速至少在流通单元观察细胞的位置是维持在恒定流速。

根据本发明中所提及的各方面，提供一种用于显微镜的细胞观察仪器，该仪器包括一个流通单元，流通单元内设有容纳流体流动的腔体，腔体上设有一个腔体入口和腔体出口。腔体入口和流体供应部件相连接，流体供应部件包括系统循环供应管和剂量供应管。每根供应管通过阀门和腔体入口相连接，包括公用压力源推动流体流动以平行连接腔体入口的管，以设定的流速充入腔体，然后从腔体出口处流出。系统循环供应管和剂量供应管用来保持进入腔体流体流动的平衡，即通过在关闭系统循环供应管上的阀门同时打开剂量供应管的上阀门，以保持流过腔体的流体保持设定的流速。

通常情况下，其中设有多个剂量供应管。通常，公用压力源是压力空气的蓄压器（air pressure reservoir）。通常情况下，系统循环供应管包括存储流体的容器和供应隔膜（supply diaphragm）。或者还在腔体的入口处设置围绕腔体间隔分布的注射孔。或者这些注射孔的方向指向腔体中心位置或注射孔之间相互平行。或者这些注射孔是不同大小的尺寸。通常，腔体入口用于提供从流通单元的一侧流向另一侧横穿流通单元的流体层流。通常，流体是液体或人工培养细胞液。

附图说明

以下通过列举的实施例，参照附图对本发明提供的发明创造做进一步详细的描述，其中：

图1是本发明中灌注系统示意图，其中用于根据本发明各方面的观察细胞仪器的细胞观察被阐述。

图2是本发明各方面中提供的细胞观察仪器的透视图。

图3是本发明各方面中多个可选观察流通单元的结构示意图。

图4是细胞观察仪器的第二个实施例；以及

图5是操作仪器方法实例流程图。

具体实施方式

如上所述，在流体灌注系统中，由于流体在流动中的扰动，很难形成可靠的观察。这个问题在包括共聚焦显微镜在内的装置中尤为突出。由于共聚焦显微镜系统中存在细焦点，使得潜在的扰动会产生巨大的困难。能够理解的是，共聚焦显微镜系统的焦平面将限制在1μm（或更小），这样压力脉冲和其他改变都会临时或者一段时间内改变图片，这可以使正确分析人工培养细胞系统必要的观察变得不清楚。理论上，持续的穿越人工培养细胞系统的层流应当被提供。并且，仪器中使用荧光检测器或其他测量设备，流体的扰动将使得测量/观察结果不准确，所要观察的样品将会移出视野、或焦点、或完全被移除。

以前选用蠕动泵的系统本身会产生压力波动，尤其是在共聚焦显微镜分析过程中，由于实现观察的穿越流通单元中的流体流速变化，会导致的图像中出现失真。观察窗一般包括流动腔体或单元。通常情况下，两块板式盖片部件之间夹着一个中空中心设有流体腔体或腔室的圆弧或圆环部件。腔体或腔室或单元具有一个进口和出口，通过这些进口和出口使得培养细胞培养基（culture support medium）形式的流体通过。在需要实时观察时，图像失真的问题会进一步加剧严重。实时观察需要观察一段时间内人工培养的细胞中发生的改变，因此，当图片不能获得时，这样失真期间降低了实时监测对人工培养细胞系统产生作用的准确性。

本发明各方面的一个目的在于提供一个压力推动灌注的系统，该系统中提供新鲜细胞培养基的持续稳定层流，以维持人工培养细胞该细胞放置于流通单元可供观察部分，该部分作为观察室。可以这样认为，仪器中其他因素如恒温和其他环境条件一样需要保持不变。此外，通过具体控制压力系统，可以认为，所希望的穿过流通单元的流速可根据实际操作进行调整。虽然描述的主要部分在人工培养细胞，应当理解的是，观察细胞被维持或需要流体流动的其他情况下也可以使用本发明各方面中提供的仪器。

在理想的情况下，如本发明提供的实施例所述的内容，细胞观察仪器还包括用于提供多种物质的剂量，例如预选的药物，到流到观察流通单元的流体流中，以检测这些物质对人工培养细胞产生的影响的技术，或者以其他方式进入流通单元中。按照本发明中所提及的引入剂量药物，可在不影响流通单元恒定流体流速、压力和温度的情况下实现，因此这些因改变而产生的影响不影响观察，并避免这些影响因素导致图像失真。通过这样的方法。由此，共聚焦显微镜实时成像培养细胞或其他置于流通单元中物质可以实现，同时保持维持培养基和其他进入流通单元中的物质的灌注。如果图片失真，通过这样的方法，实时观察和分析置于流通单元中人工培养细胞会受到限制地实现。

图1提供的是用于人工培养细胞灌注细胞观察仪器的示意图。因此，在灌注仪器中压力源1被提供，通常用作一些流体培养基容器2。泵——一般为蠕动泵，在所述情况下用来推动流体进入仪器中流通单元入口3至观察流通单元4，后从流通单元的出口5流出或至垃圾箱6。可以了解的是，一般储蓄容器2a中的一个会提供一个基础的系统流体培养基，以正常的方法流过单元4，其他储蓄容器2b-2e中存有不同的流体，用于观察不同流体在单元4所产生的影响。通常阀门7设置在不同储存器2之间，切换流入流通单元4中的流动流体。

可以理解为，使用如蠕动泵一类的泵，作为流体驱动器1和通过阀门7进行切换，可能对流过流通单元4的流动流体产生干扰的压力脉冲。流通单元4会用诸如共焦显微镜进行观察，上述显微镜受到压力波动导致生成的图像上出现失真问题。避免出现压力变化问题，导致理想的层流出现偏离问题，本发明各方面进行了尝试以求解决。

图2提供的是本发明各方面中提供的细胞观察仪器的结构示意图。仪器20包括流通单元21，其上设有腔体进口22和与垃圾箱19相连的腔体出口23。腔体进口21连接第一系统流体输送管24和多个额外流体供应管（包括剂量流体供应管25a-e），所有管相接并以并联方式连接到流体输送线26上。流体输送线26与腔体进口22相连接。垃圾箱19是需要的，以保持流动畅通，并使对焦平面的影响最小化。垃圾箱19不是密封的单元，其与大气相通。

第一系统流体输送管24中包括蓄液容器27。蓄液容器27中储存着流体，通过和加压源29相连的隔膜28为流体加压。加压源29包括储蓄溶液，适应于用泵30来充入压缩空气。压力开关31设置在并联枢纽32之前。

并联枢纽32将压缩空气并行输送到隔膜28，和由导管33构成的剂量供应管25。压力作用在蓄液容器27（通过隔膜）和剂量供应管25中的流体上，促进流体通过流体输送线26和流通单元21的腔体进口22。

剂量供应管25中的压力通过公用多接口歧管34传送到导管33中。流量调节器35设置在并联枢纽32和第一蓄液容器27之间。额外流量调节器36设置在并联枢纽32和公用多接口歧管34之间。流量调节器35、36调节供应到蓄液容器27和额外剂量流体供应管33中的压力。压力计37和流量调节器35一同设置在管路上，以确保监控供应到第一蓄液容器27和泄压阀38中的压力，增加额外的可靠性和安全性。通过操作、第一系统流体供应管24的阀门39，和对应的剂量流体供应管25上的阀门40，流动的流体从流体输送线26进入腔体进口22，汇流，保持在稳定的设定流速。分别来自管路24、25的相互并行的流体从，以大致相一致的流速流过在使用中的流通单元21，各管路之间处于平衡状态。

可以认为，同时打开和关闭阀门39、40将有效的产生同样的流体压力和流速，并保持不变进入腔体开口22。如果需要，调节阀门36同样也可以产生从导管33到主要的第一供应通道39的不同流速。冲洗室41作为抑制转换时间偏差的“缓冲井”，设置在阀门39、40之间。可以理解为，冲洗室40中保持一定量的流体，以至于如果在阀门39、40之间出现轻微的偏差，冲洗室41中的一定量的流体还能维持持续稳定的流动。

蓄压器29中的压力通过反馈回路（未在图中画出）来控制，反馈回路设置在蓄压器29和泵30及压力开关31之间。当蓄压器29中的压力低于设定值，压力开关31将启动泵30。进一步，当蓄压器29中具有充足的压力时候，压力开关会关闭泵。这样，蓄压器中的压力将维持不变，没有明显的压力改变以改变流过流通单元的流动。实施例中蓄压器具有0.51m³的体积，其压力保持在1.8 bar（180 kPa）。

蓄液容器27提供相对大量的通过隔膜28穿过蓄压器29加压的流体。隔膜因此形成气体加压移位构件，使得所用空气作为传输流体，但不会污染。在操作时间内，流体的加压在蓄液容器27始终保持，因此，在此期间系统中加压压力和流体向腔体进口22的流动是持续的。这样持续的压力带来持续的流体流动，流体以层流形式穿过观察窗42或至少是观察窗的观察部分。蓄液容器27中可以存放1L的流体。

 通过平衡由导管33和阀门40所组成的给剂量供应管25内的加压，伴随着系统流体输送管24都被系统加压，可以理解为，阀门39、40的分别在开关之间切换能维持相同设定的流体压力，并随着这个压力从流体输送线26流向腔体入口22。通常，流入腔体进口22的流体压力是由蓄液容器27中的流体提供。在短时间内剂量的药物将通过剂量供应管25进入流体中。在这种情况下，通过腔体进口22的流体流中的各份流体，来自不同的剂量供应管25，并被由来自所有蓄液容器27的流体带来的、通过阀门39的系统流动压力的返回所驱动。当各份的剂量药物或其他物质进入流通单元21时，将对细胞及细胞培养物产生作用，特别是通过使用共聚焦显微镜或检测器能通过观察窗42观察到的，判断剂量药物对细胞所产生的影响。进一步，当药物引入管路中，系统输送管24通过关闭阀门39而被切断连接，流体加压通过剂量供应管25保持。

可以这样理解，每个冲洗室41和腔体进口22之间的距离，根据部件的大小和流体的流速，能确定出剂量物质从供应管26流入流体中所需的时间、以确定各份药物和其他物质进入单元21时间。在这样的情况下，可以认为冲洗室41将开始清洗和冲刷药物或其他剂量物质，这些物质通过流体供应管25进入流体中，出现在单元21中的人工培养细胞中。冲刷仪器中的这些药物时，只有从第一流体输送管24中的流体流向流体输送线26。蓄液容器27中的流体将冲洗每一个冲洗室41，并将其中任何物质都冲刷干净。本发明提供的仪器独特的优点在于，清洗冲洗室的稀释速度很快。

可以这样认为，通过进口22的实际流速通过公用蓄压器29和调节器35、36来确定。在这种情况下，增大蓄压器29中的压力将加快流体流动的速度。在由蓄液容器27中的隔膜28膨胀所产的压力和由公用多接口歧管34进入剂量供应管产生的压力之间形成一种平衡。平衡会在分别发生在加压管路到供应管24、25之间。在这种情况下，将会在关闭泵39、提前打开泵40之间出现稍微的延迟，因为供应管24、25内的分别加压大致上相平衡，既不会因为压力差出现流体流入其他管路或是因为压力差而流出的管路的情况。在这样的情况下，将各份的药物或其他物质注射到流体中，使其进入单元21是精确的。应当理解的是，可以打开一个或者多个或全部阀门40使从多个导管33a-e中的流体形成混合流体。

本发明所提及的方面，基本上流体流过流通单元21的流动要求保持不变。一个目的在于尝试提供一种穿过单元22中观察窗42的稳定层流，这样就不会在流体中产生任何导致图片失真的脉冲或扰动。如上面所述的共聚焦显微镜具有非常窄的焦平面，在这样的情况下，扰动和因此对人工培养细胞产生的干扰将导致不出现聚焦的图片，这些是实时观察药物或其他物质对细胞产生影响所无法接受的。没有仪器中是完美的，在这样情况下，切换阀门39、40、以及潜在温度差异和诸如打开阀门39、40产生震动的因素都可能对流通单元21产生一定的干扰。虽然如此，但相比之前的仪器，这样的干扰是微弱的，出现的时间特别短的和影响相对微小的。

整个仪器可以被放置在密封的环境下使用，使得仪器处于恒温的状态。

通过提供一个系统供应管和剂量供应管之间的平衡关系，和降低压力脉冲，使用仪器进行多种不同的测试（在下面会详细讨论这些测试），这些测试在现有仪器上无法进行。

在改进中，细胞观察仪器中简单的包括系统流体管。在这样情况下，蓄液容器27和加压的技术，通常通过隔膜28形成一个相对较大的加压系统，在这样保持不变的环境下，流体在没有压力变化情况通过整个供应管道流向单元21。本来，单元腔体21中人工培养的细胞可以在不含药物或其他物质的流体培养基提供营养液的情况下观察一段时间。仪器在这样情况下，完全依赖调节器35根据阀门39和进口22的尺寸大小进行调节。虽然如此，本发明的优先实施例中，系统供应管和剂量供应管连接在一起，以观察/测量剂量物质对流通单元21中的培养细胞产生的影响。在这种条件下，加压形成平衡，因此为流速是保持稳定方面中关键点，例如当人工培养细胞中即时速度减少干扰和因干扰而产生共聚焦显微镜图片上失真问题。

进一步改进中，包括通过两个带有容器的系统供应管，以维持流体流动通过单元。当一边的容器空了，可以通过切换另一个进行供应，使得第一个容器可以再次进行灌注。一些系统供应管可以通过自动切换，以维持长期项目中流通单元和人工培养细胞的供给。

如图2所示，流通单元21上设有大致相匹配的进口22和出口23。所述相匹配指的是尺寸匹配，以使流入流通单元的流体体再次被流出流通单元的流体抵消，以保持，从单元的一端流向另外一端的稳定的层流。通常所描述单元具有中圈形状，包括形成于两块盖板部件之间的腔体，盖板部件将圆环形部件夹在中间，在其中还形成进口22和出口23。这种结构是已知的，可以应用在单独共聚焦显微镜上。

图3提供了多种可选流通单元的结构示意图。图3a提供一种流通单元横截面图，其中包括覆盖部件51、52及夹在其之间的圆环形部件53。圆环形部件53形成流通单元腔体54，位于覆盖部件51、52之间，在其中，人工培养细胞在流体培养基中得以维持，培养基从圆环形部件的进口和出口之间流过（图上未标记）。腔体53的尺寸和流通单元的尺寸根据操作需要而决定。所形成的腔体54闭孔结构的横截面如图3a所示，该结构单元根据需要安装在适合的显微镜上，

如上面所述，形成穿过流通单元的层流是十分重要的。通常可以通过图2所展示的穿过单向进口和单向出口来实现。或者如图3b和图3c所展示的，流通单元上设置多个进口和/或出口。图3b中，进口55和出口56设置在相对的位置，使得液体流过单元的方向和箭头所指向的方向相一致。或者如图3c所展示，进口设置在指向圆心57的位置，其中腔体分别从进口58指向出口59，使得流体能通过用于观察的流通单元。

流通单元的观察窗通常是圆形的。或者如图3d所展示的，流通单元制作成具有菱形的分解面，以至于单向进口60可以为观察形成一个特定的流动流通单元横截面。进一步，如图3e所展示的，流通单元具有椭圆形的横截面，再次形成一个进口61和出口在两侧的流动流通单元横截面，能更加稳定的观察。

通常提供一个平衡增压和穿过根据本发明各方面的观察仪器中流通单元的流速，需要进一步谨慎的观察流通单元本身。此外，假定和理想的细胞结构可以通过根据本发明所述仪器生成的稳定的流速来形成。因此，图3f中所描述的单元结构中包括多个进口63，这些进口设置在delta型区域64的延长部分，使得分散流入观察窗65，所以减少在流体中形成干扰和扰动，形成一个更适合共聚焦显微镜观看的稳定状态。而且，保持这种稳定的状态可以通过设置适当的出口或输出调节区域65，该区域在多管调节型的材料中形成，例如网状，可以避免在流出流体中产生任何干扰。

如上所述，按照本发明的所提供的观察细胞仪器中流体加压是平衡和稳定的。制造出的流通单元通过入口和出口限制流体中形成脉冲和扰动来定形。由于平稳的流体流过流通单元，流体中改变和使模糊/污染而产生干扰的可能性降低。

通常剂量供应管的数量根据需要而定，但是对数量还是有所限制，以免出现过于复杂的情况。通常流速控制在5毫升/分钟，压力控制在小于6磅/平方英寸。其目标在于确保在此流速不会产生干扰，特别是当剂量药物或物质进入人工培养细胞中时不会产生扰动。在这样的情况下，与流动路径相关的尺寸（由孔径大小所定义）是一致的，其他考虑因素被制定，其与形状有关，形状为T型连接口和流体供应管，以避免因供应管中流量影响产生干扰。通常流通单元21设置在剂量供应管和系统循环管下游，以维持供应管道26在内任何管道都要保持在一定程度内的稳定。

对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。本发明涉及将药物注入系统流体中，能够理解的是，剂量供应管形成一个等流或强流流体，流体沿着流体输送线26流动，而不是各种流体在剂量供应管中混合。通常剂量供应管路中设有多个大致相同并可相互替换的导管33，而不仅仅是用剂量供应管本身。或者，能够理解的是，一些药物需要更大的体积和浓度，因此，不同形状和尺寸的剂量管通过调节会形成一种平衡，通过公用多接口歧管34和蓄压器29用来进行这种调节。

使用时，仪器20仅需要连通供电装置。由电力提供能量的泵30为蓄压器29充入空气。供应的电力同样对电加热器（图中未画）提供能量，以保持仪器中处于恒温状态，例如维持的37℃的恒温环境下，在人造环境室（图中未画）内。

参考图5，步骤80表示的是，蓄液容器27中充满（或部分充满）系统循环流体。步骤81表示的是，泵30用于给蓄压器29充入压缩空气。步骤82表示的是，通过观察窗可以看到其中的情况，例如将人工培养细胞放置在流通单元21中。步骤83表示的是，启动阀门39使得系统循环流体不断流过流通单元21，系统循环流体中通常包含维持人工培养细胞存活的营养物质。来自蓄压器29的压缩空气流过流量调节器35，并对设置在第一蓄液容器27中的隔膜28产生作用，形成流动。这使得隔膜对第一蓄液容器能容纳的流体产生影响，并促使流体流通过第一液体输送管24和液体输送线26后进入流通单元21中。应当理解地是，仪器可以在较大的流速范围内运行，例如像0.06 ml/min至20 ml/min之间。

可能需要的细胞检测和任意测试如在步骤84中所显示的进行。一些测试可以在仪器中完成，下面通过举例来说明。在步骤85中，蓄压器29中的压力下降至低于阈值水平，压力开关31工作并启动泵30。任何在泵运行过程中产生的压力脉冲都将被存储在蓄压器29中的空气所吸收，从而防止任何压力脉冲对进入流通单元21的流体流动产生影响。该方法现在回到步骤84中，可以持续、不间断、不被因储蓄容器的灌注而影响检测样品。通过阀门39可以直接控制流过流通单元21中的流速。因此，使用者可以为维持人工培养细胞设定一个流速范围。

蛋白质剥离测试（sheer test）是组织工程领域中判断蛋白质是否有用的一种测试，它被用来评估细胞附着支撑结构的强度。该测试中需要引入蛋白质，设置在支撑结构上，以第一流速打开阀门39，使其进入流通单元和引入系统循环液。当观察/测量其中蛋白质时，增加第一液体供应管中的流速。增加流速可以分几个阶段进行或持续进行。导致蛋白质从支撑结构上剥离的流速被确定。通过调节阀门39或阀门控制系统70（将在下面提及），增加流体的流速。

进一步的测试为动力学测试，其中将人工培养的细胞放置在流通单元中，用化学药品、抗体或蛋白质对细胞进行观察/测量，例如细胞表面的吸附或脱附。因此，细胞进入流通单元21中，阀门39启动了系统循环供应。化学药品、抗体或蛋白质通过开启其中一个剂量供应管上的阀门40而进入其中。除第一流体供应管对流通单元提供供应外，剂量供应管也对流通单元提供供应。既然这样，共同使用的蓄压器29将平衡两者的压力供应，使得每个流过流通单元中流速维持稳定不变。进一步，当其中一个剂量供应管在提供流体时，第一流体供应管将关闭。

在剂量供应管25被阀门40打开前，阀门39可以进行调节，以暂时降低流过流通单元21的流速。一旦打开剂量供应管的阀门，流速将回到之前的水平。这是有用的，因为使用者带来的小的脉冲或“可视触发”在鉴定中是有用的，当剂量供应管中的流体进入流通单元21中。

进一步的测试还包括变构（allosteric）测试，其中化学/分子/抗体对细胞蛋白结合受额外物质存在的影响，额外物质作用在蛋白质不同位置。这允许稀释（特别是无限稀释或接近无限稀释）的条件下使用，因此可以实时观察第一物质从细胞中被冲洗干净。另外，假设第二物质在冲洗过程中被应用，可以实时观察冲洗第一物质过程中对物质（第一物质作用在细胞膜蛋白质上的不同位置，即对变构位点产生作用）产生的变构效应。仪器20中包括多条并联的剂量供应管、剂量供应管中装有多种不同的物质，用不同物质来评估他们产生的作用。

如上面所述的，仪器中进一步的优点在于，可以用其他供应管中引入的药物来冲洗仪器。蓄液容器27中的冲刷流体快速稀释药物，直至流体输送线中不存在任何药物。因此，流通单元被稀释以至于药物不能再次附着在细胞的表面。

应当理解的是，细胞观察仪器特别在鉴定药物的方法中发挥作用。蓄压器29和泵30随同压力调节器35、36，使得第一供应管和剂量供应管中平稳增压，从而上述测试能稳定的进行下去。进一步，该仪器的制造成本低廉。待引入的选用药物可以被分别放置在不同的剂量供应管中，依次或组合引入流通单元和细胞中。

第二实施例如图4所示。图4和图2中相同的部件使用相同的附图标记。第前述实施例中，阀门39、40都是通过手动控制。在本实施例中，阀门39、40由控制系统来控制，用压缩空气来控制阀门的开关和调节开度。控制系统70和阀门控制器71分别和每个阀门40相连接。阀门控制器71从和29相同的蓄压器29’接收压力。泵30往蓄压器29’中充入压缩空气，当然，可以为蓄压器29’提供一个单独泵。其优点在于，使得压力源与控制系统70/阀门控制器71和蓄压器29被分开，减少因影响流体流动通过流通单元的压力脉冲或改变所产生的风险。阀门控制器71根据控制系统70发出的指令，精确地控制阀门39、40开和关以及流体流过流通单元21的流速。控制系统70通过设定的程序完成一系列操作，包括是否要提供可视触发（visual trigger）。控制系统可以被设置，以使可视触发足以被观察者发现，但不至于太大以至于观察仪器中的细胞受到影响。在图4中控制系统70同样还控制阀门39，虽然没有在图4中画出。

Claims (37)

1.一种灌注待检测样品的细胞观察仪器，该仪器包括一具有腔体的流通单元（21），腔体内用于容纳样品，腔体设有腔体入口（22）和腔体出口（23），流通单元（21）接受流体从腔体入口（22）至腔体出口（23）流过腔体，即定向流过样品；腔体入口（22）与流体输送线（26）相连，第一流体输送管道（24）通过阀门（39）和流体输送线（26）连通，仪器中还包括一个对第一流体输送管道（24）提供压力的压力源，所述压力源包括一个用于存储加压液体的蓄压器（29）。

2.根据权利要求1所述的细胞观察仪器，其中蓄压器（29）的压力来自泵（30），蓄压器（29）用于减少来自泵（30）的压力脉冲。

3.根据权利要求1或2所述的细胞观察仪器，其中第一流体输送管（24）包括第一蓄液容器（27），所述第一蓄液容器（27）包括隔膜（28），当接收到来自蓄压器（29）中的压力时，隔膜（28）将推动流体的流动。

4.根据权利要求3所述的细胞观察仪器，其中第一流体输送管（24）包括系统循环供应管和第一蓄液容器（27），所述第一蓄液容器（27）中容纳系统循环流体。

5.根据上述任意一项权利要求所述的细胞观察仪器，其中仪器中设有至少一个以上通过阀门（40）和流体输送线（26）相连接的额外流体供应管（25），所述一根或一根以上的额外流体供应管（25）和蓄压器（29）相连接。

6.根据上述任意权利要求所述的细胞观察仪器，其中一个或每个额外流体供应管（25）中包括设置在阀门（40）和流体输送线（26）之间的缓冲井（41），所述缓冲井（41）用于降低压力脉冲对阀门驱动装置产生的影响。

7.根据权利要求5所述的细胞观察仪器，其中至少一个额外流体供应管（25）中包括一用于接受将被引入到腔体的药物的剂量供应管。

8.根据上述任意一项权利要求所述的细胞观察仪器，其中蓄压器（29）包括存储压缩空气的容器。

9.根据上述任意权利要求所述的细胞观察仪器，其中腔体出口（23）与开口垃圾桶（19）相连。

10.根据上述任意一项权利要求所述的细胞观察仪器，其中流通单元（21）包括：用于固定选定的检测装置的观察窗（42）；设置在腔体内用于检测样品的聚焦显微镜，和设置在腔体内用于检测样品发出荧光的荧光检测器。

11.根据上述任意一项权利要求所述的细胞观察仪器，其中每个流体供应管（24、25）上设有流量调节装置（35、36）。

12.根据权利要求5所述的细胞观察仪器，其中额外流体供应管（25）通过公用的多接口歧管获得压力。

13.根据上述任意权利要求所述的细胞观察仪器，其中流通单元（21）包括位于两个盖片部件之间的圆环。

14.根据上述任意一项权利要求所述的细胞观察仪器，其中腔体入口（22）具有围绕腔体间隔设置的多个注射孔（55，58）。

15.根据权利要求14所述的细胞观察仪器，其中所述多个注射孔的方向指向腔体中心位置或注射孔之间相互平行。

16.根据权利要求14或15中所述的细胞观察仪器，其中注射孔为多种不同大小的尺寸。

17.根据上述任意一项权利要求所述的细胞观察仪器，其中腔体入口（22）用于提供从流通单元（21）的一侧流向另一侧横穿所述流通单元中的流体层流。

18.根据上述任意一项权利要求所述的细胞观察仪器，其中腔体为圆形、菱形、或椭圆形。

19.根据上述任意一项权利要求所述的细胞观察仪器，其中细胞观察仪器在密封的人造环境腔室使用，使得仪器处于近似恒温的状态。

20.一种使用通过流体灌注仪器的进行观察的方法，包括以下步骤：

a）向第一蓄液容器（27）加入系统循环流体；

b）向蓄压器（29）中注入加压液体；

c）将待观察的样品放到流通单元（21）的腔体中；

d）利用蓄压器（29）使得流体流动穿过流通单元（21）的腔体；

e）检测样品。

21.根据权利要求20所述的方法，其中步骤e）中还包括使用共聚焦显微镜观察样品或使用荧光检测器检测样品发出的荧光。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其中方法还包括调整至少在第一蓄液容器（27）中流体的流速，并作进一步观察。

23.根据权利要求20至22中任意一项所述的方法，其中该仪器中还包括含有剂量流体的额外流体供应管，该方法包括以下步骤：

i）引入剂量流体和

ii）检测剂量流体对样品产生的影响。

24.根据权利要求23所述的方法，其中方法中还包括在引入剂量流体之前暂时降低系统循环流体的流速，在引入剂量流体时，流速增加为观察者提供剂量流体已经被引入的指示。

25.根据权利要求24所述的方法，其中流体流速增加至和暂时降低系统循环流体流速之前的流体流速相同的水平。

26.根据权利要求23或24所述的方法，其中剂量流体被引入 到系统循环流体中时，保持流体以恒定流速流过流通单元（21）。

27.根据权利要求23或24所述的方法，其中引入剂量流体时，同时系统循环流体通过关闭相应的阀门来停止流动，使得流体能保持恒定流速流过流通单元（21）。

28.根据权利要求20至27中任意一项所述的方法，其中该方法还包括在检测样品前，将仪器连通外部供应电源，即对设备供应电力。

29.根据权利要求20至28中任意一项所述的方法，其中该方法还包括当流体流过流通单元（21）时，向蓄压器（29）中充入加压流体的步骤。

30.根据权利要求20至29中任意一项所述的方法，其中该方法选用上述权利要求1至19中任意一项所述的细胞观察仪器。

31.一种鉴定药物的方法，包括以下步骤：

a）将人工培养的细胞放置在流通单元（21）中；

b）提供系统循环流体以第一恒定流速流过人工培养的细胞；

c）在维持流体以第一恒定流速流过所述细胞情况下，将选用的第一剂量药物加入系统循环流体中；

d）观察药物对人工培养细胞产生的影响；

e）如果药物对人工培养细胞产生的影响符合制定的标准，确定药物具有药效。

32.根据权利要求31所述的方法，其中方法中还包括在引入剂量流体之前暂时降低系统循环流体的流速，在引入剂量流体时，流速增加以为观察者提供剂量流体已经被引入的指示。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中该方法包括进行动力学测试过程。

34.根据权利要求31或32所述的方法，其中该方法包括将第一物质灌注到细胞中，并观察第一物质对细胞所产生的影响，在第一物质上将第二物质灌注到细胞中，然后观察第二物质对细胞中的第一物质的作用产生的影响。

35.根据权利要求31至34中任意一项所述的方法，其中该方法包括将第一物质灌注到细胞中的步骤，在“冲洗”阶段稀释第一物质的浓度，并观察其对细胞产生的影响。

36.根据权利要求35所述的方法，其中方法步骤中还包括在“冲洗”阶段引入不同于第一物质的第二物质，观察导致的细胞变构效应。

37.根据权利要求31至36中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括在鉴定药物过程中，向蓄压器（29）充入加压流体的步骤。

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