CN102636482A - 试剂比色与光谱检测相结合的毒死蜱农药残留速测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于食品安全检测的一种试剂比色与光谱检测相结合的毒死蜱农药残留速测方法。包括采用间苯二酚作试剂比色原料，找出与间苯二酚发生显色反应的特征吸收峰，建立不同品种叶菜中残留农药毒死蜱的光谱信息的原始谱图和毒死蜱含量标准检测模型，采集待测叶菜样品的近红外光谱图，将近红外光谱图进行吸收峰特征比较，判断待测叶菜样品中含有毒死蜱，同时根据特征变量的具体值，估计毒死蜱残留的浓度。本发明可以快速判断出毒死蜱残留是否超标以及高精度的估计值。全部分析过程只需要3-5分钟其检测灵敏度可以达到0.1mg/kg。

Description

试剂比色与光谱检测相结合的毒死蜱农药残留速测方法

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，特别涉及基于试剂比色与光谱技术相结合的一种试剂比色与光谱检测相结合的毒死蜱农药残留速测方法。

背景技术

在世界人口不断增长的今天，粮食需求越来越趋于紧张。估计到2020年，世界粮食需求量将由2000年的19.04亿吨增长至24.87亿吨，但耕地却有减无增。同时，当前在农业生产中遭受病虫草等危害的情况年年总有发生。据统计，每年全世界因受病虫草害所减少的粮食产量，约占粮食总量的30％左右。农药在粮食增产方面发挥着极为重要的作用，可以说如果停止使用农药等化学品，全世界就会有上亿人面临着饥饿的威胁，今后在相当长的时期内，农药将是实现粮食产量增加的重要措施之一。

世界农药产量自1985年以后维持在200-250万吨。我国自1990年开始，农药产量位于世界第二位，并且由1991年的25.3万吨增加到1999年的42.6万吨。我国的农药生产使用经历了20世纪50年代的砷、铅、汞制剂已于上世纪70年代起就停止使用；自80年代有机氯农药由于化学性质稳定，残留时间长，脂溶性强，且利用率较低，给土壤和农业环境造成严重污染等原因被停用以后，各类取代农药便得到快速发展，其中最主要的就是有机磷农药。

近年来，有机磷农药的检测方法得到迅速发展。世界各国的专家都加速开展快速、灵敏、准确、简便的检测方法的研究。根据有机磷农药的化学特性和毒理学性质，检测有机磷农药的分析方法主要有波谱法、色谱法和酶抑制法。另外，还有经典的化学比色法、薄层分析法、免疫法等。近年来，生物传感器技术因具有灵敏、快速、选择性高、一般不须对样品进行预处理、适合现场和在线检测等优点，成为研究的热点。此外，人们还开展了生物芯片技术的研究。

(1)波谱法

该方法是根据有机磷农药中某些官能团或水解、还原产物与特殊的显色剂在一定的条件下，发生氧化、磺酸化、酯化、络合等化学反应，产生特定波长的颜色反应来进行定性或定量(限量)测定。早期所用的只是一种微量化学试验法。

(2)色谱法

色谱法是目前有机磷农药的最主要检测方法，根据检测过程中的物理化学特性又可分为薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法三类。

薄层色谱法是一种较为成熟的、应用也较广泛的微量快速检测方法，先用适宜的溶剂提取有机磷农药，经纯化浓缩后，在薄层硅胶板上分离展开，显色后再与标准有机磷农药比较其比移值(Rf)进行定性测定，也可用薄层扫描仪进行定量测定。该方法的特点是经济、简便、快速，但其精确度不是太高，检出限通常为0.1-0.01ug。

气相色谱法是进入20世纪50年代以后，在柱层析的基础上发展起来的一种新型的仪器分析方法，已成为目前典型的、应用最广的仪器分析方法。该方法是利用经提取、纯化、浓缩后的有机磷农药注入气相色谱柱，程序升温气化后，不同的有机磷农药在固定相中分离，经不同的检测器检测扫描绘出气相色谱图，通过保留时间来定性，通过峰高或峰面积与标准曲线对照来定量。该方法的检测精度非常高，可以检出1ng。

高效液相色谱法是在液相柱层析的基础上，引入气相色谱理论并加以改进而发展起来的色谱分析方法。与气相色谱法相比，不仅分离效能好，灵敏度高，检测速度快，而且应用面广。但缺点是价格昂贵，难以大面积推广。

(3)酶抑制法

酶抑制法是利用有机磷农药的毒理特性建立的一种快速检测方法。由于有机磷农药可以抑制乙酰胆碱酯酶(Acctylcholinesterase，简称AchE)的活性，在无有机磷农药存在时，乙酰胆碱(Acetylcholine，简称：Ach)在AcHE作用下可以产生胆碱和乙酸；当有有机磷农药存在时，Ache的活性受到抑制，作为其分解产物的乙酸也相应减少。利用上述反应特性，根据指示剂颜色或反应液pH值的变化，就可以达到检测有机磷农药的目的。

(4)免疫分析

免疫分析法是利用抗原和相应抗体在体外也能特异性结合的原理发展起来的一类特异、灵敏、快速的检测技术，由于其内在的优势，广泛应用于包括农药残留检测在内的诸多领域。

(5)生物芯片技术

生物芯片的概念源于计算机芯片，生物芯片技术是在一小片固相载体上储存大量的生物信息(多至几十万个)，并与生物化学处理等技术相结合而发展起来的一种新兴技术。将抗有机磷抗体固定于生物芯片上，通过被标记过的抗原(有机磷与其他大分子物质的结合物)与抗体的特异性结合反应达到对有机磷的检测。

毒死蜱(chlorpyrifos)，美国陶氏益农公司开发的一种广谱性杀虫剂，在中国登记的商品名是乐斯本。原药为白色或灰白色颗粒状晶体(或块状固体)，熔点41.5～43.5度；对鱼类及蜜蜂有毒，对烟草敏感。毒死蜱是目前全世界生产和销售最大的杀虫剂品种之一，也是世界卫生组织许可的有机磷品种，现已经在中国、美国、澳大利亚、日本等14个国家登记和注册。该品种具有触杀、胃毒和熏蒸三种作用方式，其杀虫谱广，毒性较低，对地上地下害虫同样高效，是防治粮食、果树、蔬菜和其他经济作物的理想杀虫剂，对地下害虫的防治效果尤为突出。

2006年4月4日，农业部、发改委、工商总局、质检总局联合发文(第632号)再次强调五个高毒有机磷品种(甲胺磷、乙基对硫磷、甲基对硫磷、久效磷、磷铵)全面禁止生产、销售、使用的具体细节问题，进一步加快了替代品种开发的力度。作为国家发改委推荐的高效、低毒、低残留的有机磷品种之一的毒死蜱，与氟虫腈、吡虫啉、阿维菌素等被农技推广部门所认可。随着毒死蜱生产工艺中技术难度最大的中间体三氯吡啶醇钠技术的突破，国内原药合成技术突飞猛进，大多数生产厂家原药含量已大于97％，制造成本大幅降低，主要依靠进口印度原药的局面彻底打破。毒死蜱也成为现在市场上使用最广的有机磷农药之一。近年来，毒死蜱残留带来的食品安全隐患逐渐被人们重视起来。但是现在还没有一种非常方便、直观、准确的有机磷类农药残留的检测方法，因此借用比色剂结合光谱检测叶菜中有毒死蜱农药残留的检测技术恰恰拥有方便，直观等特点，可以为进一步设计便携式农药检测仪器提供基础。

发明内容

本发明的目的是针对相关研究表明，叶菜类蔬菜在喷洒农药后，超过60wt％的有效成份都残留在叶子部分上，同时，叶子的接触面较广，适合进行显色反应预处理；所以要检测叶菜类蔬菜的毒死蜱的残留量，叶子正好是最佳的检测部位而提供一种试剂比色与光谱检测相结合的毒死蜱农药残留速测方法，其特征在于，所述毒死蜱农药残留速测方法包括以下步骤：

1)采用间苯二酚作试剂比色原料，找出与间苯二酚发生显色反应的特征吸收峰；由于物质在近红外区的化学组成性状特征的信息量非常丰富，对毒死蜱的目标特征吸收峰进行筛选和验证；

2)根据步骤1)及相关食品安全指标，建立不同品种叶菜中残留农药毒死蜱的光谱信息的原始谱图和毒死蜱含量标准检测模型；

3)采集待测叶菜样品的近红外光谱图；

4)提取步骤2)中不同叶菜品种的近红外光谱原始谱图与步骤3)中采集的待测叶菜样品的近红外光谱图进行吸收峰特征比较；

5)如果检测模型判断样品特征处于含有残留的区间内，则说明待测叶菜样品中含有毒死蜱，同时根据特征变量的具体值，估计毒死蜱残留的浓度；如果检测模型判断样品特征处于不含残留的区间内，则说明被测叶菜样品不含有毒死蜱。

所述步骤1)的对特征吸收峰的筛选包括如下步骤：

a.采集毒死蜱的标准纯制品的近红外光谱谱图；

b.采集市售40wt％浓度的毒死蜱中各种添加成分的标准纯制品的近红外光谱谱图；

c.采集标准纯间苯二酚制品的近红外光谱图；

d.将a，b，c中得到的近红外光谱图进行对比，筛选出目标特征吸收峰的特征吸收峰。

所述步骤1)的对目标特征吸收峰进行验证采用以下步骤：

(1)大量采集含有不同浓度的毒死蜱农药残留的叶菜类样品，进行显色反应预处理，再进行近红外光谱扫描，得到采集样品的谱图；

(2)对采集的所有样品按照国家标准对毒死蜱残留进行气相色谱-质谱联用检测，检测结果作为参考标准；

(3)用上述步骤d中筛选出的特征吸收峰，对照步骤(1)的所有采集样品的谱图，判断毒死蜱的残留状况，将判断结果与步骤(2)得到的参考标准作比对，验证上述步骤d筛选出的特征吸收峰对含氯基团与间苯二酚产生的显色反应是否具有特征性。

(4)经过筛选和验证，含氯基团与间苯二酚发生显色反应后变化的特征吸收峰在5200cm-1附近，根据仪器的分辨率以及图像采取系统的精度，以5200cm-1为中心向两边延伸5cm-1，即以5195cm-1至5205cm-1之间出现的特征吸收峰为识别含氯基团与间苯二酚产生显色反应的特征吸收峰值范围。

所述步骤2)的毒死蜱含量标准检测模型的建立包含如下的步骤：

①对某一品种叶菜广泛采集未经毒死蜱等其它有机磷农药污染的样品，并用气相色谱-质谱联用仪对采集的样品进行检测验证，确保所有该品种叶菜样品中不含有毒死蜱残留。

②对步骤①中的叶菜样品进行近红外光谱扫描，得到该品种叶菜样品的近红外光谱原始谱图；

③对样品群人工喷洒不同浓度的毒死蜱农药，进行标注；

④对喷洒不同浓度的毒死蜱的样品进行与步骤①中的叶菜样品同等条件的显色反应预处理；

⑤采集④中所有样品的近红外谱图；

⑥对每一组样品在5195cm-1至5205cm-1之间的吸光度进行均值化处理，得到每一组样品在特征区间的特征值；

⑦根据⑥中得到的特征数据，用最小二乘法建立标准检测模型。

本发明的有益效果是使用本发明方法对常见叶菜的未知样品进行毒死蜱检测，只需要对样品进行简单的显色反应预处理后，测定样品的近红外光谱，得到样品在特征区间的特征值，然后用其特征值匹配标准检测模型，就可以判断出毒死蜱残留是否超标以及高精度的估计值。全部分析过程只需要3-5分钟其检测灵敏度可以达到0.1mg/kg。

附图说明

图1为5wt％间苯二酚样品在4000～8000cm-1的吸光度光谱图。

图2为16mg/kg毒死蜱样品在4000～8000cm-1的吸光度光谱图。

图3为含有不同浓度毒死蜱(16mg/kg、8mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg)体系的吸光度谱图。

图4为含有不同浓度毒死蜱(16mg/kg、8mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg)体系在5195cm-1至5205cm-1之间的吸光度的标准曲线。

具体实施方式

本发明提供一种试剂比色与光谱检测相结合的毒死蜱农药残留速测方法。经相关研究表明，叶菜类蔬菜在喷洒农药后，超过农药60wt％的有效成份都残留在叶子部分上，同时，叶子的接触面较广，适合进行显色反应预处理；所以要检测叶菜类蔬菜的毒死蜱的残留量，叶子正好是最佳的检测部位。

毒死蜱，英文名：Chlopyrifos，化学名称：O，O-二乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，分子式：C9H11C13N03PS，分子量：350.5。毒死蜱是一种广谱性杀虫剂，具有较强的触杀、胃毒及熏蒸功能，其作用机制为破坏害虫的神经系统，使昆虫过度兴奋，麻痹而死亡。毒死蜱作为有机磷农药，除了具有含磷基团外，还具有含氯基团。

间苯二酚：英文名称：m-dihydroxybenzene。分析式：C₆H₆O₂，分子量：110.11。间苯二酚主要用于橡胶粘合剂、合成树脂、染料、防腐剂、医药和分析试剂等方面。

相关试剂比色的研究文献表明，间苯二酚在弱碱的环境下，会与含氯基团的有机磷农药发生红色显色反应，在静止状态下，30min充分反应完成，在可见光谱区体现出一定的特征。但基于快速检测方法的要求，加上间苯二酚本身在近红外谱区内有比较丰富的特征吸收峰，因此，通过对间苯二酚在近红外谱区特征吸收峰的峰值变化，可以更快地达到检测毒死蜱的目的。

鉴于近红外光区的吸收强度弱、信噪比低、光谱背景复杂的特点，必须尽可能地降低光谱中的干扰信息和无效信息，增加信噪比，把复杂、重叠的近红外光谱中的有效信息提取出来，则要求有一批有代表性的尽可能包含所有复杂背景信息的样品群体作为校正集，采集全波段的连续光谱；再从全谱中选择某区段(或某些区段)的全部波长点组成光谱数据群体与样品中某成份的化学值相对应，建立起光谱数学模型。本发明毒死蜱农药残留速测方法包括以下步骤：

1)采用间苯二酚作试剂比色原料，找出与间苯二酚发生显色反应的特征吸收峰；由于物质在近红外区的化学组成性状特征的信息量非常丰富，对毒死蜱的目标特征吸收峰进行筛选和验证；

2)根据步骤1)及相关食品安全指标，建立不同品种叶菜中残留农药毒死蜱的光谱信息的原始谱图和毒死蜱含量标准检测模型；

3)采集待测叶菜样品的近红外光谱图；

4)提取步骤2)中不同叶菜品种的近红外光谱原始谱图与步骤3)中采集的待测叶菜样品的近红外光谱图进行吸收峰特征比较；

5)如果检测模型判断样品特征处于含有残留的区间(5195cm-1至5205cm-1)内，则说明待测叶菜样品中含有毒死蜱，同时根据特征变量的具体值，估计毒死蜱残留的浓度；如果检测模型判断样品特征处于不含残留的区间内，则说明被测叶菜样品不含有毒死蜱。

下面通过对无公害绿色油菜进行的检测的实例对本发明进行进一步说明。具体检测步骤为：

将所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用，配制试剂所用蒸馏水需要通过0.45的滤膜过滤。

(1)样品制备

将间苯二酚溶于100ml蒸馏水中，配制成5wt％的间苯二酚溶液，并加入0.5ml按体积比为蒸馏水∶氨水＝1∶1的氨水溶液，使比色液处于弱碱性环境下。

取6组不同浓度毒死蜱溶液各1ml，其中16mg/kg 2组，8mg/kg、2mg/kg、1mg/kg及0.5mg/kg各1组。

将6组毒死蜱溶液均匀喷洒在6无公害绿色油菜上，在25℃晾干待用。

(2)取6组各10g喷洒有不同浓度毒死蜱溶液的油菜样品，将其切碎并和甲醇混合并超声搅拌60分钟，取上清液，并用过滤纸过滤。提取和过滤两次，过滤液用10ml甲醇漂洗，其混合液在真空旋转蒸发器里被浓缩，溶液的体积被浓缩到0.5ml之后达到干燥状态，残渣在蒸馏水中溶解，并定容到5ml。

对6组样品分别加入0.5ml配制好的间苯二酚溶液，轻微震荡后静制3分钟，并采集其近红外光谱信息(如图1所示)。扫描谱区为4000～12000cm-1，光谱采集间隔为2cm-1，扫描次数为32次(MPA将32次扫描结果的平均值作为一次进样扫描数据保存下来)。实验采用空气为参比在室温下进行光谱采集，样品池光程为1mm，每个样品重复测量三次，取平均光谱作为分析用数据(如图2-4所示)，对光谱数据采用Savitzky-Golay卷积平滑滤波、一阶微分作预处理后，用相关系数法确定5200cm-1为特征波峰

(3)分析结果如表1的样品的加标回收率(其中加标回收率是指在空白的样品无公害油菜中加入定量的检测物质毒死蜱，然后用检测量除以添加量。n是重复的次数)所示。样品在所测范围内，其吸光强度与毒死蜱浓药的浓度成负相关关系，毒死蜱浓度越高，在该范围内，其峰值越低(其波峰趋势仍是非常明显)。因此可以以5200cm-1处的波峰作为判断毒死蜱农药是否存在的依据，并可根据其强度作定量分析。

表1样品的加标回收率

Claims (4)

1.一种试剂比色与光谱检测相结合的毒死蜱农药残留速测方法，其特征在于，所述毒死蜱农药残留速测方法包括以下步骤：

1)采用间苯二酚作试剂比色原料，找出与间苯二酚发生显色反应的特征吸收峰；由于物质在近红外区的化学组成性状特征的信息量非常丰富，对毒死蜱的目标特征吸收峰进行筛选和验证；

2)根据步骤1)及相关食品安全指标，建立不同品种叶菜中残留农药毒死蜱的光谱信息的原始谱图和毒死蜱含量标准检测模型；

3)采集待测叶菜样品的近红外光谱图；

4)提取步骤2)中不同叶菜品种的近红外光谱原始谱图与步骤3)中采集的待测叶菜样品的近红外光谱图进行吸收峰特征比较；

5)如果检测模型判断样品特征处于含有残留的区间内，则说明待测叶菜样品中含有毒死蜱，同时根据特征变量的具体值，估计毒死蜱残留的浓度；如果检测模型判断样品特征处于不含残留的区间内，则说明被测叶菜样品不含有毒死蜱。

2.根据权利要求1所述试剂比色与光谱检测相结合的毒死蜱农药残留速测方法，其特征在于，所述步骤1)的对特征吸收峰的筛选包括如下步骤：

a.采集毒死蜱的标准纯制品的近红外光谱谱图；

b.采集市售40wt％浓度的毒死蜱中各种添加成分的标准纯制品的近红外光谱谱图；

c.采集标准纯间苯二酚制品的近红外光谱图；

d.将a，b，c中得到的近红外光谱图进行对比，筛选出目标特征吸收峰的特征吸收峰。

3.根据权利要求1所述试剂比色与光谱检测相结合的毒死蜱农药残留速测方法，其特征在于，所述步骤1)的对目标特征吸收峰进行验证采用以下步骤：

(1)大量采集含有不同浓度的毒死蜱农药残留的叶菜类样品，进行显色反应预处理，再进行近红外光谱扫描，得到采集样品的谱图；

(2)对采集的所有样品按照国家标准对毒死蜱残留进行气相色谱-质谱联用检测，检测结果作为参考标准；

(3)用上述步骤d中筛选出的特征吸收峰，对照步骤(1)的所有采集样品的谱图，判断毒死蜱的残留状况，将判断结果与步骤(2)得到的参考标准作比对，验证上述步骤d筛选出的特征吸收峰对含氯基团与间苯二酚产生的显色反应是否具有特征性。

(4)经过筛选和验证，含氯基团与间苯二酚发生显色反应后变化的特征吸收峰在5200cm-1附近，根据仪器的分辨率以及图像采取系统的精度，以5200cm-1为中心向两边延伸5cm-1，即以5195cm-1至5205cm-1之间出现的特征吸收峰为识别含氯基团与间苯二酚产生显色反应的特征吸收峰值范围。

4.根据权利要求1所述试剂比色与光谱检测相结合的毒死蜱农药残留速测方法，其特征在于，所述步骤2)的毒死蜱含量标准检测模型的建立包含如下的步骤：

①对某一品种叶菜广泛采集未经毒死蜱等其它有机磷农药污染的样品，并用气相色谱-质谱联用仪对采集的样品进行检测验证，确保所有该品种叶菜样品中不含有毒死蜱残留。

②对步骤①中的叶菜样品进行近红外光谱扫描，得到该品种叶菜样品的近红外光谱原始谱图；

③对样品群人工喷洒不同浓度的毒死蜱农药，进行标注；

④对喷洒不同浓度的毒死蜱的样品进行与步骤①中的叶菜样品同等条件的显色反应预处理；

⑤采集④中所有样品的近红外谱图；

⑥对每一组样品在5195cm-1至5205cm-1之间的吸光度进行均值化处理，得到每一组样品在特征区间的特征值；

⑦根据⑥中得到的特征数据，用最小二乘法建立标准检测模型。

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