CN102628046A - 富含鸟嘌呤的核酸适体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种富含鸟嘌呤的核酸适体及其应用。核酸适体为如下1)-4)中的至少一种：1)SEQ ID NO：1所示的DNA分子；2)SEQ ID NO：2所示的DNA分子；3)SEQ ID NO：3所示的DNA分子；4)SEQ ID NO：4所示的DNA分子。本发明为癌症的治疗提供了一种核酸适体药物。与其它肿瘤化疗药物相比，核酸适体药物具有很多优势：抑制肿瘤细胞增殖的特异性、容易合成和修饰、无免疫原性、能快速的穿透组织和良好的代谢动力学。

Description

富含鸟嘌呤的核酸适体
本申请是申请日为2011年5月26日、申请号为201110138613.8、发明创造名称为“富含鸟嘌呤的核酸适体及其应用”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种富含鸟嘌呤的核酸适体及其应用。
背景技术
癌症是一类引起人类死亡的主要疾病，每年全球因癌症死亡人数大约为700万。随着细胞生物学的发展以及对癌症发病机制的了解，癌症的化学药物治疗得到了很好的发展。目前大约有90多种化学药物发展用于杀死肿瘤细胞和癌症治疗。但是这些药物缺乏特异性，在临床上通常给患者带来致命的副作用。因此需要发展特异性杀死肿瘤或抑制其生长的靶向药物。
核酸适体是通过指数富集的配体系统进化法从DNA/RNA文库中筛选出来的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。它通过分子内碱基堆积、疏水、氢键和静电等作用力折叠成独特的空间结构，从而高特异性和高亲和力识别其靶标分子。核酸适体与靶标分子结合的特异性和亲和力与抗体相似，甚至更强。核酸适体具有较低的分子量、无免疫原性、快速的组织通透性和良好的代谢动力学。核酸适体一旦证实，就可以通过自动化的固相合成的方法制备，从而保证了不同批次之间产品不会存在差异。核酸适体化学性质稳定和容易通过化学修饰赋予其其它功能。
更重要的是，与抗体相比，核酸适体的靶标范围更广。一些与疾病紧密相关的生长因子、酶、受体以及肿瘤标志物等物质都能成为核酸适体的靶标。目前针对血管表皮生长因子受体的核酸适体作为治疗老年湿性黄斑疾病药物已经被FDA批准上市；同时还有八种核酸适体药物处于不同临床考察阶段。因此针对与疾病相关分子的核酸适体作为一种潜在治疗药物吸引着研究者的注意。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种核酸适体及其衍生物。
本发明所提供的核酸适体及其衍生物，所述核酸适体为如下1)-4)中的至少一种：
1)SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
2)SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
3)SEQ ID NO：3所示的DNA分子；
4)SEQ ID NO：4所示的DNA分子。
所述核酸适体的衍生物为如下a)-f)中的至少一种：
a)将所述核酸适体删除部分核苷酸或增加部分核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；
b)将所述核酸适体部分碱基用天然或人造核苷酸碱基替代后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；
c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；
d)将所述核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；
e)将所述核酸适体用聚乙二醇修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；
f)将所述核酸适体与其它药物联用，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。
上述核酸适体及其衍生物在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述核酸适体及其衍生物在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述肿瘤为肺腺癌、肝癌和/或乳腺癌。
上述应用中，所述肿瘤细胞为MCF10CA1d或乳腺肿瘤干细胞。
本发明为癌症的治疗提供了一种核酸适体药物。与其它肿瘤化疗药物相比，核酸适体药物具有很多优势：抑制肿瘤细胞增殖的特异性、容易合成和修饰、无免疫原性、能快速的穿透组织和良好的代谢动力学。
附图说明
图1为不同浓度的核酸适体对肺腺癌细胞系A549细胞增殖的影响。
图2为核酸适体对不同肿瘤细胞株增殖的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、核酸适体及其衍生物
一、核酸适体
S50：GGGCGGGGGGTGGGGTGGTTGG(SEQ ID NO：1)；
S49：GGG GGG TGG GGT GGT TGG(SEQ ID NO：2)；
S11：GGT GGG TGG GTT GGG TGG(SEQ ID NO：3)；
S6：GGG TGTAGG GGT GGG GAT TGT GGG(SEQ ID NO：4)；
随机序列：5′-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-(N40)-C TCA TGG ACG TGC TGGTGA C-3′。
A、G、C和T分别代表未经修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
二、核酸适体衍生物
所述核酸适体的衍生物为如下a)-f)所示：
a)将所述核酸适体删除部分核苷酸或增加部分核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；
b)将所述核酸适体部分碱基用天然或人造核苷酸碱基替代后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；
c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；
d)将所述核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；
e)将所述核酸适体用聚乙二醇修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；
f)将所述核酸适体与其它药物联用，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。
实施例2、核酸适体的应用
一、核酸适体的合成及其预处理
用AB 3400DNA合成仪合成核酸适体S50、核酸适体S49、核酸适体S11、核酸适体S6及随机序列，合成的DNA经HPLC纯化、真空干燥、80％醋酸去除DMT、乙醇沉淀和真空干燥、用Tris-HCl(pH 9.0)调节pH至7.0，过滤灭菌后，最终用无菌的D-PBS稀释至500μM，于-20℃保存备用。
二、细胞实验
肺腺癌A549细胞系购自ATCC，编号为CCL-185；
人正常支气管上皮HBE细胞系购自ATCC，编号为CRL-2078.
肿瘤干细胞为乳腺肿瘤干细胞在文献“Cancer Research，2010，70：3005-3008”中公开过，公众可从中国科学院化学研究所获得。
乳腺癌MCF10CA1d细胞系和人乳腺表皮MCF10A1细胞系均在文献(BreastCancer Research and Treatment，2001，65：101-110；BMC Cancer，2002，2：1-7)中公开过，公众可从中国科学院化学研究所获得。
(一)不同浓度的核酸适体对A549细胞增殖的影响
用于培养A549细胞的培养基为DMEM+10％胎牛血清。
A549细胞经胰酶-EDTA处理和离心后，按照4000个细胞/毫升重新悬浮在新鲜培养基中，接着以800细胞/孔的密度种植于96孔板中。将96孔板置于细胞培养箱中孵育24小时后，移除培养基，加入200微升37℃预热的新鲜培养基。然后分别往各孔培养基中加入核酸适体或随机序列，使其最终浓度分别为0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM、12μM和16μM。将96孔板置于细胞培养箱中继续孵育。四天后，用MTS方法检测细胞的增殖程度。每组处理均设置3组平行实验。
细胞相对数目的统计或计算方法：MTS法最后一步是在490纳米下，用酶标仪读数，依据细胞活性状态不同，染色程度不一样，最后得到的数值也不同。
结果如表1和图1所示。实验表明5μM的四种核酸适体均能明显抑制A549细胞增殖，然而随机序列不能抑制A549的增殖。
表1、各组的细胞相对数目
  0μM   0.5μM   1μM   2μM   4μM   8μM   12μM   16μM
  S50   1   0.85283   0.74632   0.53574   0.317   0.29131   0.29488   0.28786
  S49   1   0.92   0.8872   0.66622   0.39321   0.33833   0.32687   0.31259
  S11   1   0.89392   0.75322   0.61   0.43422   0.34224   0.34912   0.34945
  S6   1   0.9   0.8543   0.62829   0.45693   0.42272   0.39329   0.39798
  随机   1   1.14922   1.1225   1.1226   1.15012   1.13856   1.15146   1.14158
(二)考察核酸适体S50对HBE、MCF10A1、MCF10CA1d和肿瘤干细胞增殖抑制
培养HBE、MCF10A1、MCF10CA1d和肿瘤干细胞的培养基如下：
HBE细胞：DMEM加10％胎牛血清；
MCF10A1和MCF10CA1d细胞：DMEM/F12，10mM HEPES，5％马血清，20纳克每毫升的表皮生长因子(EGF)，10微克每毫升的胰岛素，100纳克每毫升的霍乱毒素，0.5微克每毫升的肾上腺素，100微克每毫升青霉素，100微克每毫升链霉素；所述浓度均为各物质在培养基中的终浓度。
乳腺肿瘤干细胞：DMEM/F12，10mM HEPES，20纳克每毫升的表皮生长因子，5微克每毫升的胰岛素，2％B27无血清添加因子(美国Invitrogen公司)，0.5毫克每毫升皮质醇。
对于HBE、MCF10A1、MCF10CA1d和肿瘤干细胞，除核酸适体和随机序列在培养基中的最终浓度为10μM外，其余操作均与实验(一)中所述相同。以加入等量PBS缓冲液为对照。
结果如表2和图2所示。实验结果表明核酸适体S50对两种非肿瘤细胞株(HBE和MCF10A1)的增殖没有抑制作用，但是对乳腺癌MCF10CA1d和肿瘤干细细胞的增殖有明显的抑制作用。
表2、各组的490吸光度
  HBE   MCF10A1   MCF10CA1d   肿瘤干细胞
 PBS缓冲液   0.98228   0.98675   0.98674   0.97685
 S50   0.92228   0.90532   0.69701   0.71536
 随机   0.99   0.99   0.98965   0.989
Figure IDA0000153728510000011
Figure IDA0000153728510000021

Claims (6)

1.核酸适体及其衍生物，所述核酸适体为SEQ ID NO：4所示的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的核酸适体及其衍生物，其特征在于：所述核酸适体的衍生物为如下a)-f)中的至少一种：
a)将所述核酸适体删除部分核苷酸或增加部分核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；
b)将所述核酸适体部分碱基用天然或人造核苷酸碱基替代后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；
c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；
d)将所述核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；
e)将所述核酸适体用聚乙二醇修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；
f)将所述核酸适体与其它药物联用，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。
3.权利要求1或2所述核酸适体及其衍生物在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用。
4.权利要求1或2所述核酸适体及其衍生物在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肺腺癌、肝癌和/或乳腺癌。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为MCF10CA1d或乳腺肿瘤干细胞。
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