CN102627695B - 原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了原发性胆汁性肝硬化(PBC)特异性自身抗原，其为HK1亚型1、HK1亚型2、KLHL12、KLHL7、ZBTB2和EIF2C1。本发明筛选到6个新PBC自身抗原。在检测PBC患者血清中，这些自身抗原的阳性率都达到了15％以上，因此，这些新发现的自身抗原是潜在的区别其他自身免疫性疾病而准确诊断PBC的生物标记物。

Description

原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原及其应用

技术领域

本发明属于生物标志物领域，具体涉及原发性胆汁性肝硬化抗原标志物及其应用。

背景技术

原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种慢性胆汁淤积性肝脏疾病，以肝内中小胆管的进行性破坏为主要特征，最终导致肝硬化和肝功能衰竭的一种疾病(Poupon，R 2010，Selmi，C.2011)。其病理学表现为汇管区炎症，淋巴细胞围绕受损的胆管周围，并浸润至胆管基底膜和胆管上皮细胞内，胆管上皮细胞呈空泡状变性坏死，进而引起上皮样组织细胞增生，形成肉芽肿，这种形态学特点提示胆管上皮是PBC免疫攻击的目标。PBC最常见的临床症状为乏力和皮肤瘙痒。与胆汁淤积有关的PBC特殊并发症主要有骨质疏松、脂溶性纤维素缺乏、高脂血症和脂肪泻等。在疾病后期，可发生肝硬化和门脉高压的一系列与其他原因导致的肝硬化所致者基本类似的并发症，如腹水、食管胃底静脉曲张破裂出血和肝性脑病等。

PBC最主要的血清生化指标就是血清碱性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰转肽酶(Gamma-glutamyltransferase，γ-GT)升高，一般升高3-4倍，并且可见于疾病的早期和无症状期。但是谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)通常正常或轻度至中度升高。早期患者没有黄疸，但随着病情的进展，在较晚期的患者中血清胆红素明显升高，血清胆红素水平有助于判定PBC患者的预后及决定肝移植的时机。高胆红素、低白蛋白血症和延长的凝血酶时间都是预后不良的指标。此外，PBC患者的血清胆汁酸水平通常会升高。

血清中存在抗线粒体抗体(AMA)是PBC的重要标志。AMA并非PBC唯一的特异性自身抗体，在PBC血清中亦可检测到抗核抗体(ANA)，有呈现核模型(M-ANA)，有呈现多核点型(multiplenuclear dots，MND)。此外，部分PBC患者表现有抗平滑肌抗体阳性、抗甲状腺抗体、抗DNA抗体和类风湿因子等自身抗体。

自从医学工作者发现某些疾病患者的血清呈现特异的免疫荧光染色模式后，探索这些自身抗体所针对的自身抗原以及建立相关检测技术的工作就一直在进行。鉴定自身抗原方面，起初通过免疫荧光技术和细胞生物学知识初步确定靶抗原的细胞定位，再通过分离提取不同的细胞器，确认自身抗体识别的蛋白质在细胞中较精细的定位。随着蛋白质电泳技术、免疫印迹技术及生物质谱技术的发展，越来越多的自身抗原被鉴定。近年来，随着cDNA表达文库技术以及高通量重组蛋白表达纯化技术的运用，特别是高通量蛋白质芯片技术的发展，自身抗原的鉴定工作变得越来越简单、方便和快捷。

另一方面，自身抗体的临床实验室检测技术也取得了飞速发展，从起初的基于组织和/或细胞的免疫组织化学技术及免疫荧光技术，到传统的沉淀反应、免疫电泳技术、凝集试验、补体结合试验技术等。随着分子生物学的发展，特别是重组蛋白表达技术的发展，各种标记免疫测定技术(包括酶联免疫测定技术、放射免疫技术、荧光免疫测定、化学发光免疫测定和金免疫技术等)已成为主要的免疫测定技术。此外，免疫印迹法也发挥了明显的作用。近年来，随着基因组学和蛋白质组学技术的发展，蛋白质芯片技术以其较高的检测灵敏度在自身抗原鉴定方面发挥了重要作用，目前已有不少于21种蛋白质芯片用于临床(Hartmann，M.，J 2009)，其中至少有5种经FDA认证批准用于自身免疫性疾病的诊断。

目前，自身抗原鉴定的方法主要包括以下五种：1)SEREX技术；2)噬菌体展示技术；3)SERPA技术；4)蛋白质芯片技术；5)MAPPing技术。其中SEREX技术、噬菌体展示技术需要构建表达文库，经过数轮的生物淘洗，最终确定候选自身抗原的身份，程序繁琐，耗时耗力。此外还存在以下缺点，1)筛选到的表位主要以大肠杆菌容易表达的线性表位为主；2)由于大部分的文库是从肿瘤组织或细胞中提取mRNA制备cDNA的，表达文库倾向于原本就是较高丰度的胞内蛋白，而自身抗体识别的自身抗原大部分都是表达量较低的蛋白质。

SERPA技术是伴随中蛋白质组学技术的发展而产生的，在鉴定识别蛋白质翻译后修饰自身抗体方面有独特的优势，并且也摆脱了构建表达文库费时费力的工作，但是由于双向电泳技术分离细胞全蛋白的能力所限，特别是极端分子量和等电点的蛋白质抗原的分离，以及电泳过程中天然蛋白质构象被破坏，筛选到的自身抗体仍然以识别线性表位为主。

MAPPing技术是利用免疫亲和的方法首先使用对照血清预结合非疾病特异识别的天然蛋白质自身抗原，然后再使用疾病血清免疫亲和作用下结合疾病特异的天然蛋白质自身抗原。该方法更容易鉴定到能够识别天然蛋白质的自身抗体。其技术流程更接近与SEREX技术和噬菌体展示技术，都是经过多次淘洗的过程，只是这里需要经过生物质谱鉴定自身抗原的身份。其缺点就是鉴定自身抗原的身份比较麻烦，特别是由于天然细胞中存在大量蛋白质-蛋白质相互作用的复合体，在预吸附的过程中有可能将与非特异性自身抗原结合的疾病特异自身抗原一起除去，造成后续无法找到疾病特异的自身抗原。

蛋白质芯片技术是一种高通量、高灵敏度、微型化的分析技术，是检测血清和其他临床样本中多种自身抗体的有效工具。不但用于快速发现新的、对疾病的诊断和预后有重要应用价值的疾病相关自身抗体标记物，而且用于大批量、低成本检测已知的疾病相关自身抗体。由于蛋白质芯片上靶标抗原都是已知的，因此很容易判断鉴定的新的自身抗原的身份。然而制备蛋白质芯片上成千上万的蛋白质抗原探针却并非易事。目前芯片抗原可以使用经蛋白质组学技术分离的细胞全蛋白组分、各种已知抗体亲和捕获的天然蛋白质，以及外源宿主表达的重组蛋白。外源宿主表达的重组蛋白可能会面临非天然蛋白质的构象，克隆表达重组蛋白任务繁重等缺点。分离的细胞全蛋白组分和用已知抗体亲和捕获天然蛋白质的方法基本消除了非天然蛋白质的顾虑，但是也面临多种条件限制，如蛋白质组学技术分离的全蛋白组分的分离效果有待提高；鉴定目的靶标抗原比较麻烦；已知抗体的制备也比较繁琐且不易获得等重大缺陷。此外亦有采用构建cDNA基因芯片，利用体外原位无细胞表达体系制备相应的蛋白质芯片的报道，这种方法省去了纯化大量重组蛋白的麻烦，但无法确保芯片上重组蛋白质的有效表达。

如前所述，PBC是一种自身免疫性肝脏疾病，自身抗体标记物的检测在疾病的诊断中具有重要作用。AMA是PBC临床诊断的重要标准之一，且可以在PBC无症状期或临床症状前期出现在患者血清中。AMA(主要是II型抗线粒体抗体，AMA-M2)在PBC诊断中的敏感度为90％左右。随着各种临床疾病研究的深入，发现AMA可以广泛存在于其他多种自身免疫性疾病，如原发性干燥综合征，硬皮病，自身免疫性肝炎以及病毒性肝炎等。甚至有报道发现40.9％(28/69)的急性肝衰竭患者呈现AMA-M2阳性(leung 2007)。此外，仍有10％左右为AMA阴性PBC患者，这部分患者的诊断只能依靠其他各种临床症状结合肝活检进行确认。

除AMA外，抗gp210抗体、抗p62抗体、抗sp100抗体、抗sp140抗体及抗LBR抗体等自身抗体在PBC的诊断中也有重要临床价值，但是普遍阳性率偏低(1％-30％)，且大部分与AMA-M2同时出现。

PBC是一种遗传因素和环境因素相互作用下的自身免疫性疾病，其发病机制并不清晰。自身抗体在PBC发病机制中的作用了解不足且存在争议。尽管AMA在PBC中拥有较高的敏感度和特异性，有实验表明，AMA的滴度可能与疾病活动性相关，提示AMA可能参与了肝脏组织的损伤。但也有相反的观点，争议颇多。因此鉴定更多的自身抗体可能有助于揭示PBC的发病机制，特别是自身抗体在其中的作用。

由于PBC的治疗比较特殊，完全不同于其他疾病，特别是自身免疫性肝炎和病毒性肝炎等其他肝脏疾病。因此在肝炎基数较大的中国，PBC的鉴别诊断非常重要。因此有必要鉴定更多PBC相关的自身抗体标记物，以服务于PBC的临床诊断。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供原发性胆汁性肝硬化(PBC)特异性自身抗原及其应用。

本发明通过高密度蛋白质芯片与小样本血清杂交筛选候选PBC自身抗原及后续的制备PBC芯片并与大样本血清杂交筛选相结合的方案共筛选出6个与原发性胆汁性肝硬化(PBC)高度相关且敏感度均大于15％的特异性自身抗原，分别为HK1亚型1、HK1亚型2、KLHL12、KLHL7、ZBTB2和EIF2C1。

进一步地，本发明还提供所述的自身抗原作为生物标志物在制备原发性胆汁性肝硬化检测试剂中的应用。

其中，所述试剂为基于放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫或金免疫技术的试剂，如包被所述抗原的免疫荧光试纸条、免疫放射试纸条，免疫金试纸条等，但不限于此。

其中，所述的自身抗原可为两个或两个以上自身抗原融合的抗原。

在本发明优选的一个实施方案中，所述的检测试剂为包被有一种或多种所述的自身抗原的原发性胆汁性肝硬化检测芯片。

其中，所述的检测芯片还可包被BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2、E3BP、PDC-E1β、PDC-E1α、Gp210、p62、LBR、CENP-B、Sp100和Sp140中的一种或多种原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原。

在本发明另一个实施方案中，所述检测芯片包被KLHL12、ZBTB2和gp210。

其中，所述的检测芯片，还可包被质控抗原。其中，所述的质控抗原可为本领域中合适的任何质控抗原，如鼠IgG、人IgG和禽流感病毒核蛋白中的一种或多种。

进一步地，本发明还提供一种原发性胆汁性肝硬化ELISA检测试剂盒，其含有酶标板，所述的酶标板包被一种或多种所述的自身抗原。

优选的，所述的酶标板还可包被BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2、E3BP、PDC-E1β、PDC-E1α、Gp210、p62、LBR、CENP-B、Sp100和Sp140中的一种或多种原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原，以提高检测PBC的灵敏度。

本发明通过高密度蛋白质芯片与PBC患者血清杂交筛选到23个候选PBC相关自身抗原。为了进一步验证这些自身抗原的特异性，构建了包含其中的21个候选PBC相关自身抗原以及9个临床上已经使用或报道的PBC特异性自身抗原在内的PBC芯片，然后通过大样本血清(包括191份PBC血清，及321份对照血清：43AIH，55HBV，31HCV，48RA，45SLE，49SSc and 50健康人)与PBC芯片杂交，通过数据结果分析，共鉴定到13个自身抗原在PBC血清中具有较高的灵敏度和特异性，数据分析显示13种蛋白质在PBC中的敏感度达到15％以上，其中6个为新发现的，分别为HK1(isoforms I和isoformsII)，KLHL7，KLHL12，ZBTB2，和EIF2C1。其中，HK1亚型I、HK1亚型II、KLHL12、KLHL7的阳性率达到了35％以上。结果还发现，联合KLHL12、ZBTB2和gp210检测对AMA-M2阴性的PBC患者诊断起重要辅助作用，检测敏感度为47.8％，特异性为89.4％，与AMA-M2检测PBC基本一致(89.7％)。为了方便于临床检测，297份PBC血清和637份对照血清用于基于ELISA技术的抗KLHL12和ZBTB2自身抗体检测，结果发现其阳性率分别为29.6％和11.2％，特异性分别为98％和99.7％。另外Western blot结果证实PBC血清中抗HK1和KLHL7的自身抗体不但能被芯片可检测，Western blot也是可检测的。

附图说明

图1所示为PBC血清及对照血清杂交高密度蛋白质芯片局部效果图。A、B和C图显示的是三份PBC血清与芯片杂交的效果图；D、E和F图显示的是三份对照组血清与芯片杂交的效果图。绿色方框中两个平行点蛋白质探针为HK1亚型I(isoform I)；黄色方框中探针为KLHL12；蓝色方框中为ZBTB2。

图2为高密度蛋白质芯片与46份血清样本杂交后每份血清所识别的阳性探针的数量比较。A为26份PBC血清识别阳性探针数量的分布；B为20份对照血清识别阳性探针数量的分布。

图3PBC自身抗原蛋白质芯片的布局及抗GST抗体检测。A重新表达纯化的30个PBC自身抗原及阳性对照(红色填充)和阴性对照(灰色填充)在芯片中的分布。B抗GST抗体检测结果，所有30个重组抗原均带有GST标签，对照中AIV-NP为大肠杆菌表达，带6*His标签。

图4大样本血清与PBC自身抗原芯片杂交局部效果图。A-D显示的是四份PBC血清与芯片杂交的效果图；E-I显示的对照血清与芯片杂交效果图。

图5在PBC血清中敏感度大于15％的7种已知PBC自身抗原与191份PBC血清及321份对照组血清杂交后的信号分布。

图6在PBC血清中敏感度大于15％的6种新鉴定的PBC自身抗原与191份PBC血清及321份对照组血清杂交后的信号分布。

图7ELISA法检测KLHL12和ZBTB2分别与934份各种血清杂交反应的信号分布。

图8部分血清与HK1(isoform I)和KLHL7的免疫印迹检测。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

PBC的诊断是按照2000年AASLD确立的标准诊断(Heathcote，E.J.2000)。所有血清由北京协和医院风湿免疫科自2006年至2010年收集，所有疾病血清均来自临床确诊患者。所有PBC血清均进行了AMA、ANEA、ACA及核点型抗体以及AMA-M2的检测。AMA、ANEA、ACA及核点抗体的检测是基于Hep2细胞(德国Euroimmune公司)的免疫荧光技术。而抗AMA-M2抗体的检测是利用anti-MIT3E kit(德国Euroimmune公司)试剂盒进行的ELISA检测。所有AMA或/和抗M2抗体阴性的血清均满足PBC穿刺肝活检及生化检测的诊断标准。下述实施例中涉及的各试验均得到北京协和医院伦理委员会的审核批准。

实施例1利用高密度蛋白质芯片筛选候选PBC相关的自身抗原

高密度蛋白质芯片由美国约翰·霍普金斯大学朱衡老师实验室提供。每张高密度蛋白质芯片中含有48个矩阵，每个矩阵包含800个探针，呈32X25的阵列排列。在芯片上每种蛋白质探针有一个平行点，该蛋白质芯片包含16,368种重组蛋白质。大部分重组蛋白来自酿酒酵母宿主表达的相应基因全长ORF，且在N端具有GST标签(Jeong，2012)。该高密度蛋白质芯片已经公开于Jeong et al.，RapidIdentification of Monospecific Monoclonal Antibodies Using a HumanProteome Microarray，Molecular&Cellular Proteomics(2012.2.3在线公开)，本领域技术人员可据此进行制备。

由于所有芯片上的蛋白质探针N端均带有GST标签，因此首先使用鼠抗GST单克隆抗体与芯片杂交验证芯片质量。接着挑取26份PBC确诊患者血清以及20份对照血清(5份自身免疫性肝炎(AIH)血清、5份乙型病毒性肝炎(HBV)血清和10份健康人血清)与46张芯片杂交，通过信号采集及数据分析鉴定候选的PBC相关自身抗原。

1)芯片质量验证

利用抗GST抗体杂交蛋白质芯片，验证芯片上有效蛋白质探针的数量以及平行探针之间的相关性，具体操作步骤如下：

取出-80℃保存的高密度蛋白质芯片后直接浸入3％BSA的封闭液中，37℃封闭1h；

取0.5μl小鼠抗GST单克隆抗体按照1∶1000的比例稀释于3％BSA中，震荡混匀，10000rpm*10min离心，上清即为稀释好的一抗。芯片从封闭液中取出后，用吸水纸将多余的封闭液从一侧尽量吸干，置于湿盒中。然后吸取180μl稀释好的一抗加到芯片上，缓慢加盖玻片，避免气泡产生，37℃孵育1h；

将孵育好的芯片置于PBST中，小心取下盖玻片，芯片放入洗盒中用37℃预热的PBST 40rpm漂洗3次，每次10分钟；

取0.5μl cy5标记的山羊抗小鼠IgG抗体，按照1∶1000的比例稀释于3％BSA中，震荡混匀，10000rpm*10min离心，上清即为稀释好的二抗。从洗盒中取出芯片，用吸水纸从一侧吸干多余的洗液，置于湿盒中。吸取180μl稀释好的二抗加到芯片上，缓慢加盖玻片，避免气泡产生，37℃避光孵育二抗1h；

将孵育好的芯片置于PBST中，小心取下盖玻片，芯片放入洗盒中用37℃预热的PBST 40rpm避光漂洗3次，每次10分钟。然后再用37℃预热的纯水40rpm避光漂洗3次，每次10分钟；

取出芯片，置于50ml离心管中，芯片上有探针的一侧朝外，2000rpm*3min离心，甩干芯片上残余的纯水，LuxScan-10K/A芯片扫描仪扫描芯片，每次杂交完成后都设置相同的扫描参数扫描芯片。扫描仪的参数设置如下：光电倍增管(PMT)设置为850，激光能量(Power)设置为95，扫描的像素为5um，

当芯片上探针的信噪比(SNR)大于3时，认为芯片上该探针可被检测，然后计算芯片上可被检测的蛋白质探针的比例及每个探针的两个平行点之间的相关性。

每张高密度蛋白质芯片上共计38400个探针点(包括阳性对照点和阴性对照点；每种探针具有两个平行点)，其中包括16368种非冗余重组人源蛋白质。

每张芯片上所有探针共组成48个矩阵，每个矩阵呈32X25的微阵列排列。由于所有重组蛋白质探针的N端均带有GST标签，因此使用小鼠抗GST单克隆抗体进行检测芯片上所有探针，确保用于血清筛选的芯片上绝大多数重组蛋白能被检测到。以每个蛋白质探针的2个平行点的信号强度作做散点图，平行点之间的相关系数为97.8％，显示平行探针点之间具有良好的重复性。

2)筛选候选PBC相关的自身抗原

筛选用血清的组成：26份PBC血清以及20份对照血清(5AIH血清、5HBV血清和10健康人血清)。每一份血清与一张蛋白质芯片杂交，除了一抗为PBC患者血清或对照疾病血清及二抗为cy5标记的羊抗人IgG抗体外，杂交方法如步骤1)中1-6。

按照GenePix Pro 6.0软件的操作手册，将所有芯片扫描图片的亮度和对比度均设置为99，然后使用芯片图像采集软件GenePix Pro6.0分析并获取每张芯片上各靶标蛋白质点杂交的信号强度。

将GenePix Pro 6.0软件采集到的每张芯片上所有探针的信号信息导入Excel表格中。每个探针点的前景信号强度(F635median)分别除以其周围背景信号强度(B635median)作为该点的信号值。

I_ij＝F635median/B635median

I_ij代表blockj中的蛋白质i点的信号值。

蛋白质抗原探针的信号值越趋近于1，说明血清中相应的自身抗体越无法检测到。信号值越高说明自身抗体的结合靶标蛋白质抗原探针的能力越强。

为了消除不同批次芯片及同一批次芯片上不同空间对杂交造成的差异，芯片数据的处理采用芯片内归一化(within-chipnormalization)的方法对每张芯片上的信号进行归一化。即假设芯片内所有靶标蛋白是随机点制到基片上的，且只有很少部分(小于5％)的靶标蛋白质作为自身抗原被血清中相应的靶标自身抗体识别而被检测到，因此芯片上信号的分布是随机的，不同矩阵(block)之间是一致的。本研究设定每个block中的所有探针点信号值的中位值是1，以此来归一化芯片上不同block内探针点的信号值。

即 ${\tilde{I}}_{\mathrm{ij}}=I_{\mathrm{ij}}-\mathrm{median}\left(I_j\right)+1.$

median(I_j)代表block j中所有点信号值的中位值，代表归一化后的block j中的蛋白质i点的信号值。

在此基础上，按照朱衡老师实验室已发表的文章(Hu，2009)中所述方法设定cutoff值判断芯片上所有探针点是否为阳性。即计算整张芯片上所有点信号值的均值I_average，以及所有信号值小于1的信号值的标准差SD，以I_average+6SD为cutoff值，来判断芯片上的探针点是否为阳性。然后统计每份血清杂交的芯片上阳性反应的蛋白质抗原探针的个数，利用非参数检验卡方检验(chi-square test，X²)或Fisher精确检验(Fisher exact test)确定候选的PBC相关自身抗原。同时，将特异性达到100％，敏感度不小于15％的抗原也作为候选的PBC自身抗原。

高密度蛋白质芯片与血清反应后的代表性局部图像如图1所示(方框内为差异的蛋白抗原探针)。总体来说，无论是PBC患者血清，还是肝病对照组(AIH血清和HBV血清)和健康人血清，都只能识别芯片上很少的蛋白。

使用芯片内归一化的方法对每张芯片上的信号进行归一化，然后统计分析确定每张芯片上的阳性探针。芯片上能够被每份血清识别的蛋白质的数目不尽相同，如图2所示，蛋白质抗原被识别的数目在PBC与对照中基本没有区别。26份PBC血清识别的蛋白质抗原的数目为70-709(平均数±标准差：347±191)，20份对照血清识别的蛋白质抗原数据为74-1440(429±306)。

对于芯片上每个蛋白质探针是否为PBC相关的自身抗原，利用X²检验或Fisher精确检验确定7个蛋白质为PBC特异反应的靶标蛋白质抗原。同时，本研究亦将特异性达到100％，敏感度不小于15％为标准，共有16个抗原也作为候选的PBC特异自身抗原。详细信息如表1。

表1 小样本血清与高密度蛋白质芯片杂交筛选到23个候选PBC特异自身抗原。

实施例2PBC自身抗原蛋白质芯片的构建与血清筛选验证

利用实施例1筛选得到23个候选PBC自身抗原及9个临床上已知或最近几年文献报道的PBC特异性自身抗体标记物制备PBC芯片时，芯片中计划表达的重组蛋白质抗原为32个。但是由于一些不可控的因素，本实施例以其中的30个PBC相关自身抗原的继续开展研究(表2)。

将上述30个蛋白质抗原重新表达纯化用于制备PBC相关抗原蛋白质芯片，图3-A为30个PBC相关自身抗原与对照探针在小芯片上的点阵布局。除了30个PBC相关自身抗原探针外，还包括阳性对照探针1)AIV-NP(avian influenza virus-Nucleoprotein，禽流感病毒核蛋白)；2)鼠IgG(鼠抗人IgG抗体)；3)人IgG及阴性对照探针1)Buffer(重组蛋白洗脱液)；2)GST标签蛋白。图3-B为抗GST抗体检测芯片上一个点阵中所有PBC相关自身抗原的结果。

PBC自身抗原蛋白质芯片上所有35个探针都具有重复的双点。每张基片上共点制12个点矩阵，在血清与芯片的杂交反应前，用围栏将每一个点阵隔离开，这样每一个点阵都形成一个独立的空间，因此每张芯片可同时检测12份血清。

与PBC自身抗原蛋白质芯片杂交的大样本血清包括43份AIH血清，55份HBV血清，31份HCV血清，50份健康人血清，191份PBC血清，48份类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)血清，45份系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)血清，49份系统性硬皮病(Systemic Sclerosis，SSc)血清。图4为PBC自身抗原蛋白质芯片与PBC血清及对照血清反应的代表性图像。从中可以明显的看到PBC血清杂交的结果中信号强度大(红色)的探针数量明显比AIH，SSc，SLE等其他自身免疫性疾病多。

对每个探针来说，首先计算50份健康人血清杂交信号的平均值及其标准差，采用高于平均值五倍标准差的数值为cutoff值来判断所有血清与该探针是否呈阳性反应。然后统计各个探针在191份PBC血清及个对照组血清中的阳性率。

具体各血清组与芯片上所有30种蛋白质抗原阳性反应的例数及其阳性率见表2(1种已知蛋白质抗原)和表3(18种候选PBC蛋白质抗原)。

表2各血清组与芯片上12种已知PBC自身抗原杂交反应呈现阳性的病例数及其阳性率

*非PBC包括健康、AIH、HBV、HCV、RA、SLE和SSc

表3各血清组与芯片上18种候选PBC自身抗原杂交反应呈现阳性的病例数及其阳性率

*非PBC包括健康、AIH、HBV、HCV、RA、SLE和SSc

从表2和表3的数据分析结果来看，所有小芯片上的30个自身抗原探针与健康人血清反应的阳性率均小于2％。与PBC血清反应的阳性率大于15％的共计有13种蛋白质，分别是：PDC-E2、BCOADC-E2、gp210、E3BP、CENPB、LBR、sp140、HK1(isoformI)、HK1(isoform II)、KLHL7、KLHL12、ZBTB2和EIF2C1。所有这13种抗原的阳性比例在PBC与健康人之间均有统计学上的显著差异(p＜0.05)。

在这13种阳性率大于15％的自身抗原中，前7个为临床上已经使用或者文献报道的PBC相关自身抗原，在各血清组与芯片上相应探针杂交反应的信号分布见图5；后6个为新发现并用大样本验证的PBC相关自身抗原，在各血清组与芯片上相应探针杂交反应的信号分布见图6。

从图5和图6中可以看到，在小芯片检测的结果中，M2抗原中PDC-E2和BCOADC-E2的信号在PBC血清中信号明显高于对照血清及健康人血清，另gp210表现也很好。在新鉴定的抗原中，HK1(isoform I)、HK1(isoform II)、KLHL7和KLHL12等蛋白质在PBC血清中的杂交信号也明显优于对照血清及健康人血清。

PBC自身抗原芯片上总计有12种已知抗原，包括AMA-M2型自身抗体所识别的6种蛋白质；ANEA所识别的gp210、p62和LBR等位于核膜上的蛋白质；多核点型荧光模式抗体所识别的Sp100和Sp140两种蛋白质；以及ACA的主要抗原蛋白质CENP-B。

对于M2复合体的6个已知PBC特异的自身抗原来说，其中抗BCOADC-E2、PDC-E2和E3BP的自身抗体的阳性率比较高，分别为62.3％、51.83％和33.51％。而另外3个成员来说，抗OGDC-E2、PDC-E1α和PDC-E1β自身抗体的阳性率比较低，分别为8.4％、9.4％和12.6％。

本实验中，所有PBC血清除了采用免疫荧光技术检测AMA外，还使用产自欧蒙(北京)医学诊断技术有限公司的商品化ELISA试剂盒检测AMA-M2型自身抗体。商品化试剂盒的名称为：抗M2-3E抗体IgG检测试剂盒(Anti-M2-3E ELISA)。结果显示AMA-M2型自身抗体在PBC血清中的阳性率为84.8％(162/191)。该商品化ELISA试剂盒微孔板包被的抗原是从猪心中分离得到的酮酸脱氢酶复合体和重组融合蛋白的混合物。重组融合蛋白质是大肠杆菌表达的，包含了BCOADC-E2、PDC-E2和OGDC-E2三种抗原表位。因此，当血清针对M2复合体中的其中任何一个自身抗原成分反应阳性的时候，本研究就认为该血清抗M2复合体阳性，小芯片检测191份PBC血清，发现157份为抗M2复合体阳性，阳性率为82.2％。本研究中自制的芯片与欧蒙公司的试剂盒检测的匹配率(同时检测阳性或阴性的血清占总体的比值)为91.6％。结果显示本实验室制备的PBC相关抗原蛋白质芯片是可靠的。

值得欣喜的是，在13个与PBC血清反应阳性率大于15％的蛋白质中，6个为新发现的PBC自身抗原，它们分别是HK1(Hexokinaseisoform I，阳性率为46.6％)，HK1(Hexokinase isoform II，阳性率为44.0％)，KLHL12(Kelch-like protein 12，阳性率为40.3％)，KLHL7(Kelch-like protein 7，阳性率为35.1％)，ZBTB2(Zinc fingerand BTB domain-containing protein 2，阳性率为16.8％)和EIF2C1(Eukaryotic translation initiation factor 2C，subunit 1，阳性率为15.2％)。

由于PBC是一种肝脏特异的自身免疫性疾病，其早期的临床症状及生化指标与其他的肝脏疾病比较类似，故本研究首先着眼于新发现的自身抗原在PBC与肝脏疾病对照组之间的差异。肝脏疾病对照组包括43例AIH血清、55例HBV血清和31例HCV血清。与另外一种自身免疫性肝病AIH相比，6个新发现的自身抗原中除了EIF2C1外，均能够明显的与PBC患者血清反应相关(p＜0.01)。与中国常见的病毒性肝炎(86例)相比的话，所有6个新发现的自身抗原均能够明显的与PBC患者血清反应相关(p＜0.01)。因此，相对于AIH及病毒性肝炎等其他常见肝脏疾病来说，这些新发现的自身抗原为PBC患者血清所特异识别的。

PBC作为一种自身免疫性疾病，新鉴定到的自身抗原在区别PBC与AIH之间的优异表现促使本研究专注于PBC与其他自身免疫性疾病之间的差异。本研究中实际使用的的自身免疫性疾病的对照包括48例RA，45例SLE和49例SSc血清病例。与RA和SSc血清样本相比，所有5个新鉴定到的自身抗原(HK1 isoform I，HK1isoform II，KLHL12，KLHL7和ZBTB2)在PBC血清中阳性反应明显增高。与SLE血清样本相比的话，HK1 isoform I，KLHL12，KLHL7等自身抗原被PBC识别的比例明显高于SLE血清(p＜0.05)。因此，这些新发现的自身抗原是潜在的区别其他自身免疫性疾病准确诊断PBC的生物标记物。

尽管AMA-M2在PBC的诊断中非常重要，然而仍然有约10％的PBC患者由于AMA-M2阴性必须借助于更多的生化检测以及临床症状的排查，特别是有创伤性的生物活检检测才能确诊。由于已知的PBC自身抗体标记物中除了AMA-M2外其余自身抗体的敏感度都比较低(1-30％)。因此寻找M2阴性PBC特异的标记物也一直是PBC研究的难点。基于PBC自身抗原芯片筛选191份PBC血清和321份各对照组血清的杂交试验研究显示联合检测KLHL12、ZBTB2以及gp210对于M2阴性PBC患者的诊断具有重要的应用价值。联合检测的灵敏度为47.8％，而特异性为89.4％(321份对照血清中阳性率为10.3％)，与M2对PBC检测的特异性相似(89.7％)。因此新筛选到的自身抗原与gp210联合检测将有助于对AMA-M2阴性PBC患者的诊断。

实施例3ELISA验证新发现的自身抗原

鉴于小芯片结果中HK1 isoform I，HK1 isoform II，KLHL12，KLHL7和ZBTB2对于PBC诊断的敏感度和特异性较高(EIF2C1在PBC与SLE中检测灵敏度相似，15.2％vs15.6％)，决定采用临床上常用的ELISA法检测这些新鉴定的自身抗原。另外由于HK1 isoformI与HK1 isoform II在序列上仅有N端21个氨基酸存在差异，且两者在小芯片中的表现基本一致，故在此制备的ELISA板子的抗原包括HK1 isoform I，KLHL12，KLHL7和ZBTB2，包被浓度分别为200ng/孔、75ng/孔、200ng/孔和50ng/孔。

对于KLHL12与ZBTB2两个自身抗原的检测(图7)。ELISA检测的样本包括934份血清：53份AIH患者血清、112HBV患者血清、54份HCV患者血清、87份健康人血清、297份PBC患者血清、122份RA患者血清、86份SLE患者血清、123份SSc患者血清。

在ELISA的检测结果中，每份血清进行平行检测，将平行两孔的OD值的平均值作为该份血清与包被抗原免疫反应的信号值。设定OD450＞0.4为cutoff值，当OD值大于0.4时，该血清与检测的自身抗原反应阳性。抗KLHL12和ZBTB2抗体阳性血清的个数如表4所示。

表4 抗KIHL12和ZBTB2自身抗体在各组血清中的阳性个数及阳性率。

从表4中得知抗KLHL12和ZBTB2自身抗体的在PBC血清中的阳性率分别为29.6％和11.5％，特异性为98％和99.7％。与PBC自身抗原芯片检测的结果相比，敏感度偏低(29.6％vs40.3％，11.5％vs16.8％)特异性偏高(98％vs95％，99.7％vs98.4％)。

实施例5利用Western blot方法检测抗HK1和KLHL7自身抗体

在大样本血清与PBC自身抗原蛋白质芯片杂交的结果显示抗HK1和KLHL7的自身抗体的信号明显大于个阴性对照组，且芯片杂交的信号值很高(至少有25％的血清杂交信号值大于5000)，然而ELISA检测中却发现阳性血清与阴性对照血清的OD值比较相似。为了探测血清中抗HK1和KLHL7自身抗体在血清中真实存在，本研究使用了Western blot方法进行检测。

从结果中发现，当用抗标签蛋白抗体进行检测时，发现HK1和KLHL7抗原以及标签均在相应分子量出现条带，而分别选定的4例抗HK1抗体和抗KLHL7抗体的阳性的杂交结果显示这些PBC血清中均分别存在抗HK1和抗KLHL7的自身抗体(图8)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原ZBTB2作为生物标志物在制备原发性胆汁性肝硬化检测试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂为包被有所述的自身抗原ZBTB2的原发性胆汁性肝硬化检测芯片。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的检测芯片还包被BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2、E3BP、PDC-E1β、PDC-E1α、Gp210、p62、LBR、CENP-B、Sp100和Sp140中的一种或多种原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的检测芯片还包被质控抗原。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的质控抗原为鼠IgG、人IgG和禽流感病毒核蛋白中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂为原发性胆汁性肝硬化ELISA检测试剂盒，其含有酶标板，所述酶标板包被原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原ZBTB2。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的酶标板还包被BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2、E3BP、PDC-E1β、PDC-E1α、Gp210、p62、LBR、CENP-B、Sp100和Sp140中的一种或多种原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原。