CN102618538A - 一种调控真核生物基因转录的dna序列及其结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种调控真核生物基因转录的DNA序列及其结合蛋白。本发明人首次从恶性疟原虫中鉴定和分离介导var基因家族转录沉默的非编码DNA序列及其结合蛋白——肌动蛋白。该DNA序列与肌动蛋白相互作用使var基因定位于细胞核周的异染色质区,导致基因沉默。并且,基于本发明的新发现,可筛选调节var基因转录、进而调节恶性疟原虫毒力的物质。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域;更具体地,本发明涉及一种调控真核生物基因转录的DNA序列及其结合蛋白。
背景技术
恶性疟原虫红细胞膜表面蛋白(PfEMP1)是var基因家族的编码产物,为恶性疟原虫最重要的毒力因子之一,介导被感染红细胞与宿主细胞受体黏附和免疫逃避等过程。var基因家族具有相互排斥性表达的特点,在约60个var基因中,一般只有其中一个基因获得表达。疟原虫在红细胞内的生活史循环中,该唯一表达的成员不断发生转换(Switching),导致高度的抗原变异。研究表明,该过程是在转录水平上进行调控:所有var基因都位于细胞核周,沉默的基因位于异染色质区;活化的基因则位于常染色质。因此,var基因位点在细胞核周区域的定位是该过程的关键调控途径。但是,介导这一核周定位(Anchoring)的相关因子尚未有报导。
所有var基因具有类似的结构:两个外显子和一个内含子。其中,内含子序列高度保守。已有研究证实var基因的转录沉默与其内含子有关,内含子的缺失可导致相应var基因的转录激活。因此,内含子是var基因家族的重要调控序列,但是相应的作用因子(核蛋白)及其分子机制尚不清楚。鉴定参与var基因转录调控的内含子关键序列以及相关的结合蛋白,并研究它们的调控途径,不仅有助于阐明var基因家族的表达调控机制,而且为恶性疟原虫的防治提供潜在的药物靶点,具有重要的科学和应用意义。
发明内容
本发明的目的在于获得var基因内含子区域中关键核蛋白结合位点(iNBE)的DNA序列(寡核苷酸序列)、与该特征序列结合的核蛋白,以及iNBE/核蛋白复合物在var基因转录调控中所起的作用机制。
本发明的目的还在于提供调控var基因转录的蛋白及调控方法,所述的蛋白是肌动蛋白。
本发明的目的还在于提供筛选降低疟原虫毒力的潜在物质的方法。
在本发明的第一方面,提供一种寡核苷酸,所述的寡核苷酸选自:
(i)如下所示序列的寡核苷酸:5’AAAAA(TA)nTCATAAAATAAAAA 3’;其中n=2-20(优选的,n=3-9;如3,4,5,6或7);或
(ii)与(i)的寡核苷酸同源的变异体,具有与(i)的寡核苷酸相同的与蛋白质结合的能力。
在一个优选例中,所述的寡核苷酸分离自恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)var基因家族的内含子序列。
在另一优选例中,所述的寡核苷酸是分离的或人工合成的。
在另一优选例中,所述的寡核苷酸是核蛋白的结合位点。
在另一优选例中,所述的蛋白质是肌动蛋白;较佳地是I类肌动蛋白(ActinI)。
在本发明的另一方面,提供所述的寡核苷酸的用途,用于特异性地与肌动蛋白相互作用。
在另一优选例中,所述的肌动蛋白是I类肌动蛋白(Actin I)。
在本发明的另一方面,提供肌动蛋白的用途,用于与var基因内含子相互作用(结合),调控var基因的转录和表达。
在另一优选例中,所述的肌动蛋白选自:
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白;
(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个;更佳地1-10个;更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且具有(a)所述蛋白的功能的由(a)衍生的蛋白。
在另一优选例中,所述的肌动蛋白由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列编码而成。
在本发明的另一方面,提供一种复合物,包括所述的寡核苷酸以及肌动蛋白。
在另一优选例中,所述的复合物是分离的。
在另一优选例中,所述的复合物中,所述的寡核苷酸以及肌动蛋白相互作用(结合)。
在本发明的另一方面,提供所述的复合物的用途,用于筛选抑制var基因转录水平、从而降低疟原虫毒力的物质。
在本发明的另一方面,提供一种筛选降低疟原虫毒力的潜在物质的方法,所述方法包括:用候选物质与所述的复合物接触,观察该复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况,若两者的相互作用增强,则表明其是对于降低疟原虫毒力有用的潜在物质。
在另一优选例中,所述方法包括:
(a)在测试组中,向包含权利要求4或5所述的复合物的体系中添加待筛选的候选物,并检测复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况;并且,在对照组中,在不添加所述候选物的、包含权利要求4或5所述的复合物的体系中,检测复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况;
(b)将步骤(a)测试组复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用与对照组复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用进行比较,如果测试组复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用在统计学上强于(优选显著强于,较佳的强20%或更强;更佳的强40%或更强;进一步更佳的强60%或更强)对照组,就表明该候选物是对于降低疟原虫毒力有用的潜在物质。
在另一优选例中,通过免疫共沉淀法鉴定复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况。
在另一优选例中,所述的肌动蛋白是游离的肌动蛋白(G-actin)。
在本发明的另一方面,提供一种调控细胞内var基因的转录的方法,所述方法包括:采用调节肌动蛋白聚合或解聚合的试剂处理细胞。
在另一优选例中,所述的细胞是疟原虫的细胞。
在另一优选例中,采用调节肌动蛋白解聚合的试剂处理细胞,调控细胞内var基因转录沉默,从而降低疟原虫的毒力;或
采用调节肌动蛋白聚合的试剂处理细胞,调控细胞内Var基因转录激活。
在另一优选例中,所述的调节肌动蛋白解聚合的试剂是Cytochalasin D(CD)。
在另一优选例中,所述的调节肌动蛋白聚合的试剂是Jasplakinolide(JAS)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、恶性疟原虫var基因内含子的EMSA探针设计。自恶性疟原虫3D7株系基因组中扩增获得染色体中间位置var基因(PFD1000c)的全长内含子,并通过PCR分割成一系列片段重叠的短探针(5’端生物素标记)进行多轮的EMSA试验,最终的探针c1.2.2即为iNBE序列。
图2、用EMSA试验鉴定var基因内含子核心结合序列(iNBE)。图示左侧为第一轮EMSA试验中,4条探针分别与恶性疟原虫3D7株核蛋白提取物的结果,其中int-a/b/c/d分别代表4条探针;N.E.代表恶性疟原虫核蛋白抽提物;C1、C2为初步鉴定到的不同的探针/核蛋白复合带。图示右侧以c1.2.2(iNBE)探针检测到特异性探针/核蛋白复合带,提示内含子核心结合序列所在位点。
图3、竞争性EMSA验证iNBE结合复合物的特异性。恶性疟原虫核蛋白抽提物与竞争性DNA(无生物素标记DNA)相互作用的EMSA结果,以c1.2.2作为全部EMSA反应的特异探针;N.E.:核提取物,ssDNA:鲑鱼精DNA,酵母tRNA。
图4、iNBE序列在3D7株基因组中的分布。图上部横坐标代表不同5’UTR类型的var基因,纵坐标为3D7株不同Var基因内含子中的iNBE核心结合序列的拷贝数,图中每一个黑点代表一个内含子,共59个内含子。
图5、免疫印迹分析Pfactin-I抗体的特异性。图示不同虫期阶段的恶性疟原虫抽提物分别与抗Pfactin-I抗体(鼠抗)进行免疫印记试验的结果,R、T、S分别代表3D7虫株的环状体、滋养体和裂殖体阶段。
图6、超迁移试验(Super-shift)验证Pfactin-I与iNBE的相互作用。超迁移试验鉴定var基因内含子特征序列,抗体来自重组Pfactin-I免疫后小鼠的血清总IgG,佐剂免疫小鼠组的IgG作为该实验阴性对照。
图7、染色质免疫沉淀试验(ChIP)验证Pfactin-I与iNBE的体内相互作用。图示PCR鉴定ChIP实验获取的DNA组分,其中1泳道为input DNA,即免疫沉淀前的样品,2、3泳道分别为佐剂组IgG获取的DNA产物,上样量分别为1μl和2μl;4、5泳道分别为实验组IgG获取的DNA产物,上样量分别为1μl和2μl。
图8、间接免疫荧光技术(IFA)分析Pfactin-I在恶性疟原虫中的亚细胞定位。100倍油镜观察,绿色荧光示目的蛋白Pfactin-I在细胞核的分布位置,蓝色荧光示DAPI细胞核染色,Merge示两荧光通道融合显示目的蛋白具体分布特征,标尺为2μm。
图9、不同Actin抑制剂对恶性疟原虫var基因转录谱的作用。
A:CD以及JAS这两种药理性质相反的药物作用于Actin蛋白后,诱使其发生生物学性状改变,其中Actin蛋白单体以楔形图标显示。
B:荧光定量PCR鉴定经不同药物作用后的var基因亚类转录变化,以DMSO(对照)、CD以及JAS三种药物分别与原虫培养液进行孵育。星号显示该两组药物组别之间具有明显的统计学差异(p<0.01,T检验)。FBA(fructose-biphosphate aldolase gene):果糖二磷酸醛缩酶。
具体实施方式
本发明首次从恶性疟原虫中鉴定和分离介导var基因家族转录沉默的非编码DNA序列(寡核苷酸)及其结合蛋白——肌动蛋白。该DNA序列与肌动蛋白相互作用使var基因定位于细胞核周的异染色质区,导致基因沉默。本发明人鉴定的DNA序列还存在其它真核生物体,具有介导真核生物基因转录调控应用前景;所述的肌动蛋白在真核生物中也是高度保守的。并且,基于本发明的新发现,可筛选调节var基因转录(激活或沉默)、进而调节恶性疟原虫毒力的物质。
iNBE序列
目前,var基因家族的研究热点主要集中在var基因家族的转录调控机制,其中,非编码区域的转录调控功能日益受到重视。非编码区包括5’UTR(启动子)、3’UTR以及内含子序列,其中,内含子区域在Var基因的转录沉默过程中发挥重要作用,但是相关机制尚未清楚。本发明人通过长期、深入的研究,首次鉴定了var基因内含子中存在着关键的细胞核蛋白结合位点(Intron Nuclear-proteinBinding Element,iNBE),长度为18个碱基,该序列存在于大多数var基因的内含子中。每个内含子中含有该序列的拷贝数与相应var基因在染色体上的位置有关,其中,染色体中间区域的var基因内含子含有相对高的拷贝数,提示该内含子序列主要介导该类var基因的转录调控。
在本发明的具体实施例中,以恶性疟原虫3D7株的一个var基因(No、PFD1000c)的内含子的不同区域作为EMSA试验的探针,对细胞核核蛋白抽提物进行EMSA试验。结果发现,该内含子区域存在一个多拷贝重复区,该区域是内含子中唯一具有核蛋白结合能力的位点(iNBE)。通过全基因组序列对比分析,发现iNBE序列只存在于var基因家族中的内含子区域中,并且该序列的拷贝数分布与var基因在染色体上的位置有关。此外,在人类、大鼠或小鼠等哺乳动物基因组中,也发现了不同拷贝数(分别是12、6和9个)的iNBE序列,提示该序列在进化上具有高度的保守性(在不同动物体中甚至可达到序列或序列片段完全一样,即100%一致性),可能具有类似的作用机制。
作为本发明的优选方式,所述的iNBE序列具有5’AAAAA(TA)nTCATAAAATAAAAA 3’所示的序列,其中,n为大于3的正整数(如3,4,5或以上),如n=3-20。较优选的,所述的iNBE是具有n为3-9(如3,4,5,6或7)的序列,该序列是所有var基因内含子中iNBE序列的主要类型(75/76)。
本发明还涉及上述寡核苷酸的变异体。此寡核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生(如人工构建)的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个寡核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其功能或特性(如与蛋白结合的特性)。
本发明所述的寡核苷酸可以以分离的形式提供。如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
本发明的寡核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。目前,已经可以完全通过化学合成来得到本发明所述的寡核苷酸序列(DNA序列)。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
I类肌动蛋白(Actin-I)
本领域技术人员均了解,肌动蛋白(Actin)是真核细胞高度保守的细胞骨架和核骨架蛋白组成成分。其传统的细胞学特性为维持细胞形态以及细胞的运动。细胞核内也有Actin的存在,并且在基因转录调控方面起着关键作用。
本发明人通过iNBE结合蛋白复合物的质谱分析,鉴定出I类肌动蛋白(Actin-I)是iNBE结合复合物中的成员之一。以恶性疟原虫为例,该蛋白(Pfactin-I)富集于恶性疟原虫环状体细胞核周围区域,提示iNBE与Pfactin-I的相互作用是介导var基因位点在细胞核核周定位的重要途径。此外,本发明人通过肌动蛋白抑制实验,证实了游离的Actin(G-actin)主要参与Var基因的沉默;聚合的Actin(F-actin)则导致var基因的转录活化,表明恶性疟原虫细胞核内肌动蛋白的动态平衡对var基因的沉默/活化具有重要的调控作用。
在恶性疟原虫中,存在两种表达Actin的基因,即:Pfactin-I和Pfactin-II,后者仅表达于疟原虫的有性生殖阶段,而前者则贯穿了疟原虫的整个生活史。现有研究表明,恶性疟原虫Actin蛋白主要参与裂殖子运动及入侵红细胞过程。本发明以iNBE序列作为纯化探针,从恶性疟原虫细胞核蛋白抽提物中分离出iNBE结合复合物,并且通过串联质谱分析鉴定出,Pfactin-I是该复合物的成分之一。本发明人通过制备Pfactin-I特异的抗体,分析了该蛋白在恶性疟原虫中的亚细胞分布状态。间接免疫荧光试验(IFA)表明,Pfactin-I主要分布在疟原虫细胞核核周。通过与恶性疟原虫核孔复合物抗体进行共定位IFA试验,证实该蛋白富集于细胞核核内的外围,即var基因位点的分布区域,提示Pfactin-I通过与iNBE相互作用,介导var基因位点在细胞核核周的定位,从而导致var基因在核周的异染色质区域处于转录沉默状态。
作为本发明的优选方式,所述的Actin-I是Pfactin-I,在恶性疟原虫基因组序列(www.plasmodb.org)中的编号为:PFL2215w,其具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,以及SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
本发明还涉及具有与所述的肌动蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-20个,较佳地1-15个,更佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括所述的肌动蛋白的活性片段和活性衍生物。
该肌动蛋白的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与SEQ ID NO:3杂交的DNA所编码的蛋白。
本发明还提供所述的肌动蛋白的类似物。这些类似物与天然肌动蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到,如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变,还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。
Actin抑制药物对var基因转录谱的影响
由于Actin是真核生物生长发育必需的持家基因,因此无法通过基因敲除方法研究该蛋白对于Var基因的转录调控功能。根据不同物种中Actin保守的结构特征,其主要有两种存在形式:游离的单个分子(G-actin)和聚合的微丝(F-actin),这两种形式之间的平衡对于Actin的生物学功能具有及其重要的意义。据此,本发明人利用了两种化合物:Jasplakinolide(JAS)和Cytochalasin D(CD)对这种平衡作用进行短暂的破坏,分别导致Actin的聚合或解聚,并通过实时定量PCR方法观察var基因转录谱的变化,从而评估不同形态的Actin对var基因的调控作用。本发明人发现,JAS处理后,3个持家基因的转录水平基本保持不变,但是具有iNBE序列的var基因出现了明显的转录上调,而不具有iNBE序列的var基因则未受明显的影响。该试验表明,聚集状态的Actin可以介导var基因的激活;而游离的Actin分子则与var基因默认的沉默状态有关。
因此,本发明还提供了一种调控细胞内var基因的转录的方法,所述方法包括:采用调节肌动蛋白聚合或解聚合的试剂处理细胞。较佳地,所述的细胞是疟原虫的细胞。具体的,采用调节肌动蛋白解聚合的试剂处理细胞,调控细胞内var基因转录沉默,从而降低疟原虫的毒力;或采用调节肌动蛋白聚合的试剂处理细胞,调控细胞内Var基因转录激活。例如,所述的调节肌动蛋白解聚合的试剂是Cytochalasin D(CD);或所述的调节肌动蛋白聚合的试剂是Jasplakinolide(JAS)
同时,本发明还提供了调节肌动蛋白聚合或解聚合的试剂的用途,用于调控细胞内var基因的转录。
筛选降低疟原虫毒力的物质
本发明还提供了一种对于筛选降低疟原虫毒力的物质有用的复合物,其包括本发明所述的寡核苷酸以及肌动蛋白,且两者能够相互结合。所述的复合物可以是分离的或存在于混合物中(如细胞核蛋白)。所述的复合物可以作为筛选降低疟原虫毒力的物质(该物质可以是潜在物质)的筛选模型。
因此,本发明还提供了一种筛选降低疟原虫毒力的潜在物质的方法,所述方法包括:用候选物质与寡核苷酸以及肌动蛋白形成的复合物接触,观察该复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况,若两者的相互作用增强,则表明其是对于降低疟原虫毒力有用的潜在物质。
可以通过设置不加入候选物质的对照组来进行比较,以方便地做出判断;这种方法是本领域人员熟悉的。
作为本发明的优选方式,所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的疟原虫毒力抑制试验,以进一步选择和确定对于抑制疟原虫毒性有用的物质。
在本发明中,鉴定肌动蛋白与本发明的寡核苷酸相互作用以及相互作用的强弱的方法是本领域人员熟知的技术,比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术。作为本发明的一种优选实施方式,可通过免疫共沉淀法鉴定复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况。采用免疫沉淀技术来验证所述的寡核苷酸与蛋白之间的特异性相互作用。所述的免疫共沉淀技术的原理是:在保持核酸-蛋白相互作用的条件下,收获和裂解细胞,从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的核酸-蛋白,然后通过离心等方法分离免疫沉淀物。核酸-蛋白的共沉淀物,可采用抗该蛋白的抗体,通过比如Western印迹来检测其中存在的蛋白,通过比如PCR扩增技术检测其中存在的核酸。此外,如果细胞在裂解前已经用标记物进行过标记,则可通过放射自显影或其它免疫学技术来观察共沉淀的核酸-蛋白。
发明的主要优点在于:
(1)通过EMSA实验,首次从var基因内含子区域中鉴定了恶性疟原虫细胞核蛋白的结合位点,而且该位点的分布与Var基因的染色体位置有关联。
(2)该内含子位点(iNBE)在高等哺乳动物基因组中也有一定的分布,提示了一种进化上的保守性。
(3)首次在疟原虫细胞核内鉴定到了核内Actin,而且该蛋白与var基因内含子具有相互作用,提示其参与了var基因在细胞核内的定位,从而导致var基因沉默。
(4)首次在细胞核内观察到Actin富集于核周,目前为止,未曾在其他生物体中发现该现象。
(5)通过Actin药物抑制试验,揭示了Actin的动态平衡对于var基因转录调控的重要作用,并证实聚合的Actin能够激活var基因转录,而且这种活化作用和内含子的iNBE序列有关。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、恶性疟原虫var基因内含子序列的扩增及探针制备
(1)var基因内含子序列扩增
为了制备EMSA探针,首先需要从恶性疟原虫3D7株(参见中国专利申请200610118947.8)基因组中扩增出var基因内含子序列,克隆到载体上并进行测序。由于恶性疟原虫非编码区序列中的AT含量可以高达90%以上,因此普通的Taq酶无法有效地扩增这些序列,而且难以保证序列的正确性。在本实施例中,为了兼顾扩增效率和序列保真,本发明人全部采用Toyobo的KOD-Plus高保真酶。具体的反应配制以及扩增程序如下:
10x KOD-Plus反应缓冲液:5μl;
MgCl(2mM):5μl;
dNTP(2mM):5μl;
上游引物(SEQ ID NO:4)(20μM):1μl;
下游引物(SEQ ID NO:5)(20μM):1μl;
疟原虫基因组DNA:1μl;
KOD-Plus(Toyobo):1μl;
双蒸水:31μl
50μl
反应程序:95℃,2min;94℃30s,50℃30s,65℃1min,32循环;65℃,10min。1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物,并割胶回收目的片段。
本发明人将扩增出的目的基因通过双酶切连接方法克隆到T载体(Promega)上(具体方法参见分子克隆第二版),并对阳性重组子进行序列分析,每个基因测2个克隆,以排除PCR反应过程中的点突变,最终获得序列正确的var基因(PFD1000c)内含子序列。
(2)探针制备
注:自恶性疟原虫3D7株系基因组中扩增获得染色体中间位置var基因(PFD1000c)的全长内含子,并通过PCR分割成一系列片段重叠的短探针(5’端生物素标记)进行多轮的EMSA试验。
在本实施例中,本发明人采用生物素-亲和素反应系统取代常规的同位素法进行EMSA分析。首先需要制备基于var基因内含子序列的生物素标记的探针,根据探针长度的不同,主要有以下两种标记方法:
(1)PCR法
对于100bp以上的探针,由于不易获得如此长度的引物,因此无法进行直接标记。于是本发明人先设计一对引物,并在合成时直接在这对引物的5’端进行生物素标记。然后用该对引物从载体上的基因中扩增目的片段,琼脂糖凝胶电泳后回收,TE溶液洗脱,即可作为EMSA探针使用。
(2)直接标记法
对于较短的探针(比如80bp以下),本发明人利用Pierce公司的Biotin 3’EndDNA Labeling Kit分别在两条互补的引物3’端标记生物素(具体操作参见操作手册:Pierce 89818),然后将这两条互补引物等量混合,在PCR仪上90℃变性1分钟,室温逐渐冷却,静置30-60分钟后,即可作为EMSA引物。
考虑到EMSA分析中探针长度适宜在300bp以下,因此为了便于探针的设计与合成,本发明人以该内含子序列为模板,通过PCR方法扩增出部分序列重叠(~20bp)的4条探针:Bio-int-a、b、c和d,并用1.5%琼脂糖凝胶电泳对这4条探针进行分离和纯化,最后测定浓度后用于EMSA试验。当某一条探针具有核蛋白结合活性后,则在该探针序列的基础上进行更短探针的设计,从而找到该内含子中最关键和最短的结合位点(图1)。
实施例2、恶性疟原虫海南株总核蛋白初步提取
1.取100ml的体外培养的恶性疟原虫3D7株培养物,原虫率约为10%(每100各红细胞中被疟原虫感染的红细胞个数),2000rpm,5min去上清。
2.加入20ml的0.15%(w/v)皂素/PBS溶液,混匀,4℃,30min。
3.8000rpm,4℃,10min,去上清。
4.用20ml冷的1xPBS溶液洗涤3次,每次4℃,8000rpm,10分钟。
5.加入1.5ml完全细胞裂解液(20mM Hepes pH7.9,10mM KCl,1mMEDTA,1mM EGTA,1mM DTT,1×蛋白酶抑制剂混合物,0.65%(v/v)NP-40),充分混匀,振荡10秒,冰水浴10分钟。
6.8000rpm,5min,小心吸取上清,即为疟原虫胞浆蛋白,分装后-80℃保存。
7.重复2次,充分洗涤细胞核。
8.在细胞核沉淀中加入150μl完全核蛋白提取液(20mM Hepes pH7.9,800mM KCl,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM DTT,1×蛋白酶抑制剂混合物),混匀后置于冰水浴上,间隔振荡,每次10s,总共30min。
9.14000rpm,4℃,30min。
10.小心吸取上清,即为疟原虫核蛋白。
11.在核蛋白中加入等体积的核蛋白稀释缓冲液(20mM Hepes pH7.9,1mM EDTA,1mM EGTA,1×蛋白酶抑制剂混合物,30%(v/v)甘油),混匀后,分装,-80℃保存。
实施例3、EMSA实验鉴定内含子-核蛋白复合物
在本实施例中,本发明人主要采用Pierce公司的LightShiftChemiluminescent EMSA试剂盒进行核蛋白的鉴定(具体方法参见Pierce 20418产品说明书)。其主要步骤如下:
A.预实验,初步建立EMSA体系,并摸索探针的最佳用量;
B.EMSA分析
(1)根据探针大小,配制相应的非变性PAGE胶。
(2)以0.5×TBE为电泳缓冲液,4℃,100V,预电泳1h。
(3)根据不同的实验目的,设计相应的EMSA反应体系(以20μl体系为例),各体系如表1。
表1
*表中,不满20μl的以水补足。
**结合缓冲液(EMSA缓冲液)的配制为:80mM Hepes(pH7.9),240mMKCl,8mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,2mM EDTA,0.4%(v/v)Triton X-100,40%(v/v)甘油。
***竞争DNA的量分别为探针的50和100倍(摩尔)。
(4)配制好以上系列反应物后,4℃,静置20min。注:对于竞争反应,竞争DNA先加入体系,与核蛋白反应10min后再加入标记探针。
(5)除第一管(探针对照)外,其余所有反应体系均直接上样,而不用上样缓冲液,4℃,100V电泳。根据探针大小,以及溴酚兰迁移速度与DNA片段大小的对比关系,确定合适的电泳距离。
(6)卸胶,转移至预先用0.5×TBE浸泡10min后的带正电荷尼龙膜(Pall)上,并采用三明治法进行半干转移,转移缓冲液为0.5×TBE。5mA/cm2,20min。
(7)取下尼龙膜,正面朝上置于大小合适的干净培养皿中,晾干,并转入紫外交联仪中,254nm,120mJ/cm2,1min。
(8)在培养皿中加入5ml Blocking buffer,浸没整张尼龙膜,置于水平摇床上,轻摇15min。
(9)弃去Blocking buffer,加入新的5ml Blocking buffer,并加入1/300体积的HRP标记的亲和素(Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate),混匀,置于水平摇床上轻摇15min。
(10)用镊子夹住尼龙膜边缘,取出转入新的培养皿中,加入5ml洗涤缓冲液,轻摇5min,并重复3次。
(11)将尼龙膜取出转入新的培养皿中,加入5ml底物平衡溶液(SubstrateEquilibration buffer),轻摇5min。
(12)在另一培养皿中加入各1ml的发光底物Luminol/Enhancer solution和Stable Peroxide Solution。
(13)在暗室中,将尼龙膜浸入发光底物中,反应1~5min,按照需要随时终止反应。
(14)将尼龙膜取出,用吸水纸去除表面的底物溶液,然后置于曝光暗盒中,上面覆盖一张保鲜膜,排除气泡后压片。根据需要确定曝光时间的长短(5s~30min)。
(15)取出X光片,根据条带颜色,显影1-2min,然后定影1min,最后将片子用自来水冲洗干净后,晾干。
结果表明:Bio-int-c区域内的iNBE序列(SEQ ID NO:1(即n=3)为关键的核蛋白结合位点(图2),可以形成两条迁移带(C1和C2);同时,竞争性EMSA试验结果表明,只有iNBE自身序列能够抑制该复合物的形成,表明该内含子与细胞核蛋白的相互作用是特异性的(图3)。
实施例4、iNBE在恶性疟原虫基因组中的分布
通过在恶性疟原虫3D7基因组库(www.plasmodb.org)中进行序列搜索和对比,发现该序列(iNBE序列)只存在于var基因家族的内含子序列中,而且不同类型的var基因具有不同的拷贝数,染色体中间区域的var基因几乎全部含有该序列,平均拷贝为2个,而端粒位置的Var基因则含有相对较少的拷贝数,特别是upsA类var基因(共10个基因)全部没有该序列,提示这一亚类的var基因内含子可能具有其它的调控途径(图4)。
实施例5、亲和素偶联的Agarose纯化特异结合核蛋白及质谱分析证实Pfactin-I蛋白
(1)亲和层析
1.收集约1L以上的恶性疟原虫培养物(混合虫体),平均原虫率约为10%。
2.按照前述核蛋白提取方法,根据培养物体积,按比例扩大各个试剂的用量,最终获得5ml的核蛋白提取物。
3.取亲和素偶联的agarose(ImmunoPure,Immobilized Streptavidin,Pierce20349)5ml,装柱。
4.用50ml 1×EMSA结合缓冲液充分洗涤。
5.取100μl生物素标记探针,用5ml 1×EMSA结合缓冲液稀释后过柱,重复1次。6.用10ml 1×EMSA结合缓冲液洗涤,置于4℃备用。
7.取2~5ml核蛋白提取物,加入poly(dI-dc)(dI-dC)(购自Sigma),终浓度为20μg/μl,并用1×EMSA缓冲液(含有1×蛋白酶抑制剂混合物)稀释核蛋白溶液至其中的KCl浓度约为100mM。
8.取一个新的15ml离心管(Falcon),加入上述核蛋白溶液以及洗涤后的Streptavidin-agarose填料,充分混匀后,置于4℃,旋转混合30min。
9.将核蛋白-生物素标记探针-streptavidin-agarose复合物转移到柱子中,回收核蛋白溶液。
10.用1×EMSA结合缓冲液(含PMSF,终浓度为1mM)洗涤柱子,共50ml。
11.用含有200mM KCl的1×EMSA结合缓冲液(PMSF)洗涤柱子,20ml。
12.用含有800mM KCl的1×EMSA结合缓冲液(PMSF),按照1×凝胶体积洗脱。
13.用EMSA方法鉴定滤过液和洗脱液中目的蛋白的分布情况。
(2)串联质谱分析
1.用截留分子量为10kDa的蛋白超滤管(Millipore)将含有目的核蛋白的亲和纯化洗脱液进行超滤并浓缩,最终的缓冲液置换为1×EMSA结合缓冲液(PMSF),体积为50~100μl。
2.10%SDS-PAGE凝胶电泳分析浓缩后的洗脱液,电泳至溴酚兰到底。
3.对凝胶进行银染,主要过程如下:
(1)用至少5倍凝胶体积的乙醇∶冰醋酸∶水(30∶10∶60)的混合液固定蛋白质,室温平缓摇动4h;
(2)弃去步骤(1)中溶液,加入不少于5倍凝胶体积的30%(v/v)乙醇,室温平缓摇动30min;
(3)重复步骤(2)一次;
(4)去乙醇液,加入10倍凝胶体积的去离子水,室温平缓摇动10min;
(5)重复步骤(4)两次;
(6)废弃洗涤水,戴上手套,加入5倍凝胶体积的0.1%(w/v)硝酸银。室温平缓摇动温育30min。
(7)去硝酸银溶液,用去离子水流动冲洗凝胶两面(每次20秒钟)。必须防止凝胶表面干燥,否则会在这些地方出现人为染色假象
(8)加入5倍凝胶体积的新鲜配置的2.5%(w/v)碳酸钠和0.02%(v/v)甲醛水溶液。室温平缓摇动进行温育,仔细观察凝胶,数分钟内可呈现蛋白染色带,继续温育直到达到所需对比度。
(7)用1%(v/v)乙酸洗涤凝胶数分钟以终止显色反应,然后用去离子水洗涤凝胶数次。
4.将银染后的凝胶进行拍照,然后割下与纯化前核蛋白电泳图相比出现富集的条带,送上海基康公司进行串联质谱(MS/MS)分析,分析该蛋白的氨基酸序列。
串联质谱分析的结果提示:Pfactin-I蛋白(SEQ ID NO:2,编码核酸的序列如SEQ ID NO:3)是iNBE结合复合物中的成分之一,具有52%的序列覆盖率(质谱鉴定到的肽段所覆盖的氨基酸个数与全长的蛋白长度的比例)。该蛋白位于恶性疟原虫第12条染色体上(PlasmoDB accession number PFL2215w)。
实施例6、超迁移率实验(Super-shift assay)以及染色质免疫沉淀(ChIP)验证Pfactin-I蛋白与iNBE相互作用
为了获取抗Pfactin-I的抗体,首先将对应于Pfactin-I蛋白第70-247位氨基酸序列的编码序列进行PCR扩增,克隆到pET-28a-c(+)(购自Novagen)的多克隆位点中,并融合了6×His.tag(rPfactin-I),然后导入宿主菌BL21中进行诱导表达,将经过亲和纯化的rPfactin-I免疫小鼠(佐剂组作为阴性对照),并从免疫血清中获取总IgG,用于后续两项实验。
(1)超级迁移率变动实验(Super shift assay)
1、准备细胞总提取物。
2、加入10μg的抗Pfactin-I的IgG抗体到EMSA结合反应体系中,余下步骤同EMSA实验(实施例3)中相应方法。
结果表明,该抗体能够特异识别恶性疟原虫肌动蛋白(图5),并在超迁移试验中形成特异的超迁移条带,证实了Pfactin-I存在与iNBE结合复合物中(图6)。此外结果还提示,Pfactin-I蛋白存在于C1复合物中。
(2)染色质免疫共沉淀(ChIP)
染色质免疫共沉淀实验标准步骤参照Abcam cross-1inking ChIP(X-ChIP)说明手册,以下为主要步骤:
(1)收集大约6×109的疟原虫虫体,并用Saponin(获自Sigma)裂解。
(2)室温下将染色质与0.75%(v/v)的甲醛交联10分钟。
(3)洗涤细胞两次后,收集细胞;虫体重新悬浮于FA裂解液(Abcam)。
(4)超声震碎DNA片段,使之平均碎片大小维持在500-1000bp左右,并在1.5%(w/v)的琼脂糖凝胶下进行检测。
(5)上述混合物最高速离心约5分钟,15ul上清备用,剩余的上清液用ChIP稀释液(Abcam)稀释10倍左右。稀释部分与抗Pfactin多克隆抗体作用并过夜。
(6)检测DNA,DNA的提取纯化采用酚-氯仿方法,并可用做后续PCR实验的模板。
ChIP试验结果表明,在体内状态下,Pfactin-I与iNBE存在着特异性的相互作用(图7)。
实施例7、间接免疫荧光试验(IFA)分析Pfactin-I在恶性疟原虫细胞内的分布
疟原虫的处理和固定:将严格同步的环状体阶段的疟原虫培养物进行0.15%(w/v)的皂素处理,室温,10分钟,然后用1×PBS洗涤两次。用4%(v/v)的paraformaldehyde的固定15分钟(4℃),然后用1×PBS洗涤一次。最后用适量1×PBS悬浮固定后的虫体备用。IFA反应时,一抗为稀释500或者1000倍的Pfactin-I抗体(来自实施例6中的抗重组Pfactin-I的鼠抗),二抗为Alexa 448标记的羊抗鼠抗体(Invitrogen)。
IFA结果表明,Pfactin-I富集于细胞核周围(图8)。
实施例8、PfActin-I药物学实验与var基因不同组别转录变化分析
本实施例从药物学实验证明Actin蛋白在药物作用下改变了存在形态时,其var基因转录变化情况,以期揭示更多关于Pfactin-I在var基因转录调控中的作用。
(1)Actin抑制剂与恶性疟原虫培养物质共孵育
1)Cytochalasin D(简称CD,Sigma)以及Jasplakinolide(简称JAS,Invitrogen)分别通过DMSO溶解至母液浓度10mM以及1mM;
2)将经过严格同步的、原虫率维持在2%-5%的早期环状体期虫体培养液分别与两种药物混匀,并于37℃恒温箱中培养。CD终浓度:10μM;Jas终浓度:10μM;
3)于10小时后收集虫体,此时虫体大约维持在中、晚期环状体阶段(裂殖子入侵后10-15小时),并提取总RNA。
(2)荧光定量PCR检测不同var亚组的转录变化
1)Trizol提取总RNA,提取标准流程请参照Invitrogen公司说明书,逆转录标准流程请参照“M-MLV酶”TAKARA公司说明书,所用的三种内参引物Seryl-tRNA合成酶,fructose-biphosphate aldolase和Actin请参阅Salanti A et al.,(2003).Selective upregulation of a single distinctly structured var gene inchondroitin sulphate A-adhering Plasmodium falciparum involved inpregnancy-associated malaria.Mol.Microbiol.49,179-191.。Var基因亚组特异的引物请参阅Rottmann M et al.,(2006).Differential expression of var gene groupsis associated with morbidity caused by Plasmodium falciparum infection inTanzanian children.Infect.Immun.74,3904-3911.
2)荧光定量PCR基本反应体系:
其中,PCR前向引物和PCR后向引物为各var基因亚组对应的上下游引物,参阅Rottmann M et al.,Infect Immun,2006。
3)荧光定量PCR基本反应程序
95℃10秒钟预变性,接下来是40个循环左右的95℃5秒变性,60℃31秒退火加延伸。将所有Var基因组别对应的数值与Seryl-tRNA合成酶这一内参数值做比对。并通过如下计算公式ΔCt=Ctvar基因组-Ctseryl-tRNA合成酶,ΔCt经由2ΔCt公式转换为相对拷贝数(relative copy number简写RCN)变化。同时每个反应加入溶解曲线的步骤以及分析,产物经由8%(w/v)PAGE胶电泳鉴定real-time PCR产物。
Actin蛋白单体与聚合物之间的平衡关系可以影响核外周Var基因的沉默状态。本发明人采用了两种效果截然相反的药物CD和JAS:CAD促进单体的延长和Actin纤维解聚,而JAS则促进Actin单体的聚合和Actin纤维的稳定(图9)。
结果表明,JAS组明显促进C组和BC2组var基因转录水平升高,部分促进B2组水平的升高(图9)。C组和BC2组这两组var基因内含子中含有全部Actin蛋白结合序列,而B2组var基因内含子中仅含有部分Actin蛋白结合序列,提示聚合状态下的Actin蛋白促使含有Actin结合序列的var基因迁移至核外周转录活跃区域,从而活化这部分基因的转录;而CD对各组的转录水平无明显影响,提示单体状态的Actin蛋白介导维持var基因的转录沉默状态。
实施例9、筛选方法
如实施例6“(2)”中的方法,获得SEQ ID NO:1(即n=3)的寡核苷酸与肌动蛋白相互作用的系统,并将所述系统分为:
对照组:不给予候选物质;和
测试组:给予候选物质。
利用ChIP方法,中寡核苷酸与肌动蛋白相互作用情况,若相对于对照组,测试组中所述寡核苷酸与肌动蛋白相互作用在统计学上有增强((较佳地增强50%),则说明候选物质是对于降低疟原虫毒力有用的潜在物质。
实施例10、疟原虫毒力试验
将疟原虫培养物与不同候选药物(物质)处理后,首先如上所述检测所述寡核苷酸与肌动蛋白的相互作用,然后利用qRT-PCR,Western-blot以及体外细胞粘附方法检测var基因的转录和表达情况,能观察到var基因整体的表达水平明显下调,或者发生了表达类型的改变(Switching),即由原先表达的高毒力相关的var基因转变为弱毒力相关的var基因类型,或者发生了var基因表达的缺失,都表明疟原虫的毒力下降。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种寡核苷酸,其特征在于,所述的寡核苷酸选自:
(i)如下所示序列的寡核苷酸:5’AAAAA(TA)nTCATAAAATAAAAA 3’;其中n=2-20;或
(ii)与(i)的寡核苷酸同源的变异体,具有与(i)的寡核苷酸相同的与蛋白质结合的能力。
2.权利要求1所述的寡核苷酸的用途,用于特异性地与肌动蛋白相互作用。
3.肌动蛋白的用途,用于与var基因内含子相互作用,调控var基因的转录和表达。
4.一种复合物,其特征在于,包括权利要求1所述的寡核苷酸以及肌动蛋白。
5.如权利要求4所述的复合物,其特征在于,所述的寡核苷酸以及肌动蛋白相互作用。
6.权利要求4或5所述的复合物的用途,用于筛选抑制var基因转录水平、从而降低疟原虫毒力的物质。
7.一种筛选降低疟原虫毒力的潜在物质的方法,其特征在于,所述方法包括:用候选物质与权利要求4或5所述的复合物接触,观察该复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况,若两者的相互作用增强,则表明其是对于降低疟原虫毒力有用的潜在物质。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述方法包括:
(a)在测试组中,向包含权利要求4或5所述的复合物的体系中添加待筛选的候选物,并检测复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况;并且,在对照组中,在不添加所述候选物的、包含权利要求4或5所述的复合物的体系中,检测复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况;
(b)将步骤(a)测试组复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用与对照组复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用进行比较,如果测试组复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用在统计学上强于对照组,就表明该候选物是对于降低疟原虫毒力有用的潜在物质。
9.一种调控细胞内var基因的转录的方法,其特征在于,所述方法包括:采用调节肌动蛋白聚合或解聚合的试剂处理细胞。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,
采用调节肌动蛋白解聚合的试剂处理细胞,调控细胞内var基因转录沉默,从而降低疟原虫的毒力;或
采用调节肌动蛋白聚合的试剂处理细胞,调控细胞内Var基因转录激活。
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