CN102617471B

CN102617471B - 左旋美普他酚双分子衍生物和/或其盐及其制备方法和用途

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Publication number: CN102617471B
Application number: CN201110033828.3A
Authority: CN
Inventors: 郑伟; 李娟�; 陈红专; 谢琼; 郑优丽; 李炜; 仇缀百
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2031-01-31
Also published as: CN102617471A

Abstract

本发明属制药领域，涉及新的左旋美普他酚双分子衍生物和/或其盐及其制备方法和用途，本发明的左旋美普他酚双分子衍生物和/或其盐类具有通式（）的结构。实验显示，本发明的化合物在体外实验中显示乙酰胆碱酯酶抑制活性和金属离子螯合活性，可进一步开发成具有双重作用的早老性痴呆治疗药物。另外，本发明化合物也可用于制备预防或治疗因自由基氧化损伤所致的神经退行性疾病的药物，所述神经退行性疾病包括帕金森病、亨廷顿氏病和老年性痴呆等。

Description

左旋美普他酚双分子衍生物和/或其盐及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及制药领域，涉及新的左旋美普他酚双分子衍生物和/或其盐及其制备方法和用途。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)也称早老性痴呆，属严重威胁老年人生命健康的神经退行性疾病，以认知和记忆受损为主要症状乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEIs)是目前临床上治疗AD的主要药物，据报道，在美国FDA批准的五个AD治疗药物中有四个为AChEIs，研究显示，该类抑制剂通过提高脑内乙酰胆碱水平，而有效改善患者的认知能力。

专利申请CN101037430 A 公开了一类以长碳链连接的左旋美普他酚双配基衍生物具有乙酰胆碱酯酶抑制作用。

随着对AD发病机理和致病基因的深入研究，越来越多的证据表明：脑内β-淀粉样蛋白(Aβ) 的异常聚集和沉积造成的神经损伤是AD发病的核心机制。减少Aβ生成和聚集是有效的AD治疗策略和药物开发的最热点领域。令人信服的证据表明, Aβ并不是自发地聚集, 而是与脑中的过量金属离子发生了一种年龄依赖性的作用, 它使Aβ沉淀为富含金属的斑块。近十余年来, 研究者运用多种方法, 诸如EPR, NMR,Raman 光谱, CD 谱, 荧光光谱, 电位滴定和聚集度测定等技术, 对金属离子, 特别是Zn²⁺, Cu²⁺和 Aβ的相互作用进行了深入研究（House, E.; Collingwood, J.; Khan, A, et al. Aluminium，iron，zinc and copper influence the in vitro formation of amyloid fibrils of Abeta42 in a manner which may have consequences for metal chelation therapy in Alzheimer′s disease[J]. Alzheimers Dis 2004, 6(3),291-301）。实验表明,金属离子能促进 Aβ聚集体和淀粉样斑的形成,金属螯合剂能使AD脑的淀粉样斑块组织溶解, 同时减轻APP 转基因鼠的大脑Aβ沉淀负荷。根据已有的实验证据，金属异常也与加剧氧化损害有直接联系。过渡金属元素在许多生物反应中是必不可少的，打破其平衡会导致自由基产生，自由基被铁、铜或其它微量氧化还原金属催化（Gaggelli, E.; Kozlowski, H.; Valensin, D.; Valensin, G. Copper homeostasis and neurodegenerative disorders (Alzheimer’s, prion, and Parkinson’s diseases and amyotrophic lateral sclerosis). [J] Chem. Rev . 2006, 106, 1995–2044）、（Doraiswamy, P.M.; Finefrock, A.E. Metals in our minds: therapeutic implications for neurodegenerative disorders[J]. Lancet Neurol. 2004, 3, 431–434）；金属离子调节的氧化应激与线粒体功能障碍有关（Lin, M.T.; Beal, M.F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature 2006, 443, 787–79）。因此，使用金属离子螯合剂调节患者脑内的金属平衡是治疗包括AD在内的神经退行性疾病的有效策略。

金属离子螯合剂用于AD的治疗正走向临床（Liu, G; Garret, M.R.; Men, P. et al. Nanoparticle and other metal chelation therapeutics in Alzheimer disease[J]. Biochim Biophys Acta 2005, 1741(3), 246-252），它们可清除自由基和超氧化物，有效地减轻AD患者脑内的氧化损伤、减少Aβ在脑中的聚积。氯碘羟喹(clioquinol，PBT-1)是临床应用的抗寄生虫病药物，具有金属离子螯合作用。澳大利亚Prana生物技术公司有研究报道，将氯碘羟喹用于转基因鼠，发现可以透过血脑屏障，且脑内Aβ沉淀斑块形成降低49％。

发明内容

本发明的目的是提供新的治疗阿尔茨海默病(AD)的药物。本发明对美普他酚双分子衍生物进行进一步研究，提供了一种新的左旋美普他酚双分子衍生物和/或其盐。本发明的左旋美普他酚双分子衍生物和/或其盐同时具有乙酰胆碱酯酶抑制活性、金属离子螯合活性和抗Aβ聚集活性，可进一步制成为治疗AD的多靶向配体药物。

本发明的左旋美普他酚双分子衍生物的结构如通式(I)所述：

Figure 2011100338283100002DEST_PATH_IMAGE001

（I）

其中，m、n独立地选自1～3中的整数，m与n可以相同也可以不同，优选为相同，更优选为2；

Y₁和Y₂独立地选自O、S和NR，Y₁和Y₂相同或不同，优选为相同，更优选均为NR，所述R为氢、甲基、乙基或CH₂COOH，优选为氢或甲基；

B₁、B₂ 、B₃、B₄独立地为-CH₂或-CO-，优选B₁与B₄相同，且B₂与B₃相同；

x为0或1，优选为0。

本发明中，优选提供下述化合物：

N,N’-(1,3-亚丙基)-双{2-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-N-甲基-乙酰胺}，

N¹,N²-双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-丙基}-乙二酰胺，

N,N’-(1,3-亚乙基)-双{2-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-乙酰胺}，

N,N’-(1,3-亚丙基)-双{2-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-乙酰胺}，

N,N’-(1,3-亚丙基)-双{2-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-N-甲基-丁酰胺}，

N¹,N²-双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-丙基}-丙二酰胺，

N¹,N²-双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-乙基}-乙二酰胺，

N¹,N²-双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-乙基}-丙二酰胺，

(3S,3’S)-1,1’-{2,2’-[1,3-亚丙基-双（甲亚氨基）]-双(2,1-亚乙基)}-双（3-乙基-3,1-亚氮杂环庚基）二苯酚，

N¹,N²-双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-丙基}-乙二胺。

进一步，本发明提供最优选的化合物：

N¹,N²-双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-丙基}-乙二酰胺；

本发明所述的盐类可以是左旋美普他酚双分子衍生物与无机酸或有机酸形成的盐，其中，所述无机酸是盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸或任意两者的混合酸；所述有机酸是酒石酸、扁桃酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸、富马酸或任意两者的混合酸。

本发明提供了制备上述左旋美普他酚双分子衍生物的方法，其特征在于，其包括在碱性条件下将式(II)化合物与式(III)进行反应，

其中，Z为Br或Cl。

所述碱选自吡啶、三乙胺、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、碳酸钾或钠、氢氧化钾或钠等，优选三乙胺；

本发明中，反应溶剂可采用乙醇、四氢呋喃、乙醚、二氧六环、乙腈、二氯甲烷、氯仿、苯、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）或者上述溶剂的混合物，优选乙腈。

本发明中，式(III)化合物可自商业获得，或者通过本领域熟练技术人员已知的方法制备得到。

本发明的进一步目的是提供上述左旋美普他酚双分子衍生物及其盐类在治疗痴呆症和其它神经退行性疾病中的用途。

本发明的化合物同时具有乙酰胆碱酯酶抑制活性、金属离子螯合活性和抗Aβ聚集活性，这种多重作用是现有的美普他酚类衍生物所不具备的。因此，本发明所提供的新型化合物，有望被开发成为治疗AD的多靶向配体药物。另外，本发明化合物也可用于制备预防或治疗因自由基氧化损伤所致的其它神经退行性疾病的药物，这些神经退行性疾病包括帕金森病和亨廷顿氏病等。

附图说明

图1是本发明 N¹,N²-双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-丙基}-乙二酰胺盐酸盐与不同浓度的Cu²⁺混合的示差光谱图。

图2是本发明 N¹,N²-双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-丙基}-乙二酰胺盐酸盐与不同浓度的Fe²⁺混合的示差光谱图。

图3是本发明 N¹,N²-双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-丙基}-乙二胺盐酸盐与不同浓度的Cu²⁺混合的示差光谱图。

图4是本发明 N¹,N²-双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-丙基}-乙二胺盐酸盐与不同浓度的Fe²⁺混合的示差光谱图。

具体实施方式

以下结合具体的实施例来进一步说明本发明，下述实施例仅是示例性而非限制本发明。

（一）通式(II)化合物的制备：

通式(II)化合物（(3S)-N-去甲基美普他酚），由(3S)-美普他酚去甲基制得，其制备方法参见中国专利申请（CN101037430 A）；

其中，(3S)-美普他酚通过拆分美普他酚消旋体制得，其制备方法参见中国专利申请（CN1850804 A）。

（二）通式(III)化合物的制备

Figure 2011100338283100002DEST_PATH_IMAGE003

方法一：

通式(IV)化合物和通式(V)化合物分别溶于适量的溶剂中。合适的溶剂包括四氢呋喃、乙醚、二氧六环、乙腈、二氯甲烷、氯仿、苯、甲苯或者上述溶剂的混合物，可以根据具体的反应情况，溶剂合适的量可以是在常温下能溶解化合物的最小溶剂量或更多。

在碱性条件下，将通式(V)的化合物的上述溶液加到通式(IV)的化合物的上述溶液中，冷却下反应直至反应终点（反应终点的监控可采用本领域技术人员常用的方法，例如TLC）。

分离纯化得到通式(III)化合物，分离纯化的方法可采用本领域技术人员常用的分离方法，例如，萃取、柱层析、重结晶等。

通式(III)化合物的可通过本领域常用的光谱分析手段确定，例如¹HNMR、MS等。

方法二：

通式(VI)化合物和通式(VII)化合物分别溶于适量的溶剂中，再在碱性条件下，将通式(VI)的化合物的溶液加到通式(VII)的化合物的溶液中，其它同方法一，得到通式(III)化合物。

实施例1 N,N’-(1,3-亚丙基)-双（2-氯-N-甲基乙酰胺）（方法一）

N,N’-二甲基-1, 3-丙二胺2.42g (23.68mmol)溶解在20mL CHCl₃中，加入NaOH 2g,水4 mL。冰浴冷却到0 oC，缓慢滴加氯乙酰氯5.37g ( 47.55mmol)的10mL CHCl₃液，0℃下继续搅拌反应20min，TLC监测反应终点(氯仿:乙醇=10:1), 加入水10 mL，分出CHCl₃层，水层用CHCl₃15 mL×2提取，合并有机层，加入无水MgSO₄干燥。过滤后，减压浓缩，得到白色固体,用乙酸乙酯重结晶，得白色针晶5.2g，收率86.1%，mp98-100 oC。

¹ ₃ 4.06(s, 4H, Cl-CH₂), 3.45-3.33 (m, 4H, N-CH₂), 3.10、3.07、2.96、2.94 (s, 6H, N-CH₃), 1.94-1.80 (m, 2H, CH₂)；

MS (ESI): 255.1 (100.0%)、257.0(64.4%)、256.1(10.5%)[M+H]⁺；277.0 [M+Na]⁺；531.1 [2M+Na]²⁺；

采用相应的反应试剂，按照类似的方法制备下述化合物：

表1

实施例2 N ¹ ,N ² -双(3-氯丙基)-乙二酰胺 （方法二）

将3-氯丙胺盐酸盐2.6g(20.0mmol) 溶解在20mL CHCl₃中，加入NaOH 2g,水4mL。冰浴冷却到0 oC，缓慢滴加乙二酰氯1.27g (10.0mmol)的10mL CHCl₃液，0℃下继续搅拌反应20min，有白色固体析出，抽滤，滤饼用少量水洗，干燥后，得白色固体2.17g。滤液加入水10 mL，分出CHCl₃层，水层用CHCl₃15 mL×2提取，合并有机层，加入无水MgSO₄干燥。过滤后，减压浓缩，又得到淡黄色固体0.24g。粗品N¹,N²-双(3-氯丙基)-乙二酰胺收率100%。取 1g粗品用乙酸乙酯重结晶，得白色针晶0.67g，收率67.0%，mp 169-170 oC。

¹ ₃ 7.65(s, 2H, NHCO), 3.59(t, 4H, J=6Hz, Cl-CH₂), 3.51 (dd, 4H, J₁=7Hz, J₂=13Hz, N-CH₂), 2.08-2.02 (m, 4H, CH₂)；

MS (ESI): 241.0 [M+H]⁺；263.0 [M+Na]⁺

采用相应的反应试剂，按照类似的方法制备下述化合物：

表2

（三）通式(I)化合物的制备

其中，Z为Br或Cl。

将上述制备的通式(II)化合物溶于适量的溶剂中。合适的溶剂包括四氢呋喃、乙醚、二氧六环、乙腈、二氯甲烷、氯仿、苯、甲苯或者上述溶剂的混合物，可以根据具体的反应情况，溶剂合适的量可以是在常温下或稍微加热能溶解化合物的最小溶剂量或更多。

在碱性条件下，将上述制备的通式(III)的化合物加到通式(II)的化合物的上述溶液中，加热反应直至反应终点（反应终点的监控可采用本领域技术人员常用的方法，例如TLC）。可加催化剂促进反应，例如加催化量的KI。反应结束后，冷却，加适量的水，用氨水调节pH至8～9，有机溶剂萃取（例如氯仿），干燥合并的有机相、柱层析分离得通式(I)化合物。

通式(I)化合物的可通过本领域常用的光谱分析手段确定，例如¹HNMR、MS等。

实施例3 N,N’-(1,3-亚丙基)-双{2-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-N-甲基-乙酰胺}

(3S)-N-去甲基美普他酚(II )1.5g (6.85 mmol)微热溶解在15 mL乙腈中，加入三乙胺 1.9mL (13.7 mmol)。搅拌下加入实施例1化合物0.75g (2.94mmol)，回流反应3小时，冷却到室温，浓缩至干，加入20 mL饱和碳酸钠溶液，用氯仿30mL×2、20mL×2提取。合并有机层，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩到干，得黄色油状物，经硅胶柱层析（5% EtOH/ CHCl₃）分离，得淡黄色固体1.49g, 收率81.6%。粗品0.39g 用乙酸乙酯重结晶，得淡黄色晶体0.26g, 收率66.7%，mp68-71 oC。

¹ ₃ 7.11-7.08 (m, 2H, Ar-H), 6.94-6.64 (m, 6H, Ar-H), 3.28-3.21 (m, 5H, N-CH₂), 3.18-3.16 (m, H, N-CH₂), 3.05-2.95 (m, 3H, N-CH₂), 2.76 (m, 3H, N- CH₂), 2.70 (s, 3H, N- CH₃), 2.68(s, 3H, N- CH₃), 2.57-2.52 (m, 4H, N-CH₂), 2.18-2.16 (m, 2H, CH₂), 1.61(m, 10H, CH₂), 1.48-1.37(m, 6H, CH₂), 0.49-0.45 (m, 6H, CH₃)；

MS (ESI): 621.4 [M+H]⁺, 311.4 [M+2H]²⁺

实施例4 N ¹ ,N ² -双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-丙基}-乙二酰胺

(3S)-N-去甲基美普他酚(II )0.79 g (3.60 mmol)热溶解在15 mL乙腈中，加入三乙胺0.8 mL (5.75mmol)和实施例2化合物0.35g(1.45 mmol)，再加入催化量KI, 回流反应24小时。冷却，蒸除溶剂，加水20 mL，氯仿20 mL, 用氨水调pH= 8~9, 分出氯仿层，水层再用氯仿20 mL×2提取。合并氯仿层，无水Na₂SO₄干燥。过滤，浓缩，得黄色油状物 1.17 g，硅胶柱层析分离 (洗脱剂：氯仿:乙醇：氨水＝93:6:1)，得白色粉末0. 53 g，收率 59.7％。

607.5 [M+H]⁺

采用相应的反应试剂，按照类似的方法制备下述化合物：

表3

其中，B₁、B₂、B₃、B₄为CH₂的通式(I’)化合物也可通过还原相应的B₁和B₄（或者B₂和B₃）为CO的通式(I)化合物，合适的还原剂包括LiALH₄、NaBH₄、KBH₄或者KBH₄/ZnCl₂。

或者

实施例5 (3S,3’S)-1,1’-{2,2’-[1,3-亚丙基-双（甲亚氨基）]-双(2,1-亚乙基)}-双（3-乙基-3,1-亚氮杂环庚基）二苯酚

在无水THF 5 mL中加入LiALH₄粉末0.20 g (5.26 mmol)，冰水浴冷却下，缓慢滴入实施例3制备的化合物0.50 g（0.80 mmol)的10 mL无水THF溶液，回流反应1 h , TLC监测反应终点。冷却，依次滴加水0.10 mL、15％NaOH水溶液0.10 mL、水0.30 mL。过滤，滤饼用丙酮20 mL加热提取后，再次过滤，两次滤液合并后浓缩，加水15 mL，氯仿20 mL，滴加10％NH₄Cl水溶液调节pH至9。水层用氯仿10mL×4提取，合并有机层，无水Na₂SO₄干燥。过滤，浓缩，得黄色油状物0.42 g。硅胶柱层析，得近无色油状物0.28g, 收率29.4%。

¹ HNMR (CDCl ₃ ): 7.13 (t, 2H, J=7.8Hz, Ar-H), 6.87(s, 2H, Ar-H), 6.79 (d, 2H, J=7.8Hz, Ar-H), 6.54(d, 2H, J=8.0Hz, Ar-H), 2.93(d, 2H, J=14.1Hz, N-CH₂), 2.75-2.57 (m, 8H, N-CH₂), 2.47-2.41 (m, 2H, N-CH₂), 2.36-2.26 (m, 8H, N-CH₂), 2.22 (s, 6H, N-CH₃), 2.11-2.07 (m, 2H, CH₂), 1.64-1.54(m, 16H, CH₂), 0.55 (t, 6H, J=7.5Hz, CH₃)；

MS (ESI): 593.5 [M+H]⁺, 297.2 [M+2H]²⁺

实施例6 N ¹ ,N ² -双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-丙基}-乙二胺

在无水THF 10 mL中加入LiALH₄粉末0.23 g (6.05 mmol)，冰水浴冷却下，缓慢滴入实施例4制备的化合物0.53 g（0.87 mmol)的20 mL无水THF溶液，回流反应24 h , TLC监测反应终点。冷却，依次滴加水0.23 mL、15％NaOH水溶液0.23 mL、水0.69 mL。过滤，滤饼用丙酮20 mL加热提取后，再次过滤，两次滤液合并后浓缩，加水15 mL，氯仿20 mL，滴加10％NH₄CL水溶液调节pH至9。水层用氯仿10mL×4提取，合并有机层，无水Na₂SO₄干燥。过滤，浓缩，得黄色油状物0.51 g。硅胶柱层析(洗脱剂：氯仿:乙醇：氨水＝93:6:1)，，得近无色油状物122mg, 收率22.1%。MS (ESI): 579.4 [M+H]⁺

（四）通式(I)化合物的盐的制备：

通式(I)化合物与各种无机酸或有机酸成盐制得其盐类。无机酸可以是盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸或氢碘酸等，有机酸可以是酒石酸、扁桃酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸或富马酸等。

实施例7 N ¹ ,N ² -双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-丙基}-乙二酰胺盐酸盐

实施例4制备的化合物80mg溶解在10 mL无水乙醚中，过滤，滤液滴加无水HCl-乙醚溶液调节pH至4，析出白色粉末盐酸盐, 过滤，干燥后称重59mg，收率62.3％，mp.154-157 oC，[α]_D=-7.7° (c=0.390, MeOH)。

¹ ₆ 10.30 & 10.14(br s, 4/3 H, NH⁺), 9.59, 9.50, (s, 2H, Ar-OH), 8.98-8.96 (m, 2H, NHCO), 8.63& 8.55 (br s, 2/3 H, NH⁺), 7.27-7.20 (m, 2H, Ar-H), 6.91-6.75 (m, 6H, Ar-H), 3.89 (d, 2/3 H, J=13.6 Hz, N-CH₂), 3.57 (d, 4/3 H, J=14.1 Hz, N-CH₂), 3.42(m, 2H, N-CH₂), 3.32-3.18 (m, 12H, N-CH₂), 2.46-2.41(m, 1H, CH₂), 2.25-2.13 (m, 5H, CH₂), 2.08-2.01 (m, 2H, CH₂), 1.98-1.79 (m, 9H, CH₂), 1.61-1.48 (m, 3H, CH₂), 0.57 (t, 6H, J= 7.3 Hz, CH₃)；

¹³ CNMR (DMSO-d ₆ ): 160.08, 160.01, 157.55, 157.47, 144.82, 143.64, 129.42, 129.25, 117.23, 116.89, 114.10, 113.57, 113.49, 113.30, 63.68, 61.35, 58.63, 57.13, 56.58, 56.31, 43.70, 43.37, 36.39, 36.20, 35.33, 35.26, 34.43, 33.05, 26.33, 24.88, 22.84, 22.79, 20.76, 20.46, 8.10, 7.96;

MS (ESI): 607.5 [M+H]⁺ , 304.3 [M+2H]²⁺

实施例8 N ¹ ,N ² -双{3-[(S)-3-乙基-3-(3′-羟基苯基)-氮杂环庚烷-1-基]-丙基}-乙二胺盐酸盐

实施例6制备的化合物69mg溶解在10 mL无水乙醚中，过滤，滤液滴加无水HCl-乙醚溶液调节pH至4，析出白色粉末盐酸盐, 过滤，干燥后称重65mg，收率75.6％，mp. 132-136oC，[α]_D=-27.1° (c=0.240, MeOH)。

¹ ₆ 10.26 & 10.19&9.94&9.83 (br s, 4H, NH⁺), 9.51, 9.43, (s, 2H, Ar-OH), 8.77&8.26&8.17(s, 2H, NH), 7.22-7.13 (m, 2H, Ar-H), 6.90-6.69 (m, 6H, Ar-H), 3.94 (m, 2/3 H, N-CH₂), 3.57 (m, 4/3 H, N-CH₂), 3.32-2.80 (m, 14H, N-CH₂), 2.41-2.01 (m, 8H, CH₂), 1.98-1.67 (m, 9H, CH₂), 1.53-1.47(m, 3H, CH₂),0.51 (t, 6H, J= 7.4Hz, CH₃)；

¹³ CNMR (DMSO-d ₆ ): 157.55, 157.45, 144.77&144.70, 143.84, 129.56, 129.29, 117.34, 117.03, 113.94, 113.60, 113.50, 113.31, 63.99&63.85, 61.33, 58.59, 56.23, 55.97, 55.88, 43.98, 43.82, 43.43, 40.00, 36.16, 35.39, 35.09, 35.07, 33.14, 32.98, 26.38&26.34, 25.18, 21.22, 20.72&20.31, 19.93&19.49, 18.50, 10.91, 8.12&8.01

MS (ESI): 579.4 [M+H]⁺ , 290.4[M+2H]²⁺

（五）AChE抑制活性的测试

酶抑制活性采用Ellman比色法测定，根据乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱，生成胆碱及乙酸，胆碱与巯基显色剂反应生成黄色化合物，比色法检测胆碱数量，从而以水解产物胆碱的数量反映乙酰胆碱酯酶活力的实验原理，按AChE试剂盒说明书测定胆碱酯酶活性。对照药选择上市药物利斯的明（Rivastigmine）。

AChE酶源：取250g左右的大鼠颅内大脑，分离出前额叶皮质，称取重量后加9倍生理盐水制成10%组织匀浆，3500rpm离心10min，取上清待测。

反应液内含200 μL酶液(0.415 U/mL，0.1 M磷酸钠缓冲液，pH 8.0)，300 μL Ellman显色剂5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)3.3 mM(0.1 M磷酸钠缓冲液，pH 7.0，含NaHCO₃ 6 mM)和30 μL酶抑制剂溶液。于37°C保温20分种后，加入碘化硫代乙酰胆碱(0.05 mM水溶液300μL)作为底物。用紫外分光光度计在25°C 时412 nm波长下测定化合物的光密度，与不加待测化合物的空白管比较计算得出的降低百分率即为酶抑制率。每个化合物均测双管。

胆碱酯酶活力（U/mg蛋白）=（OD_测定管-OD_对照管）/（OD_标准管-OD_空白管）*1μmol/mL

胆碱酯酶活性抑制率(%)=（ChE活力_对照-ChE活力_加药）/ChE活力_对照*100%

按照上述公式计算化合物的胆碱酯酶活性抑制率。每个化合物均配成10^-6mol/L浓度进行初筛；对照药物为石杉碱甲。按照初筛结果选择化合物的七至九个浓度测定其酶抑制率，并以该化合物摩尔浓度的负对数与酶抑制率进行线性回归，求得50%抑制时的摩尔浓度即为该化合物的IC₅₀值。其中，实施例7和实施例8及对照药物的结果见表4。

表4

（六）金属离子螯合活性测试

利用分光光度法测试目标化合物的金属离子螯合活性。目标化合物在200~400nm的近紫外区有明显吸收，而Cu²⁺和Fe²⁺在此波长范围内无明显吸收（即使浓度达到500μM）。根据体系中各组分的吸光度具有加和性(A=ε₁C₁+ε₂C₂+…+ε_nC_n)，本发明配制了不同配比的待测液：目标化合物的浓度为常数30μM，而Cu²⁺和Fe²⁺离子的浓度逐渐提高（1~40μM），混合30min后进行检测。利用示差光谱直观地显示化合物与金属离子混合前后紫外吸收光谱的变化，这种吸收峰的改变说明了体系中络合物的生成。其中，实施例7与不同浓度的Cu²⁺混合的示差光谱（图1)，与不同浓度的Fe²⁺混合的示差光谱（图2)和实施例8分别与不同浓度的Cu²⁺ 、Fe²⁺混合的示差光谱（图3和4)说明了这两个化合物具有金属离子螯合活性。

（七）对AChE诱导的Aβ聚集抑制活性测试

Aβ_1-40肽(Biosource) 2 μL于六氟异丙醇(HFIP)中冻干后溶解在DMSO中，加0.215 M磷酸钠缓冲液(pH 8.0)配制成230 μM的Aβ试液；Aβ试液中加入16 μL人重组AChE (Sigma-Aldrich)配制成AChE终浓度为2.30 μM的AChE-Aβ试液；AChE-Aβ试液中加入2 μL供试抑制剂配制成抑制剂-AChE-Aβ试液。上述试液室温孵育48 h，重复测试两次。Aβ沉积纤维的形成用硫磺素T荧光法检测。

孵育结束，加入含1.5 μM硫磺素T (Sigma-Aldrich)的50 mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 8.5) 稀释成2.0 mL。荧光检测，激发波长和发射波长分别为446 nm和490 nm。计算抑制剂在不同浓度下对AChE诱导Aβ聚集的抑制百分率，计算公式：100?(IFi/IFo × 100)，IFi和IF₀分别表示抑制剂-AChE-Aβ试液和AChE-Aβ试液的荧光强度。记录抑制曲线，进行回归分析，并计算IC₅₀值。对照药选择上市药物利斯的明（Rivastigmine）和已知的特异性AChE诱导的Aβ聚集抑制剂碘化丙啶(Propidium iodide)。其中，实施例7和实施例8及对照药物对AChE诱导的Aβ聚集抑制活性测试结果如表5所示。

表5

（八）对Cu²⁺诱导的Aβ聚集抑制活性测试

应用浊度法检测目标化合物对Cu²⁺诱导的Aβ聚集的抑制活性。将Aβ_1–40（终浓度10μM)与 Cu²⁺（终浓度为20 μM）和目标化合物（终浓度为100μM）在37 °C下孵育，反应的缓冲体系为20 mM Hepes, 150 mM NaCl缓冲液，体积为100 μL。30分钟后，在λ=405nm处测定吸光度。计算化合物在此浓度下对Cu²⁺诱导的Aβ聚集的抑制百分率。对照药选择已知的金属离子螯合剂二亚乙基三胺五乙酸（diethylenetriamine pentaacetic acid ，DTPA）。

其中，实施例7和实施例8及对照药物的测试结果如表6所示。

表6

Compound	% Inhibition of Cu²⁺-induced Aβ Aggregation at 100 μM
		实施例7	75.1 ± 8.4
实施例8	76.4 ± 6.9
		DTPA	85.6 ± 7.2

Claims

1.通式(I)的左旋美普他酚双分子衍生物：

其中：

m、n独立地选自1～3中的整数；

Y₁和Y₂独立地为NR，所述R为氢、甲基、或乙基；

B₁、B₂、B₃、B₄独立地为-CH₂-或-CO-；

x为0或1。

2.根据权利要求1所述的左旋美普他酚双分子衍生物，其特征在于，所述m与n相同，Y₁和Y₂相同，B₁与B₄相同，且B₂与B₃相同。

3.根据权利要求2所述的左旋美普他酚双分子衍生物，其特征在于，所述Y₁和Y₂为NR，所述R为氢、甲基。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的左旋美普他酚双分子衍生物，其特征在于，所述B₁、B₄为-CH₂-。

5.根据权利要求4所述的左旋美普他酚双分子衍生物，其特征在于，所述B₂、B₃为-CH₂-。

6.根据权利要求4所述的左旋美普他酚双分子衍生物，其特征在于，所述x为0。

7.根据权利要求5所述的左旋美普他酚双分子衍生物，其特征在于，所述x为0。

8.根据权利要求5～7中任一项所述的左旋美普他酚双分子衍生物，其特征在于，所述m、n为2。

9.一种权利要求1～8中任一项所述的左旋美普他酚双分子衍生物与无机酸或者有机酸形成的盐类，其特征在于，所述无机酸选自盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸或任意两者的混合酸；所述有机酸选自酒石酸、扁桃酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸、富马酸或任意两者的混合酸。

10.一种制备权利要求1～8中任一项所述的化合物的方法，其特征在于，其包

括在碱性条件下将式(II)化合物与式(III)进行反应，

其中，Z为Br或Cl。

11.一种权利要求1-8中任一项所述的左旋美普他酚双分子衍生物在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途，所述神经退行性疾病为帕金森症、亨廷顿氏病和痴呆症。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病为痴呆症。