CN102607880A - 压电显微切割系统、切割深度定位方法及切割方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种压电显微切割系统,包括:平台、振动切割部、第一电动操作手、持针器、第二电动操作手、图像采集系统和计算机系统。本发明还提供了一种切割深度定位方法及切割方法。本发明提供的压电显微切割系统,可以自动定位在所需切割生物组织深度方向任意位置,并可自动完成目标生物组织的切割,还可实现目标组织切片的分离。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,具体涉及一种压电显微切割系统、切割深度定位方法及切割方法。
背景技术
显微切割技术是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料(组织、细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等)进行切割分离并收集用于后续研究的技术。其特点是可从构成复杂的组织中获得某一特定的同类细胞或单个细胞。在分子生物学的特定细胞切割,细胞遗传学的特定染色体切割,肿瘤疾病理学的基因检测等方面具有广泛的应用。显微切割分离技术拓宽了基因组学研究的领域和精度,更为分子肿瘤学的发展提供了不可替代的帮助,已日渐成为不可替代的支柱技术之一。
早期是从冰冻组织切片上直接在肉眼下用解剖刀刮去不需要的部分,剩下感兴趣的组织。后来发展成在显微操作仪引导下使用带有黏附尖端的解剖针或吸管,进行手动切割或提取。
手动直接显微切割直接在显微镜下手持切割用针分离组织或细胞群,此种方式切割精度低,费时费力,可重复性差,而且不能避免污染,只适用于对较大块组织中的局部区域或细胞群进行分离,切割单个细胞十分困难。
机械辅助显微切割是利用普通光学显微镜的微调旋钮控制切割针切割细胞,采用玻璃切割针,此方式切割精度较手动直接显微切割的精度有了提高,可以达到对较大的单个细胞的切割,切割精度仍然较低,且不能实现自动化。
激光捕获显微切割使用红外激光束切割在薄膜下的组织或细胞,产生的热量少,不会损伤组织的DNA,RNA和蛋白质,可以进行单个细胞,甚至染色体的切割,实现了高度精确,无污染,快速和自动 化切割。虽然激光捕获显微切割操作简便,耗时少,取材准确,但需特殊的设备,激光器造价昂贵。
国内也有一些压电超声显微切割的装置,但都不能实现切割深度方向可控的全自动切割,使用不方便,效率低,不能保证获得最佳的切割效果,此外在组织切片深度切割方向上不可控。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种压电显微切割系统、切割深度定位方法及切割方法。本发明提供的压电显微切割系统,可以自动定位在所需切割生物组织深度方向任意位置,并可自动完成目标生物组织的切割,还可实现目标组织切片的分离。
有鉴于此,本发明提供一种压电显微切割系统,包括:
平台,其可提供置放具有一生物组织的载物片;
振动切割部,其还包括一切割针及一振动体,该切割针与该振动体相连接,该振动体以一振动频率振动并带动所述切割针进行振动,使所述切割针对所述生物组织进行切割动作;
第一电动操作手,连接于所述振动切割部,并带动所述切割针实现三自由度的运动;
持针器,设于所述平台的上方,用以在生物组织完成切割后取下切片组织;
第二电动操作手,连接于所述持针器,并带动所述持针器实现三自由度的运动;
图像采集系统,其还包括一CCD图像传感器和一显微镜,该CCD图像传感器和显微镜相连接以采集所述显微镜所放大的物象;
计算机系统,其一输入端连接于所述CCD图像传感器的输出端,其一输出端连接于所述显微镜的输入端,该计算机系统还分别连接于所述第一电动操作手和所述第二电动操作手,以分别控制所述第一电动操作手和所述第二电动操作手实现三自由度的运动。
优选的,在上述压电显微切割系统中,所述平台连接于所述计算 机系统,该平台于一空间内进行至少一自由度的位移运动。
优选的,在上述压电显微切割系统中,所述显微镜为倒置显微镜。
优选的,在上述压电显微切割系统中,所述切割针为压电超声切割针,所述振动体为压电叠堆陶瓷。
优选的,在上述压电显微切割系统中,所述振动体的振动频率为0~40KHz,振动幅值为0~7um。
优选的,在上述压电显微切割系统中,所述振动切割部还包括一连接部,该连接部的一端与所述切割针固定,该连接部的另一端设有螺纹并与所述振动体固定。
本发明还提供了一种利用所述压电显微切割系统的切割深度定位方法,包括:
(1)控制切割针移动并接近生物组织的表面;
(2)切割针与生物组织恰好接触,获取生物组织表面的位置信息并存储;
(3)以所述位置信息为参考平面,自该参考平面向下移动的距离即为切割深度。
本发明还提供了一种利用所述压电显微切割系统的切割方法,包括:
(1)将显微镜中观察到的生物组织的放大的物象通过CCD图像传感器传送到计算机系统,并在显示器上显示出来;
(2)利用计算机系统的输入设备,在所显示的生物组织的放大的物象上确定需要切割的路线,并存储该切割路线信息;
(3)输入切割深度信息;
(4)计算机系统控制第一电动操作手运动,执行所述切割路线和切割深度指令对生物组织进行切割;
(5)计算机系统控制第二电动操作手运动,通过持针器将切割下的切片组织取下。
本发明提供一种压电显微切割系统、切割深度定位方法及切割方法。通过计算机系统控制生物组织的切割及切割后将切片组织取下, 实现了自动化,克服了手工完成生物组织切片的切割、分离工作时操作者工作强度大、实现困难、费时、易疲劳、人为误差不可避免的缺陷。通过切割针与生物组织恰好接触,获取生物组织表面的位置信息,并以该位置信息作为参考平面,可以定位切割针在生物组织深度方向的位置。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1所示为本发明具体实施例中压电显微切割系统的结构示意图;
图2a~2c所示为本发明具体实施例中振动切割部的三种优选结构示意图;
图3a~3c所示为本发明具体实施例中切割深度定位方法的原理示意图;
图4所示为本发明具体实施例中对振动切割部的针尖进行图像处理后的电镜照片;
图5所示为本发明具体实施例中切割针针尖视觉跟踪示意图;
图6a~6g所示为利用本发明具体实施例中的压电显微切割系统进行切割的实验结果。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种压电显微切割系统,以克服手工完成生物组织切片的切割、分离工作时操作者工作强度大、实现困难、费时、易疲劳、人为误差不可避免的缺陷。与现有的压电切割相比,本发明所设计的显微切割系统,可以自动定位在所需切割组织切片深度方向任意位置,并可自动完成目标组织切片的切割,利用不同粗细的切割针可实现不同大小区域的切割,最小可完成小于10um×10um区域的特定组织切片的切割(能胜任细胞级的切割),并可实现目标组织切片的分离。
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。
参图1所示,压电显微切割系统10包括平台11、振动切割部12、第一电动操作手13、持针器14、第二电动操作手15、图像采集系统和计算机系统16。
平台11,其可提供置放具有一生物组织的载物片。平台11连接于计算机系统16,该平台11于一空间内进行至少一自由度的位移运动。计算机系统16可以控制平台11进行移动,平台11优选为X/Y精密电动载物定位平台,可实现X、Y两自由度的运动。
振动切割部12,包括一切割针及一振动体,该切割针与该振动体相连接,该振动体以一振动频率振动并带动所述切割针进行振动,使所述切割针对所述生物组织进行切割动作。切割针优选为压电超声切割针,振动体优选为压电叠堆陶瓷,压电叠堆陶瓷与自带信号发生器宽频带压电陶瓷电源127的一端连接。振动体的振动频率优选为0~40KHz,振动幅值为0~7um。
图2a~2c所示为振动切割部的结构示意图。
由于在显微切割中,如果切割针和振动体连接不紧,在超声振动时会导致切割针不仅沿其轴向振动,还容易产生水平面内不可控的横向摆动。这样就可能会导致切口不平整、切口变宽、切割不彻底,甚至切割针在切割过程中脱落等。因此本发明实施例中,振动切割部12 还包括一连接部,该连接部的一端与切割针固定,该连接部的另一端设有螺纹并与振动体固定。
振动切割部12的结构优选自图2a~2c所示的三种方式。图2a中是直接把切割针124塞进一个圆柱形的螺栓(连接部)121上再把螺栓121拧入压电叠堆陶瓷。图2b中连接部122的一端是螺栓状的圆柱体,另一端则是曾十字形的夹持结构,十字形的夹持结构外面用螺帽拧紧固定住切割针125。图2C中连接部123的半圆柱状的纵切面上开有一个半圆柱形的槽,把切割针126放入槽内,用金属片盖住然后用螺丝拧紧。
第一电动操作手13连接于振动切割部12,并带动切割针实现三自由度的运动。
持针器14,设于平台11的上方,用以在生物组织完成切割后取下切片组织。
第二电动操作手15,连接于持针器14,可带动持针器14实现三自由度的运动。
第一电动操作手13和第二电动操作手15分别设置于载物片的两侧。
图像采集系统,包括一CCD(Charge-coupled Device)图像传感器161和一显微镜162,该CCD图像传感器161和显微镜162相连接以采集显微镜162所放大的物象。CCD图像传感器161优选为CCD摄像头,显微镜162优选为倒置的显微镜,其设于平台11的正上方。
计算机系统16,其一输入端连接于CCD图像传感器161的输出端,其一输出端连接于显微镜162的输入端,该计算机系统16还分别连接于第一电动操作手13和第二电动操作手15,以分别控制该第一电动操作手13和第二电动操作15手实现三自由度的运动。
计算机系统16通过开发的软件实现对显微镜162的调焦、切换物镜以及调节光线亮度等操作。
CCD图像传感器161的输出端优选通过USB数据线连接至计算 机系统16。
计算机系统16的一个信号输出端连接控制器111以实现对平台在X-Y方向的驱动。
本发明实施例还提供了利用上述压电显微切割系统的切割方法,包括如下步骤:
(1)将显微镜中观察到的生物组织的放大的物象通过CCD图像传感器传送到计算机系统,并在显示器上显示出来;
(2)利用计算机系统的输入设备,在所显示的生物组织的放大的物象上确定需要切割的路线,并存储该切割路线信息;
(3)输入切割深度信息;
(4)计算机系统控制第一电动操作手运动,执行所述切割路线和切割深度指令对生物组织进行切割;
(5)计算机系统控制第二电动操作手运动,通过持针器将切割下的切片组织取下。
压电显微切割系统10的工作过程如下:生物组织切片17通过载物片固定在平台11上表面的开孔处,计算机系统16向控制器131发送运动控制信号,并由第一电动操作手13带动切割针实现在空间三个坐标方向位置调整的控制,进而实现不同方向上的切割。同时,通过自带信号发生器宽频带压电陶瓷电源127可实现对切割针沿其长度方向高频伸缩振动参数的调整,使其实现不同频率和振幅的振动状态,满足不同切割条件下的振动状态要求。振动切割部12的振动频率0~40khz,振动幅值0~7um,最大振动加速度可达到15.28g。CCD图像传感器161实现组织切片切割图像信息的采集,送入计算机后,可以实现事实观察显微切割全过程,可以根据需要及时调整控制参数,且可以随时保存图像或录制视频。
压电显微切割系统10用于切割特定需要的组织切片,并实现感兴趣组织切片的分离,具体实施步骤如下:将振动切割部12固定于精密三自由度第一电动操作手13上,前端的切割针尖贴近生物组织17 的表面,振动切割部12与生物组织17的上表面成角度θ;在生物组织17上没有组织的地方提取切割针的深度信息,使切割针停在载玻片上方20um处,移动平台11或者水平移动振动切割部12找到需要切割的位置。通过控制第一电动操作手13降低振动切割部12到一定位置使其切入生物组织17,切入深度为2~6um;使振动切割部12在第一电动操作手13的驱动下,在水平面内进给运动,从而切割分离出生物组织切片,在进给运动的过程中,振动切割部12始终在自带信号发生器宽频带压电陶瓷电源127的驱动下沿其自身长度方向进行超声振动,振动频率为20khz~30khz。
压电显微切割系统10在切割时,振动切割部12在高精度、高分辨率的第一电动操作手13驱动下沿设定切割轨迹运动,压电超声切割刀不断作超声振动,在超声的作用下,切割更容易、更彻底,生物组织切片的边缘更平滑。切割后组织可以直接通过持针器14取下并放到指定的位置进行下一步分析,不需要做后续处理。
振动切割部12具沿其轴向振动会产生两个方向上的分量,即水平面内的振动和纵坐标平面内的振动。
压电陶瓷可带动切割针沿着固定杆轴线振动,驱动信号为:
y(t)=Asin(ωt) (1)
其中:ω-频率(ω=2πf);A-振动幅值。这里切割组织切片选为石蜡包埋切片。
那么切割针在水平面内x轴的振动分量为:
x(t)=Asin(ωt)*cos(θ) (2)
切割针在纵坐标平面内的振动分量为:
z(t)=Asin(ωt)*sin(θ) (3)
其中:θ为切割针的倾角。
而切割组织切片主要依靠的是纵向分量,当振动幅值达到一定值时便可切开组织,所以获取切割针尖的深度信息很关键。
本发明实施例还公开了一种切割深度定位方法,包括如下步骤:
(1)控制切割针移动并接近生物组织的表面;
(2)切割针与生物组织恰好接触,获取生物组织表面的位置信息并存储;
(3)以所述位置信息为参考平面,自该参考平面向下移动的距离即为切割深度。
以下结合图3a~3c对上述切割深度定位方法的原理进行详细描述,其中图3c为图3b中A的局部放大图。
上述获取深度信息的操作原理是基于实验过程中观察的现象,如图3a所示,当振动切割部12在第一电动操作手13的驱动下沿Z方向向下运动时,位置1,2,3,4分别表示振动切割部12的初始位置、接触样品表面之前、与样品表面刚刚接触以及接触后在表面滑动,1′、2′、3′、4′则是对应的切割针前端的平面图像。可以看出,当振动切割部12在下降过程中图像坐标平面上沿某一方向缓慢运动,且切割针的针尖在水平方向上几乎没有位移,当与生物组织17表面接触时,针尖将会沿着水平方向运动,然后快速回撤。根据这一原理,通过视觉识别与表面接触点3′,即可获得深度方向的高度信息,并以表面为参考平面,实现对操作工具的Z方向的控制。图3b~3c是组成图像平面的示意图,我们设定在最初的位置1时,振动切割部12的针尖与生物组织17表面的距离为h,振动切割部12的针尖和显微镜162之间的距离为u,图像平面和显微镜162之间的距离为v。在接触之前,顶端和视轴的水平距离始终为X0。水平间距在接触之后改变,设为X。在建立接触之前,三角相似关系
两边微分
由式(5)可以看出,振动切割部12的针尖与生物组织17表面 发生接触之前,振动切割部12沿Z轴方向下降的距离正比于振动切割部12的针尖在显微镜162反馈图像平面中x坐标值,且变化趋势相反。
类似地,根据图3a和图3b,振动切割部12的针尖与生物组织17表面发生接触之后,满足
两边微分
式(7)表明在接触之后,在振动切割部12的针尖成像平面x轴坐标值正比于沿Z轴方向下降的距离。根据以上的分析,我们发现在接触之前,振动切割部12的针尖成像x轴坐标值先减小,当发生接触之后迅速增加,表现为突然改变运动方向。
为了获得切割针的准确位置,首先需要对针尖进行识别与跟踪。其操作流程包括:首先指定Region of Interest(ROI),在20倍的物镜下,ROI被设为60×60;第二步,运用高斯平滑滤波,自适应阈值,腐蚀等在ROI内对切割针的针尖进行图像处理,结果如图4所示;第三步,获得针尖前端轮廓,定位在针尖轮廓的最右边,准备沿着Z轴移动振动切割部12来实现接触检测。
在切割针向下运动时,通过视觉跟踪实时检测切割针针尖轮廓最右边像素位置的跟踪曲线如图5所示。在向下运动过程中(1’-3’-4’),振动切割部12以1um/step的速度接近目标表面,与表面发生机械接触,点(3’)是第一次稳定的接触点(过程1’-3’);进一步向下运动,切割针尖端会在目标表面上滑动(过程3’-4’)然后回撤;振动切割部12停止向下运动开始快速地回撤(4’-3”-5’),切割针尖端在目标表面滑动(过程4’-3”),但是运动方向与下降过程中的滑动是相反的,与目标表面脱离,获得了第二次接触点(3”);切割针尖端离开目标表面 升高到目标物上方任意指定位置(本文的设定值为20um),至此整个接触检测过程结束。因此通过获得接触点3’之后,以获得的目标表面接触点3’为参考点,就可以判断出在深度方向位置。
切割针尖端在沿深度Z方向运动与生物组织17表面接触后,会在表面发生快速滑动,然后振动切割部12向上回撤,在整个过程中振动切割部12与生物组织17表面在一次接触探测实验中能够获取与生物组织17表面接触两次(接近和离开),本发明用分辨率为0.4um的三自由度操作手在20倍物镜下,获得一个像素的重复定位精度,大约0.4um。在所有的实验中,接触检测都在没有破坏切割针尖端的条件下实现。
图6a~6g是在供给信号频率15khz、供电电压30V、振动切割部12移动速度25um/s、切割针倾斜45度的条件下的(经实验此条件为最佳条件)切割效果图。其中,图6a所示为在计算机系统上设定的切割路线(直线);图6b所示为执行图6a中的切割路线并实现切割完成,切割方向从左向右;图6c所示为切割针插入生物组织不同深度的切割效果,切割方向从右向左;图6d所示为在计算机系统上设定的切割路线(四边形);图6e所示为执行图6d中的切割路线并实现切割完成,切割方向为顺时针;图6f所示为将图6e中切下的组织取走;图6g所示为组织取走后的效果图。
综上所述,本发明的优点在于:通过计算机系统控制生物组织的切割及切割后将切片组织取下,实现了自动化,克服了手工完成生物组织切片的切割、分离工作时操作者工作强度大、实现困难、费时、易疲劳、人为误差不可避免的缺陷。通过切割针与生物组织恰好接触,获取生物组织表面的位置信息,并以该位置信息作为参考平面,可以定位切割针在生物组织深度方向的位置。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种压电显微切割系统,其特征在于,包括:
平台,其可提供置放具有一生物组织的载物片;
振动切割部,其还包括一切割针及一振动体,该切割针与该振动体相连接,该振动体以一振动频率振动并带动所述切割针进行振动,使所述切割针对所述生物组织进行切割动作;
第一电动操作手,连接于所述振动切割部,并带动所述切割针实现三自由度的运动;
持针器,设于所述平台的上方,用以在生物组织完成切割后取下切片组织;
第二电动操作手,连接于所述持针器,并带动所述持针器实现三自由度的运动;
图像采集系统,其还包括一CCD图像传感器和一显微镜,该CCD图像传感器和显微镜相连接以采集所述显微镜所放大的物象;
计算机系统,其一输入端连接于所述CCD图像传感器的输出端,其一输出端连接于所述显微镜的输入端,该计算机系统还分别连接于所述第一电动操作手和所述第二电动操作手,以分别控制所述第一电动操作手和所述第二电动操作手实现三自由度的运动。
2.根据权利要求1所述的压电显微切割系统,其特征在于,所述平台连接于所述计算机系统,该平台于一空间内进行至少一自由度的位移运动。
3.根据权利要求1所述的压电显微切割系统,其特征在于,所述显微镜为倒置显微镜。
4.根据权利要求1所述的压电显微切割系统,其特征在于,所述切割针为压电超声切割针,所述振动体为压电叠堆陶瓷。
5.根据权利要求4所述的压电显微切割系统,其特征在于,所述振动体的振动频率为0~40KHz,振动幅值为0~7um。
6.根据权利要求4所述的压电显微切割系统,其特征在于,所述振动切割部还包括一连接部,该连接部的一端与所述切割针固定,该连接部的另一端设有螺纹并与所述振动体固定。
7.一种利用权利要求1~6任意一项所述压电显微切割系统的切割深度定位方法,其特征在于,包括:
(1)控制切割针移动并接近生物组织的表面;
(2)切割针与生物组织恰好接触,获取生物组织表面的位置信息并存储;
(3)以所述位置信息为参考平面,自该参考平面向下移动的距离即为切割深度。
8.一种利用权利要求1~6任意一项所述压电显微切割系统的切割方法,其特征在于,包括:
(1)将显微镜中观察到的生物组织的放大的物象通过CCD图像传感器传送到计算机系统,并在显示器上显示出来;
(2)利用计算机系统的输入设备,在所显示的生物组织的放大的物象上确定需要切割的路线,并存储该切割路线信息;
(3)输入切割深度信息;
(4)计算机系统控制第一电动操作手运动,执行所述切割路线和切割深度指令对生物组织进行切割;
(5)计算机系统控制第二电动操作手运动,通过持针器将切割下的切片组织取下。
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《光学精密工程》 20060630 王会香等 生物显微切割微操作仪的设计与研制 416-421 7-8 第14卷, 第3期 * |
王会香等: "生物显微切割微操作仪的设计与研制", 《光学精密工程》 * |
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