CN102600459B - 乳铁蛋白在预防和治疗肿瘤转移中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了乳铁蛋白在预防和治疗肿瘤转移中的用途。具体地，本发明提供了乳铁蛋白在制备预防或抑制肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的药物中的用途。本发明的药理实验证明：本发明提供的人乳铁蛋白对肿瘤转移具有良好的预防和治疗效果，能够明显抑制小鼠黑色素瘤等恶性肿瘤的转移、定植及生长。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，尤其是生物制药和肿瘤治疗领域。更具体地，本发明涉及一种预防和抑制肿瘤转移的方法，该方法通过给予人乳铁蛋白或与其他抗癌药物相结合的组合物来实现。
背景技术
乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种分子量约80KD的多功能碱性糖蛋白，主要存在于哺乳动物的外分泌液(如：乳汁、眼泪、汗液、唾液、精液等)和中性粒细胞中。LF在人乳中含量丰富，在初乳中含量可达7g/L，在成熟乳汁中含量有所下降并趋于平衡，通常保持在1g/L的水平。
自1939年LF首次从牛乳中分离得到以来，其促进体内铁的吸收和传递、抗菌、抗病毒感染、调节机体免疫力等生物活性陆续被发现。研究发现，LF在人体的自然防御过程中扮演着重要的角色。
成熟的LF由690个氨基酸残基组成，其氨基酸序列有两个主要特征：一是LF包含一条多肽链，这条多肽链是一个双重重复结构，目前认为这是由于进化过程中的基因重复造成的，重复结构中的两部分同源性高达40％；第二是乳铁蛋白中含有大量碱性氨基酸，使蛋白具有较强的碱性，乳铁蛋白的强碱性和高等电点对它的多种生物活性都起到重要作用。
研究表明，口服牛乳铁蛋白(bLF)能够加强肠道免疫力。此外，将喂饲bLF的大鼠暴露于化学致癌剂中，其与普通大鼠相比能够明显抑制结肠、肺部、食道、膀胱等部位肿瘤的生长。在裸鼠鳞状细胞癌动物模型和正常小鼠乳房癌模型、鳞状细胞癌模型中，口服重组人乳铁蛋白(recombinant humanlactoferrin，rhLF)均能够明显抑制肿瘤生长。目前，美国Agennix重组人乳铁蛋白作为治疗非小细胞肺癌的药物已进入III期临床，作为肾细胞癌的治疗药物也已进入期II期临床研究阶段。
肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，也是大部分肿瘤病人死亡的主要原因。目前，外科手术与放化疗结合的治疗方式能够在大部分肿瘤的原发位点对其进行有效的控制。而大部分的肿瘤转移灶是不能通过外科手术治愈的，化学治疗、激素治疗和放射治疗能够在一定程度上提高肿瘤转移病人存活率，但是转移灶的出现往往意味着全身性系统性疾病的发生。
肿瘤侵袭转移是一个连续的、渐进的、动态的过程，其基本过程为：原发性肿瘤细胞大量增殖及肿瘤周围和内部新生血管的迅速生长；少数肿瘤细胞从原发病灶脱落后，侵入血管、淋巴管中，并在循环系统中随血液、淋巴流迁移到另一部位；肿瘤细胞与毛细血管壁发生黏附，穿出血管后形成微小转移灶；细胞增殖并产生新的血管，形成与原发瘤同样类型的继发性肿瘤。
近年来，对肿瘤转移机制的研究在一定程度上有所进展和突破，但是，本领域尚缺乏令人满意的、有效抑制肿瘤转移(尤其是肺转移)的方法和药物。
因此，本领域迫切需要开发新的、能够有效抑制或减少肿瘤转移的药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的、能够有效抑制或减少肿瘤转移的药物。
在本发明的第一方面，提供了一种乳铁蛋白的用途，它被用于制备预防或抑制肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的药物。
在另一优选例中，所述的乳铁蛋白选自下组：人乳铁蛋白、羊乳铁蛋白、牛乳铁蛋白、或其组合。
在另一优选例中，所述的乳铁蛋白是重组人乳铁蛋白或来自人乳中的人乳铁蛋白。
在另一优选例中，所述的乳铁蛋白以0.01-100mg/kg体重(较佳地0.05-50mg/kg体重，更佳地0.1-10mg/kg体重)的剂量(每次或每天)施用于哺乳动物。
在另一优选例中，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药：口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组或所述的肿瘤细胞是选自以下肿瘤的肿瘤细胞：黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、白细胞过多症、成神经细胞瘤、鳞状细胞癌、头癌、颈癌、牙龈癌、舌癌、乳癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、肉瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑瘤、结肠癌以及膀胱癌。
在另一优选例中，所述的药物含有药学上可接受的载体、人乳铁蛋白和任选的化疗剂。
在另一个优选例中，其中所述化疗剂选自下组：烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物以及相关抑制剂、长春花碱类、epipodopyvllotoxins、抗生素、L一天冬酞胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位复合物、大黄素取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-释放激素类似物。
在另一优选例中，所述的药物的制剂选自下组：片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。
在本发明的第二方面，提供了一种预防和抑制肿瘤转移的方法，包括步骤：将乳铁蛋白或含有乳铁蛋白的药物组合物施用于需要的哺乳动物对象。
在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人。
在另一优选例中，乳铁蛋白的施用剂量或有效量为每天1mg～100g/70kg体重，较佳地为10mg～50g/70kg体重。
在另一优选例中，所述的用药方式包括口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾以及皮肤局部或全身经皮用药。
在另一个优选例中，用药方式包括口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾；
在另一个优选例中，用药方式包括口服、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾；
在另一个优选例中，用药方式是口服。
在另一优选例中，含有乳铁蛋白的药物是单方制剂或复方制剂，其中复方制剂还可包含抗肿瘤化合物，如化疗剂。
在另一个优选例中，其中所述化疗剂选自下组：烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物以及相关抑制剂、长春花碱类、epipodopyvllotoxins、抗生素、L一天冬酞胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位复合物、大黄素取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-释放激素类似物。
在另一个优选例中，其中所述化疗剂选自以下物质组成的组：5一氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨、紫杉醇和多西紫衫醇。
在另一优选例中，所述制剂包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、或喷雾剂。
在本发明的第三方面，提供了一种体外抑制肿瘤细胞迁移的方法，包括步骤：让肿瘤细胞在乳铁蛋白存在下进行培养，或者与乳铁蛋白接触，从而抑制肿瘤细胞的迁移。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞是选自以下肿瘤的肿瘤细胞：黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、白细胞过多症、成神经细胞瘤、鳞状细胞癌、头癌、颈癌、牙龈癌、舌癌、乳癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、肉瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑瘤、结肠癌以及膀胱癌。更佳地，所述的肿瘤细胞是黑色素瘤细胞(如B16F10细胞株)和非小细胞肺癌(如A549细胞株)。
在另一优选例中，在所述方法中，所述的乳铁蛋白的浓度为0.01-100mg/mL，较佳地为0.05-50mg/mL，更佳地为0.1-10mg/mL。
在本发明的第四方面，提供了一种乳铁蛋白的用途，它被用于制备预防或抑制肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的保健品或食品补充剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了Western印迹鉴定人乳铁蛋白结果(rhLF：重组人乳铁蛋白；gLF：羊乳铁蛋白；hLF：人乳铁蛋白，M为分子量标准)。
图2显示了HPLC测定乳铁蛋白的纯度的图谱。
图3显示了乳铁蛋白分子量测定的质谱图。
图4显示了rhLF对非小细胞肺癌A549细胞株的生长抑制作用。
图5显示了rhLF抑制非小细胞肺癌A549细胞株的迁移。
图6显示了黑色素瘤肺转移模型小鼠的肺部解剖图。
图7显示了给予不同浓度rhLF后小鼠肺部黑色素瘤的生长情况。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，乳铁蛋白居然可有效地抑制肿瘤(或肿瘤细胞)转移或迁移，因此可用于制备预防或抑制肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的药物。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人以转人乳铁蛋白基因山羊乳汁为原料，经离心、脱脂、去除乳清中的颗粒状杂质、SP-Sepharose阳离子交层析纯化等处理步骤，获得高纯度的乳铁蛋白。
C57BL/6小鼠经适应性饲养后，进行尾静脉注射接种。黑色素瘤细胞株B16F10培养至对数生长期后收集细胞，胰酶消化后用PBS洗两遍，1000rpm离心5min，生理盐水调节细胞浓度至1×106个/mL。每只C57BL/6小鼠经尾静脉注射接种小鼠黑色素瘤细胞0.2mL。
按以上模型构建方法制备小鼠B16F10肺转移模型动物后，根据实验分组设计随机分为阴性对照、阳性对照、rhLF高剂量组、rhLF中剂量组、rhLF低剂量组5组，每组8只动物。接种24h后，第1次灌胃注射给药，每只动物接受容量0.2mL/10g，连续灌胃给药21天。于第22天处死动物。手术剥取小鼠肺部组织，在生理盐水中洗净淤血后，计数肺转移瘤灶数。经统计分析发现，乳铁蛋白用药量为150mg/kg、300mg/kg和600mg/kg的各组肿瘤转移抑制效果分别为32.02％、53.46％和70.96％，有明显剂量依赖性。
乳铁蛋白
在本发明的组合物中，核心的活性成分是乳铁蛋白。
可用于本发明的乳铁蛋白宜为哺乳动物的乳铁蛋白，包括天然的乳铁蛋白或重组的乳铁蛋白。代表性的例子包括(但并不限于)：人、牛、羊的乳铁蛋白。
在另一优选例中，所述人乳铁蛋白是重组人乳铁蛋白(rhLF)及来自人乳中的人乳铁蛋白。
在另一优选例中，所述人乳铁蛋白纯化自转基因哺乳动物的乳汁。
在另一优选例中，所述人乳铁蛋白纯化自转基因山羊的乳汁。
药物组合物和给药方式
本发明提供了含有活性成分(a)乳铁蛋白；以及(b)药学上可接受的载体的药物组合物。
在本发明的药物组合物中，乳铁蛋白的含量没有特别限制，通常为0.01-95wt％，较佳地为0.1-90wt％。
本发明的药物组合物可以是单方制剂，也可以是复方制剂。
在复方制剂中，除了含有乳铁蛋白之外，还可包含其他抗肿瘤化合物，例如化疗剂。代表性的化疗剂包括(但并不限于)：烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物以及相关抑制剂、长春花碱类、epipodopyvllotoxins、抗生素、L一天冬酞胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位复合物、大黄素取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-释放激素类似物。优选的化疗剂包括：5一氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨、紫杉醇和多西紫衫醇。
本发明的药物组合物的剂型和制备方法没有特别限制，可用本领域常规通用的制法制成片剂、胶囊、颗粒剂、缓释剂、注射剂等各种剂型。优选的剂型是口服制剂(如片剂)和注射剂。
在本发明中，乳铁蛋白或含乳铁蛋白的的药物制剂可用于预防和治疗肿瘤转移或肿瘤细胞迁移。
适用于本发明的肿瘤包括(但并不限于)：黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、白细胞过多症、成神经细胞瘤、鳞状细胞癌、头癌、颈癌、牙龈癌、舌癌、乳癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、肉瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑瘤、结肠癌以及膀胱癌。
在另一个优选例中，所述的肿瘤为黑色素瘤。
在本发明中，给药方式没有特别限制，可以通过口服、静脉内、肌内、腹腔内或皮下等途径给药。
本发明制剂可以每天服用或给药一次或两次、或多次，或者以缓释方式给药。优选的方式是每天服药一次，因为这样便于病人坚持，从而显著提高病人服药的顺应性。
服用时，极大多数病例一般每天应用的总剂量为每人1mg～200g，较佳地为10mg～100g。
保健品或食品补充剂
本发明还提供了一种乳铁蛋白的用途，它被用于制备预防或抑制肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的保健品或食品补充剂。
本发明的保健品或食品补充剂还有食品上可接受的载体以及乳铁蛋白。在本发明的保健品或食品补充剂中，乳铁蛋白的含量没有特别限制，通常为0.01-95wt％，较佳地为0.1-90wt％。
本发明的保健品或食品补充剂还可含有其他营养成分，例如硒、铁、以及维生素等。
本发明的保健品或食品补充剂可用于预防或抑制肿瘤转移或肿瘤细胞迁移，尤其可作为肿瘤患者术后或治疗过程之中或之后的辅助食品或食品补充剂。
本发明的主要优点在于：
(a)人乳铁蛋白是人体的正常组分，对人无毒无害。
(b)患者不仅可以配伍使用人乳铁蛋白制剂，强化传统放化疗法的疗效，缓解副作用，还可以长时间服用起到良好的预防或治疗效果，因而具有广阔的商业前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数为重量百分比和重量份数。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1重组人乳铁蛋白的制备
1材料与方法
1.1试剂和原料
buffer A(400mM NaCl，20mM PB，pH7.5)，buffer B(1000mM NaCl，20mMPB，pH7.5)；生理盐水。
重组人乳铁蛋白的转基因山羊乳汁(购自上海转基因研究中心)，经测定，每升羊乳汁含有约40-66g的人乳铁蛋白和约0.05-0.12g的少量羊乳铁蛋白。
1.2方法
1.2.1脱脂：
取高效表达重组人乳铁蛋白的转基因山羊乳汁20mL，如下进行羊乳脱脂：10000rpm离心30min后，用4层纱布过滤得滤液。
1.2.2脱酪：
滤液与20mL 800mM NaCl(40mM PB，pH7.5)混匀，用浓盐酸调pH4.6；40℃温浴30min后，10000rpm离心30min，取上清；上清用NaOH调pH7.0后，10000rpm离心30min，取上清。
1.2.3去除杂质
脱脂脱酪后的上清过0.22μm滤膜除菌、除杂质，得无菌羊乳清。
1.2.4SP-Sepharose阳离子交换层析
脱脂、脱酪、除菌后的羊乳清，在400mM NaCl(20mM PB，pH7.5)条件下上样，与SP-Sepharose介质结合后，用1M NaCl(20mM PB，pH7.5)进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰即得到乳铁蛋白。
1.2.5Sephadex G-25分子筛脱盐
阳离子交换层析纯化获得的乳铁蛋白，经Sephadex G-25分子筛脱盐，流动相为生理盐水。脱盐后，乳铁蛋白所处溶液体系为生理盐水。
1.2.6冻干
目的蛋白分装于西林瓶中，冻干。
1.2.7鉴定及质量检查
纯化获得的乳铁蛋白生理盐水溶液经Western印迹进行蛋白鉴定；经Lorry法蛋白定量测得蛋白含量；非还原性SDS-PAGE凝胶电泳和高效液相法测定乳铁蛋白纯化产物纯度；紫外分管光度法测定乳铁蛋白纯化产物的铁饱和度；还原性SDS-PAGE凝胶电泳和质谱法测定乳铁蛋白纯化产物的分子量。
2.结果
纯化获得的乳铁蛋白生理盐水溶液经Western印迹鉴定，结果为阳性，羊乳铁蛋白的Western印迹鉴定结果为阴性，说明该乳铁蛋白确为人乳铁蛋白(图1)；经Lorry法蛋白定量测得蛋白含量为30mg/mL；非还原性SDS-PAGE凝胶电泳和高效液相法测定乳铁蛋白纯化产物纯度均大于98％(图2)；紫外分管光度法测定乳铁蛋白纯化产物的铁饱和度约为5％，铁不饱和乳铁蛋白占蛋白总量的95％；还原性SDS-PAGE凝胶电泳和质谱法测定乳铁蛋白纯化产物的分子量约为80KD(图3)。
实施例2重组人乳铁蛋白对非小细胞肺癌A549细胞株的体外生长抑制试验和转移抑制试验
1材料与方法
1.1试剂与材料
Transwell小室(孔径8μm)，DMEM基础培养基，DMEM完全培养基，DMEM培养基(含1％胎牛血清)，DMEM培养基(含20％胎牛血清)，胰酶，青链霉素，0.1％结晶紫染液，MTT。
非小细胞肺癌A549细胞株。
1.2方法
1.2.1rhLF对非小细胞肺癌A549的体外生长抑制试验(MTT法)
收集对数期A549细胞，调整细胞悬液浓度至104个/mL，每孔加入100μL铺板使待测细胞密度为1000个孔。5％CO2，37℃孵育，至细胞贴壁，加入浓度梯度rhLF，每孔100μL，药物终浓度为4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL，同时设置阴性对照孔(每孔加培养基100μL)、阳性对照孔(每孔加1mg/mL达卡巴嗪100μL)和调零孔(只含培养基)。
5％CO2，37℃孵育24h后，每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h。小心吸去孔内培养液，每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值。按下述公式计算细胞生长抑制率∶抑制率＝1-(试验孔-调零孔)/(阴性孔-调零孔)。
1.2.2rhLF对非小细胞肺癌A549的转移抑制试验(Transwell法)
制备细胞悬液前，换用无血清DMEM培养基继续培养A549细胞株。饥饿24h后，胰酶消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，细胞用PBS洗2遍后，用含1％FBS的DMEM培养基重悬，并调整细胞密度至5×105/mL。
取非小细胞肺癌A549细胞悬液100μL加入Transwell小室。24孔板下室分别加入600μL含20％FBS的DMEM培养基。其中，高、中、低剂量给药组下室培养基中分别含10mg/mL rhLF，1mg/mL rhLF，0.1mg/mL rhLF，同时设阳性对照组(下室培养基中只含20％FBS，不加其他药物)。细胞于5％CO2，37℃常规培养24h。
取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗两遍后，甲醇固定30min，适当风干后，0.1％结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞。显微镜下随机挑选5个视野进行拍照，并计数视野中细胞个数。
2.结果
肿瘤细胞体外生长抑制试验结果表明，重组人乳铁蛋白在体外对非小细胞肺癌A549细胞株没有明显的生长抑制作用(图4)。rhLF浓度为4mg/mL时，对肿瘤细胞抑制率仅为24％；在浓度低于1mg/mL时，rhLF对肿瘤细胞无生长抑制作用；阳性药物达卡巴嗪对细胞生长有显著抑制作用，抑制率为63％。
在Transwell实验中，高、中、低剂量给药组(10mg/mL rhLF，1mg/mL rhLF，0.1mg/mL rhLF)平均每个视野细胞数为47.8±6.1、54±6.4、63.2±7.7，阳性对照组单个视野中平均细胞个数为137±13.8(图5)。这表明，3个乳铁蛋白给药组的细胞迁移数比阳性对照组有显著的减少，且随着乳铁蛋白剂量增加，细胞迁移个数减少。
此外，在高、中、低剂量中观察到的未迁移的肿瘤细胞数目基本相同，这表明，在肿瘤细胞数量基本相同的情况下，高、中、低剂量的乳铁蛋白对肿瘤细胞的迁移作用的抑制作用与乳铁蛋白呈现出剂量相关性(呈正比)。由于MTT实验中rhLF对A549细胞生长无明显抑制作用但有明显的迁移抑制作用，因此这提示，rhLF对肿瘤细胞的生长抑制作用与对肿瘤细胞的迁移抑制作用是不同的，并且在Transwell试验中的抑制迁移作用并不是因为对肿瘤细胞的生长抑制所导致。
实施例3重组人乳铁蛋白对小鼠黑色素瘤肺转移生长抑制作用
为了进一步研究乳铁蛋白在动物体内的抑制肿瘤转移的活性，在本实施例中，采用小鼠黑色素瘤B16F10肺转移模型评价了乳铁蛋白的体内抑制肿瘤转移、定植和生长的活性。
1材料与方法
1.1实验动物
动物来源：C57BL/6小鼠，由中国军事医学科学院实验动物研究中心提供(实验动物生产许可证：SCXK(军))
动物周龄：6-8周；动物体重：18～22g；动物性别：雄性。
1.2受试药物
1)人乳铁蛋白
从转人乳铁蛋白基因羊奶中纯化获得，配制方法：每次给药前用生理盐水配制所需浓度。纯化方法同实施例1。
2)阳性药物
本实验对照药物为达卡巴嗪，南京制药厂有限公司生产(批号：20100101；规格：0.1克(按C6H10N60计))。每次给药前用生理盐水溶液溶解，配制所需浓度，备用。
1.3实验分组
本实验乳铁蛋白高、中、低剂量组给药量分别为600mg/kg/d、300mg/kg/d、150mg/kg/d，具体给药方式及实验药物名称见表1。
表1：乳铁蛋白的黑色素瘤肺转移抑制作用实验方案
1.4实验模型构建
将小鼠黑色素瘤B16F10细胞株进行体外培养，培养基为：89％DMEM、10％胎牛血清、1％青链霉素；培养条件为：37℃、5％CO2、饱和湿度。待细胞生长至对数生长期，用胰酶消化，PBS洗两遍后，在无菌条件下用生理盐水制备成1×106/mL的细胞悬液。每只C57BL/6小鼠尾静脉注射0.2mL黑色素瘤细胞悬液。
1.5分组及给药
按以上模型构建方法制备小鼠B16F10肺转移模型动物48只，根据实验分组设计随机分为6组，每组8只动物。接种后24h第1次灌胃注射(p.o.)给药(乳铁蛋白)，每只动物接受容量0.2mL/10g，连续灌胃给药21天。
1.6结果评价
连续灌胃21天后，于第22天处死动物。手术剥取小鼠肺部组织，在生理盐水中洗净淤血后，计数肺转移瘤灶数。
2结果
实验结果表明乳铁蛋白对小鼠体重增长无明显影响，阳性药物达卡巴嗪对小鼠体重增长有显著抑制作用。对照组，肺上转移灶多，基本上布满了整个肺部；阳性对照组(达卡巴嗪)显著减少黑色素瘤的肺转移；乳铁蛋白中剂量组(300mg/kg)和高剂量组(600mg/kg)明显减少黑色素瘤的肺转移。具体结果见表2和表3。
表2乳铁蛋白抑制小鼠黑色素瘤转移实验结果
实施例4
重复实施例2，不同点在于，用从人乳汁中分离纯化的天然人乳铁蛋白(纯化方法同实施例1)和从牛乳汁中分离纯化的天然牛乳铁蛋白(纯化方法同实施例1)分别替换原重组的人乳铁蛋白。
结果，在高、中、低剂量的3个乳铁蛋白给药组组(10mg/mL，1mg/mL，0.1mg/mL)的细胞迁移数比阳性对照组有显著的减少，且随着乳铁蛋白剂量增加，细胞迁移个数减少(减少幅度范围为45-65％)。同样地，在Transwell试验中的抑制迁移作用也不是因为对肿瘤细胞的生长抑制所导致。
实施例5含人乳铁蛋白的药物组合物
1、人乳铁蛋白片剂
乳铁蛋白 65mg
乳糖 26mg
淀粉 20mg
滑石粉 20mg
硬脂酸镁 0.3mg
工艺：充分混合上述各组分，压成大片，研压后过14-16目筛。用9/32时凹冲重新压片，得到最终产品。
2、人乳铁蛋白干粉注射剂
人乳铁蛋白 20g
甘露醇 100g
氯化钠 90g
注射用水补足至1000mL。
取20g人乳铁蛋白溶解于适量注射用水中，再加入100g甘露醇和90g氯化钠，搅拌溶解，完全溶解后用注射用水补足至1000mL，0.22μm滤膜过滤后，分装至安瓿瓶中，每瓶5mL，冷冻干燥后封口，得终产品。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种乳铁蛋白的用途，其特征在于，用于制备预防或抑制肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的药物；所述的肿瘤选自下组或所述的肿瘤细胞是选自以下肿瘤的肿瘤细胞：黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌；
所述药物由唯一活性成分(a)乳铁蛋白；以及(b)药学上可接受的载体构成；
所述乳铁蛋白的铁饱和度为5％。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的乳铁蛋白选自下组：人乳铁蛋白、羊乳铁蛋白、牛乳铁蛋白、或其组合。
3.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的乳铁蛋白是重组人乳铁蛋白或来自人乳中的人乳铁蛋白。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的乳铁蛋白以0.01-100mg/kg体重的剂量施用于哺乳动物。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药：口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的口服是舌下含化。
7.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组或所述的肿瘤细胞是选自以下肿瘤的肿瘤细胞：黑色素瘤、非小细胞肺癌。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物由药学上可接受的载体和人乳铁蛋白构成，其中，所述人乳铁蛋白的铁饱和度为5％。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物的制剂选自下组：片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。
10.一种体外抑制肿瘤细胞迁移的方法，其特征在于，包括步骤：让肿瘤细胞在乳铁蛋白存在下进行培养，或者与乳铁蛋白接触，从而抑制肿瘤细胞的迁移；所述的肿瘤细胞是选自以下肿瘤的肿瘤细胞：黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌，其中，所述乳铁蛋白的铁饱和度为5％。
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