CN102597260A

CN102597260A - 用于诊断阿兹海默氏病的过程和方法

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Publication number: CN102597260A
Application number: CN2010800341504A
Authority: CN
Inventors: 里奇·爱因斯坦; 周魏因; 帕斯卡·伯德莱
Original assignee: Exonhit SA
Current assignee: Exonhit SA
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2012-07-18
Also published as: JP2013500708A; CA2768339A1; WO2011012691A2; US20120190577A1; EP2287336A1; EP2459740A2; AU2010277532A1; BR112012002077A2; WO2011012691A3

Abstract

本申请涉及可用于在哺乳动物、尤其是人类中诊断阿兹海默氏病的方法和组合物。最值得注意的是，本申请描述了阿兹海默氏病的外周血生物标志物并在诊断方法中使用了所述生物标志物。本申请还涉及可用于实施所述方法的工具和/或试剂盒(试剂、探针、引物、抗体、阵列或芯片、细胞等)及其制备和应用。本发明还可用于在哺乳动物中、包括在疾病的早期阶段中检测阿兹海默氏病的存在或发展，以及预测阿兹海默氏病治疗的有效性。

Description

用于诊断阿兹海默氏病的过程和方法

本申请涉及用于在哺乳动物、特别是人类中检测阿兹海默氏病的方法和组合物。最值得注意的是，本申请描述了阿兹海默氏病的血清标志物及其在诊断方法中的应用。本申请还涉及用于实施所述方法的工具和/或试剂盒（试剂、探针、引物、抗体、阵列或芯片、细胞等）及其制备和应用。本发明可用于在哺乳动物中、包括在疾病的早期阶段中（包括在出现症状前或AD前阶段时）检测阿兹海默氏病的存在或进展。

阿兹海默氏病是痴呆的主要原因，并且是最常见的神经变性疾病。这种渐进性发展的疾病，以记忆丧失和语言、定向和判断能力的降低为特征。通常与衰老相关的生理问题相混淆的症状的性质、它们的严重性以及它们出现的年龄，因人而异。这造成了这种疾病早期阶段诊断的困难。

对患有这种疾病的患者的脑进行的检查，揭示了在记忆的重要区域海马中，以及参与推理、语言和记忆的大脑皮层中神经元的丧失。胆碱能神经元尤其受到这种减少的影响。

在阿兹海默氏病患者的脑中观察到的另一个主要异常是细胞内和细胞外蛋白质聚集体的积累。细胞内τ蛋白的神经原纤维聚集体似乎与痴呆的严重性极为相关。由β-淀粉样肽的细胞内和细胞外聚集所形成的老年性斑块，是神经元和神经胶质细胞受到影响的区域的特征。

然而，值得注意的是，这些聚集区域并不对应于认知功能降低特征性的突触减少的位点。

对家族性疾病形式进行的遗传学研究显示，4个基因与疾病的发生相关：APP（淀粉样前体蛋白；β-淀粉样肽的前体）、早老蛋白1和2（PS 1和PS2）以及载脂蛋白E（ApoE）。尽管这些基因中的每个的突变或多态性能够引起β-淀粉样肽生产的增加，但对控制突触和神经元丧失的机制仍然了解得很少。就此而言，几种假说和机制似乎并存，由此暗示了各种现象：

1涉及神经元和神经胶质细胞的纯粹脑现象：

-氧化胁迫，其最引人注目的是可以由β-淀粉样肽诱导并受到胆甾醇代谢的调节；

-钙流的变化和兴奋毒性。

2炎性和免疫反应现象；

3性激素的变化；

4甲状腺机能减退和胰岛素信号传导调控中的缺陷。

因此，阿兹海默氏病以整合体内平衡控制的各种系统的变化以及引起涉及免疫系统的炎性反应和内分泌调节的变化两者的对某些神经元的攻击为特征。后者反过来对其他神经元的活性和生存力以及免疫功能有影响，这些级联反应强调了不仅神经变性、而且激素调节和免疫应答也在阿兹海默氏病的发展中发挥作用。

目前，没有阿兹海默氏病的强有力和特异性的特征物、尤其是来自血样的特征物可用于建立这种疾病、尤其是疾病的各种不同阶段的诊断。提供特别是疾病早期阶段的有效的诊断测试，将能使患者从疾病发作时进行治疗，从而获益于更有效和更定制的治疗，特别是在最佳条件下通过乙酰胆碱酯酶抑制剂例如加兰他敏、多奈哌齐和利伐斯的明进行治疗。

本发明提供了对这种需求的响应。具体来说，本发明描述了用于阿兹海默氏病的血清标志物的鉴定，所述标志物能够开发这种疾病的存在、严重性或发展或者发生这种疾病的风险的有效和预测性的诊断方法。因此，本发明描述了在患有阿兹海默氏病的患者的血液中鉴定特异性或偏好性表达的分子特征物，尤其是从经历了可选剪接的某些基因的复合表达产生的分子特征物。最引人注目的是，本发明描述了序列SEQ ID NOS.:1-1754的鉴定，所述序列存在于来自人类对象的血细胞的基因或RNA中，并且其单独或组合时是阿兹海默氏病所特有的。因此，本发明提供了根据在对象血液中测量一种或多种基因的表达来诊断、预测和/或监测阿兹海默氏病的进展的工具和方法。这些基因表达中解调控的存在，被用于在对象中确立（或证实）阿兹海默氏病的存在。

因此，本发明的一个目的在于（体外或离体）检测或证实哺乳动物中阿兹海默氏病的存在的方法，所述方法包含在来自哺乳动物的生物样品、优选在血液（源于血液的）样品中确定一个或多个基因或RNA的表达变化的存在，所述基因或RNA包含选自SEQ ID NOS.:1-1754的序列，其中这种变化的存在指示了该哺乳动物中阿兹海默氏病的存在或发生阿兹海默氏病的风险。

本发明的另一个目的涉及评估或监测对阿兹海默氏病治疗的响应的方法，所述方法包含在治疗前和/或治疗期间测量包含选自SEQ ID NOS.:1至1754的序列的一个或优选几个基因或RNA的表达，以及将如此测量到的表达与治疗前或治疗较早阶段时测量到的表达进行比较的步骤，其中所述表达的变化指示了对治疗的响应。

本发明的另一个目的涉及治疗阿兹海默氏病的方法的改进，所述改进包括在治疗前和/或治疗期间测量对象中包含选自SEQ ID NOS.:1至1754的序列的一个或优选几个基因或RNA的表达。测量表达使得能够将治疗适应于病理的演变。治疗典型为使用乙酰胆碱酯酶抑制剂例如加兰他敏、多奈哌齐和利伐斯的明进行的治疗。

本发明的另一个目的涉及乙酰胆碱酯酶抑制剂例如加兰他敏、多奈哌齐和利伐斯的明制备药物的应用，以在表现出如上定义的至少一种基因的表达解调控的患者中治疗阿兹海默氏病。

在本发明的情形中，基因或RNA的变化是指（i）表达的任何变化，即表达水平（例如转录或翻译）的解调控和剪接的解调控，后者引起例如特定剪接形式的出现或各种剪接形式之间的（相对）量或比率的变化，以及（ii）产生的蛋白质结构的任何变化（截短、延长或突变形式的出现或消失等）。

正如将在下文中描述的，本申请描述了在患有阿兹海默氏病的患者血液中鉴定某些基因中的剪接变化。在本发明的范围内，可以使用用于测量这些基因在血液中的表达的任何分子或技术，例如核苷酸引物、核苷酸探针或特异性抗体，其可以在悬液中或采取固定化形式，正如在后文中详细描述的。

因此，本发明的另一个目的涉及包含其上固定化有核酸的支持物的产品，所述核酸包含与例如前面定义的一个或优选几个基因或RNA互补和/或对其特异的序列。优选情况下，产品包括不同核酸，所述核酸包含例如前面定义的至少5、10、20、30、40、50、60、100、150、200种或更多基因或RNA的互补和/或特异性序列。

本申请的另一个目的涉及包含支持物的产品，所述支持物上固定化有由例如上面定义的基因或RNA编码的多肽的至少一种配体。优选情况下，产品包含选自上面提到的多肽的各种多肽的至少5、10、20、30、40、50、60种或更多种配体。

本申请的另一个目的涉及包含区室或盒子或容器的试剂盒，所述区室或盒子或容器包含至少一种、优选几种包含例如前面定义的一种或多种基因或RNA的互补和/或特异性序列的核酸，和/或例如前面定义的一种或多种多肽的一种、优选几种配体。优选情况下，产品包含选自上面提到的核酸和配体的至少5、10、20、30、40、50、60、100、150、200种或更多种的各种核酸的序列和/或配体。试剂盒还可以包括用于杂交或免疫反应的试剂，以及如果需要的话，对照和/或说明书。

本发明的另一个目的涉及例如上面定义的产品或试剂盒的应用，用于在哺乳动物对象、优选为人类对象中检测阿兹海默氏病。

本发明的另一个目的涉及例如上面定义的产品或试剂盒的应用，用于确定对阿兹海默氏病治疗的响应或用于选择可能对治疗响应好的对象。

本发明的另一个目的在于分离的核酸，所述核酸包含选自SEQ ID NOS.:1至1754的序列或其具有至少15、16、17、18、19或20个连续碱基的片段或与所述碱基互补的序列。优选情况下，本发明的核酸不包含天然基因或RNA的完整序列。优选情况下，它包含不超过500个碱基，优选不超过400或300个碱基。本发明的核酸典型是合成的，也就是说通过非天然技术（重组、体外、化学合成等）来生产。本发明的核酸的实例是典型长度在10至30个碱基之间的探针或引物。

本发明的另一个目的在于由例如上面定义的核酸编码的多肽。

阿兹海默氏病的标志物

本发明旨在揭示和表征人类患者、更具体为来自外周血细胞的阿兹海默氏病特征性的生物事件。这些事件构成了当在患者中优选组合地被检测到时，能够甚至在早期阶段确定一种这类疾病的存在或该疾病的发展阶段的生物标志物。此外，本发明的标志物可用于测量对治疗的响应和/或选择药物候选物。

鉴定到的生物事件典型地涉及基因表达调控的变化。它可以是基因或RNA或基因或RNA的某些形式的表达的部分或完全抑制、基因或基因或RNA的某些形式的表达增加、或基因剪接形式的出现或消失等问题。

因此，本发明旨在检测样品中的一种或多种靶分子，有利情况下，所述靶分子选自：

a）包含选自SEQ ID NOS.:1至1754的序列或其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的特征性片段的核酸，

b）具有与a）的序列互补的序列的核酸，

c）a）或b）的核酸的功能类似物，或

d）由a）至c）的核酸编码的多肽。

序列SEQ ID NOS.:1-1754的核酸由本发明人通过转录组学分析技术，从来自健康人类对象或患有阿兹海默氏病的对象的血细胞样品中鉴定。这些序列在组合时是阿兹海默氏病特征性的。这些序列在本申请中被称为“靶”序列。它们存在于生物学意义上的基因中。它们的序列在序列表中给出，并且它们描述在表1中。

术语“功能类似物”优选表示在人类群体中存在的序列SEQ ID NOS:1至1754的多态性变体。在大多数情况下，这些多态性显示为碱基水平上的特定变异，即使还存在其他多态性结构。这些类似物可以通过本技术领域的专业人员已知的技术来鉴定，尤其是考虑到本申请中提供的序列以及相应基因的名称。

在具体实施方案中，方法包含确定a）至c）的至少一种核酸的存在（或不存在或表达水平的变化）。

在非常具体的实施方案中，方法被用于在人类对象中检测阿兹海默氏病，并包含确定a）至c）的至少一种核酸的存在（或不存在或表达水平的变化）。

在具体的可选实施方案中，方法包含组合确定例如上面定义的至少5、10、15、20、30、40、50、60、70种或更多种靶分子的存在或不存在或（相对）量。“组合”确定是指建立起包含几种标志物的表达（或杂交）谱（或特征）这一事实。组合确定典型地同时进行，也就是说通过综合表达谱进行。然而，组合确定也可以通过并行或顺序测量几种标志物来进行，以获得谱的鉴定。事实上，本发明能够在一组标志物上建立并确定表达谱（或特征），以便评估哺乳动物中阿兹海默氏病的存在或发生阿兹海默氏病的风险。表达谱典型地使用选自上面指出的靶的几种标志物的组合，例如包含所有这些靶的组合来执行。

在特定实施方案中，本发明的方法包含在来自哺乳动物的生物样品中，确定选自上面定义的至少5种、优选至少10种不同靶分子的存在（或不存在或（相对）量）。

就此而言，本申请描述了选自上面定义的靶分子的特定子集（栏（panel）），其特别适合于从全血样品检测患者中阿兹海默氏病的存在。

因此，在具体实施方案中，本发明的方法包含在来自哺乳动物的生物样品中，组合确定包含上面a）至d）项中定义的标志物的所有栏的靶的核酸，优选为本申请中定义的栏1至16（参见表2）之一的所有核酸的存在或不存在或相对量。

因此，在具体实施方案中，本发明的方法包含在来自哺乳动物的生物样品中，组合确定栏1至14之一、或其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的特征性片段、或具有与其互补的序列的所有核酸和/或其功能类似物和/或由所述核酸编码的多肽的存在（或不存在或（相对）量）。在本申请中提供的实施例事实上显示，这些标志物组预测性地检测阿兹海默氏病的存在或发展阶段。在具体实施方案中，方法还包含检测例如前面定义的一种或多种其他靶分子。

在具体实施方案中，本发明的方法包含在来自哺乳动物的生物样品中确定核酸的存在（或不存在或（相对）量），所述核酸分别包含SEQ ID NOS.:1至1754中显示的序列、或其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的特征性片段、或具有与其互补的序列的核酸。

本发明的具体目的在于在哺乳动物中检测阿兹海默氏病的存在的方法，所述方法包含在允许互补序列之间杂交的条件下，将来自哺乳动物血样的核酸与探针组相接触，所述探针组包括含有下列每种靶核酸序列或其互补链的全部或部分的至少一种探针：SEQ ID NOS.:34、230、341、454、664、811、951、1127、1136和1752，以获得表达谱，所述表达谱对于哺乳动物中阿兹海默氏病的存在是特征性的。换句话说，探针组包含：

.包含SEQ ID NO:34或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO:230或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO:341或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO:454或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO:664或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO:811或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO:951或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO:1127或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO:1136或其互补链的全部或部分的至少一种探针；以及

.包含SEQ ID NO:1752或其互补链的全部或部分的至少一种探针。

在方法的优选实施方案中，除了上面指出的探针之外，探针组还包含含有下列每种其他靶核酸序列或其互补链的全部或部分的至少一种探针：SEQ ID NOS.:35、316、593、666、855、1330和1498。

因此，优选的靶核酸组至少包含含有序列SEQ ID NOS.:34、35、230、316、341、454、593、664、666、811、855、951、1127、1136、1330、1498和1752或其互补序列的核酸。正如在实施例中说明的，各种标志物组由本发明人在临床上进行了揭示和验证，允许在对象中确定阿兹海默氏病的存在。上面定义的栏15和16包含在本申请中描述并临床测试的所有显著的栏1-14所共有的一组标志物，因此构成了对于检测阿兹海默氏病来说特别有益和代表性的两个子集。

在特别优选方式中，探针组包含对于表2中定义的栏1至14之一的每个核酸、或对于其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的特征性片段、和/或对于其互补链来说特异的至少一种探针。

此外，正如将在下文中更详细解释的，有利的是使用包含对于每个核酸靶序列来说，几个、典型为1至3个部分交叠或不交叠的特异性探针的探针栏。此外，有利情况下，探针被固定化在支持物上。此外，一般通过计算机软件来分析表达谱。

本发明的另一个目的在于在哺乳动物中检测阿兹海默氏病的存在或发生阿兹海默氏病的风险，所述方法包含从来自哺乳动物的血样检测与例如前面定义的一栏探针互补的核酸的水平变化，其中变化是哺乳动物中存在阿兹海默氏病时所特有的。

本发明还能够定义其他栏，所述栏包含例如前面定义的至少某些标志物，其可以任选与其他标志物栏合。这样的栏可以通过在患者样品中测试这些标志物的存在或不存在来获得，以定义其他预测性栏合。

本发明还涉及使用例如前面定义的探针栏在体外或离体检测对象中阿兹海默氏病的存在。

本发明还涉及使用包括含有前面提到的一种或多种核酸序列靶的全部或部分的至少一种引物的引物栏，在体外或离体检测阿兹海默氏病。

本发明还涉及在哺乳动物中检测阿兹海默氏病的存在的方法，所述方法包含在允许扩增反应的条件下，将来自哺乳动物血样的核酸与一栏引物相接触，所述引物栏包括含有下列每种核酸序列或其互补链的全部或部分的至少一种引物：SEQ ID NOS.:34、230、341、454、664、811、951、1127、1136和1752，以获得谱或扩增产物，所述谱或扩增产物是哺乳动物中存在阿兹海默氏病时所特有的。

检测基因表达变化的方法

正如前面指出的，基因或RNA的变化是指（i）表达的任何变化，即表达水平（例如转录或翻译）的解调控，剪接的解调控，后者引起例如特定剪接形式的出现或各种剪接形式之间的（相对）量或关系的变化，以及（ii）产生的蛋白质结构的任何变化（截短、延长或突变形式的出现或消失等）。

用于检测样品中核酸物质的各种技术可用于本发明中，例如 northern印迹、选择性杂交、使用覆盖有寡核苷酸探针的支持物、核酸扩增例如RT-PCR、定量PCR或连接PCR等。这些方法可以包括使用能够选择性或特异性检测样品中的核酸靶的核酸探针（例如寡核苷酸）。可以按照本技术领域的专业人员已知的各种方法来执行扩增，例如PCR、LCR、转录介导的扩增（TMA）、链置换扩增（SDA）、NASBA、使用等位基因特异性寡核苷酸（ASO）、等位基因特异性扩增。检测也可以使用例如Southern印迹、单链构象分析（SSCA）、原位杂交（例如FISH）、凝胶迁移、异源双链体分析、下一代测序等来进行。如果需要，可以将检测到的核酸量与参比值、例如在未患阿兹海默氏病的患者中观察到的中位数或平均值，或者与在对照样品中平行测量到的值进行比较。因此能够证实表达水平的变化。

根据优选实施方案，方法包含通过选择性杂交或选择性扩增检测a）至c）的核酸的存在或不存在或（相对）量。

选择性杂交典型地使用核酸探针来进行，所述探针优选固定化在支持物、例如固相或半固相支持物上，支持物具有至少一个用于固定化核酸探针的平的或不平的表面。这样的支持物是例如载片、珠子、膜、滤纸、柱子、平板等。它们可以由任何相容的材料，例如特别是玻璃、二氧化硅、塑料、纤维、金属、聚合物等制成。核酸探针可以是任何核酸（DNA、RNA、PNA等），优选是单链的，包含例如上面a）至c）中定义的靶分子的特定序列。探针典型地包含5至400个碱基，优选8至200、更优选少于100、更优选少于75、60、50、40或甚至30个碱基。探针可以是在本发明的序列SEQ ID NO:1至1754（靶序列）的基础上，按照标准合成技术生产的合成寡核苷酸。这样的寡核苷酸典型地包含10至50个碱基，优选20至40个、例如约25个碱基。在特别有利的实施方案中，为了改进检测到的信号，在杂交过程中使用从同一靶序列定义的数种不同寡核苷酸（或探针）来检测同一靶分子（从患者RNA的扩增产物转录，以产生cRNA或cDNA）。这可以包括同一靶序列的各种不同区域或给定区域上中心位置不同的特定寡核苷酸。有利情况下，使用包含1-3个探针的探针栏，所述探针可以完全或部分交叠或不交叠，并且对同一靶分子特异。也可以使用探针对，其中一个成员与靶序列完全配对，而另一个存在错配，从而能够估算背景信号。探针可以被设计成与外显子或内含子区域，或与外显子-外显子、外显子-内含子或内含子-内含子接合区杂交。因此，探针能够揭示和辨别各种可选剪接同种型。

在优选实施方案中，使用其序列包含选自SEQ ID NOS.:1至1754的核酸序列或与其互补的序列的全部或部分的探针。在优选方式下，使用长度在15至50个碱基之间、更优选在15至40个碱基之间的核酸探针，并且其序列与选自SEQ ID NO:1至1754的序列或其互补序列的片段一致。探针也可以被设计在相反方向中。

在特别优选的实施方案中，使用探针栏，也就是说1-3个探针的栏，每个探针包含选自SEQ ID NOS.:1至1754或其互补链的同一核酸序列的交叠或不交叠的区段。

根据本技术领域的专业人员已知的方法，探针可以预先合成然后沉积在支持物上，或者直接原位合成在支持物上。探针也可以通过基因栏或分子技术例如通过扩增、重栏、连接等来制造。

由此定义的探针及其在对象中检测阿兹海默氏病的应用（主要在体外），构成了本申请的另一个目的。

杂交可以在本技术领域的专业人员已知并可由他们调整的标准条件下执行（参见Sambrook,Fritsch,Maniatis（1989）《分子克隆》（Molecular Cloning），Cold Spring Harbor Laboratory Press）。最引人注目的是，根据所需的灵敏度水平、可用的材料的量等，杂交可以在高、中或低严紧性条件下进行。例如，适合的杂交条件包括在55℃至63℃之间的温度下2小时至18小时。适合于高密度支持物的其他杂交条件是例如45℃至55℃之间的杂交温度。在杂交后，典型地可以在包含SDS的缓冲液、例如包含0.1X至10X SSC和0.5%至0.01%SDS的缓冲液中执行各种清洗，以除去未杂交分子。也可以使用含有SSPE、MES、NaCl或EDTA的其他清洗缓冲液。

在典型的实施方案中，将核酸（或阵列或支持物）在典型地含有100μg/ml鲑鱼精子DNA的杂交缓冲液（快速杂交缓冲液，Amersham）中，在65℃下预杂交30分钟。然后将样品的核酸在65℃下与探针接触（典型地施加到支持物或阵列上）2小时至18小时。优选情况下，将样品核酸用已知标记物（生物素、放射活性、酶、荧光、发光标记物等）事先标记。然后将支持物在65℃下在5X SSC、0.1%SDS缓冲液中清洗30分钟，然后在0.2X SSC、0.1%SDS缓冲液中清洗。按照标准技术、例如通过使用适合的仪器（例如InstantImager,Packard Instruments）测量支持物上的标记，来分析表达谱。自然地，本技术领域的专业人员可以通过例如修改杂交温度和/或缓冲液的盐浓度，以及通过添加辅助性物质例如甲酰胺或单链DNA，来调整杂交条件。

因此，本发明的具体目的在于在哺乳动物中检测阿兹海默氏病的存在或发生阿兹海默氏病的风险，或评估对抗阿兹海默氏病的治疗的响应的方法，所述方法包含在允许互补序列之间杂交的条件下，将来自哺乳动物血样的核酸与对前面鉴定到的靶分子特异的探针栏相接触以获得表达谱，所述表达谱对于哺乳动物中阿兹海默氏病的存在或发生阿兹海默氏病的风险或治疗的有效性来说，是特征性的。

因此，本发明的具体目的在于在哺乳动物中检测阿兹海默氏病的存在的方法，所述方法包含在允许互补序列之间杂交的条件下，将来自哺乳动物血样的核酸与对至少下列靶分子特异的探针栏相接触：

a）包含前面定义的栏1至14之一的序列或其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的特征性片段的核酸，和/或

b）具有与a）的序列互补的序列的核酸，和/或

c）a）或b）的核酸的功能类似物，

以获得表达谱，所述表达谱对于哺乳动物中阿兹海默氏病的存在是特征性的。

在具体实施方案中，除了其他靶分子和/或其他探针之外，本发明的方法使用尤其是本发明中提到的靶分子子集。

因此，本发明的另一个具体目的在于在哺乳动物中检测阿兹海默氏病的存在或发生阿兹海默氏病的风险的方法，所述方法包含在允许互补序列之间杂交的条件下，将来自哺乳动物血样的核酸与对选自下列靶的至少两种不同分子特异的探针栏相接触：

a）包含SEQ ID NOS.:1至1754中显示的序列或其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的特征性片段的核酸，和/或

b）具有与a）的序列互补的序列的核酸，和/或

c）a）或b）的核酸的功能类似物，

本发明的另一个具体目的是检测哺乳动物中阿兹海默氏病的存在的方法，所述方法包含在允许互补序列之间杂交的条件下，将来自哺乳动物血样的核酸与探针栏相接触，所述探针栏包括含有栏1-16之一的每个核酸序列或与其互补的序列的全部或部分的至少一种探针，以获得表达谱，所述表达谱对于哺乳动物中阿兹海默氏病的存在是特征性的。

正如在实验部分中进一步详细解释的，本发明的优选探针栏至少包含下列探针：

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:34 或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:230或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:341或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:454或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:664或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:811或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:951或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:1127或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:1136或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:1752或与其互补的序列的全部或部分。

正如前面指出的，术语“部分”在有利情况下是指15至50个连续核苷酸的区域。

应该理解，除了引述的10种探针或探针的栏（探针栏）之外，该探针栏还可以包含其他探针或探针栏，其包含例如选自SEQ ID NO:1至1754和/或其他序列的序列。

因此，本发明的另一个优选探针栏除了上面提到的探针之外，至少还包含下列其他探针：

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:35 或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:316或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:593或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:666或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:855或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:1330或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:1498或与其互补的序列的全部或部分.

栏1-14可以如上所述定义。构成这些栏的基本探针在实施例中给出。

本发明的另一个目的在于在哺乳动物中检测阿兹海默氏病的存在或发生阿兹海默氏病的风险的方法，所述方法包含从哺乳动物的血样检测与探针栏互补的核酸水平的变化，所述探针栏包含含有前面定义的栏之一的每种核酸序列的全部或部分的至少一种探针，所述变化对于哺乳动物中阿兹海默氏病的存在或发生阿兹海默氏病的风险来说是特征性的。

可以将表达谱与一个或多个基础谱、尤其是健康对象和/或患有阿兹海默氏病的对象特征性的基础谱进行比较，所述比较能够确定被测试患者患有阿兹海默氏病的可能性。典型情况下，比较利用本技术领域的专业人员已知的计算机软件来进行。

优选使用引物或引物对执行选择性扩增，以便当靶核酸存在时扩增出样品中靶核酸之一的全部或部分。引物可以对样品核酸中的靶序列、例如前面定义的SEQ ID NO:1至1754的靶序列或靶序列两侧的区域特异。典型情况下，引物包含单链核酸，有利情况下其长度在5至50个碱基之间，优选在5至30个碱基之间。这样的引物以及其在对象中检测阿兹海默氏病的应用（主要是体外应用），构成了本申请的另一个目的。引物可以被设计成与外显子或内含子区域，或与外显子-外显子、外显子-内含子或内含子-内含子接合区杂交。因此，引物揭示和辨别各种形式的基因剪接。

就此而言，本发明的另一个目的在于使用核苷酸引物或一栏核苷酸引物来扩增一个或优选几个包含SEQ ID NO:1至1754的靶序列的基因或RNA，以在哺乳动物中检测阿兹海默氏病的存在，或在哺乳动物、优选为人类中评估对抗阿兹海默氏病治疗的响应。

本发明的另一个具体目的在于在哺乳动物中检测阿兹海默氏病的存在的方法，所述方法包含在允许扩增的条件下，将来自哺乳动物血样的核酸与对选自下列靶的至少两种不同分子特异的引物栏相接触：

a）包含SEQ ID NOS.:1至1754显示的序列的核酸或其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的特征性片段，和/或

b）具有与a）的序列互补的序列的核酸，和/或

c）a）或b）的核酸的功能类似物，

以获得扩增谱，所述扩增谱对于哺乳动物中阿兹海默氏病的存在是特征性的。

多肽变化的检测

在另一个实施方案中，本发明包含测定由例如前面定义的基因编码的多肽的存在或（相对）量。样品中多肽的揭示或测定可以通过任何已知技术来进行，尤其是利用特异性配体例如抗体或抗体片段或衍生物的技术。优选情况下，配体是多肽的特异性抗体或这种抗体的片段（例如Fab、Fab'、CDR等），或这种抗体的衍生物（例如单链可变区片段抗体scFv）。配体典型地被固定化在支持物上，例如载片、珠子、柱子、平板等。样品中靶多肽的存在或量，可以通过例如使用标记的配体或使用第二种标记的指示配体等，通过揭示靶与配体的复合物来检测。可以使用并且众所周知的免疫技术是ELISA和RIA技术等。如果需要，可以将检测到的多肽的量与参比值、例如在未患阿兹海默氏病的患者中观察到的中位数或平均值，或与在对照样品中平行测量的值进行比较。因此，能够揭示表达水平的变化。

可以通过常规技术，尤其是通过用包含多肽（或其免疫原性片段）的免疫原免疫接种非人类动物并回收抗体（多克隆）或产生细胞（以生产单克隆抗体），来生产靶多肽的特异性抗体。用于多克隆或单克隆抗体、单链可变区片段抗体和人类或人源化抗体的生产技术，描述在例如Harlow等，《实验指南》（A Laboratory Manual），CSH Press,1988；Ward等，Nature 341（1989）544；Bird等，Science 242（1988）423；WO 94/02602；US 5,223,409；US 5,877,293和WO 93/01288中。免疫原可以通过合成或通过在适合的宿主中表达例如前面定义的核酸靶来生产。这样的单克隆或多克隆抗体及其具有相同抗原特异性的衍生物，以及其在检测阿兹海默氏病中的应用，也构成了本申请的目的。

蛋白质表达和/或结构的变化也可以利用本技术领域的专业人员已知的包含质谱术的技术来检测，所述技术更广义来说被归类在名称蛋白质栏分析之下，以便检测患有阿兹海默氏病的患者的血液中的特异性特征。

方法的实施

本发明的方法适用于来自被测试哺乳动物的任何生物样品，尤其是包含核酸或多肽的任何样品。具体实例包括血液、血浆、血小板、唾液、尿液、粪便等样品，更广义来说任何栏织、器官或有利情况下包含核酸或多肽的生物流体样品。

在一个优选和特别有利的实施方案中，样品是血液衍生物样品，例如血液、血清或血浆样品。事实上，本发明源于阿兹海默氏病的血液标志物的鉴定，因此能够不需栏织活检样品，而是仅仅从血样检测这种疾病。

样品可以通过任何已知技术获得，例如通过抽取、通过非侵入性技术或来自样品保藏中心或库等。此外，可以对样品进行预处理以便于接近靶分子，例如通过裂解（机械、化学、酶等）、纯化、离心、分离等。样品也可以被标记以便于确定靶分子（生物素、荧光、放射活性、发光、化学或酶标记等）的存在。此外，可以对样品的核酸进行分离、处理、富集、纯化、反转录、扩增、片段化等。在具体实施方案中，样品的核酸是RNA，尤其是样品的mRNA。在非常具体的实施方案中，核酸是RNA、尤其是mRNA的扩增产物，或从RNA、尤其是样品的mRNA制备的cDNA。

在优选实施方案中，生物样品是全血、即没有经历分离步骤的样品，其任选可以被稀释。

本发明适用于任何哺乳动物、优选为人类。本发明的方法对于人类中阿兹海默氏病的检测，尤其是阿兹海默氏病的存在或严重性或发展程度的检测特别有用。因此，实施例中提供的数据显示，本发明能够以高于70%的灵敏度和高于70%的特异性检测阿兹海默氏病的存在。事实上，已知在临床检查的基础上，在当前的健康患者诊断中的假阳性率约为15%至30%，并且在多次临床检查的基础上，在当前的AD患者诊断中的假阳性率是15%。决定性诊断只能在死后从脑的尸体剖检来建立。

本申请的具体目的涉及在人类对象中检测阿兹海默氏病的存在或演化的方法，所述方法包含栏合确定人类对象的生物样品中选自下列的靶分子的存在（或不存在或（相对）量）：

a）包含SEQ ID NOS.:1至1754显示的序列的核酸或其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的特征性片段，

b）具有与a）的序列互补的序列的核酸，和

c）a）或b）的核酸编码的多肽。

优选情况下，方法包含栏合确定5、10、20、30、40、50或60种或更多种例如上面定义的靶分子的存在、不存在或量。

本申请的另一个具体目的涉及在人类对象中检测阿兹海默氏病的存在或进展的方法，所述方法包含将来自对象的含有核酸的生物样品与包含支持物的产品相接触，所述支持物上固定化有包含与选自下列的一种或优选数种靶分子互补和/或对其特异的序列的核酸：（i）包含选自SEQ ID NO:1至1754的序列的核酸或其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的片段，以及（ii）具有与（i）的序列互补的序列的核酸，以获得表达谱，所述表达谱指示了所述人类对象中阿兹海默氏病的存在、严重性/发展程度或发生阿兹海默氏病的风险。优选情况下，产品包括含有与上面提到的至少5、10、20、30、40、50、60种或更多种不同基因或RNA互补和/或对其特异的序列的不同核酸。

本发明的另一个目的涉及包含支持物的产品，所述支持物上固定化有包含与选自下列的一种或优选数种靶分子互补和/或对其特异的序列的核酸：（i）包含选自SEQ ID NO:1至1754的序列的核酸或其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的片段，以及（ii）具有与（i）的序列互补的序列的核酸。优选情况下，产品包括含有与例如前面定义的至少5、10、20、30、40、50、60种或更多种基因或RNA互补和/或对其特异的序列的不同核酸。

本申请的另一个目的涉及包含支持物的产品，所述支持物上固定化有至少一种、优选数种核酸，所述核酸包含选自SEQ ID NO:1至1754的序列或其功能类似物。优选情况下，产品包含选自上面提到的核酸的至少5、10、20、30、40、50、60种或更多种各种不同核酸。

本发明的另一个具体目的涉及包含支持物的产品，所述支持物上固定化有探针栏，所述探针栏包括含有下列每种核酸序列或其互补链的全部或部分的至少一种探针：SEQ ID NOS.:34、230、341、454、664、811、951、1127、1136和1752。

本发明的另一个具体目的涉及包含支持物的产品，所述支持物上固定化有探针栏，所述探针栏包括含有下列每种核酸序列或其互补链的全部或部分的至少一种探针：SEQ ID NOS.:34、35、230、316、341、454、593、664、666、811、855、951、1127、1136、1330、1498和1752。

本发明的优选产品包含其上固定化有不同核酸的至少一个探针栏的支持物，所述核酸包含与表1中定义的栏1至14之一的核酸互补和/或对其特异的序列。

典型情况下，探针选自SEQ ID:1755-6532。

本发明还涉及包含区室或容器的试剂盒，所述区室或容器包含选自前面定义的核酸的至少5、10、20、30、40、50、60种或更多种的各种不同核酸。

本发明还涉及包含例如前面定义的产品和用于杂交反应的试剂的试剂盒。

本发明还涉及上面定义的产品或试剂盒的应用，用于在体外或离体检测对象中阿兹海默氏病的存在或对阿兹海默氏病治疗的响应。

本发明的另一个目的涉及包含支持物的产物，所述支持物上固定化有由例如上面定义的核酸靶编码的多肽的至少一种配体，所述核酸靶即包含选自SEQ ID NO:1至1754的序列的核酸，其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的特征性片段，具有与其互补的序列的核酸或其功能类似物。优选情况下，产品包含选自上面提到的多肽的各种不同多肽的至少5、10、20、30、40、50、60种或更多种配体。

支持物可以是任何固体或半固体支持物，其具有至少一个平的或不平的（即在两个或三个维度上）表面，允许核酸或多肽的固定化。这样的支持物是例如载片、珠子、膜、滤纸、柱子、平板等。它们可以由任何相容的材料，例如尤其是玻璃、二氧化硅、塑料、纤维、金属、聚合物、聚苯乙烯、特氟龙等制成。试剂可以通过已知技术固定化在支持物表面上，或者在核酸的情况下直接原位合成在支持物上。固定化技术包括被动吸附（Inouye等，J.Clin.Microbiol.28（1990）1469）和共价键合。技术描述在例如WO 90/03382和WO 99/46403中。固定化在支持物上的试剂可以预定次序放置以便于形成的复合物的检测和鉴定，并可以按照可变和可改变的密度放置。

在一个实施方案中，本发明的产品包含大量合成的寡核苷酸，其长度在5至100个碱基之间，并对例如前面定义的一种或多种基因或RNA特异。

本发明的产品典型地包含对照分子，其被用于结果的校准和/或标准化。

本申请的另一个目的涉及包含支持物的产品，所述支持物上固定化有包含选自SEQ ID NO:1755-6532的序列的全部或部分的核酸。这些序列代表了SEQ ID NO:1至1754的特异性探针。这样的产物在有利情况下能够掺入其特点不能辨别患有阿兹海默氏病的患者群体的所选核酸，这样的核酸被用作产品的标准化对照。这些核酸可以对应于选自SEQ ID NO:1755-6532的序列的全部或部分。

本申请的另一个目的涉及包含区室或容器的试剂盒，所述区室或容器包含与例如前面定义的一种或多种基因或RNA互补和/或对其特异的序列的至少一种、优选几种核酸，和/或例如前面定义的一种或多种多肽的一种、优选几种配体。优选情况下，产品包含选自上面提到的核酸和配体的至少5、10、20、30、40、50、60种或更多种的各种不同核酸和/或配体。在具体实施方案中，产品包含序列SEQ ID NO:1至1754的每种核酸或例如上面定义的每种多肽靶的配体。在另一个具体实施方案中，产品包含序列SEQ ID NO:1755-6532的每种核酸。试剂盒还可以包含用于杂交或免疫反应的试剂，以及如果需要的话，包含对照和/或说明书。

本发明的另一个目的涉及选自SEQ ID NO:1至1754的序列的核酸，或其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的特征性片段，或具有与其互补的序列的核酸或其功能类似物。本发明还涉及包含所述核酸的克隆或表达载体，以及包含一个这样的载体或核酸的任何重栏细胞。

本发明的另一个目的涉及包含选自SEQ ID NO:1至1754的序列的核酸，或其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的特征性片段，或具有与其互补的序列的核酸或其功能类似物的应用，用于在哺乳动物对象中检测（主要是体外检测）阿兹海默氏病。

根据本发明的实施方案的具体实例，从待测试的哺乳动物抽取血样。任选对血样进行处理，其方式使得核酸更容易接近，并对所述核酸进行标记。然后将核酸施加到例如前面定义的产品并测定表达谱，使得能够诊断对象中阿兹海默氏病的存在或不存在。本发明的方法简单，离体执行，并允许从血样早期检测阿兹海默氏病。

应该理解，在本申请的范围内可以使用任何等同的技术来确定靶分子的存在。

在考察下面的实施例后，本发明的其他特点和优点将变得明显，所述实施例必须被视为说明性而非限制性的。

图例说明

图1.GWSA微阵列上存在的探针的配置。A）B、F和T型的外显子探针和C、D和E型接合处探针最佳地覆盖剪接事件。B）能够覆盖任何单一外显子跳跃的探针也以相同配置存在。类似地，也存在外显子-外显子（X）、外显子-内含子（Z）和内含子-外显子（Y）接合处探针。

表格说明

表1.序列SEQ ID NO:1至6532的描述。

表2.栏1至14的每一个的探针栏的列表。

实施例1：阿兹海默氏病的生物标志物的鉴定

1.1.生物样品的特征

下面提出的实施例最初使用177个或177个中的100个血样来进行（2.5ml全血，获取在两个PaxGene管中）。这些样品覆盖根据DSM-IV标准被诊断为可能患有阿兹海默氏病的90位患者。这些患者平均年龄为78.08岁（标准偏差：6.67岁）。这些患者表现出低于27的MMSE（简易精神状态检查）分值（平均分值17.16；标准偏差为6.04）。此外，还召集了87位年龄与AD患者相当，在临床检查后宣布没有痴呆的对象（平均年龄69.71岁，标准偏差6.53岁；平均MMSE为29.31，标准偏差为0.97）。

1.2.从血样提取总RNA

将血样直接收集在PAXGene^TM Blood RNA管（PreAnalytix,Hombrechtikon,CH）中。在血样抽取步骤后，为了获得完全的细胞裂解，将管在室温放置4小时，然后储存在-20℃或-80℃，直至进行生物材料的提取。更准确来说，在这种流程中，使用PAXGene Blood 试剂盒（PreAnalytix）按照制造商的推荐提取总RNA。简单来说，将管离心（10min，3,000g）以便获得核酸沉淀物。将该沉淀物清洗，并转移到含有蛋白质消化所需的蛋白酶K的缓冲液中（在55℃下10min）。执行另一次离心（3min，14,000g）以除去细胞碎片，并加入乙醇以便优化结合核酸的条件。总RNA特异性结合在PAXgene RNA离心柱上，在将其洗脱之前，使用无RNAse的DNAse套装（Qiagen,Hilden，德国）消化污染的DNA。提取到的总RNA的质量和数量，使用Agilent 2100 Bioanalyser以及RNA 6000 NanoChip试剂盒（Agilent Technologies,Santa Clara,CA），通过执行电泳图谱来评估。只有满足质量标准的样品被用于进一步分析。

1.3.全基因栏SpliceArray^TM（GWSA）

通过微阵列检测和定量转录本的详尽表达，需要使用特定的探针配置。任何参比信使RNA/剪接变体对都可以作为长同种型/短同种型进行建模（图1A）。因此，与外显子跳跃相关的剪接变体与参比变体相比将是短同种型。包含新外显子或保留内含子的剪接变体与参比变体相比将是长同种型。其他可选剪接事件（使用5'或3'隐蔽剪接位点）也可以相同方式建模。

测量剪接变体的表达所需的探针栏也显示在图1A中。该探针栏由三种传统的外显子探针F、T和B以及三种外显子-外显子或外显子-内含子接合处探针C、D和E构成。探针F和T测量两种同种型的表达，探针B、C和D测量长同种型的表达，探针E测量短同种型的表达。

为了设计所有这些探针，需要鉴定对应于人类基因的剪接事件，然后“靶向”将从其设计探针的区域。对应于接合处探针C、D和E的靶序列由30个核苷酸的长度确定，在接合处的每侧各15个核苷酸。因此，能够通过25个核苷酸的探针，例如11/14,12/13或13/12（斜线（/）表示接合区）“覆盖”任何接合处。

GWSA芯片是能够通过考虑剪接变体的存在，彻底提供人类基因栏表达的完全覆盖率的微阵列。选择了20,649个人类基因然后对其进行分析，以鉴定已知的剪接事件和相关可能性。这些基因中的90%以上能够与这样的事件相关联。从约140,000个鉴定到的剪接事件设计了如上所述的探针。此外，使用特异性针对对应于单外显子跳跃的剪接事件的探针，也能预测这类事件的存在（图1B）。此外，掺入覆盖每个基因的每个外显子-外显子、外显子-内含子和内含子-外显子区的接合处探针，也能表征影响外显子的5’和3’末端的剪接事件（图1B）。通过靶序列设计了三种不同探针，并将其合并成探针栏。各个探针的表达值被合并计算成探针栏值。有时，如果靶序列上的限制过度约束，探针栏将只含2个或甚至1个探针。GWSA是在分辨率为5微米的Affymetrix 平台上建立的个人设计的微阵列。GWSA通过符合MAQC标准（微阵列质量控制；Shi等，Nat Biotechnol.2006;24（9）:1151-61）的质量控制。

1.4.RNA扩增

使用50ng总RNA作为使用WT-Ovation^TM Pico RNA扩增系统试剂盒（NuGen,San Carlos,CA）进行靶合成的基质。然后使用FL-Ovation^TM cDNA生物素模块（NuGen,San Carlos,CA）来执行扩增的5μg cDNA的片段化以及生物素标记。按照制造商的说明书执行各种不同步骤。每个扩增/片段化/标记系列含有来自AD患者和对照的相等数量的样品。

提取的互补DNA的质量和数量，使用Agilent 2100 Bioanalyser以及NanoChip RNA 6000试剂盒（Agilent Technologies,Santa Clara,CA），通过执行电泳图谱来评估。

1.5.在GWSA芯片上的杂交

将5μg扩增并用生物素标记的cDNA用于杂交。将由Affymetrix（Affymetrix,Santa Clara,CA）推荐的标准方法应用于靶与GWSA微阵列的杂交。然后对DNA芯片进行清洗，并按照Affymetrix的推荐揭示特异性杂交。使用

30007G扫描仪检测杂交信号。

1.6.数据检索和标准化

然后将在扫描芯片后获得的.CEL文件输入到Partek Genomic Suites^TM（Partek Incorporated,St.Louis,MI）中，用于随着寡核苷酸探针中GC栏成的变化调整背景信号，通过RMA校正背景信号，进行阵列的分位数归一化，以及为探针栏中的每个寡核苷酸（1455607PS）进行测量到的表达值的合并。

然后将数据进行过滤，对于探针栏的表达值来说，阈值表达水平被设为6.2（log 2标度），同时基于表达值在整个探针栏（361299PS）上的分布频率，对于变差来说，阈值被设定在0.3（299577PS）。

实施例2.特征的选择

将鉴别性特征的训练栏用于使用二元分类算法和5或10倍交叉验证的监督聚类分析（Partek Genomic Suites^TM）。执行非参数检验（1-因素ANOVA）来分析通过探针栏获得的表达值，并将其用作过滤工具来选择整合在特征中的变量。然后将通过训练栏优化的分类模型应用于测试栏，以鉴定特征的性能，即特异性（对照患者正确分类的%）和灵敏度（AD患者正确分类的%）。

对模型进行测试，并在所有训练栏上评估每种模型的性能。选择了具有最高性能平均数的14个特征，用于辨别患有阿兹海默氏病的患者和无痴呆症的对照患者。构成这些栏1-14的标志物的列表提供在表2中。这些栏在第一次研究中的性能概述在下表中：

实施例3.表达谱从血样辨别对照患者与患有阿兹海默氏病（AD）的患者的证实

使用GWSA微阵列，对代表约21,000个基因的全人类转录栏的表达进行分析，并在AD和无痴呆症对照（NDT）患者之间进行比较。在实施例2中提到的所有分析揭示出一栏1754个相关靶序列（参见表1，SEQ ID NOS.:1-1754）。

然后，本发明人研究了与这些1754个序列的子集相关的探针栏的同时表达，以获得阿兹海默氏病的特异性表达谱。

在没有参加该特征的定义并在盲研究中召集的个体的测试栏（验证栏）上，对这些特征的性能进行评估。性能值描述在实施例2中。

在基因水平上的特征分析揭示，对于所有14个栏来说，有10个基因是共同的。相应基因的列表提供在下面（栏15）。

登记ID	符号	描述
			10308	ZNF267	锌指蛋白267
1462	CSPG2	硫酸软骨素蛋白聚糖2（versican）
			22832	KIAA1009	kiaa1009
2591	GALNT3	udp-n-乙酰-α-d-半乳糖胺
			3717	JAK2	janus激酶2（蛋白质酪氨酸激酶）
51086	TNNI3K	tnni3相互作用激酶
			54851	ANKRD49	锚定蛋白重复结构域49
597	BCL2A1	bcl2相关蛋白a1
			6093	ROCK1	rho结合性含螺旋卷曲的蛋白激酶1
9976	CLEC2B	c型凝集素结构域家族2，成员b

因此，用于检测阿兹海默氏病的所有探针的优选实例包括：

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:34或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO: 1136或与其互补的序列的全部或部分；以及

实施例4.表达谱从血样辨别对照患者与患有阿兹海默氏病（AD）的患者的证实

在基因水平上的特征分析能够选择出显示最佳性能的5个栏共同的17个标志物。这17个标志物的名单（其包括实施例3的10个标志物）提供在下面（栏16）。

17PS ADvsC	SEQ ID
		10308.001.2-T	34
10308.006.1-F	35
		1462.002.1-B	230
2123.001.1-T	316
		22832.016.1-B	341
2591.003.1-T	454
		3146.000.2-X	593
3717.000.10-X	664
		3717.000.23-X	666
51086.001.1-B	811
		51426.010.1-B	855
54851.003.1-F	951
		597.000.1-Z	1127
6093.031.1-B	1136
		6672.027.1-T	1330
830.000.5-Z	1498
		9976.003.1-F	1752

因此，用于检测阿兹海默氏病的所有探针的另一个优选实例包括：

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:35或与其互补的序列的全部或部分；

-交叠或不交叠的1至3个探针，其每个包含序列SEQ ID NO:1498或与其互补的序列的全部或部分；以及

实施例5.检测流程

诊断测试的步骤如下：

首先从收集在Paxgene管中的血样提取RNA。这些管含有强变性添加剂，其通过降低RNA的体外分解并最小化基因诱导，使体内核酸稳定。当与Paxgene^TM Blood RNA试剂盒一起使用时，获取的样品能够精确检测和定量基因转录的水平。在提取后，通过本技术领域公知的程序，对样品质量进行评估并对RNA定量。

将RNA反转录、线性扩增，然后片段化，用生物素标记，最后在含有本发明的探针的生物芯片上杂交。然后将芯片清洗，对杂交进行显示，然后对它们进行扫描，以测量每个探针上的杂交水平。使用Partek统计分析软件输出杂交结果并对其进行分析。

特征的应用给出了二元应答，其能够将被测试的患者置于AD类别或对照类别中。

Claims

1.一种用于在哺乳动物中检测阿兹海默氏病的存在的方法，所述方法包含在允许互补序列之间杂交的条件下，将来自哺乳动物血样的核酸与一组探针相接触以获得表达谱，所述表达谱对于哺乳动物中阿兹海默氏病的存在是特征性的，所述探针组包括：

.包含SEQ ID NO：34或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：230或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：341或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：454或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：664或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：811或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：951或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：1127或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：1136或其互补链的全部或部分的至少一种探针；以及

.包含SEQ ID NO：1752或其互补链的全部或部分的至少一种探针，

并且上述的部分包含参比序列的至少15个连续的核苷酸。

2.权利要求1的方法，其中探针组还包括：

.包含SEQ ID NO：35或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：316或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：593或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：666或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：855或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：1330或其互补链的全部或部分的至少一种探针；以及

.包含SEQ ID NO：1498或其互补链的全部或部分的至少一种探针。

3.权利要求1或2的方法，其中探针组包括对表2中限定的栏1至14之一，或其具有至少15、优选至少16、17、18、19、20、25或30个连续碱基的特征性片段和/或其互补链的每个核酸特异的至少一种探针。

4.前述权利要求任一项的方法，其中探针组包括对于每个靶核酸来说，一组1至3个部分交叠或不交叠的特异性探针。

5.前述权利要求任一项的方法，其中探针被固定化在支持物上。

6.前述权利要求任一项的方法，其中表达谱通过计算机软件方法来分析。

7.前述权利要求任一项的方法，其中样品是全血样品。

8.一种产品，其包含支持物，支持物上固定化有探针组，所述探针组包括：

.包含SEQ ID NO：34或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：230或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：341或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：454或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：664或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：811或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：951或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

.包含SEQ ID NO：1752或其互补链的全部或部分的至少一种探针；

上述的部分包含参比序列的至少15个连续的核苷酸。

9.一种产品，其包含支持物，支持物上固定化有至少两种不同的核酸探针，每种探针包括与选自SEQ ID NOS.：1-1754的靶核酸或其互补链互补和/或对其特异的序列。

10.权利要求9的产品，其包含支持物，支持物上固定化有至少一组不同的核酸探针，所述核酸探针包含与表2中限定的栏1至14任一个的核酸互补和/或对其特异的序列。

11.权利要求9的产品，其包含支持物，支持物上固定化有与栏10的170种核酸或其互补链中的每种互补和/或对其特异的探针。

12.权利要求9的产品，其包含支持物，支持物上固定化有与栏12的150种核酸或其互补链中的每种互补和/或对其特异的探针。

13.权利要求9的产品，其包含支持物，支持物上固定化有与栏13的120种核酸或其互补链中的每种互补和/或对其特异的探针。

14.权利要求9的产品，其包含支持物，支持物上固定化有与栏14的250种核酸或其互补链中的每种互补和/或对其特异的探针。

15.权利要求9至14任一项的产品，其中探针选自SEQ ID NOS.：1755-6532。

16.一种试剂盒，其包含区室或容器，所述区室或容器包含选自权利要求1至15任一项中限定的核酸的至少5、10、20、30、40、50、60种或更多种不同的核酸。

17.一种试剂盒，其包含权利要求8至15任一项的产品和用于杂交反应的试剂。

18.权利要求8至17任一项的产品或试剂盒在体外或离体检测对象中阿兹海默氏病的存在或对阿兹海默氏病治疗的响应中的应用。

19.权利要求1至5任一项中限定的探针组在体外或离体检测对象中阿兹海默氏病的存在中的应用。

20.一种用于在哺乳动物中检测阿兹海默氏病的存在的方法，所述方法包含在允许扩增反应的条件下，将来自所述哺乳动物血样的核酸与一组引物相接触，所述引物组包括含有下列靶核酸序列或其互补链中每个的全部或部分的引物：SEQ ID NOS.：34、230、341、454、664、811、951、1127、1136和1752，以获得扩增谱或产物，所述扩增谱或产物对于所述哺乳动物中阿兹海默氏病的存在是特征性的。

21.包含权利要求20中提到的每个靶核酸序列的全部或部分的引物的一组引物在体外或离体检测阿兹海默氏病中的应用。