CN102596231B - 嵌合因子ⅶ分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及嵌合因子VII多肽及所述嵌合因子VII多肽的使用方法。

Description

嵌合因子Ⅶ分子
优先权声明
根据美国法典第35章第119条(e)款，本申请要求2009年6月25日提交的美国临时申请序号61/220,278的权益，其全部内容通过引用结合到本文中。
政府资助声明
本发明在国立卫生研究院授予的补助号为5-P01-HL06350的政府资助下完成。美国政府在本发明中具有某些权利。
发明领域
本发明涉及嵌合人凝血因子VII(FVII)多肽以及编码这类多肽的多核苷酸构建体、包含并表达所述多核苷酸的载体和宿主细胞、药物组合物、治疗用途和方法，所述嵌合人凝血因子VII多肽与目前可得到的因子VII多肽相比具有较大的促凝剂活性和较少的血栓形成并发症。
发明背景
凝血是由不同的血液组分(或因子)的复杂相互作用构成的过程，其最终产生纤维蛋白凝块。通常，参与称为凝结“级联”的血液组分为酶学上无活性的蛋白质(酶原或原酶)，所述蛋白质通过激活剂(其本身为经激活的凝血因子)的作用转化为蛋白水解酶。已经历这种转变的凝血因子通常称为“活性因子”，并通过将字母“a”加至凝血因子的名称上来命名(例如，经激活的因子VII被命名为因子VIIa或FVIIa)。
正常情况下，止血过程的启动由组织因子和因子VIIa之间复合体的形成介导。然后，该复合体将因子IX(FIX)和X(FX)转化为其活性形式。在含组织因子的细胞上，因子Xa(FXa)将有限量的凝血酶原转化为凝血酶。凝血酶将血小板和因子V(FV)及VIII(FVIII)激活成因子Va(FVa)和VIIIa(FVIIIa)，两种辅因子在进一步的过程中引致全面的凝血酶爆发。该过程包括通过因子IXa(FIXa)(在与因子VIIIa的复合体中)生成因子Xa并在经激活的血小板表面上进行。最后，凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，导致纤维蛋白凝块形成。近几年，已发现因子VII和组织因子是凝血的主要起始因子。
因子VII是血浆糖蛋白，其作为单链酶原在血液中循环。酶原具有边际催化活性。在体外，因子Xa、因子XIIa、因子IXa、因子VIIa或凝血酶可将单链因子VII转化为双链因子VIIa。因子Xa被认为是因子VII的主要生理激活剂。与止血中包含的数种其它血浆蛋白质类似，因子VII的活性依赖于维生素K，在蛋白质氨基末端附近聚簇的多个谷氨酸残基的γ羧化需要维生素K。金属离子引起的因子VII和磷脂的相互作用需要这些经γ羧化的谷氨酸。酶原因子VII向激活的双链分子的转变通过切割内部Arg152-Ile153肽键发生。另外，众所周知，高浓度的因子VII导致体外自体活化。在组织因子、磷脂和钙离子的存在下，双链因子VIIa通过有限的蛋白酶解快速激活因子X或因子IX。
编码人FVII(hFVII)的基因映射到染色体13的q34-qter9处(deGrouchy等人，HumGenet1984；66：230-233)。其包含九个外显子并且跨越12.8Kb(O′Hara等人，ProcNatlAcadSciUSA1987；84：5158-5162)。FVII的基因组织和蛋白质结构类似于其它维生素K依赖性促凝血蛋白质，其中外显子1a和1b编码信号序列；外显子2编码前肽和GLA结构域；外显子3a编码短的疏水区；外显子4和5编码表皮生长因子样结构域；以及外显子6-8编码丝氨酸蛋白酶催化结构域(Yoshitake等人，Biochemistry1985；24：3736-3750)。
因子IX(克里斯马斯因子)是在正常止血中有活性的丝氨酸蛋白酶的酶原，酶促活性需要特定谷氨酸残基的羧化。因子IX、X、VII和蛋白质C是紧密相关的相同丝氨酸蛋白酶家族的种内同源基因，具有高度的氨基酸序列同一性以及编码这些蛋白质的基因的内含子-外显子排列。这些紧密相关的蛋白质从氨基末端到羧基末端具有类似的功能结构域结构，包括γ-羧基谷氨酸(GLA)结构域、两个表皮生长因子样(EGF)结构域、激活肽和催化结构域。S蛋白为666个氨基酸的维生素K依赖性蛋白质，具有GLA结构域、4个EGF样结构域、凝血酶敏感区和2个层粘连蛋白结构域。
维生素K依赖性凝结血浆蛋白质包含作为蛋白质附着至膜的位点起作用的GLA结构域，GLA结构域在不同的凝结蛋白质(coagulationprotein)之间高度保守。尽管它们具有相似性，但GLA结构域对磷脂表现出广泛的亲和力，其中S蛋白的GLA结构域对磷脂具有最高的亲和力。(Ellison等人，Biochemistry，1998；37：7997-8003)，(McDonald等人，Biochemistry1997；36：5120-27)。
常需要刺激或改善受试者中的凝结级联。因子VIIa已用来控制出血障碍，所述出血障碍具有数种成因例如凝血因子缺乏(例如，血友病A和B或凝血因子XI或VII缺乏)或存在凝血因子抑制剂。因子VIIa也已用来控制具有正常发挥作用的凝血级联(无凝血因子缺乏或针对任何凝血因子的抑制剂)的受试者内发生的过度出血。这种出血可例如由血小板功能缺陷、血小板减少或冯维勒布兰德病(vonWillebrand′sdisease)所导致。
出血还是与手术和其它形式的创伤有关的主要问题。例如，因子VII已广泛用于治疗在伊拉克和阿富汗中受伤的士兵。(PerkinsJG等人.TheJournalofTrauma.2007；62：1095-9；讨论9-101)。其使用已证实挽救了许多生命，但是就像大多数医学治疗一样，存在副作用，例如中风或其它治疗后的血栓形成事件。但是，使用FVIIa的医师的总体印象是，其使用所挽救的生命比所失去的生命要多很多。也许对此最好的说明是，在以前的战争中，大约30％的伤者死于他们的损伤，而在当前的海湾战争中的死亡数目已减少至约10％。(GawandeA，等人，NEnglJMed.2004；351：2471-5)。
表达因子VIIa的转基因血友病B小鼠的研究证实，因子VIIa的连续低水平表达(低于1.5μg/ml)修复血友病B小鼠中的凝血活性。但是，野生型或血友病B小鼠中高于2μg/ml的因子VIIa的水平导致心脏和肺中形成血栓；心脏和肺均为高组织因子表达位点。这表明，当接触在心脏和肺中于血管损伤时暴露的组织因子时，循环中高水平的因子VIIa引起血栓形成。(Margaritas等人，J.Clin.Invest.2004；113：1025-31)。此外，研究显示，血友病狗中载体介导的犬因子VIIa的基因转移在短期和中期既安全又有效。(Margaritas等人，GeneTherapy2009；113：3682-3689)。
目前对正在寻求监管部门批准的制品提出了与因子VII治疗有关的警告。例如，欧洲药品管理局人类药品评估单位(EuropeanMedicinesAgency，HumanMedicinesEvaluationUnit)劝告，目前的因子VII疗法带有患血栓形成和弥散性血管内凝血的风险的警告，尤其是在将因子VII给予有冠心病或肝脏疾病历史的患者、手术后的患者、新生儿以及处于来自血栓形成和弥漫性血管内凝血的风险中的那些患者时。见，例如，CoreSPCforHumanPlasmaDerivedCoagulationFactorVIIProducts(用于从人血浆获得的凝血因子VII制品的核心SPC)(CPMP/BPWG/2048/01)，2004年7月。
在此之前已显示，因子VIIa的EGF-1结构域在因子VIIa对组织因子的亲和力方面发挥关键的作用。在组织因子存在和不存在两种情况下使用合成底物和因子X两者，带有因子IX的EGF-1结构域的因子VIIa多肽具有比野生型因子VIIa低的催化活性。(Jin等人，Biochemistry，1999，28：1185-92)。乍看起来，这似乎无须使用嵌合体构建体来治疗出血；但是，Monroe(BritishJournalofHaematology1997；99：542-549)提出，FVIIa在治疗血友病和出血中的机制不依赖于组织因子。但是，本领域中对因子VIIa是否独立于组织因子而为非活性的的观点有分歧。
人重组FVIIa的商业制剂以NovoSeven和NovoSevenRT出售。NovoSeven和NovoSevenRT适用于治疗血友病A或B患者中的出血事件，并且是市面上可获得的治疗出血事件的唯一的rFVIIa。最近，已证实NovoSeven可与再水化冻干血小板结合，它们可以联合给予以使因子VII定位到损伤位点。(Fischer等人，Platelets，2008；19：182-91)。另外，据显示，因子VII的选择性聚乙二醇化可增加血浆半衰期(Stennicke等人，Thromb.Haemost，2008；100：920-28)，以及具有3个氨基酸取代的重组人因子VII在血小板表面上的活性增加。(Moss等人，J.Thromb.Haemost.，2009；7：299-305)。本发明嵌合因子VIIa分子的聚乙二醇化预期以类似方式运作，从而增加血浆半衰期。同样，在本发明嵌合因子VIIa分子中，本领域中已知的其它蛋白质修饰(例如非多肽部分的共价连接以形成缀合物(例如糖基化))预期以类似方式发挥作用，即，由非多肽部分的共价连接赋予蛋白质的性质预期赋予嵌合因子VIIa分子。
存在对可以以相对低的剂量给予的具有高促凝剂活性的因子VIIa变体的需要，以及存在对产生较少与可用的治疗有关的不良副作用(例如血栓形成并发症)的变体的需要。
发明概述
本申请公开了提供一种或多种所需益处的嵌合FVIIa分子，特别是包含hFVIIa结构域和来自凝血系统(coagulationsystem)的一种或多种蛋白质的结构域的嵌合hFVIIa分子。因此，与市售rFVIIa相比，本发明的嵌合FVIIa分子具有一种或多种改善的性质，包括具有较高的促凝剂活性和/或能够以相对低的剂量给予和/或产生较少的血栓形成并发症。因此，使用本发明嵌合体的医疗提供优于目前可得的rFVIIa化合物的优点，例如潜在较低的剂量和/或较少的不良副作用。
本发明代表性的嵌合FVIIa多肽包括这样的嵌合FVIIa，其包含FVII的EGF-2和催化结构域及维生素K依赖性凝结蛋白质的GLA结构域以及维生素K依赖性凝结蛋白质的EGF-1结构域。在本发明特定的实施方案中，本发明的嵌合FVIIa多肽包括1)以下嵌合FVIIa，其包含FIX的GLA和EGF-1结构域及FVII的EGF-2和催化结构域；2)以下嵌合FVIIa，其包含FIX的EGF-1结构域和FVII的GLA、EGF-2和催化结构域；3)以下嵌合FVIIa，其包含S蛋白的GLA结构域、FIX的EGF-1结构域和FVII的EGF-2和催化结构域；4)以下嵌合FVIIa，其包含S蛋白的GLA和EGF-1结构域及FVII的EGF-2和催化结构域；5)以下嵌合FVIIa，其包含S蛋白的EGF-1结构域及FVII的GLA、EGF-2和催化结构域；以及6)以下嵌合FVIIA，其包含S蛋白的EGF-1结构域、FIX的GLA结构域以及FVII的EGF-2和催化结构域。本发明的代表性嵌合FVIIa多肽还可包括野生型FVIIa或任意上述嵌合FVIIa多肽，其在EGF-1结构域或GLA结构域中具有氨基酸取代。所述取代可以是保守取代或非保守取代。这类取代可包括EGF-1结构域的残基69处的异亮氨酸被丙氨酸取代和/或残基79处的精氨酸被丙氨酸取代。其它的取代可包括精氨酸在残基5处取代赖氨酸，这导致GLA结构域对IV型胶原具有较高的结合亲和力，但是似乎并不影响血小板结合(Gui等人，J.ThrombHaemost.2009；7：1843-1851)；另一氨基酸、优选为保守氨基酸取代、更优选为丙氨酸在残基306处取代甲硫氨酸，这进一步减少对组织因子的亲和力；以及，天冬氨酸在残基158处取代缬氨酸、缬氨酸在296处取代谷氨酸和/或谷氨酰胺在残基298处取代甲硫氨酸，这导致因子VIIa具有较高的比活。
还提供通过给予一种或多种本文描述的嵌合FVIIa多肽治疗患出血障碍的受试者中的出血障碍的方法。治疗出血障碍的方法可包括将核酸分子给予受试者的方法，所述核酸分子包含编码本发明嵌合因子VIIa多肽的核苷酸序列。
另外，本发明提供通过给予包含GLA结构域的蛋白质治疗患出血障碍的受试者中的出血障碍的方法，其中相对于该蛋白质在受试者血浆循环中的浓度，该蛋白质靶向和/或集中在凝块部位附近。这可包括利用以比目前可得的因子VII多肽大的亲和力与血小板结合的结构域，所述血小板存在于凝块形成部位处或附近。这类结构域的实例为不同凝结蛋白质的GLA结构域，其与位于血小板表面的带负电荷的磷脂层结合。这类GLA结构域的非限制性实例包括FIX的GLA结构域和S蛋白的GLA结构域，所述FIX的GLA结构域比FVIIa的GLA结构域更紧得多地结合血小板和磷脂(Melton等人.“LocationoftheplateletbindingsiteinzymogencoagulationfactorIX(酶原凝血因子IX中血小板结合位点的位置)”BloodCoagulFibrinolysis12：237-243(2001))，所述S蛋白的GLA结构域比任意其它已知的GLA结构域更紧地结合磷脂((McDonald等人.“ComparisonofnaturallyoccurringvitaminK-dependentproteins：correlationofaminoacidsequencesandmembranebindingpropertiessuggestsamembranecontactsite(天然存在的维生素K依赖性蛋白质的比较：氨基酸序列和膜结合性质的相关性表明膜接触位点)”Biochemistry：36：5120-5127(1997)))。包含GLA结构域的蛋白质的非限制性实例包括：包含FIX或S蛋白的GLA结构域的重组蛋白质、包含FIX或S蛋白的GLA结构域的嵌合蛋白质和/或包含FIX或S蛋白的GLA结构域的本发明的嵌合FVIIa多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供通过给予本发明嵌合因子VIIa多肽治疗患出血障碍的受试者的方法，所述本发明嵌合因子VIIa多肽包含从因子VII多肽获得的催化结构域和一个或多个血小板靶向结构域。这类血小板靶向结构域包括来自与血小板表面相互作用或结合的蛋白质的结构域。这种与血小板表面的相互作用或结合可通过血小板的膜磷脂或通过血小板细胞表面蛋白质和/或受体来介导。这类结构域的非限制性实例包括冯维勒布兰德因子(vonWillebrandFactor)的A1结构域，其为血小板糖蛋白Ib的主要结合位点(Emsley等人，JBC，273：10396-10401(1998))；和与血小板膜蛋白质和/受体结合的抗体(例如与血小板膜磷脂结合的抗体)的Fab片段(结构域)(Out等人，Blood，77：2655-2659(1991))。
这类利用以下结构域将凝结蛋白质靶向至凝块部位具有降低与目前因子VII疗法有关的并发症例如血栓形成性(thrombogenicity)的风险的额外但意想不到的益处，所述结构域与血小板结合并具有对组织因子降低的亲和力。这种方法还可用来将其它治疗上有用的多肽或其它分子靶向到血小板或凝块部位。这类治疗上有用的分子可包括抗凝剂等。
本发明还提供通过给予受试者多肽来治疗患出血障碍的受试者中的出血障碍的方法，所述多肽具有与因子VII的血栓形成性相比减少的血栓形成性(例如，与天然因子VII的血栓形成性相比减少至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％等)。“减少的血栓形成性”可以根据本领域已知的方法以多种方式来确定，包括但不限于：与对照相比较，确定减少的凝块数目、较小的凝块、凝块出现所需要的时间较长(体内或体外试验中)、较少的由于血栓形成而导致的受试者死亡和/或生存时间延长。与因子VII相比血栓形成性减少的多肽，可例如为本发明的嵌合因子VII多肽或其活性片段。这类多肽的非限制性实例包括以下嵌合FVIIa，其包含FIX的GLA和EGF-1结构域及FVII的EGF-2和催化结构域；以及以下嵌合FVIIa，其包含S蛋白的GLA结构域、FIX的EGF-1结构域和FVII的EGF-2和催化结构域。
附图简述
图1显示了可用于本发明中的嵌合FVIIa分子的图示。FVII：因子VII；FIX：因子IX
图2显示了对于不同的野生型因子VIIa浓度，在基于细胞的血友病模型系统中正常情况和血友病情况(移除因子IX和因子VIII)下的凝血酶生成(nM)。
图3显示了给予50nM野生型因子VIIa或10nM嵌合因子VIIa时，在基于细胞的血友病模型系统中正常情况和血友病情况(移除因子IX和因子VIII)下的凝血酶生成(nM)。
图4显示了相对于对照值的峰值凝血酶，所述凝血酶在给予50nM野生型VIIa或10nM嵌合因子VIIa后在基于细胞的血友病模型系统中产生。
图5显示了凝固试验中无处理的血友病B小鼠、给予2mg/kgNovoSeven的血友病B小鼠、给予2mg/kg嵌合FVIIa分子的血友病B小鼠和无处理的野生型小鼠的中断止血时间(disruptionhemostasistime)。
图6显示了本发明示例性嵌合因子VII的序列，其包含因子IX的信号、前肽、GLA和EGF1结构域(带下划线的)(SEQIDNO：1)。
图7显示了本发明示例性嵌合因子VII的序列，其包含因子IX的信号、前肽和EGF1结构域(带下划线的)，以及S蛋白的GLA结构域(粗体)(SEQIDNO：2)。
发明描述
现在将在下面更充分地描述本发明。但是，本发明可以以不同的形式表达，并且不应解释为受限于本文给出的实施方案。相反，提供这些实施方案使得本公开内容全面而完整，并将本发明的范围充分地传递给本领域的技术人员。
本文中，本发明的说明书中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明。如本发明说明书和所附权利要求所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“该”也意图包括复数形式，除非上下文另有明确地指出。
除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。还将理解的是，术语例如在常用字典中定义的那些术语，应理解为具有与其在本申请和相关技术的内容中的含义一致的含义，并且不应在理想化或过于正式的意义上进行理解，除非本文明确地定义。本文中，本发明的说明书中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体结合到本文中。
同样如本文所使用，“和/或”是指和包括一个或多个相关列出项的任意和所有可能的组合，以及当以或者(“或”)理解时是指不存在组合。
除非上下文另有说明，否则特别地意图的是，本文描述的发明的不同特征可以以任意组合使用。
此外，本发明还考虑，在本发明的一些实施方案中，可排除或省略本文给出的任意特征或特征的组合。为了说明起见，如果说明书指出复合体包含组分A、B和C，则特别意图的是，可省略和单独或以任意组合放弃A、B或C中的任一个或其组合。
如本文所使用，过渡性短语“基本上由…组成”(以及语法上的变体)应理解为包含列举的材料或步骤，以及不会实质上影响要求保护的发明的基本和新的特征的那些材料或步骤。参见InreHerz，537F.2d549，551-52，190U.S.P.Q.461，463(CCPA1976)(原文中的强调)；亦参见MPEP§2111.03。因此，如本文所使用的术语“基本上由…组成”不应理解为与“包含”等同。
如本文所使用，当指可计量的值例如量或浓度等时，术语“约”意指包括指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。
如本文所使用，术语“活性”意指因子VII多肽将其底物因子X转化成活性因子Xa的能力。
术语“固有活性”也包括在组织因子存在时在经激活的血小板表面上生成凝血酶的能力。
术语“N末端GLA结构域”包括氨基酸序列SEQIDNO：18的约氨基酸残基61至约氨基酸残基105的氨基酸序列、氨基酸序列SEQIDNO：19的约氨基酸残基47至约氨基酸残基92的氨基酸序列、经鉴定的氨基酸序列的任何翻译后修饰、经鉴定的氨基酸序列中任何保守的氨基酸取代、向经鉴定的氨基酸序列添加氨基酸残基、自经鉴定的氨基酸序列缺失氨基酸残基或来自与磷脂膜结合的凝结级联蛋白质的任何其它氨基酸序列。
术语“EGF-1”描述包含六个半胱氨酸的30-40个氨基酸的区，其最初在EGF(表皮生长因子)发现，还在参与细胞信号传导的多种蛋白以及在凝结蛋白质中发现，其中几乎所有已知的EGF样结构域都包含二硫键1-3、2-4和5-6。因子VII的EGF-1结构域为SEQIDNO：18氨基酸序列的约氨基酸残基106至约氨基酸残基142。因子IX的EGF-1结构域为SEQIDNO：19氨基酸序列的约氨基酸残基93至约氨基酸残基129。S蛋白的EGF-1结构域为SEQIDNO：20氨基酸序列的约氨基酸残基117至约氨基酸残基155。这些氨基酸序列可包含任何对经鉴定的氨基酸序列的翻译后修饰、经鉴定的氨基酸序列中的任何保守氨基酸取代、向经鉴定的氨基酸序列的任何氨基酸残基添加和/或自经鉴定的氨基酸序列的任何氨基酸残基缺失。
术语“EGF-2”意指(两个或更多个EGF样结构域)串联中的第二个EGF样结构域。因子VII的EGF-2结构域为氨基酸序列SEQIDNO：18的约氨基酸残基147至约氨基酸残基188。因子IX的EGF-2结构域为氨基酸序列SEQIDNO：19的约氨基酸残基130至约氨基酸残基171。S蛋白的EGF-2结构域为氨基酸序列SEQIDNO：20的约氨基酸残基157至约氨基酸残基200。这些氨基酸序列可包含任何对经鉴定的氨基酸序列的翻译后修饰、经鉴定的氨基酸序列中的任何保守氨基酸取代、向经鉴定的氨基酸序列的任何氨基酸残基添加和/或自经鉴定的氨基酸序列的任何氨基酸残基缺失。
如本文所用，术语“催化结构域”意指介导肽键切割的蛋白质中的结构域。因子VII的催化结构域为氨基酸序列SEQIDNO：18的约氨基酸残基213至约氨基酸残基452。因子IX的催化结构域为氨基酸序列SEQIDNO：19的约氨基酸残基227至约氨基酸残基459。这些氨基酸序列可包含任何对经鉴定的氨基酸序列的翻译后修饰、经鉴定的氨基酸序列中的任何保守氨基酸取代、向经鉴定的氨基酸序列的任何氨基酸残基添加和/或自经鉴定的氨基酸序列的任何氨基酸残基缺失。
三个字母表示“GLA”意指4-羧基谷氨酸(γ-羧化谷氨酸)。
术语“蛋白酶结构域”意指介导肽键切割的蛋白质中的结构域，通常认为是SEQIDNO：18的约氨基酸残基213至羧基末端的氨基酸残基(因子VIIa的重链)。如本文所使用，术语“因子VII多肽”是指包含天然人因子VII(SEQIDNO：18)的氨基酸序列61-466的任何蛋白质或其变体或片段。这包括但不限于人因子VII、人因子VIIa及其变体。如本文所使用，术语“因子VII”意图包括无活性的一条链的酶原因子VII分子和激活的双链因子VII分子(因子VIIa)。这包括具有天然人因子VII或因子VIIa的氨基酸序列61-466(SEQIDNO：18)的蛋白质。本领域的技术人员意识到，可预期微小的序列变化以类似的方式进行，以及在不背离本发明的情况下，涉及的结构域、多肽和因子VII可稍微缩短或延长，或包含取代。因此，该定义还包括具有稍经修饰的氨基酸序列例如经修饰的N末端(包括N末端氨基酸缺失或添加)的蛋白质和肽，使得在一些实施方案中，那些蛋白质基本上保留因子VIIa的活性(例如，保留天然因子VIIa活性的约50％、60％、70％、80％、90％、95％等)。如本文所使用，术语“因子VIIa”或“FVIIa”意指由激活形式(因子VIIa)构成的产物。上述定义内的“因子VII”或“因子VIIa”还包括可在个体之间存在或发生的天然等位基因变化。此外，糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可根据所选的宿主细胞、组织或表达动物物种和宿主细胞或组织环境的性质而变化。
如本文所使用，术语“结构域”意图包括蛋白质序列和结构的一部分，其可独立于蛋白链的其余部分进化、发挥作用和存在。结构域能够形成紧凑的三维结构并常可为独立地稳定和折叠的。一个结构域可以以多种进化相关蛋白质出现。结构域的长度在约25个氨基酸至多达约500个氨基酸之间变化。“结构域”还可包括来自野生型蛋白质的结构域，其具有经由保守取代置换的一个或多个氨基酸残基。因为它们在蛋白质环境中自稳定，所以结构域可通过蛋白质之间的遗传工程来“交换”，以产生嵌合蛋白质。
如本文所使用，术语“变体”意指具有天然人因子VII或因子VIIa的氨基酸序列61-466(SEQIDNO：18)的因子VII，其中亲本蛋白质的一个或多个氨基酸已被另一氨基酸取代，和/或其中亲本蛋白质的一个或多个氨基酸已被缺失，和/或其中一个或多个氨基酸已插入蛋白质中，和/或其中一个或多个氨基酸已添加到亲本蛋白质，和/或其中GLA结构域已被来自不同蛋白质的GLA结构域(例如，结合到血小板膜或磷脂膜上的GLA结构域)取代，和/或其中GLA结构域已被来自不同蛋白质的血小板结合结构域(例如，冯维勒布兰德因子的A1结构域，其为血小板糖蛋白Ib的主要结合位点(Emsley等人，JBC，273：10396-10401(1998))；和与血小板膜蛋白和/或受体结合的抗体(例如与血小板膜磷脂结合的抗体)的Fab片段(结构域)(Out等人，Blood，77：2655-2659(1991)))取代，和/或其中因子VII的EGF-1结构域已被来自不同蛋白质的EGF-1结构域(例如，以较低的亲和力与组织因子结合的EGF-1结构域，例如因子IX的EGF-1结构域)取代。这类添加可发生在亲本蛋白质的N末端或C末端或两者，以及在内部发生。因此，在一些实施方案中，本发明的“变体”仍可以以其激活形式具有FVII的凝血活性。在一些实施方案中，本发明的变体可不具有凝血活性。
因此，在一些实施方案中，变体与天然人因子VII或因子VIIa的氨基酸序列61-466(SEQIDNO：18)具有至少40％、50％、60％或70％的同一性。例如，FVII的EGF-1结构域与FIX的EGF-1结构域具有65.7％同一性，FVII的GLA结构域与FIX的GLA结构域具有58.6％同一性和与S蛋白的GLA结构域具有51％同一性。在一个实施方案中，变体与天然人因子VII或因子VIIa的氨基酸序列61-466(SEQIDNO：18)具有至少80％同一性。在另一个实施方案中，变体与天然人因子VII或因子VIIa的氨基酸序列61-466(SEQIDNO：18)具有至少90％同一性。在又一个实施方案中，变体与天然人因子VII或因子VIIa的氨基酸序列61-466(SEQIDNO：18)具有至少95％同一性。
如本文所使用，术语“任何其它氨基酸”意指与天然存在于该位置的氨基酸不同的一个氨基酸。这包括但不限于可由多核苷酸编码的氨基酸。优选地，不同的氨基酸呈天然的L形式并可由多核苷酸编码。特定的实例为L-半胱氨酸(Cys)。
如本文所使用，术语“可操作地连接”是指两个或更多个核苷酸序列通过酶促连接或者以其它方式相对于彼此呈使得可发挥序列的正常功能的构型的共价连接。例如，将编码前序列或分泌前导序列的核苷酸序列与编码多肽的核苷酸序列可操作地连接，如果其表达为参与多肽分泌的前蛋白：将启动子或增强子与编码序列可操作地连接，如果其影响目标序列的转录；将核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，如果将其定位以促进翻译成目标蛋白质或肽。通常，“可操作地连接”意指连接的核苷酸序列是连续的，在分泌前导序列情况下是连续的并呈阅读相。连接最容易通过在适宜限制性位点处的连接来完成。如果不存在这种位点，那么与标准的重组DNA方法联用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
如本文所使用，术语“载体”意指能够在宿主细胞中扩增的任何核酸实体。因此，载体可为自主复制型载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒。或者，载体可为这样的载体：当引入宿主细胞时，其整合到宿主细胞基因组中并随其所整合到的染色体一起复制。载体的选择常取决于其将被引入的宿主细胞。载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒或粘粒载体。载体通常包含复制原点和至少一个选择基因，即编码以下产物的基因，所述产物容易检测或者其存在对于细胞生长是必要的。
如本文所使用，术语“宿主细胞”表示可表达异源DNA的任何细胞，包括杂交细胞。典型的宿主细胞包括但不限于昆虫细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞包括人细胞，例如BHK、CHO、HEK和COS细胞。在实施本发明时，培养的宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为确立哺乳动物细胞系，包括但不限于CHO(例如，ATCCCCL61)、COS-1(例如，ATCCCRL1650)、幼仓鼠肾(BHK)和HEK293(例如，ATCCCRL1573；Graham等人，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)细胞系。合适的BHK细胞系为tk-ts13BHK细胞系(Waechter和Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：1106-1110，1982)，以下称为BHK570细胞。BHK570细胞系可从AmericanTypeCultureCollection(美国典型培养物保藏所)，10801University，Boulevard，Manassas，Va.20110获得，ATCC登记号为CRL10314。tk-ts13BHK细胞系也可从ATCC获得，登记号为CRL1632。其它合适的细胞系包括但不限于RatHepI(大鼠肝癌；ATCCCRL1600)、RatHepII(大鼠肝癌；ATCCCRL1548)、TCMK(ATCCCCL139)、人肺(ATCCHB8065)、NCTC1469(ATCCCCL9.1)和DUKX细胞(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220，1980)。同样有用的有3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其它细胞的融合物。
如本文所使用，术语“合适的生长培养基”意指包含细胞生长和编码本发明因子VII多肽的核酸序列表达所需的营养和其它组分的培养基。
术语“缀合物”(或可互换地，“缀合多肽”)意指通过一个或多个多肽与一个或多个非多肽部分的共价连接形成的异源(在复合或嵌合的意义上)分子，所述非多肽部分为例如聚合物分子、亲脂化合物、糖部分或有机衍生剂。优选地，缀合物在相关浓度和条件下可溶，即，可溶于生理流体例如血液中。本发明缀合多肽的实例包括经糖基化和/或聚乙二醇化多肽。
术语“共价连接”意指多肽和非多肽部分彼此直接共价连接，或通过一个或多个间插部分彼此间接共价连接，所述间插部分为例如一个或多个桥、间隔基或连接部分。可使用术语“非缀合多肽”来指缀合物的多肽部分。
当在本文中使用时，术语“非多肽部分”意指能够与本发明多肽的连接基团缀合的分子。这类分子的合适实例包括聚合物分子、糖部分、亲脂化合物或有机衍生剂。当在本发明缀合物的上下文中使用时，将理解的是，非多肽部分通过多肽的连接基团连接到缀合物的多肽部分。如上面所解释，非多肽部分可直接共价连接到连接基团，或可通过一个或多个间插部分间接共价连接到连接基团，所述间插部分为例如一个或多个桥、间隔基或连接部分。
“聚合物分子”为通过两个或更多个单体的共价连接形成的分子，其中没有单体是氨基酸残基，除了在聚合物为人白蛋白或另一丰富的血浆蛋白质时。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换使用。该术语意图包括通过体外糖基化连接的糖类分子，体外糖基化即，体外进行的通常包括将糖类分子与多肽的连接基团共价连接的合成糖基化，其任选使用交联剂。
通过体内糖基化例如N-或O-糖基化(如下面进一步所描述)连接的糖类分子在本文中被称为“糖部分”。除了明确指出缀合物中非多肽部分例如聚合物分子或糖部分的数目时以外，每次对包含于缀合物中或者以其它方式用在本发明中的“非多肽部分”的提及应指提及一个或多个非多肽部分，例如聚合物分子或糖部分。
术语“连接基团”意指多肽的官能团，特别是其氨基酸残基或糖类部分的官能团，其能够连接非多肽部分例如聚合物分子、亲脂分子、糖部分或有机衍生剂。
对于体内N-糖基化，术语“连接基团”以非传统方式使用，是指构成N-糖基化位点(序列为N-X-S/T/C，其中X为除脯氨酸外的任意氨基酸残基，N为天冬酰胺以及S/T/C为丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸，优选为丝氨酸或苏氨酸，以及最优选为苏氨酸)的氨基酸残基。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺残基为糖部分在糖基化过程中与之连接的残基，但是，除非存在N-糖基化位点的其它氨基酸残基，否则这种连接不能实现。
因此，当非多肽部分为糖部分以及缀合将通过N-糖基化来实现时，如与目标多肽的氨基酸序列变化有关地使用的术语“包含用于非多肽部分的连接基团的氨基酸残基”应理解为如下的含义：构成N-糖基化位点的一个或多个氨基酸残基将以使得功能性N-糖基化位点引入氨基酸序列中或从所述序列中移除的这样的方式改变。
在本文中，术语“处理”或“治疗”意在包括控制和/或预防预期出血例如在手术中，以及调节已发生的出血，例如在创伤中或在按需治疗血友病患者中，其目的在于抑制或最小化出血。因此术语“治疗”包括本发明因子VIIa多肽的预防给予。
术语“出血事件”意在包括失控的和过度的出血。出血事件可为与手术和其它形式的组织损伤有关的主要问题。失控的和过度的出血可发生在具有正常凝血系统的受试者中以及患有凝血或出血障碍的受试者中。
如本文所使用，术语“出血障碍”反映出血中表现出的细胞、生理或分子起源的任何先天性、获得性或诱导性缺陷。实例为凝血因子缺乏(例如，血友病A和B或凝血因子XI或VII缺乏)、凝血因子抑制剂、血小板功能缺陷、血小板减少、冯维勒布兰德病或由手术或创伤引起的出血。
过度出血还发生在具有正常发挥作用的凝血级联(无凝血因子缺乏或针对任何凝血因子的抑制剂)的受试者中以及可由血小板功能缺陷、血小板减少或冯维勒布兰德病引起。在这些情况中，出血可比作由血友病导致的那些出血，因为如在血友病中，止血系统缺乏必要的凝固“化合物”(例如血小板或冯维勒布兰德因子蛋白质)或具有异常的必要的凝固“化合物”，导致大出血。在经历与手术或创伤有关的大量组织损伤的受试者中，正常的止血机制可被立即止血的需求压倒，并且尽管具有正常的止血机制，但他们可能形成出血。当出血发生在手术止血的可能性有限的器官例如脑、内耳区域和眼时，获得满意的止血也是问题。相同的问题可在对不同的器官(肝、肺、肿瘤组织、胃肠道)进行活组织检查的过程中和在腹腔镜手术中出现。对所有这些情况相同的是难以通过手术技术(缝线、夹紧等)提供止血，当出血是弥漫性的时(出血性胃炎和血崩)也是这种情况。急性和大出血还可发生在进行抗凝疗法的受试者中，在所述受试者中，缺陷性止血由给予的疗法引起。这种受试者在不得不快速抵消抗凝效果情形中可能需要手术介入。耻骨后前列腺根治切除术是常对患有局限性前列腺癌的受试者进行的程序。该手术常因显著失血和有时大量失血而复杂化。前列腺切除术过程中大量失血主要与具有许多密集的血管化部位的复杂解剖情况相关，所述部位对于手术止血来说不容易接近，并且可导致大面积的弥漫性出血。同样，脑内出血是中风最不可治疗的形式并与高死亡率和脑内出血后最初几个小时内的血肿生长相关。用rFVIIa进行治疗可限制血肿的生长、减少死亡率并改善在90天时的功能性结果。但是，使用目前可获得的rFVIIa有发生血栓栓塞性不利事件的风险。具有较低血栓形成性的本发明嵌合因子VII分子，可克服中风疗法中的此问题。在不满意止血的情况中可导致问题的另一情形是给予具有正常止血机制的受试者抗凝疗法以防止血栓栓塞性疾病时。这类疗法可包括肝素、其它形式的蛋白聚糖、华法林或其它形式的维生素K拮抗剂以及阿司匹林和其它血小板聚集抑制剂。
在本发明的一个实施方案中，出血与血友病相关。在另一个实施方案中，出血与具有获得性抑制剂的血友病相关。在另一个实施方案中，出血与血小板减少相关。在另一个实施方案中，出血与冯维勒布兰德病相关。在另一个实施方案中，出血与严重的组织损伤相关。在另一个实施方案中，出血与严重创伤相关。在另一个实施方案中，出血与手术相关。在另一个实施方案中，出血与腹腔镜手术相关。在另一个实施方案中，出血与出血性胃炎相关。在另一个实施方案中，出血与血崩相关。在另一个实施方案中，出血发生在机械止血的可能性有限的器官中。在另一个实施方案中，出血发生在脑、内耳区域或眼中。在另一个实施方案中，出血与进行活组织检查的过程相关。在另一个实施方案中，出血与抗凝疗法相关。
如本文所使用，术语“受试者”意指任何动物，特别是哺乳动物例如人，以及适当时可与术语“患者”互换使用。
术语“正常止血系统的增强”意指提高产生凝血酶或产生功能性凝块的能力。
术语“基因疗法”是指通过基因的外源给予改变内源基因的表达的方法。如本文所使用，“基因疗法”还指编码缺陷蛋白质的缺陷基因的置换，或缺失基因的置换，其通过将对应于缺陷或缺失基因的功能性基因引入有需要的个体的体细胞或干细胞中来进行。基因疗法可通过离体方法完成，其中将分化的干细胞或体干细胞从个体机体中移除，接着利用病毒载体作为基因递送载体将缺陷基因的正常拷贝引入外植的细胞中。另外，体内直接基因转移技术允许利用大范围的病毒载体、脂质体、蛋白质DNA复合体或裸DNA将基因原位转移入个体的细胞中，以达到治疗结果。术语“基因疗法”还指通过引入多核苷酸至有需要的个体的体细胞或干细胞中来置换编码缺陷蛋白质的缺陷基因，所述多核苷酸基本上与缺陷基因或蛋白质在其非缺陷时应发挥的作用一样地发挥作用。
在本发明中，在给予受试者核酸分子的情形中使用基因疗法，所述核酸分子包含编码本发明嵌合FVII的核苷酸序列。因此，本发明提供分离的核酸分子，其包含编码本发明嵌合FVII蛋白质的核苷酸序列。这类核酸分子可存在于核酸构建体(例如，载体或质粒)中。这类核酸构建体可存在于细胞中。本文还提供将本发明嵌合FVII蛋白质递送至细胞的方法，包括将包含编码嵌合FVII蛋白质的核苷酸序列的核酸分子在表达核苷酸的条件下引入细胞中，以在细胞中产生嵌合FVII蛋白质。细胞可为引入受试者内的细胞和/或细胞可为已存在于受试者内的细胞。
嵌合因子VII的制备
本文描述的嵌合因子VII多肽可通过重组核酸技术产生。一般来说，将克隆的野生型因子VII核酸序列修饰以编码所需蛋白质。然后将该经修饰的序列插入表达载体中，接着将该载体转化或转染到宿主细胞内。高等真核细胞特别是培养的哺乳动物细胞适合作为宿主细胞。已知人因子VII的完整核苷酸和氨基酸序列(见美国专利第4,784,950号，在此描述了重组人因子VII的克隆和表达；以及GenBank登记号J02933和AAA51983，和SwissProt登记号P08709-1)，本文将该氨基酸序列作为SEQIDNO：18提供。牛因子VII序列描述于Takeya等人，J.Biol.Chem.263：14868-14872(1988)中。已知因子IX的完整核苷酸和氨基酸序列(见Davie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A1982；79：6461-6464；Jaye等人，NucleicAcidsRes.1983；11：2325-2335；和McGraw等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1985；82：2847-2851以及GenBank登记号J00136和AAA98726及SwissProt登记号P00740)，本文将该氨基酸序列作为SEQIDNO：19提供；S蛋白的完整核苷酸和氨基酸序列亦是如此(见Hoskins等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1987；84：349-353以及GenBank登记号M15036和AAA36479及SwissProt登记号P07225)，本文将该氨基酸序列作为SEQIDNO：20提供。还已知其它凝结蛋白质的完整核苷酸和氨基酸序列，并可利用SwissProt或在NCBI网页处查看。
氨基酸序列改变可通过多种技术完成。核酸序列的修饰可通过位点特异性诱变来进行。位点特异性诱变技术是本领域熟知的并描述于例如Zoller和Smith(DNA3：479-488，1984)或“Splicingbyextensionoverlap(通过延伸重叠的剪接)”，Horton等人，Gene77，1989，第61-68页中。因此，利用因子VII的核苷酸和氨基酸序列，可引入选择的改变。类似地，本领域技术人员熟知使用利用特定引物的聚合酶链反应制备DNA构建体的程序(见，PCRProtocols，1990，AcademicPress，SanDiego，Calif.，USA)。另外，本发明嵌合因子VII多肽可通过将独特限制性位点引入编码不同多肽的核苷酸序列中来制备，其可用于分离编码不同多肽的完整结构域的核苷酸序列的片段。随后，可重组这些不同的核苷酸序列以产生不同的本发明的嵌合因子VII多肽。
例如，可将独特限制性位点引入编码不同的凝结蛋白质的核苷酸序列中，使得GLA、EGF-1、EGF-2和催化结构域可在不同的凝结蛋白质之间自由地互换。EGF-1结构域可围绕EGF-2结构域自由地旋转(Pike等人.ProcNatl.Acad.Sci.1999；96：8925-8930)，而当钙存在时，GLA和EGF-1结构域不可围绕彼此自由地旋转(Sunnerhagen等人.NatureStructuralBiology1995；2：504-509)。在此实施方案中，GLA和EGF-1结构域可来自相同的凝结蛋白质，但来自与EGF-2和催化结构域不同的蛋白质。因此，假如一个结构域的至少50％为因子VII的结构域，那么本发明嵌合因子VIIa多肽可包含来自任何凝结蛋白质的结构域。此外，本发明嵌合因子VIIa多肽可包含来自相同蛋白质或来自不同蛋白质的GLA和EGF-1结构域。
编码本发明嵌合因子VII多肽的核酸构建体可适合地为基因组或cDNA来源的构建体，其例如通过制备基因组或cDNA文库和筛选编码不同多肽的全部或部分的DNA序列来获得，所述筛选按照标准技术通过利用合成寡核苷酸探针的杂交来进行(见，Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，第二版.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.，1989)。
编码嵌合因子VII多肽的核酸构建体还可通过已建立的标准方法合成制备，所述标准方法为例如Beaucage和Caruthers，TetrahedronLetters22(1981)，1859-1869中描述的亚磷酰胺(phosphoamidite)方法，或Matthes等人，EMBOJournal3(1984)，801-805中描述的方法。根据亚磷酰胺方法，将寡核苷酸例如在自动DNA合成仪中合成、纯化、退火、连接并克隆入合适的载体中。
此外，核酸构建体可为合成和基因组混合来源的、合成和cDNA混合来源的或基因组和cDNA混合来源的构建体，其依照标准技术，通过连接合成来源、基因组来源或cDNA来源(根据合适的情况)的片段，即与完整核酸构建体的各部分对应的片段来制备。
用于产生本发明嵌合因子VII多肽的DNA序列将通常在因子VII的氨基末端编码前多肽原(pre-propolypeptide)，以获得合适的翻译后加工(例如，谷氨酸残基的γ羧化)以及从宿主细胞中分泌。前多肽原可为因子VII或另一种维生素K依赖性血浆蛋白质(例如因子IX、因子X、凝血酶原、蛋白质C或S蛋白)的前多肽原。本领域技术人员将意识到，可在嵌合因子VII多肽氨基酸序列的以下地方进行其它修饰：其中那些修饰不会显著地损害蛋白质充当促凝剂的能力。
用于表达因子VIIa变体的表达载体包含能够引导克隆的基因或cDNA转录的启动子。适用于培养的哺乳动物细胞中的启动子包括病毒启动子和细胞启动子。病毒启动子包括SV40启动子(Subramani等人，Mol.Cell.Biol.1：854-864，1981)和CMV启动子(Boshart等人，Cell41：521-530，1985)。尤其合适的病毒启动子为来自腺病毒2的主要晚期启动子(Kaufman和Sharp，Mol.Cell.Biol.2：1304-1319，1982)。另一尤其优选的启动子为中国仓鼠延伸因子-1-α(CHEF1)启动子。细胞启动予包括鼠κ基因启动子(Bergman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：7041-7045，1983)和鼠VH启动子(Loh等人，Cell33：85-93，1983)。尤其合适的细胞启动子为鼠金属硫蛋白-I启动子(Palmiter等人，Science222：809-814，1983)。表达载体还可包含一组位于启动子下游和用于嵌合因子VII序列本身的插入位点上游的RNA剪接位点。合适的RNA剪接位点可从腺病毒和/或免疫球蛋白基因中获取。包含于表达载体中的还有位于插入位点下游的多腺苷酸化信号。尤其合适的多腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期多腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp)、来自腺病毒5的Elb区的多腺苷酸化信号、人生长激素基因终止子(DeNoto等人Nucl.AcidsRes.9：3719-3730，1981)或来自人因子VII基因或牛因子VII基因的多腺苷酸化信号。表达载体还可包含位于启动子和RNA剪接位点之间的非编码病毒前导序列，例如腺病毒2三联前导序列；以及增强子序列，例如SV40增强子。
通过例如磷酸钙介导的转染(Wigler等人，Cell14：725-732，1978；Corsaro和Pearson，SomaticCellGenetics7：603-616，1981；Graham和VanderEb，Virology52d：456-467，1973)或电穿孔(Neumann等人，EMBOJ.1：841-845，1982)将克隆的DNA序列引入培养的哺乳动物细胞内。为鉴定和选择表达外源DNA的细胞，通常将赋予选择性表型(选择性标记)的基因与目标基因或cDNA一起引入细胞内。合适的选择性标记包括赋予药物抗性的基因，所述药物为例如新霉素、潮霉素和甲氨蝶呤。选择性标记可为可扩增的选择性标记。合适的可扩增的选择性标记为二氢叶酸还原酶(DHFR)序列。另一合适的选择性标记为组氨醇。Thilly(MammalianCellTechnology，ButterworthPublishers，Stoneham，Mass.，通过引用结合到本文中)对选择性标记进行了综述。本领域技术人员能够容易地挑选合适的选择性标记。
可将选择性标记在单独的质粒上与目标基因同时引入细胞内，或它们可在相同的质粒上引入细胞内。如果在相同的质粒上，选择性标记和目标基因可处于不同启动子或相同启动子的控制下，后者的安排产生双顺反子信息。这种类型的构建体在本领域已知(例如，Levinson和Simonsen的美国专利第4,713,339号)。将称为“载体DNA”的其它DNA加入到引入细胞的混合物中也可为有利的。
在细胞摄取DNA后，使细胞在合适的生长培养基中生长通常1-2天以开始表达目标基因。用于培养细胞的培养基可为任何适合生长宿主细胞的常规培养基，例如包含合适补充物的最小或复合培养基。合适的培养基可从商业供应商获得或可根据公布的配方制备(例如，在美国典型培养物保藏所的目录中)。培养基利用本领域已知的程序制备(见，例如，关于细菌和酵母的文献；Bennett，J.W.和LaSure，L.，编者，MoreGeneManipulationsinFungi(真菌中更多的基因操作)，AcademicPress，CA，1991)。生长培养基通常包含碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖类、维生素、盐、磷脂、蛋白质和生长因子。为产生γ羧化的嵌合因子VII多肽，培养基将含有维生素K，其浓度优选为约0.1ng/ml至约20μg/ml。然后施加药物选择以针对细胞生长进行选择，所述细胞以稳定方式表达选择性标记。对于已用可扩增的选择性标记转染的细胞，可增加药品浓度以针对克隆序列的拷贝数增加进行选择，从而增加表达水平。然后筛选表达所需嵌合因子VII多肽的稳定转染细胞的克隆。
合适的哺乳动物细胞系包括CHO(ATCCCCL61)、COS-1(ATCCCRL1650)、幼仓鼠肾(BHK)和293(ATCCCRL1573；Graham等人，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)细胞系。合适的BHK细胞系为tk-ts13BHK细胞系(Waechter和Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：1106-1110，1982)，下文将其称为BHK570细胞。BHK570细胞系可从美国典型培养物保藏所，12301ParklawnDr.，Manassas，Va.20852获得，其ATCC登记号为CRL10314。tk-ts13BHK细胞系还可从ATCC以登记号CRL1632获得。另外，可使用许多其它细胞系，包括RatHepI(大鼠肝癌；ATCCCRL1600)、RatHepII(大鼠肝癌；ATCCCRL1548)、TCMK(ATCCCCL139)、人肺(ATCCHB8065)、NCTC1469(ATCCCCL9.1)和DUKX细胞(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220，1980)。
本发明嵌合因子VII多肽可经缀合以延长多肽的体内半衰期。这种缀合可降低肾清除率并增加存在于体内的因子VII的量，同时降低嵌合因子VII多肽的给予频率。制备缀合的因子VII多肽的合适缀合物和方法在美国专利第7,442,524号中描述，该专利通过引用以其整体结合到本文中。
转基因动物
转基因动物技术可用于产生本发明嵌合因子VII多肽。优选在雌性哺乳动物宿主的乳腺内产生蛋白质。乳腺中的表达和目标蛋白质随后分泌到乳汁中克服了在分离来自其它来源的蛋白质中遇到的许多困难。乳汁容易收集、可大量地获得并在生物化学上良好地表征。此外，主要的乳蛋白质以高浓度(通常约1-15g/l)存在于乳汁中。本发明嵌合因子VII多肽还可产生于宿主动物的尿中，这比产生于乳汁中更为有利，因为雄性和雌性动物两者都会产生尿，并且对于分离目的，尿中的蛋白质少于乳汁中的蛋白质。
从商业观点来看，当考虑使用乳汁作为本发明嵌合因子VII多肽的来源时，清楚的是，优选使用具有大的乳产量的物种作为宿主。尽管可使用较小的动物例如小鼠和大鼠(并且优选在证实原理阶段)，但优选使用家畜哺乳动物，包括但不限于猪、山羊、绵羊和牛。由于这类因子在此物种中的转基因既往史、乳产量、成本和用于收集绵羊乳汁的设备的随时可用性，绵羊尤其合适(见，例如，PCT公布号WO88/00239关于影响宿主物种的选择的因素的对比)。通常理想的是，选择已培育用于乳制品用途的宿主动物品种例如EastFriesland棉羊，或通过在日后培育转基因系来引入奶畜。在任何情况下，都应使用健康状况良好的已知动物。
为获得在乳腺中的表达，使用来自乳蛋白质基因的转录启动子。乳蛋白质基因包括编码酪蛋白(见美国专利第5,304,489号)、β-乳球蛋白、a-乳清蛋白和乳清酸性蛋白的那些基因。β-乳球蛋白(BLG)启动子是合适的。在绵羊β-乳球蛋白基因的情况中，通常使用基因的至少5′侧翼序列近端406bp的区域，但较大部分的5′侧翼序列(高达约5kbp)是合适的，例如包含β-乳球蛋白基因5′侧翼启动子和非编码部分的约4.25kbpDNA区段(见Whitelaw等人，Biochem.J.286：31-39(1992))。来自其它物种的类似的启动子DNA片段也是合适的。
为获得在尿中的表达，使用尿路上皮特异性启动子。例如，可使用驱动尿空斑蛋白(uroplakin)相关基因的表达的启动子(见，例如美国专利第6,001,646号，该专利通过引用以其整体结合到本文中)。
β-乳球蛋白基因的其它区域也可纳入构建体中，待表达的基因的基因组区域亦可如此。本领域通常认可的是，缺少内含子的构建体，例如与包含这类DNA序列的那些构建体相比表达差(见Brinster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：836-840(1988)；Palmiter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：478-482(1991)；Whitelaw等人，TransgenicRes.1：3-13(1991)；PCT公布号WO89/01343；以及PCT公布号WO91/02318，每一个均通过引用结合到本文中)。在这点上，通常优选(当可能时)使用包含编码目标蛋白质或多肽的基因的全部或一些天然内含子的基因组序列，因此优选进一步包含来自例如β-乳球蛋白基因的至少一些内含子。一种这类区域为来自绵羊β-乳球蛋白基因的3′非编码区的提供内含子剪接和RNA多腺苷酸化的DNA区段。当取代基因的天然3′非编码序列时，该绵羊β-乳球蛋白区段可既增强又稳定目标蛋白质或多肽的表达水平。在其它实施方案中，使用来自乳特异性蛋白质基因的相应序列置换嵌合因子VII序列的启动ATG周围的区域。这种置换提供假定的组织特异性启动环境以增强表达。使用例如BLG基因的那些置换整个嵌合因子VII前原序列(pre-prosequence)和5′非编码序列是方便的，但可置换较小的区域。
对于转基因动物中嵌合FVIIa多肽的表达，将编码嵌合因子VIIa的DNA区段与其表达所需的其它DNA区段可操作地连接，以产生表达单元。这类其它区段包括上述启动子和提供转录终止和mRNA的多腺苷酸化的序列。表达单元还可包含编码分泌信号序列的DNA区段，其与编码嵌合因子VIIa的区段可操作地连接。分泌信号序列可为天然因子VII分泌信号序列，或可为另一蛋白质例如乳蛋白质的分泌信号序列(见，例如，vonHeijne，Nucl.AcidsRes.14：4683-4690(1986)；和Meade等人的美国专利第4,873,316号，其通过引用结合到本文中)。
通过将嵌合因子VII序列插入包含其它DNA区段的质粒或噬菌体载体中，来适宜地进行用于转基因动物的表达单元的构建，但表达单元可通过基本上任何连接序列来构建。尤其适宜的是提供包含编码乳蛋白质的DNA区段的载体，以及用嵌合因子VII多肽的编码序列代替乳蛋白质的编码序列；从而产生包含乳蛋白质基因的表达调控序列的基因融合物。在任何情况下，表达单元在质粒或其它载体中的克隆都促进嵌合因子VII序列的扩增。扩增适宜在细菌(例如，大肠杆菌)宿主细胞中进行，因此，载体通常包含在细菌宿主细胞内有功能的复制起点和选择性标记。然后将表达单元引入选定宿主物种的受精卵(包括早期胚胎)中。异源DNA的引入可通过几种途径之一来完成，包括微注射(例如，美国专利第4,873,191号)、反转录病毒感染(Jaenisch，Science240：1468-1474(1988))或利用胚胎干(ES)细胞的位点定向整合(由Bradley等人在Bio/Technology10：534-539(1992)中综述)。然后将卵植入假孕雌性的输卵管或子宫内并使其发育至足月。在其种系中携带引入的DNA的后代可将DNA以正常的孟德尔方式传递到其子代，使转基因群发展。本领域已知产生转基因动物的一般程序(见，例如，Hogan等人，ManipulatingtheMouseEmbryo：ALaboratoryManual(操作小鼠胚胎：实验室手册)，ColdSpringHarborLaboratory，1986；Simons等人，Bio/Technology6：179-183(1988)；Wall等人，Biol.Reprod.32：645-651(1985)；Buhler等人，Bio/Technology8：140-143(1990)；Ebert等人，Bio/Technology9：835-838(1991)；Krimpenfort等人，Bio/Technology9：844-847(1991)；Wall等人，J.Cell.Biochem.49：113-120(1992)；美国专利第4,873,191号；美国专利第4,873,316号；PCT公布号WO88/00239；PCT公布号WO90/05188；PCT公布号WO92/11757；以及英国公布号GB87/00458)。用于将外来DNA序列引入哺乳动物及其生殖细胞中的技术最初在小鼠中开发(见，例如，Gordon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：7380-7384(1980)；Gordon和Ruddle，Science214：1244-1246(1981)；Palmiter和Brinster，Cell41：343-345(1985)；Brinster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：4438-4442(1985)；和Hogan等人)。随后调整这些技术以用于较大的动物，包括家畜物种(见，例如，PCT公布号WO88/00239、WO90/05188和WO92/11757；以及Simons等人，Bio/Technology6：179-183(1988))。总之，到目前为止用于产生转基因小鼠或家畜的最高效途径中，按照已建立的技术将数百个目标DNA线性分子注射入受精卵的原核之一中。还可采用将DNA注射入合子的胞质中。
还可采用在转基因植物中的产生。表达可普遍化或定向到特定器官例如块茎中(见，Hiatt，Nature344：469-479(1990)；Edelbaum等人，J.InterferonRes.12：449-453(1992)；Sijmons等人，Bio/Technology8：217-221(1990)；以及EP0255378)。
本发明嵌合因子VII多肽的产生还可通过体外翻译来获得，例如通过兔网织红细胞裂解物、麦胚抽提物以及大肠杆菌无细胞系统。体外翻译还可连接或偶联。连接的体外翻译基于用噬菌体聚合酶的转录后接兔网织红细胞裂解物或麦胚裂解物系统中的翻译。偶联的体外翻译基于大肠杆菌无细胞系统。
回收和和激活
从细胞培养基或乳汁中回收本发明嵌合因子VII多肽。本发明嵌合因子VII多肽可通过多种本领域已知的程序来纯化，所述程序包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦(IEF))、溶解度差异(例如，硫酸铵沉淀)、或提取(见，例如，ProteinPurification(蛋白质纯化)，J-C.Janson和LarsRyden，编者，VCHPublishers，NewYork，1989)。其它纯化可通过常规化学纯化方法例如高效液相层析来进行。其它纯化方法(包括柠檬酸钡沉淀)为本领域已知，并可用于纯化本文描述的新的嵌合因子VII多肽(见，例如，Scopes，R.，ProteinPurification(蛋白质纯化)，Springer-Verlag，N.Y.，1982)。
对于治疗目的，优选本发明嵌合因子VII多肽基本上是纯的。因此，在本发明的一个实施方案中，将本发明因子VII变体纯化到至少约90-95％的纯度，优选纯化到至少约98％的纯度。纯度可通过例如凝胶电泳、氨基末端氨基酸测序和反相HPLC来评价。
嵌合因子VII多肽在其激活位点被切割以转化为其双链形式。激活可按照本领域已知的程序进行，例如以下公开的程序：Osterud等人，Biochemistry11：2853-2857(1972)；Thomas，美国专利第4,456,591号；Hedner和Kisiel，J.Clin.Invest.71：1836-1841(1983)；或Kisiel和Fujikawa，BehringInst.Mitt.73：29-42(1983)。或者，嵌合因子VII多肽可通过浓缩嵌合因子VII多肽并接触带正电的表面或树脂来激活，例如，如Bjoern等人(ResearchDisclosure，2691986年9月，第564-565页)所描述，因子VII可通过使其穿过离子交换层析柱例如MonoQ(PharmaciafineChemicals)等来激活。嵌合因子VII多肽还可在溶液中如下被激活：通过获得包含基本上纯化的嵌合因子VII多肽的制备物的溶液；向溶液中加入胺化合物、Ca2+至终浓度约5mM至约50mM(例如约10mM至约30mM)，并将溶液的最终pH调至约7.2-8.6(例如约7.6至约8.2)；在约2℃至约25℃之间将所得激活混合物温育一段时间，该时间足以使至少90％的嵌合FVII多肽转化为嵌合FVIIa多肽；以及任选地，从激活混合物中分离FVIIa。然后可将所得激活的嵌合因子VII多肽按下面的描述进行配制和给予。
基因疗法
本发明嵌合因子VII多肽还可用在通过基因疗法治疗出血障碍的方法中。在本发明的该实施方案中，本发明嵌合因子VII多肽由核酸分子编码，所述核酸分子可通过离体转移或通过体内转移引入到受试者细胞内。
本领域可用的基因疗法的任何方法可按照本发明使用。下面描述示例性方法。对于基因疗法的方法的一般综述，见Goldspiel等人，ClinicalPharmacy1993，12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy1991，3：87-95；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.1993，32：573-596；Mulligan，Science1993，260：926-932；以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.1993，62：191-217；May，TIBTECH1993，11：155-215。可使用的重组DNA技术领域公知的方法描述于：Ausubel等人，(编辑)，1993，CurrentProtocolsinMolecularBiology(现代分子生物学方案)，JohnWiley&Sons，NY；Kriegler，1990，GeneTransferandExpression，ALaboratoryManual(基因转移和表达：实验室手册)，，StocktonPress，NY；以及第12和13章，Dracopoli等人，(编辑)，1994，CurrentProtocolsinHumanGenetics(现代人类遗传学方案)，JohnWiley&Sons，NY；Colosimo等人，Biotechniques2000；29(2)：314-8，320-2，324。
编码嵌合因子VII多肽的多核苷酸可插入合适的克隆载体中。适用于基因疗法的载体包括病毒例如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、痘苗、疱疹病毒、杆状病毒和反转录病毒、细小病毒、慢病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和其它本领域常用的重组载体，其已被描述用于在多种真核和原核宿主中表达，并可用于基因疗法和用于简单的蛋白质表达。
在一个实施方案中，载体为病毒载体。病毒载体特别是腺病毒载体可与阳离子亲水脂分子复合，所述阳离子亲水脂分子例如阳离子脂质、聚L-赖氨酸(PLL)和二乙基氨基乙基葡聚糖(DEAE-葡聚糖)，其为目标细胞的病毒感染提供提高的效率(见，例如，1997年11月20日提交的PCT公布号PCT/US97/21496，通过引用结合到本文中)。适合用于本发明的病毒载体包括从痘苗、疱疹病毒、AAV和反转录病毒获得的载体。关于基因疗法中病毒载体的综述，见Mah等人，Clin.Pharmacokinet.2002；41(12)：901-11；Scott等人，Neuromuscul.Disord.2002；12Suppl1：S23-9。
在一个实施方案中，使用这样的载体，其中在基因组中的所需位点处促进同源重组的区域侧接编码序列和任何其它所需序列，从而提供自已整合到基因组中的核酸分子表达构建体(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1989，86：8932-8935；Zijlstra等人，Nature1989，342：435-438；Zarling等人的美国专利第6,244,113号；以及Pati等人的美国专利第6,200,812号，每一个均通过引用以其整体结合到本文中)。
载体可直接或间接递送入患者中，在直接递送的情况中，患者直接暴露于载体或递送复合体；在间接递送的情况中，首先在体外用载体转化细胞，然后将细胞移植入患者中。这两种方法分别称为体内和离体基因疗法。
在一个实施方案中，直接体内给予载体，在体内，其进入受试者的细胞并介导基因的表达。这可通过本领域已知的和上述的多种方法的任一种完成，例如通过将其作为合适的表达载体的部分构建并给予，使其变成在细胞内，例如通过利用缺陷型或减毒的反转录病毒或其它病毒载体进行感染(见，美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射裸DNA，或通过使用微粒轰击(例如，基因抢；生物射弹(Biolistic)，Dupont)；或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被、包裹于生物聚合物(例如，聚β-1-64-N-乙酰氨基葡萄糖多糖；见美国专利第5,635,493号)中、包裹于脂质体、微粒或微胶囊中；通过将其呈与已知进入核的肽或其它配体连接给予；或通过将其呈与经受受体介导的胞吞的配体连接给予(见，例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.1987，62：4429-4432)等。在另一个实施方案中，可形成核酸-配体复合体，其中配体包含融合病毒肽以破坏内体，使核酸避免溶酶体的降解，或包含例如从触角足(antennapedia)获得的阳离子12-聚体肽，其可用于将治疗性DNA转移入细胞中((Mi等人，Mol.Therapy2000，2：339-47)。在又一个实施方案中，可通过靶定特定受体，在体内靶定核酸用于细胞特异性摄取和表达(见，例如，PCT公布号WO92/06180、WO92/22635、WO92/20316和WO93/14188)。另外，称为磁转染(magnetofection)的技术可用来将载体递送至哺乳动物。该技术将载体与超顺磁纳米颗粒结合用于在磁场影响下的递送。该应用减少了递送时间并提高了载体的功效(Scherer等人，GeneTherapy2002；9：102-9)。
在一个实施方案中，核酸可利用脂质载体进行给予。脂质载体可与裸核酸(例如，质粒DNA)结合以促进穿过细胞膜。阳离子、阴离子或中性脂质可用于该目的。但是，阳离子脂质因为其显示出与通常具有负电荷的DNA较好地结合而是合适的。阳离子脂质也显示出介导质粒DNA的细胞内递送(Felgner和Ringold，Nature1989；337：387)。据显示，将阳离子脂质-质粒复合体静脉注射入小鼠中导致DNA在肺中表达(Brigham等人，Am.J.Med.Sci.1989；298：278)。亦参见Osaka等人，J.Pharm.Sci.1996；85(6)：612-618；San等人，HumanGeneTherapy1993；4：781-788；Senior等人，BiochemicaetBiophysicaActa1991；1070：173-179)；Kabanov和Kabanov，BioconjugateChem.1995；6：7-20；Liu等人，Pharmaceut.Res.1996；13；Remy等人，BioconjugateChem.1994；5：647-654；Behr，J-P.，BioconjugateChem1994；5：382-389；Wyman等人，Biochem.1997；36：3008-3017；Marshall等人的美国专利第5,939,401号；Scheule等人的美国专利第6,331,524号。
代表性的阳离子脂质包括在例如美国专利第5,283,185号和例如美国专利第5,767,099号中公开的那些阳离子脂质，这些公开内容通过引用结合到本文中。在一个实施方案中，阳离子脂质为美国专利第5,767,099号中公开的N4-精胺胆甾醇基氨基甲酸酯(GL-67)。其它合适的脂质包括N4-亚精胺胆甾醇基氨基甲酸酯(GL-53)和1-(N4-精胺)-2，3-双十二烷基甘油氨基甲酸酯(GL-89)。
对于病毒载体的体内给予，可与病毒载体例如腺病毒载体联合采用合适的免疫抑制治疗，以避免病毒载体和转染细胞的免疫失活。可给予例如免疫抑制细胞因子例如白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-.γ.)或抗CD4抗体，以阻断对病毒载体的体液或细胞免疫应答。在那一点上，采用以下病毒载体是有利的，所述病毒载体经改造以表达最少数量的抗原。
可利用任何上述方法离体用编码本发明嵌合因子VII多肽的构建体改造体细胞，并重新植入个体中。这种方法一般在Selden等人的PCT公布号WO93/09222中描述。另外，Payumo等人在Clin.Orthopaed.andRelatedRes.2002；403S：S228-S242中描述的基于细胞递送的专有ImPACT技术中使用了这种技术。在这种基因疗法系统中，将体细胞(例如，成纤维细胞、肝细胞或内皮细胞)从患者中移出、在体外培养、用治疗目标基因转染、表征并重新引入患者中。可使用初级细胞(从个体或组织获得，并在传代前经过改造)和次级细胞(在引入体内前在体外传代)以及本领域已知的永生化细胞。可用于本发明方法的体细胞包括但不限于体细胞例如成纤维细胞、角质形成细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、血液的构成组分、肌肉细胞、可培养的其它体细胞和体细胞前体。在一个实施方案中，细胞为肝细胞。
使用构建体转染将产生编码产物的初级或次级细胞，所述构建体包含编码本发明嵌合FVIIa多肽的多核苷酸和任选编码选择性标记的核酸以及在受体初级或次级细胞中表达嵌合FVIIa所需要的其它序列。包括但不限于感染性载体，例如反转录病毒、疱疹、腺病毒、腺伴随病毒、腮腺炎和脊髓灰质炎病毒载体的这类构建体可用于此目的。
透皮递送尤其适合用于使用表皮的细胞类型的直接转移，所述细胞类型包括角质形成细胞、黑素细胞和树突细胞(Pfutzner等人，ExpertOpin.Investig.Drugs2000；9：2069-83)。
在一个实施方案中，用于基因疗法的载体为单链自我互补的腺伴随病毒。另外，该自我互补的腺伴随病毒可包含小的运甲状腺素蛋白(transhyretin)启动子-增强子、来自小鼠细小病毒的内含子和来自牛生长激素的多腺苷酸化信号。载体还可包含Margaritis等人描述的RKRRKR序列，其导致因子VII以活性形式即因子VIIa分泌(Margaritis等人，J.Clin.Invest.，2004；113：1025-31)。
给予和药物组合物
本发明嵌合因子VII多肽可用于控制出血障碍，其具有数种起因，例如凝血因子缺乏(例如血友病A和B或者凝血因子XI或VII的缺乏)或凝血因子抑制剂；或它们可用于控制受试者中发生的过度出血，所述受试者具有正常发挥作用的凝血级联(无凝血因子缺乏或针对任何凝血因子的抑制剂)。出血可由血小板功能缺陷、血小板减少或冯维勒布兰德病导致。它们还可在由不同刺激物引起纤溶活性增加的受试者中看到。
在经历了与手术或创伤有关的大量组织损伤的受试者中，止血机制可被立即止血的需求压倒，并且尽管具有正常的止血机制，但他们可能形成出血。当出血发生诸如脑、内耳区域和眼等器官时，获得满意的止血也是问题；在弥漫性出血(出血性胃炎和血崩)的情况下当难以鉴定来源时获得满意的止血也可以是问题。相同的问题可在对不同的器官(肝、肺、肿瘤组织、胃肠道)进行活组织检查的过程中和在腹腔镜手术中出现。对这些情况相同的是难以通过手术技术(缝线、夹紧等)提供止血。急性和大出血还可发生在进行抗凝疗法的受试者中，在所述受试者中，缺陷性止血由给予的疗法引起。这种受试者在不得不快速抵消抗凝效果情形中可能需要手术介入。不满意止血的情况中可导致问题的另一情形是给予具有正常止血机制的受试者抗凝疗法以防止血栓栓塞性疾病。这类疗法可包括肝素、其它形式的蛋白聚糖、华法林或其它形式的维生素K拮抗剂以及阿司匹林和其它血小板聚集抑制剂。
对于与有意介入相关的治疗，通常在进行介入前约24小时内给予本发明嵌合因子VII多肽，并在之后持续多至7天以上。可通过如本文所述的多种途径作为促凝剂给予。
对于70kg的受试者，嵌合因子VII多肽的剂量范围为从约0.05mg/天至约500mg/天，优选从约1mg/天至约200mg/天，以及更优选从约10mg/天至约175mg/天作为负荷剂量和维持剂量，这根据受试者的重量和情况的严重性而定。对于给定的受试者和给定的情况，本领域技术人员将能够确定最佳剂量。
药物组合物主要意图用于肠胃外给予，用于预防和/或治疗性治疗。优选地，药物组合物在肠胃外给予，即静脉内、皮下或肌内，或可通过连续或脉动输注给予。或者，可配制药物组合物用于以不同方式给予，包括但不限于经口、皮下、静脉内、脑内、鼻内、透皮、腹膜内、肌内、肺内、阴道、直肠、眼内或任何其它可接受的方式。
用于肠胃外给予的组合物包含与药学上可接受的载体、优选含水载体组合(优选溶于)的本发明嵌合因子VII多肽。可使用许多含水载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。本发明嵌合因子VII多肽还可与延长稳定性和储存期的组分例如甲硫氨酸和蔗糖一起配制。本发明嵌合因子VII多肽还可制成脂质体制备物用于递送或靶向到损伤部位。脂质体制备物通常描述于例如美国专利第4,837,028、4,501,728和4,975,282号中。组合物可通过常规、熟知的灭菌技术灭菌。可将所得水溶液包装备用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干的制备物在给予前与无菌水溶液混合。组合物可包含接近生理条件需要的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。组合物还可包含防腐剂、等张剂(isotonifier)、非离子表面活性剂或去污剂、抗氧化剂和/或其它各种添加剂。
这些制剂中嵌合因子VII多肽的浓度可在大范围内变化，即，从小于约0.5％重量(通常为或至少约1％重量)至高达15％或20％重量，并且将主要按照选定的特定给予模式根据流体体积、粘度等进行选择。因此，通常用于静脉内输注的药物组合物可接近包含250ml无菌林格氏溶液和10mg嵌合因子VII多肽。用于制备可肠胃外给予的组合物的实际方法是已知的或对本领域技术人员来说是显而易见的，更多细节参见例如Remington′sPharmaceuticalSciences，第18版，MackPublishingCompany，Easton，Pa.(1990)中。
可给予包含本发明嵌合因子VII多肽的组合物用于预防和/或治疗性治疗。在治疗应用中，将组合物以足以治愈、减轻或部分阻止疾病及其并发症的量给予已患如上所述的疾病的受试者。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效量”。如本领域技术人员将理解的，对于此目的有效的量将依赖于疾病或损伤的严重程度及受试者的重量和整体状态。但是，一般来说，对于70kg的受试者，有效量的范围为从约0.05mg直至约500mg嵌合因子VII多肽/天，其中更常用的剂量为约1.0mg至约200mg嵌合因子VII多肽/天。
必须记住的是，本发明的物质通常可用于严重的疾病或损伤状况，即威胁生命或潜在地威胁生命的情况。在这类情况中，考虑到最小化外来物质和人中通常缺乏人因子VII的免疫原性，有可能且治疗医师可能觉得有需要的是，给予基本过量的这些嵌合因子VII多肽组合物。
在预防应用中，将包含本发明嵌合因子VII多肽的组合物给予易感疾病状态或损伤或者以其它方式处于疾病状态或损伤风险中的受试者，以提高受试者自身的促凝固能力。这样的量被定义为“预防有效量”。在预防应用中，精确的量再次依赖于受试者的健康状况和重量，但是剂量的范围对于70千克的受试者通常为约0.05mg至约500mg/日，更通常地对于70千克的受试者为约1.0mg至约200mg/天。
可用治疗医师选定的剂量水平和模式进行组合物的单次或多次给予。对于需要每日维持水平的能走动的受试者，嵌合因子VII多肽可利用例如便携式泵系统通过连续输注进行给予。
本发明嵌合因子VII多肽还可制成持续或延长释放的制剂。配制持续或延长释放的组合物的方法为本领域已知的，包括但不限于包含多肽的固体疏水颗粒的半渗透基质。
本发明嵌合因子VIIa多肽的局部递送，例如局部施用，可例如通过喷雾、灌注、双气囊导管、支架、纳入血管移植物或支架中、用于包被气囊导管的水凝胶或其它良好建立的方法进行。在任何情况下，药物组合物应提供足以有效地治疗受试者的量的因子VII变体。
包括以下实施例以阐述本发明。根据本发明的共同发明人发现或预期在实施本发明中运行良好的技术和程序术语来描述以下实施例的某些方面。鉴于本公开内容和本领域技术的一般水平，技术人员将意识到，以下实施例仅旨在示例性，并且在不背离本发明范围的情况下，可采用众多改变、修改和变化。
实施例
实施例I-嵌合因子VIIa多肽的构建和表达
获取人因子VII和人因子IX两者的cDNA并引入以下独特限制性位点以促进结构域交换：
BstEII位点，其位于EGF-1结构域的5’末端处(因子VII的残基47-49；因子IX的残基48-50)；
SacI位点，其位于EGF-1和EGF-2结构域的连接处(因子VII的残基82-83；因子IX的残基83-84)；
NotI位点，其位于EGF-2结构域的3’末端处(因子VII的残基135-137；因子IX的残基132-134)。
利用这些限制性位点构建不同的嵌合体以在因子VII和因子IX之间交换结构域，不同的嵌合体描绘于图1中。可使用相同或类似的限制性位点以在因子VII和S蛋白之间交换结构域。
所得嵌合体的氨基酸序列在SEQIDNO：1(因子IX信号、前肽、GLA和EGF1结构域以及因子VIIEGF2和催化结构域)和SEQIDNO：2(因子IX信号和前肽结构域、S蛋白GLA结构域、因子IXEGF1结构域以及因子VIIEGF2和催化结构域)中给出。将选择的这些重组DNA亚克隆入表达载体pCMV5中用于转染哺乳动物细胞。
然后将所得重组构建体与pSV2neo和pCMVhGC一起共转染到293人肾细胞系(ATCCCRL1573)中。如前所述选择和筛选高水平表达每一构建体的克隆(Toomey等人，1991，J.Biol.Chem.，266：19198-19202)。将每一筛选出的克隆放大至900cm2滚瓶用于大规模生产，并通过假亲和层析方法利用FastFlowQ-Sepharose和先为钙梯度后为NaCl梯度的洗脱纯化重组蛋白质。
实施例II-因子VIIa多肽的凝血酶生成
利用血友病体外模型确定因子VIIa的凝血酶生成。使用单核细胞作为组织因子来源并将其与未激活的血小板和合成血浆结合，所述合成血浆包含血浆浓度的因子V、VII、IX、VIII和XI及血浆浓度的抗凝血酶和TFPI。通过缺省因子VIII和IX产生血友病病况。
通过从健康个体中抽取4ml血液并置于柠檬酸钠管中制备单核细胞。小心地将血液铺在15ml锥形管中的3mlAccu-PrepTM淋巴细胞分离培养基(AccurateChemicals，NY，USA)顶部，并以1500rpm离心30分钟。然后将单核细胞层移出并在4℃下加入等体积的Versene(Lineberger组织培养物)中，以800rpm离心10分钟。将所得沉淀在4℃下重悬于5ml的Versene中并在800rpm下离心10分钟。将所得沉淀重悬于4ml的巨噬细胞SFM培养基(LifeTechnologies，CA，USA)中，补充500ng/ml的脂多糖(LPS)(Sigma-Aldrich，MO，USA)并将细胞以200μl/孔铺板到96孔板中。将该板在37℃、5％CO2下温育2小时，然后用巨噬细胞SFM培养基冲洗3次，接着温育过夜。
通过从健康个体中抽取4ml血液并置于柠檬酸钠管中制备血小板。小心地将血液铺在15ml锥形管中的5ml的Accu-PrepTM淋巴细胞分离培养基(AccurateChemicals，NY，USA)顶部，并以1500rpm离心30分钟。然后将血小板层移出并加入等体积的含10μg/ml前列腺素E1(PGE1)(Sigma-Aldrich，MO，USA)的柠檬酸盐-葡萄糖-盐水中，并以800rpm离心10分钟。弃除所得沉淀并通过琼脂糖凝胶过滤在补充有1mg/ml卵清蛋白的无钙的Tyrodes缓冲液中从血浆蛋白质中分离血小板。将回收的血小板于37℃下储存。
通过利用5μg/ml浓度的因子XIC-1-酯酶抑制剂并在与前面制备的单核细胞温育1小时后添加200μg/ml的抗凝血酶、0.07μg/ml的TFPI、100mg/ml的凝血酶原、8μg/ml的因子X和0.5μg/ml的因子VII，来产生用于模拟血友病的体外试验的合成血浆。过夜温育后，以7μg/ml的浓度加入因子V。对于正常条件，在1小时的温育后以4μg/ml的浓度加入因子IX，并在过夜温育后，以1U/ml加入因子VIII。
向上面的合成血浆溶液中加入260μl的血小板，并将所得悬液加入单核细胞中以启动反应。以定时的间隔移出10μl样品并将其加入到90μl含1mMEDTA和0.5mMGly-Pro-Arg-pNA(CenterchemInc.，CT，USA)的凝血酶试验缓冲液中。加入50％的柠檬酸100μl以停止合成底物切割并在405nm处测定OD。使用以下的公式确定凝血酶的浓度：
[凝血酶]＝稀释度×((A405-背景)/(停止-开始))/(转化因子)
其中转化因子为1nM凝血酶在405nm处产生0.0117OD/min速率时的。
正常条件下(包含因子VIII和IX)的凝血酶生成显示具有短的停滞期的峰值凝血酶产生(图2)。增加野生型因子VIIa的浓度提高了血友病病况中凝血酶的产生(图2)。
实施例III-嵌合因子VIIa多肽的凝血酶生成
利用实施例II中描述的血友病体外模型确定实施例I中产生的嵌合蛋白质的凝血酶生成。加入的10nM的嵌合因子VIIa具有类似于50nM野生型因子VIIa的活性(图3)，所述嵌合因子VIIa包含因子VII的EGF-2和催化结构域及因子IX的GLA和EGF-1结构域，或包含因子VII的GLA、EGF-2和催化结构域及因子IX的EGF-1结构域。
着眼于相对于对照的峰值凝血酶产生，无论是野生型因子VIIa还是测试的嵌合因子VIIa多肽都不能将峰值凝血酶产生回复到对照的水平。但是，10nM的嵌合因子VIIa使峰值凝血酶产生回复到类似于50nM野生型因子VIIa所产生的水平(图4)，所述嵌合因子VIIa包含因子VII的EGF-2和催化结构域及因子IX的GLA和EGF-1结构域，或包含因子VII的GLA、EGF-2和催化结构域及因子IX的EGF-1结构域。
实施例IV-嵌合因子VIIa多肽的凝固试验
在如Buyue，Y.，等人，2008，Blood，112：3234-3241所描述的凝固试验中，体内评价嵌合因子VIIa多肽的凝血活性。简要地说，通过将导管插入腿静脉将因子VII给予血友病B小鼠(2mg/kg的NovoSeven2mg/kg包含因子IX的GLA和EGF-1结构域及因子VIIa的EGF-2和催化结构域的嵌合因子VIIa，或1.4mg/kg包含S蛋白的GLA结构域、因子IX的EGF-1结构域和因子VIIa的EGF-2和催化结构域的嵌合因子VIIa)。使用野生型小鼠作为对照。将小鼠麻醉，通过将小规针穿过隐静脉将其它腿的隐静脉截断。然后通过将一对剪刀的尖端插入静脉内并剪断以产生小杯状来切断远端部分。凝块形成并记录直到出血停止的时间。然后用30规针移除凝块并再次记录直到出血停止的时间。重复此过程30分钟。将凝块的数目记录为中断(disruptions)数目。将记录的时间取平均，并记录为平均时间。实验对野生型小鼠中的一只小鼠进行，并且嵌合因子VIIa包含S蛋白的GLA结构域、因子IX的EGF-1结构域及因子VIIa的EGF-2和催化结构域。对于包含因子IX的GLA和EGF-1结构域及因子VIIa的EGF-2和催化结构域的嵌合因子VIIa，实验对两只血友病B小鼠进行，结果相同。对于不给予任何因子VII的血友病B小鼠，下面的表1中记录的0.25个中断表明，仅四分之一带有初始损伤的小鼠不流血不止。
表1.
用一只没有处理的血友病B小鼠、一只给予2mg/kg的NovoSeven的血友病B小鼠、一只给予2mg/kg的嵌合因子VIIa的血友病B小鼠和一只没有处理的野生型小鼠重复实验，所述嵌合因子VIIa包含因子IX的GLA和EGF-1结构域及因子VIIa的EGF-2和催化结构域。给予2mg/kg嵌合因子VIIa的血友病B小鼠出血停止的平均时间比给予2mg/kgNovoSeven的血友病B小鼠和野生型小鼠短，所述嵌合因子VIIa包含因子IX的GLA和EGF-1结构域及因子VIIa的EGF-2和催化结构域。(图5)。
实施例V-嵌合因子VIIa多肽的血栓形成性
本发明嵌合因子VIIa多肽的血栓形成性可在高水平表达这些蛋白质的小鼠模型中测试。最近，已显示表达大于2μg/ml重组野生型小鼠因子VIIa的50％的小鼠在16个月内死于形成血栓。表达类似水平的因子VIIa的血友病B小鼠具有相同的死亡率，并且当小鼠回交到C57BL/6J小鼠品系中时，形成血栓的时间大大提早(＜4个月)。(AljamaliMN等人.JClinInvest.2008；118：1825-1834)。
可产生表达2-10μg或更多嵌合多肽的血友病B小鼠(品系C57BL/6J)，并且如果嵌合因子VII多肽的表达导致形成血栓，那么这些小鼠应在早期(＜4个月)形成血栓。
小鼠品种可通过利用由Dr.PaulMonahan(theGeneTherapyCenter，UNC)开发的新的自我互补腺伴随载体(AAV)来开发。(WuZ等人MolTher.2008；16：280-289)。此载体包含小的运甲状腺素蛋白启动子-增强子(TTR启动子)、来自小鼠细小病毒的内含子、MVM和牛生长激素pA信号。据显示，基于此载体，将1×1011个载体基因组注射入门静脉内导致7μg/ml的因子IX在感染8周内持续表达。(WuZ等人MolTher.2008；16：280-289)。
可使用小鼠和人因子VIIa的cDNA和本发明嵌合因子VII多肽以评价血栓形成性。还可利用Margaritis等人描述的RKRRKR(SEQIDNO：21)序列，其引起因子VII以活性形式即因子VIIa分泌(Margaritis等人，J.Clin.Invest.，2004；113：1025-31)。
为检验此假设，可产生野生型和嵌合因子VII小鼠多肽。据报道，小鼠组织因子不与人因子VII反应，所以使用小鼠多肽以证明组织因子与给予的因子VIIa在创伤中的作用无关，但与血栓形成有关。可用于检验此假设的小鼠多肽包括：野生型小鼠因子VII(SEQIDNO：3)；带有导致多肽以双链活性形式(FVIIa)分泌的RKRRKR序列的野生型小鼠因子VII(SEQIDNO：4)；带有因子VII的EGF2和催化结构域及RKRRKR序列的小鼠因子IX信号、前肽、GLA和EGF1结构域(SEQIDNO：5)；以及带有因子VII的EGF2和催化结构域及RKRRKR序列的小鼠因子IX信号和前肽结构域、S蛋白的GLA结构域、因子IX的EGF1结构域(SEQIDNO：6)。嵌合小鼠因子VII多肽(SEQIDNO：5和6)对组织因子具有减少的亲和力(当与野生型FVII分子相比较时，可能低多达100倍)，并且这应足以防止不想要的血栓形成。
嵌合因子VII多肽还可经其它修饰以进一步减少对组织因子的亲和力。这种突变的一个实例是在残基306处将甲硫氨酸变成丙氨酸。可包括嵌合因子VII多肽的其它修饰，其导致因子VIIa的比活更高。这类修饰的实例包括以下与人序列残基158、296和298的等同物：V158D、E296V和M298Q。
上述野生型和嵌合小鼠因子VII多肽可如下构建：通过利用小鼠因子VII的cDNA作为模板并利用寡核苷酸引物扩增不同的结构域，然后将构建体插入pSC-TTR-mvm载体中，该载体的构建描述于Wu等人，MolecularTherapy，2008；16：280-289中。具体而言，野生型小鼠因子VII可利用以下引物自小鼠因子VIIcDNA扩增：5’-TGAGGATCCCCACCATGGTTCCACAGGCGCATGGGCT-3’(SEQIDNO：7)和5’-TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAAC-3’(SEQIDNO：8)。接着可用BamHI/SphI消化扩增的片段并将其插入pSC-TTR-mvm载体的BglII/SphI位点之间。随后，可将BGH多腺苷酸化序列插入所得载体的SphI位点处。
可以以类似的方式构建带有RKRRKR序列的野生型小鼠因子VII构建体。具体而言，带有RKRRKR序列的野生型小鼠因子VII可利用以下引物自小鼠因子VII的cDNA扩增：
5’-TGAGGATCCCCACCATGGTTCCACAGGCGCATGGGCT-3’(SEQIDNO：7)和5’-ACAATGCGTTTTCGCCGCTTACGGCGGCCTTGGCGGCTGCTGGAGT-3’(SEQIDNO：9)(产生第一片段)；以及
5’-TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAAC-3’(SEQIDNO：8)和5’-GCCGCCGTAAGCGGCGAAAACGCATTGTGGGAGGCAACGTGTGCCC-3’(SEQIDNO：10)(产生第二片段)。然后利用这两种片段作为模板以及以下引物进行重叠PCR：
5’-TGAGGATCCCCACCATGGTTCCACAGGCGCATGGGCT-3’(SEQIDNO：7)和5’-TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAAC-3’(SEQIDNO：8)。接着可用BamHI/SphI消化所得的扩增片段并将其插入pSC-TTR-mvm载体的BglII/SphI位点之间。随后，可将BGH多腺苷酸化序列插入所得载体的SphI位点处。
类似地构建包含小鼠因子IX信号、前肽、GLA和EGF1结构域以及因子VII的EGF2和催化结构域及RKRRKR序列的构建体(SEQIDNO：5)。具体而言，利用小鼠因子IX的cDNA作为模板及以下引物产生第一片段：
5’-AGGCCTGAAGATCTCCACCATGAAGCACCTGAACACCGTC-3’(SEQIDNO：11)及
5’-GATCAGCTGCTCATTCTTGCTTTTTTCACAGTTCCTTCCTTCAAATC-3’(SEQIDNO：12)。利用小鼠因子VII作为模板及以下引物产生第二片段：
5’-GATTTGAAGGAAGGAACTGTGAAAAAAGCAAGAATGAGCAGCTGATC-3’(SEQIDNO：13)
及
5’-ACAATGCGTTTTCGCCGCTTACGGCGGCCTTGGCGGCTGCTGGAGT-3’(SEQIDNO：9)。
可利用小鼠因子VII作为模板及以下引物产生第三片段：5’-TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAAC-3’(SEQIDNO：8)及
5’-GCCGCCGTAAGCGGCGAAAACGCATTGTGGGAGGCAACGTGTGCCC-3’(SEQIDNO：10)。然后可利用这三种片段作为模板以及以下引物进行重叠PCR：
5’-AGGCCTGAAGATCTCCACCATGAAGCACCTGAACACCGTC-3’(SEQIDNO：11)及5’-TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAAC-3’(SEQIDNO：8)。接着用BamHI/SphI消化所得的扩增片段并将其插入pSC-TTR-mvm载体的BglII/SphI位点之间。随后，将BGH多腺苷酸化序列插入所得载体的SphI位点处。
可使用类似的过程产生以下构建体，其包含小鼠因子IX信号和前肽结构域、S蛋白的GLA结构域、因子IX的EGF1结构域以及因子VII的EGF2和催化结构域及RKRRKR序列(SEQIDNO：6)。具体而言，可利用小鼠因子IX的cDNA及以下引物产生第一片段：5’-AGGCCTGAAGATCTCCACCATGAAGCACCTGAACACCGTC-3’(SEQIDNO：11)及
5’-GTTTCTTCGAACAAGGTATTTGCTCTCTTTGGACGGGTAAGAATTTTG-3’(SEQIDNO：14)。可利用小鼠S蛋白作为模板及以下引物产生第二片段：
5’-CAAAATTCTTACCCGTCCAAAGAGAGCAAATACCTTGTTCGAAGAAAC-3’(SEQIDNO：15)
及
5’-GATCTCCATCAACATACTGCTTATAAAAATAATCCGTCTCGGGATT-3’(SEQIDNO：16)。可利用以下载体作为模板及以下引物产生第三片段，所述载体带有小鼠因子IX信号、前肽、GLA和EGF1结构域和因子VII的EGF2和催化结构域及RKRRKR序列：
5’-AATCCCGAGACGGATTATTTTTATAAGCAGTATGTTGATGGAGATC-3’(SEQIDNO：17)和5’-TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAC-3’(SEQIDNO：8)。然后利用这三种片段作为模板以及以下引物进行重叠PCR：
5’-AGGCCTGAAGATCTCCACCATGAAGCACCTGAACACCGTC-3’(SEQIDNO：11)和5’-TTCCCCAGCATGCCTACAGTAGTGGGAGTCGGAAAAC-3’(SEQIDNO：8)。接着用BamHI/SphI消化所得的扩增片段并将其插入pSC-TTR-mvm载体的BglII/SphI位点之间。随后，可将BGH多腺苷酸化序列插入所得载体的SphI位点处。
将野生型小鼠因子VII(SEQIDNO：3)和带有RKRRKR序列的野生型小鼠因子VII(SEQIDNO：4)载体构建体各自注射入两只年龄匹配的雄性血友病B小鼠中(5×1011个载体基因组/小鼠)。将带有因子VII的EGF2和催化结构域及RKRRKR序列的小鼠因子IX信号、前肽、GLA和EGF1结构域(SEQIDNO：5)以及带有因子VII的EGF2和催化结构域及RKRRKR序列的小鼠因子IX信号和前肽结构域、S蛋白的GLA结构域、因子IX的EGF1结构域(SEQIDNO：6)载体构建体各自注射入三只年龄匹配的雄性血友病B小鼠中(5×1011个载体基因组/小鼠)。注射后大约三周，用带有RKRRKR序列的野生型小鼠因子VII(SEQIDNO:4)注射的所有小鼠均死亡。在注射后大约五周，注射带有因子VII的EGF2和催化结构域及RKRRKR序列的小鼠因子IX信号、前肽、GLA和EGF1结构域(SEQIDNO：5)或者带有因子VII的EGF2和催化结构域及RKRRKR序列的小鼠因子IX信号和前肽结构域、S蛋白的GLA结构域、因子IX的EGF1结构域(SEQIDNO：6)的小鼠仍然存活，并且未显示有不良的症状。每周从小鼠中采血一次，并在注射后6-8周可测定小鼠因子VII多肽的水平。此外，可通过测定经注射小鼠的血液样品的体外凝血活性来间接确定小鼠因子VII多肽的抗原水平(Margaritas等人，GeneTherapy2009；113：3682-3689)。
前面是对本发明的阐述，并不应解释为其限制。本发明由随附权利要求及其中包括的权利要求的等同物限定。所有出版物、专利申请、专利、专利公布、由GenBank数据库和/或SNP登记号确定的序列以及本文引用的其它参考文献均通过引用以其整体结合到本文中，用于与该参考文献所出现的句子和/或段落有关的教导。

Claims (12)

1.嵌合因子VIIa多肽在制备用于治疗患出血障碍的受试者中的出血障碍的药物中的用途，其中所述嵌合因子VIIa多肽包含因子VII的EGF-2和催化结构域；GLA结构域，其选自因子IX的GLA结构域和S蛋白的GLA结构域；以及EGF-1结构域，其选自因子IX的EGF-1结构域和S蛋白的EGF-1结构域。
2.权利要求1的用途，其中所述出血障碍选自：凝血因子缺乏；血小板功能缺陷；血小板减少；冯维勒布兰德病；凝血因子抑制；手术引起的出血；以及创伤引起的出血。
3.权利要求1或2的用途，其中所述出血障碍为凝血因子缺乏。
4.权利要求3的用途，其中所述凝血因子缺乏为血友病。
5.前述权利要求中任一项的用途，其中治疗所述出血障碍包括将包含编码所述嵌合因子VIIa多肽的核苷酸序列的核酸分子给予受试者。
6.前述权利要求中任一项的用途，其中所述GLA结构域为因子IX的GLA结构域，所述EGF-1结构域为因子IX的EGF-1结构域。
7.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述GLA结构域为S蛋白的GLA结构域，所述EGF-1结构域为因子IX的EGF-1结构域。
8.一种嵌合凝结蛋白质，其包含：
S蛋白的GLA结构域；
EGF-1结构域，其选自S蛋白的EGF-1结构域和因子IX的EGF-1结构域；以及
因子VII的EGF-2结构域和催化结构域。
9.一种编码权利要求8所述的嵌合凝结蛋白质的核酸分子。
10.一种包含权利要求9所述的核酸分子的载体。
11.一种包含权利要求8所述的嵌合凝结蛋白质的细胞。
12.一种包含权利要求10所述的载体的细胞。
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