CN102586412A

CN102586412A - 一种MicroRNA特异表达谱及其应用

Info

Publication number: CN102586412A
Application number: CN2011100219053A
Authority: CN
Inventors: 彭志海; 韩中博; 樊军卫
Original assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Priority date: 2011-01-18
Filing date: 2011-01-18
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2031-01-18
Also published as: CN102586412B

Abstract

本发明属生物学和医学检验领域，涉及一种MicroRNA特异表达谱及其临床应用。本发明提供的5个miRNAs或综合指标可判断肝癌肝移植术后肿瘤的复发，准确率达77％；同时，其不但可以判断整个病例群体的肿瘤复发和预后情况，对于根据Milan分层后的病人，所述的5个miRNAs或综合指标亦可分别判断肿瘤复发和预后情况；因此，本发明可用于临床肝癌肝移植术后肿瘤高复发危险病人的筛选，帮助判断预后，早期诊断复发，为早期干预治疗及实施个体化治疗提供依据。

Description

一种MicroRNA特异表达谱及其应用

技术领域

本发明属生物学和医学检验领域，涉及一种肿瘤生物标志物及其临床应用，具体涉及一种MicroRNA特异表达谱及其应用，所述的MicroRNA特异表达谱与肝癌肝移植术后肿瘤复发早期诊断和预后判断相关。

背景技术

自2004年来，随着对肿瘤分子标志物研究的不断进展，microRNA成为当今分子标志物研究的热点。现有技术公开了MicroRNAs(miRNAs)是一种约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA(双链)但是与siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA(miRNAs)参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。有越来越多的证据表明，miRNAs在肿瘤的诊断，肿瘤生物学行为以及预后的判断方面有着巨大的应用潜力。

生物芯片技术是通过微缩技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测；它的出现给生命科学、医学、化学、新药研发、生物武器战争、司法鉴定、食品与环境监督等众多领域带来巨大的革新甚至革命。按照芯片上固化的生物材料的不同，可将生物芯片划分成为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。目前，最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的“微阵列(microarray)”，也被称为基因芯片(genechip)多DNA芯片(DNAchip)。

microRNA芯片随着研究者对miRNAs的研究的不断深入，而逐渐成为对miRNAs研究的有力的辅助工具。丹麦Exiqon公司基于LNA^TM专利技术，开发出一系列microRNA研究工具，其基于LNA^TM专利技术捕获探针的microRNA芯片，具有高灵敏度，搞特异性，Tm值均一化，杂交温度高，统一标记方法，节约样品用量，无需纯化样品等特性，是microRNA高通量研究的有力辅助工具。

目前临床上常常无法做到对肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗，往往会延误治疗的最佳时机。据统计，原发性肝癌在我国恶性肿瘤发病率中排第5位，占恶性肿瘤死亡原因的第3位。肝切除曾经是治疗肝癌的主要方法，但是在我国肝癌患者中80％以上的患者有不同程度的肝硬化，而在这些患者中能够行肝切除治疗的患者仅占10％-15％。其余的患者由于肿瘤的大小，位置以及潜在肝硬化的严重程度等因素而无法实行肝切除术。随着近年来肝移植术的不断发展和成熟，以及在国际公认肝移植标准的筛选下，肝移植术已经成为肝癌的一种有效的治疗方法。但是肿瘤的复发是影响受者长期存活的主要因素。目前在国际上常用的肝癌肝移植受者选择标准主要包括米兰标准和UCSF标准。Mazzaferro等在1996年首次提出米兰标准：①单一癌灶直径≤5cm；②癌灶≤3个，每个直径≤3cm；③无肝内大血管浸润和肝外转移。符合米兰标准的肝癌受者肝移植术后4年生存率为85％，不符合米兰标准者肝移植术后4年生存率为50％。2001年，Yao等提出了UCSF(University of California，San Froncisco)标准：①单一癌灶直径≤6.5cm；②癌灶≤3个，每个直径≤4.5cm，累计直径≤8cm；③无肝内大血管浸润和肝外转移。符合UCSF标准的肝癌受者肝移植术后1年、5年生存率分别为90％、75％，不符UCSF标准者肝移植术后1年生存率为50％。但是为什么在这些肝移植准入标准的严格筛选下，仍有一定比例的病人术后肿瘤复发，我们不得而知。纵观目前主要的肝癌肝移植准入标准，都着重于肿瘤大体形态学指标，很少涉及基因及蛋白分子等实验室检查指标，不可避免地使得对于肿瘤生物学行为的评估及预后的预测片面化。

所以，探讨肝癌复发转移相关的分子机制、寻找预警复发转移的靶分子，可为临床防治肝癌移植术后复发转移提供理论依据，具有现实的社会需求和重要的科学意义。

发明内容

本发明目的是提供涉及一种肿瘤生物标志物及其临床应用，具体涉及一种MicroRNA特异表达谱及其应用，所述的MicroRNA特异表达谱是高敏感度、高特异性的新的肝癌肝移植术后肿瘤复发早期诊断及预后判断相关的一组特异性MicroRNA表达谱，能为肝癌肝移植术后肿瘤复发的早期诊断及预后判断提供参考依据。

本发明采用Exiqon公司microRNA microarray筛选出肝癌肝移植术后肿瘤复发病人与肿瘤为复发病人间的miRNAs的差异表达谱，并联合应用Taqman real-time PCR方法验证芯片结果，最后扩大样本量验证由芯片获得的miRNAs的差异表达谱。

本发明中，所述的具有差异表达的肝癌肝移植术后肿瘤复发相关的microRNAs，包括以下的一组5种miRNAs，分别为hsa-mir-19a、hsa-mir-24、hsa-mir-223、has-mir-126、has-mir-886-5p；所述的一组miRNAs可较准确区分肝癌肝移植术后肿瘤复发的样品和肿瘤未复发的样品，并可准确判断病人的预后。

本发明还提供所述的MicroRNA特异表达谱参数组合，可用于判断肝癌肝移植术后肿瘤的复发及病人的预后。

本发明中，确定所述的MicroRNA特异表达谱包括以下步骤：

(1)标本准备

肝癌肝移植术后离体的肝脏肿瘤石蜡包埋标本；

RNA抽提试剂trizol(Invitrogen)抽提RNA，-80℃备用；

(2)microRNA microarray分析差异表达的miRNAs

采用丹麦Exiqon公司microRNA microarray芯片分析肝癌肝移植术后肿瘤复发标本和肿瘤未复发标本间差异表达的miRNAs；

采用miRCURY^TMArray Power标记试剂盒，用标记酶将Hy3^TM或Hy5^TM荧光基团标记miRNA，得到用于与芯片杂交的荧光探针；

在标准条件下使用MAUI杂交仪将标记好的探针和miRCURY^TM芯片杂交；

使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算；

(3)Taqman real-time PCR方面验证芯片结果并扩大样本量进一步验证差异表达miRNAs。

上述的5个差异表达的miRNAs，经过SPSS统计学分析，结合临床随访资料，结果表明，上述一组5个miRNAs可作为一个综合的指标作为判断肝癌肝移植术后肿瘤的复发并判断病人预后的参考指标。本发明的实施例中，采用提供的5个miRNAs或综合指标作为肝癌肝移植术后肿瘤的复发判断的参考，结果表明，参考准确率达77％；同时，对于根据Milan分层后的病人亦可分别作为判断肿瘤复发和预后情况判断的参考；因此，本发明的差异表达的miRNAs可用于临床肝癌肝移植术后肿瘤高复发危险病人的筛选参考标准，为早期干预治疗及实施个体化治疗提供依据。

本发明为肝癌肝移植术后肿瘤复发早期诊断、预后判断及早期干预治疗提供了较重要的参考依据。本发明具有较大的实际临床价值，可用于临床检测筛选高危复发人群，及早开始术后干预治疗及实行个体化的治疗，减少非高危复发病人不必要的治疗及医疗花费。

本发明经济合理，每检测一人标本成本为1000元人民币，明显降低患者医疗开支，有利于促进医疗保险制度的改革。

附图说明

图1是5个miRNAs综合指标判断整个病人群体的生存率图，

其中，根据5个miRNAs综合表达情况将整个病人群体分为高危险组(High-risksignature)和低危险组(Low-risk signature)。

图2是5个miRNAs综合指标判断整个病人群体无瘤生存期图，

图3是5个miRNAs综合指标判断符合Milan标准的病人的生存率图

图4是5个miRNAs综合指标判断符合Milan标准的病人无瘤生存期图

图5是5个miRNAs综合指标判断超过Milan标准的病人的生存率图

图6是5个miRNAs综合指标判断超过Milan标准的病人的无瘤生存期图

具体实施方式

实施例1

一、标本准备

肝癌肝移植术后离体肝脏肿瘤石蜡包埋标本，分别为移植术后肿瘤复发组(5例)移植术后肿瘤未复发组(5例)，以10μm的厚度连续切片20张，装于干净EP管中常温备用。

二、RNA抽提

1.样品处理

上述样品加入液氮研磨至细粉，最后转移至有1ml TRIzol的离心管中，反复振荡约5min。(如为细胞样品，则取约106～107左右的细胞数至1ml TRIzol中，反复吹打至裂解。)

2.相分离

室温放置10min左右后，每1ml TRIzol中加入氯仿为200μl，盖上盖子，剧烈振荡约1min，室温静置2～5min，然后12000g冷冻离心15min(6℃)，小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA样品。

3.RNA沉淀

小心吸取上清液约450μl(每1ml TRIzol的吸取量)至含有600μl冷冻异丙醇的新离心管中，混匀，-20℃放置约10min，12000g冷冻离心10min(6℃)。

4.RNA洗涤

去上清，加入500μl冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后12000g冷冻离心5min(6℃)，去上清，再稍离，吸去上清液。

5.RNA溶解

风干约5～10min(注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可)，加入DEPC水约30μl。贴上标签后-80℃保存。

6.RNA浓度测定

吸取1μl抽提的RNA用DEPC水稀释10倍后，在Nanodrop上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。

7.RNA电泳检测

7.1.变性胶制备

取1g Agarose+75ml去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10ml 10×Mops和15ml甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。

7.2.电泳缓冲液配制(1×Mops)

取50ml 10×Mops，用去离子水稀释至500ml，倒入电泳槽中，再在电泳缓冲液中添加EB.

7.3.RNA样品处理

取RNA样品3μl，补充DEPC水至18μl，65℃变性10min后立即冷却，加入2μl 10×RNA loading buffer即可电泳

7.4.RNA电泳

先把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶拍照。

三、microRNA microarray

采用miRCURY^TMArray Power标记试剂盒，用标记酶将Hy3^TM或Hy5^TM荧光基团标记miRNA，可以得到用于与芯片杂交的荧光探针。

在标准条件下使用MAUI杂交仪将标记好的探针和miRCURY^TM芯片杂交。

使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。

四、Taqman real-time PCR验证芯片结果并扩大样本量进一步验证差异表达miRNAs。

1.RNA的反转录

①按照下面的体系配制反转录MIX

表1

②轻轻混匀，稍微离心，用前置于冰上。

③每个样品取5.0ulRNA与7.0ul RT-MIX混合，然后加入3.0ul 5XRT PRIMER，轻轻混匀。

④按照下面的反应条件反转

表2

16℃	30min
		42℃	30min
85℃	5min
		4℃	∞

2.PCR扩增

PCR扩增程序：

表3

将上述芯片放入阅读机，检测结合到芯片上的所有蛋白质，得每个加样点的所有蛋白质图谱。

调节设立主要参数：检测分子量范围0-50,000道尔顿，激光强度200，检测敏感度9，检测点20-80。

3.数据分析

根据上述实验得到的肝癌肝移植术后肿瘤复发与肿瘤未复发组间差异表达的miRNAs的相对定量结果，采用统计学处理，计算病人的复发危险得分，一次得分去判断病人的复发情况。其判断复发的准确率为77％。

经过统计学Kaplan-Meier生存分析，miRNAs高复发危险组与低复发危险组间存在明显统计学差异，p＜0.05。Cox多因素分析提示差异表达的5个miRNAs是肝癌肝移植术后病人预后独立的判断因素

本发明的5个miRNAs不但有助于病人的肿瘤复发情况判断，也可独立用于符合Milan标准的病人的预后判断参考，有助于将符合Milan标准的病人划分为高复发危险组和低复发危险组，统计结果显示组间的生存率存在明显的差异；所述的5个miRNAs对于超出Milan标准的病人(无大血管侵犯)同样可作为高危险复发组和低危险复发组的分组参考标准，统计结果显示组间生存率的统计学差异明显；对于超过Milan标准而具有低危险miRNA得分(即低复发危险)和符合Milan标准而具有高危险miRNA得分(即高复发危险)的病人，这两组病人在整个生存率和无瘤生存期上无明显统计学差异；结果说明：对于超过Milan标准的病人，检测的5个miRNA为低危险得分，可以推测认为，即使该些病人超过了Milan标准，但是仍然可得到与符合Milan标准类似的预后。

本实施例的结果表明，本发明提供的5个miRNAs或综合指标可作为肝癌肝移植术后肿瘤的复发判断的参考，准确率达77％；同时，其不但可作为整个病例群体的肿瘤复发和预后情况判断的参考，对于根据Milan分层后的病人，所述的5个miRNAs或综合指标亦可分别作为肿瘤复发和预后情况的判断参考；因此，本发明可用于临床肝癌肝移植术后肿瘤高复发危险病人的筛选，帮助判断预后，早期诊断复发，为早期干预治疗及实施个体化治疗提供依据。

Claims

1.一种MicroRNA特异表达谱，其特征在于，所述的MicroRNA特异表达谱为hsa-mir-19a、hsa-mir-24、hsa-mir-223、has-mir-126和has-mir-886-5p。

2.按权利要求1所述的MicroRNA特异表达谱，其特征在于，所述的MicroRNA特异表达谱通过以下步骤获得：

(1)标本准备

肝癌肝移植术后离体肝脏肿瘤石蜡包埋标本；

RNA抽提试剂trizol抽提RNA，-80℃备用；

(2)microRNA microarray分析差异表达的miRNAs

采用microRNA microarray芯片分析肝癌肝移植术后肿瘤复发离体标本和肿瘤未复发离体标本间差异表达的miRNAs；

采用Array Power标记试剂盒，用标记酶将Hy3^TM或Hy5^TM荧光基团标记miRNA，得到用于与芯片杂交的荧光探针；

在标准条件下使用杂交仪将标记好的探针与上述芯片杂交；

使用芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算；

(3)Taqman real-time PCR验证芯片结果并扩大样本量，进一步验证差异表达miRNAs。

3.按权利要求2所述的MicroRNA特异表达谱，其特征在于，步骤(2)所述的芯片分析肝癌肝移植术后肿瘤复发离体标本和肿瘤未复发离体标本间差异表达的miRNAs中，调节设立主要参数为：检测分子量范围0-50,000道尔顿，激光强度200，检测敏感度9，检测点20-80。

4.权利要求1所述的MicroRNA特异表达谱在制备肝癌肝移植术后肿瘤复发早期诊断标准中的用途。

5.权利要求1所述的MicroRNA特异表达谱在制备肝癌肝移植术后肿瘤复发预后判断标准中的用途。