CN1025860C - 起交叉反应的环周子孢子蛋白保护性抗原决定基的制造方法 - Google Patents
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Abstract
含有相当疟原虫属某一成员的环周子孢子非重复抗原决定基氨基酸顺序的肽，该肽能诱发形成识别上述的疟原虫表面蛋白。
Description
本发明提供对疟疾有保护性免疫作用的多肽抗原的制造方法及，将其用于制备疫苗的方法。该抗原具有与环周子孢子蛋白氨基酸顺序片段相对应的氨基酸顺序，它们位于这些蛋白串联重复部分的外部。本发明的抗原可用来诱发抗体的形成，这种抗体不仅能识别同种疟原虫抗原，也可识别它种疟原虫抗原。
本申请参照下述各专利的发明：
（a）美国专利，№4，466，917，Nussenzweig，R.等人，发表于1984年8月21日。
（b）Ellis，J.等人已转让的未决美国专利申请，№574，553，题目是：“保护性抗原肽”，于1984年1月27日申请。和
（c）Ellis，J.等人已转让的未决美国专利申请，№633，147，于1984年7月23日申请，题目是：“恶性疟原虫环周子孢子蛋白的保护性抗原肽”。
大多情况下，疟疾是通过感染疟疾病原虫蚊子的叮咬，把子孢子（疟疾寄生虫高度免疫原的形式）注入宿主的血液中，从而引起发病的。子孢子的免疫原性，既使不是唯一地但也大多地存在于一个单独的抗原即环周子孢子（CS）蛋白中。（F.Zavala，A.H.Cochrane，E.H.Nardin，R.S.Nussengweig和V.Nussenzweig等人在《试验医学杂志》（J.Exp.Med），1983年，157卷1947页，已作了详述。G.N.Godaon等人在《自然》（Nature）1983年，305卷29页，报环周子孢子蛋白（CS蛋白），是蚊子唾液中子孢子表面膜多肽的成分之一。该子孢子系由哺乳动物属的疟疾寄生虫而来。子孢子的强免疫原性主要是与CS蛋白有关。此蛋白是子孢子阶段所特有，具有重复的抗原决定基的免疫显性区。诺（耳斯）氏疟原虫（猴）CS蛋白从N端到C端的重复序列是：谷氨酰胺-丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸。而恶性疟原虫CS蛋白的重复四肽序列是：天冬酰胺-丙氨酸-天冬酰胺-脯氨酸。由多个相同或类似的重复的氨基酸序列所组成的合成肽显示有抗原性，并可用它进一步制造疟疾疫苗。然而，令人遗撼的是，从CS蛋白免疫显性区得到的肽，它们之间很少显示同质性，因而它们只具有种属特异性的抗原。
由于CS蛋白重复抗原决定基的免疫显性迄今，还不能肯定：不含重复显性序列的CS蛋白的其它部分，是否能诱导出影响寄生虫存活的抗体。很明显，免疫抗原性本身并不能使那些诸如抗子孢子保护性抗原的非重复序列的肽具有实用性，因为这些片段需要在CS分子暴露的表面上才可被抗体识别。
本发明的一个目的是鉴定某一种属疟原虫环周子孢子表面蛋白的一些区域，即含该蛋白非重复性抗原决定基的区域。
本发明的另一个目的是鉴定CS蛋白非重复性抗原决定基，从而生产一种抗疟疾疫苗。
本发明还有一个目的是鉴定和合成肽（相当于CS蛋白非重复性抗原决定基）。该肽能在哺乳动物中诱导形成抗体，此抗体又可反过来去识别CS蛋白，特别是识别在子孢子表面上的CS蛋白。
本发明进一步的目的是鉴定与合成抗体，此诱导形成的抗体可识别多种疟原虫的CS蛋白。
本发明另一目的是以鉴定该肽为前提，进而制造一种合成的疟疾疫苗。
本发明还有一个目的是进一步生产一种用于制作哺乳动物用的疟疾疫苗的免疫因子。
本发明旨在生产某一种属疟原虫环周子孢子表面蛋白的某一抗原决定基肽，该肽不是该蛋白重复的免疫显性抗原决定基序列的肽，但该肽能在宿主中诱导形成识别环周子孢子表面蛋白的抗体。
本发明的肽是通过它诱导形成的抗体与CS蛋白相结合而被识别的。该抗体不但与产生此抗体的某种疟疾的CS蛋白结合，也能与其它种疟疾的CS蛋白质相结合。因为，免疫显性区外的CS蛋
白的序列是广泛同质性的。一旦一种这样的肽被鉴定，其它具有同样性质的肽的氨基酸序列（或核苷酸序列）就能容易地通过比较不同种CS蛋白的序列而鉴定出来。这些肽对于制造合成疟疾疫苗是非常重要的成分。这些疟疾疫苗可用人工合成的方法，也可用遗传工程的技术来制造。
图1是诺（耳斯）氏疟原虫CS蛋白细胞内前体的图解。
图2是柏氏疟原虫（小白鼠）子孢子萃取物与本发明合成的N和C肽抗体相作用的Western免疫吸附放射自显影图。
图3是诺氏疟原虫和恶性疟原虫CS蛋白免疫显性决定基外的蛋白片段的图解。这些片段的排列达到高度的同质性。
诺氏疟原虫和恶性疟原虫CS蛋白的一级结构已从其核苷酸序列被首次推算出来。（Godson，G.N等人），《自然》杂志（Nature），1984年，225卷，593页）。诺氏疟原虫CS蛋白的细胞内前体的图解，见图1。该蛋白的两个区含有大量电荷，此区在图1中用荷电表示，它可能含一个α-螺旋结构。蛋白氨基酸末端即N端的荷电区，其侧面与含随机氨基酸在重复区的片段相连接;而靠近C末端的荷电区则每侧与一对半胱氨酸残基相连接。
具有相当于这些荷电区氨基酸序列的肽已被合成。荷电区的极性特点说明它们是暴露在CS分子的表面上，此类肽可被抗子孢子的多克隆重抗体识别（Vergara，等人《分子生物、生化、寄生虫杂志》，1984年发表，Mol & Biochem Parasifol）此类肽的多克隆抗体，在证实这类肽免疫原性质的子孢子表面上，可识别并结合真正的诺氏疟原虫CS蛋白。N和C肽的抗体（图1）可在恶性疟原虫，间日疟原虫、三日疟原虫、巴西疟原虫、柏氏疟原虫和猴疟原虫等疟原虫子孢子表面上发生反应。
资料表明：免疫原的肽对应于（紧密相关于）大部或全部种属的疟疾寄生虫子孢子CS分子的暴露的外部片段，当CS分子在细胞内加工时，该片段没有被切除。
N2和C2肽与恶性疟原虫CS蛋白相应区域比较，如前Dame，等人发表文章所述，显示了高度的同质性。有意义的是：此类肽的抗血清可识别疟原虫属其它种的子孢子。
柏氏疟原虫可致感染的子孢子中含有一种肽（图1中的N肽）与其异种兔抗血清发生部分中和作用。这表明：该种疟原虫CS蛋白相应区域存在相关的结构，同还表明：N结构区在进化上是高度保守的。
以前的证据表明：CS蛋白重复部分的抗体中和含该CS蛋白的某种疟原虫子孢子的感染，意味着合成的含有这重复部分的抗原决定基的肽，可用于制备种属特异性的疫苗。本发明得出的结论是：合成的多肽或接合物和（或）其它肽的遗传工程产品，可替代保守的（无种属特异性的）和CS分子暴露区肽结构者，将保护宿主免受多种疟原虫中任何一种的侵袭。
例1：抗子孢子多克隆抗体
根据Vandenberg，J.P.等人的方法，在蚊子感染性血餐后10到18天内，从蚊子唾液腺里可得到诺氏疟原虫的子孢子。（见：“对柏氏疟的进一步研究一哺乳动物啮齿类寄生虫一史（蒂芬斯）氏按蚊”。寄生虫杂志，54：1009-1016，1968）这些子孢子是用来在家兔体内锈发多克隆抗体的。在三个月内，经十次静脉注射，共将106到107个活的子孢子注入免体内，便可锈发多克隆重抗体形成。
例2：肽的合成
选择合成一些肽，并局限免疫接种。第一个是由诺氏疟原虫CS蛋白的重复十二肽的二聚体所组成的二十四肽。这十二肽在图1中用打点的方块表示。合成的二十四肽叫作二倍重复体。二倍重复体是一个从N端到C端具有谷氨酰胺-丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸序列的二聚体。
另外二个肽，相当于CS蛋白的片段，位于图1的荷电区。第一个用N表示，相当图1中86-99位氨基酸，其序列是：脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-谷氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸-天冬酰胺-谷氨酸。第二个用C2表示，相当于CS蛋白312-331位氨基酸，其序列是：精氨酸-精氨酸-赖氨酸-丙氨酸-组氨酸-丙氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-苏氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬
氨酸-亮氨酸-谷氨酸。
最后合成两条附加的肽链。C1链和荷电链，C1肽链的氨基酸序列起自重复区，朝向C末端排列。它全部氨基酸组成与重复区的相似。荷电的肽链相当于荷电区内紧邻N2片段向着N末端的序列。C1的序列是：甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-精氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-精氨酸。荷电链的序列是：赖氨酸-脯氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-赖氨酸-谷氨酸-赖氨酸-甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氢酸-甘氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸。
所有肽都是在Vega型250c自动合成机上合成的（产自Vega生物化学公司，Tuscon，Arizona，合成机采用Mersified，R.B.程序用电子计算机控制。（见：Fed.Proc.21∶412，1962年;J.Am.Chem.Soc.85∶2149，1963年）。
下述的十二肽合成方法是所有肽链合成的典型例子。把3克二苯甲基胺树脂悬浮，用二氯甲烷洗三次，用乙醇洗三次，置入合成机内，再用二氯甲烷洗三次。经过2分钟的冲洗后，树脂用50%三氟乙酸（含10%溶在二氯甲烷中的苯甲醚）处理30分钟，再用二氯甲烷洗十遍，用溶在二氯甲烷中的10%的二异丙基乙胺洗二次用以中和，在有溶于二氯甲烷，超过3克分子浓度的羟基三唑存在的条件下，用超过三倍克分子数的二环己基碳化二亚胺;使第一个丁氧羰基氨基酸（BOC-氨基酸）连接在树脂上1小时。第二个小时中，加用一些羟苯三唑和一些二异丙基乙胺，以超过BOC-氨基酸3倍的克分子数加入。树脂在二氯甲烷中洗三次，在纯乙醇中洗三次并在二氯甲烷中再洗三次。取出一部分混合液用Kaiser氏茚三酮程序测定。（Kaiser，E.等人，Analyt.Biochem.34∶595，1970）结果肽的氨基酸序列是：BOC-谷氨酰胺（NPE）-丙氨酸-谷氨酰胺（NPE）-甘氨酸-天冬氨酸（OBZ）-甘氨酸-丙氨酸-天冬酰胺（NPE）-丙氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺（NPE）-脯氨酸-CO-BHA，除去保护性肽树脂，免除HF分裂。
分裂是在Pennisula HF装置中进行。（Peuuisula，Laboratory，San Carlos，Calif）。在有苯甲醚（1，2ml/mg树脂），甲基乙基硫醚（1ml/mg）存在，0℃下反应一小时，然后将混合液置于高真空下干燥。再用冷无水乙醚洗，用水和冰醋酸交替冲洗萃取之，最后冷冻干燥。将粗肽混合液（每份200mg）在一个Sephebex（交联等聚糖）G-25柱（120×2.0cm）上，通过凝胶过滤脱盐，该柱用0.1M NH4HCO3，在pH8.0下平衡。从柱流出的液体用LKBUV-CordⅢ监测仪在254和206nm下通过对紫外线的吸收，将收集的肽定性。
例3：纯化能与特异性合成肽反应的抗体
将能识别肽的多克隆重抗体与例1中制备的抗子孢子家兔抗血清分离。根据制造者的指示，把肽连接到活化的Sepharose-4B珠上Sepharose为琼脂糖的商品名）。（Pharmacia Fine Chemical Company，Piscataway，New Jersey）将Sepharose-4B珠在pH8.8条件下，用0.25M.NaHCO3中的0.005M戊二醛处理1小时。洗过的珠在pH9.0下，用1M的乙醇胺恒温孵育1小时，再用磷酸缓冲液（PBS）反覆冲洗，并在pH7.4下将其悬浮于磷酸缓冲液（PBS）中。
为了除去任何非特异性的结合物质，用结合了无关肽链的珠先吸收抗诺氏疟原虫的抗血清。例如：为纯化抗C2肽的抗体，则用携带有N2肽的珠吸收抗血清样品，然后用携带有相当于荷电区肽片段的珠吸收，最后用携带有重复区肽片段的珠吸收抗血清样品。经上述处理后，将最后一次吸收得到的上清液，在室温下与含有兴趣肽（本例为C2肽）的珠一起恒温孵育数小时。用PBS反覆多次冲洗后，结合在珠上的抗体，通过用3M硫氰化钾处理，将抗体从珠上洗脱下来。洗脱液立即通过一个小的SephadexG-25柱过滤，以除去小分子。这些纯化了的抗体便可用于测定合成肽。
例4：放射性免疫试验
根据例2的方法制备N2、C2荷电区肽（相当于诺氏疟原虫CS蛋白的99-86位氨基酸）、C1肽（相当267-245位氨基酸）和2倍重复区肽。得到的肽分别在0.1M碳酸氢钠，pH9.6条件下稀释到20微克/毫升。取50微升稀释液置入聚乙烯微滴定盘的孔中（Dgnatech Laboratonis制造，
Inc，Alexaudria，Virginia）。在4℃下恒温过液，用含Tween20的缓冲液（Biorad Laboratories产品，Richmond，Calif），洗三次，在4℃下用溶于PBS中的1%小牛血清液处理2小时，并冲洗。继之，把适当的家兔抗子孢子抗血清（来自例3）的一系列稀释液加在微滴定盘孔中，每孔加入25微升，然后，将滴定盘4℃下恒温反应2小时。冲洗后。加入含1%小牛血清的磷酸缓冲液30微升，此液中含有每分钟放射计数为5×104cpm的125I标记的亲合纯化的山羊抗兔免球蛋白IgG，恒温孵育2小时后，冲洗并切下滴定盘小孔，计数。在含肽小孔中加入正常兔血清，同上处理作为对照。结果表明：家兔抗子孢子抗血清含有抗2倍重复区，N区和C区肽的抗体（试验孔中得到的计数减去用正常家兔血清稀释液恒温标记的对照孔中得到的计数）。结果表明：抗血清识别四个肽，N2、C2、荷电区肽和2倍重复区肽，而不识别C1肽。
反应的特异性用抑制试验估价。用预加到微滴定盘孔中同样肽的一系列稀释液与一已知浓度的抗子孢子抗血清稀释液恒温反应，然后用125I标记的山羊抗兔IgG处理。结果表明：兔抗子孢子抗血清可特异性的识别N2、C、荷电区和2倍重复区肽。这种抗血清反应，在抗重复区肽和C肽中，其活性表现较高;而抗N2肽抗体的滴定表现较低。由于抗原抗体结合仅被共同质的肽所抑制，所以上述各肽反应是特异性的。
例5：免疫吸附
通过用子孢子萃取液进行的Western吸附法，测试亲合、纯化的抗C2肽抗体、抗多肽抗体排除了，用抗子孢子抗体识别肽时与子孢子制备液中存在的无关抗原发生假性交叉反应的可能性。结果表明：这些抗体（抗C2抗体、抗多肽抗体）既可识别细胞内的前体，又能识别与膜相连的CS蛋白。而抗C2抗体抗重复区肽的放射免疫测定试验是阴性的，这表明混杂的抗体是不存在的。
Western吸附法操作如下：
把子孢子萃取液（105/ml）在10%SDS（十二烷基磺酸钠）聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离。把分离出的蛋白用电泳方法转移到硝酸纤维纸页上。（见：Towbin，H.等人，“将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维纸页的电泳法程序和应用”，刊在Proc.Natl.Acod.Sci.U.S.A，76：4350-4354，1979）在37℃下，，将硝酸纤维纸用含5%小牛血清和正常山羊血清的磷酸缓冲液浸泡1小时，使其饱和。然后，把不同行的含样纸条切下，把每条分别与不同的亲合纯化抗肽抗体恒温反应。抗肽抗体包括：抗2倍重复区抗体，抗荷电区肽抗体和抗C2肽抗体。用抗整个子孢子的抗血清作为对照。用含1%小牛血清的PBS充分冲洗后，将纸条在室温下与亲合纯化的I标记的山羊抗兔Ig恒温反应2小时。冲洗纸条、干燥，然后放射自显影曝光。在任何情况下，都有两个特异性带，一个相当于分子量为52，000道尔顿的肽;（诺氏疟原虫CS蛋白细胞内前体）和另一个相当于分子量为42，000道尔顿的肽;（诺氏疟原虫CS蛋白本身）仅在与抗子孢子抗血清稀释液恒温反应时，抗重复区肽的活性，才能在小孔内观察到。
例6：由合成肽诱发抗体
根据Likhite的方法（刊在“免疫学和免疫化学”，Curtis，C.SA和Chase，W.A，（Eds），Acad Press，New York1967，150-157页），用碳化二亚胺把合成的2倍重复区，N2和C2肽结合到锁眼
血兰蛋白（Keyhole limpet hemocyanin）上。结合物在完全的福氏佐剂中乳化，并注射到兔（500微克）和鼠（100微克）的足底垫中。发生免疫后6周给动物放血。用Nardin，E.H等人的间接免疫荧光法（R.Bull.WHO57（suppl）：211-217，1979）测定抗每一种疟原虫以戊二醛固定的子孢子的抗血清。抗重复区肽的抗血清。具有严格种属特异性，即只识别诺氏疟原虫。而抗N、C肽的抗血清，则不仅能识别诺氏疟原虫，也能与柏氏疟原虫、猴疟原虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和巴西疟原虫发生反应。无论是抗N或抗C血清，都能与柏氏疟原虫子孢子恒温混合发生CSP（成熟、致染子孢子与抗血清之间发生的沉积反应。这就意味着它们都在疟原虫末端诱导形成突起的、尾状聚集物（见：Vandenbery J等人在Mil Med154（suppl：1183-1190页报道，1969）。由于它们都被悬在恒温介质中的同质肽（浓度为50微克/微升）所抑制，而不被相同浓度的异质肽所抑制，说明这些反应都是特异性的。没有抗血清与鸡疟原虫子孢子发生反应。
上述结果说明C和N肽都是暴露在CS蛋白分子的外部，它们容易与一些抗体相互作用。抗
N抗体、抗C抗体与子孢子的反应活性，有力地说明：在疟疾寄生虫表面有相应的肽，当疟原虫在细胞内衍变时，此肽未被除去。用柏氏疟原虫和恶性疟原虫子孢子萃取液的免疫吸附也证明了这一点。
例7：柏氏疟原虫子孢子的免疫吸附
将柏氏瓶原虫作10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（每槽装105↑子孢子）处理，然后把得到的蛋白转移到硝酸纤维纸上。将载有子孢子的硝酸纤维纸用5%小牛血清饱和，与5%山羊血清恒温反应，再与抗柏氏疟原虫单克隆重抗体、抗体3D11，抗C或N抗体恒温反应，冲洗，再与第二个放射性标记抗体恒温反应（亲合、纯化的山羊抗兔或抗鼠免疫球蛋白）。将冲洗过的纸条经放射自显影处理。在柏氏疟原虫萃取液中，通过抗N2或C2抗体，测到分子量为52，000和44，000的二条特异性多肽。分子量为44，000的肽代表52，000肽的已加工的形式，已发现其位于柏氏疟原虫的表面膜上。我们的结论是：表面膜多肽必定含有大部分像CS蛋白C末端和N末端的结构，分别与C2和N2极为相似。
这个免疫吸附试验结果以图2表示。第一道和第五道为对照，分别含鼠和兔的血清。第二道含鼠抗C2抗血清，第三道含兔抗N抗血清，而第四道含柏氏疟原虫CS蛋白的单克隆抗体。用同样方法做恶性疟原虫的Western吸附图，其抗C2和抗N2反应也是阳性的。
例8：用兔抗诺氏疟原虫的抗体，部分中和柏氏疟原虫子孢子。
用抗血清（0.2毫升）或正常家兔血清对照，与0.5ml199介质来自Gibco公司，Grond lsland，N.Y在室温下恒温孵育45分钟，该介质液中含有切割按蚊唾液腺而得到的子孢子3×104个。孵育后，取0.2毫升（5×10个子孢子）加1毫升介质，静脉注射给5只A/J鼠，然后，每天检查疟原虫在红细胞的出现。在四种不同的试验中，均有抗N2抗体部分中和寄生虫的证据。
用抗N2抗体处理过的寄生虫所接种的一些鼠，没有发病。在各个试验组中发病前驱期都比对照组长。结果见表1。
（表1见文后）
发病前驱期的增的增长，意义很大，因为根据Schmidt，N.H等人（刊在：Am.J.Trop.Med.Hyg31（suppl）：612-645，1982）的报道：发病第一天注射子孢子所需用量的相关反应曲线是十分平坦的。
在其它两个相近的试验中，能与柏氏疟原虫子孢子发生很强CSP反应（成熟致感的子孢子与抗血清之间的反应）的兔抗C2血清，没有明显抑制子孢子感染鼠的作用。
例9：不同种属子孢子CS蛋白同质区的排列。
Daghoff，M.O等人在“酶学方法”（91：524-545，编者：Hirs，C.H.W，和Timasheff，S.N，Acad，Press，N.Y，N.Y，1983）中报道，用ALLIGN计算机程序估计三种环周子孢子蛋白（诺氏、恶性、猴疟原虫）含重复区肽的片段之间的同质程序。
这三种蛋白的重复区是十分不同的，诺氏疟原虫的为：谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-甘氨酸-谷氨酸-脯氨酸;恶性疟原虫的为：脯氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-天冬酰胺;猴疟原虫的为：天冬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺。
诺氏疟原虫和恶性疟原虫重复区之间相比，略有差异。（偏差为4.41S.D。在此，偏差3.0，表明二者可能相关）这一计算结果表明：对诺氏疟原虫重复区起反应的一些单克隆抗体，对恶性疟原虫只起微弱的交叉反应。此点与Cochrane等人报道（刊在：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79：5651，1982）的结果相同。
与上相反，用ALIGN程序分析三个种的重复区以外的氨基酸序列，发现其差异十分显著。诺氏疟原虫与恶性疟原虫之间偏差为27.37S.D;猴疟原虫和诺氏疟原虫之间为24.57S.D;猴疟原虫与恶性疟原虫之间为16.28S.D。
诺氏疟原虫的N和C肽与恶性疟原虫相应的荷电区肽之间，具有特别高的同质度，足以保证其三级结构及功能性质的相似。（见图3）。这二个片段的按排序列，通过视觉观察都可知其最大的同质度。在图3中，用白格子表示同质区，用暗格子表示的是残基。Mc Lachian，A.D发现：该残基经
常通过同质蛋白间单↑碱基的替换而互变。（J.Miol.Biol.61：409-424，1971）
上述可伸延到诺氏疟原虫重复区起始氨基酸的那些肽结构区片段的广泛同质性，证明：CS蛋白在这个肽区结构中，种系间是高度保守的。这意味着，此CS分子的N-末端可能与子孢子的重要功能有关。
不同种属的CS蛋白同质区的排列可作为鉴定不同种属CS蛋白中同质的肽。于是，恶性疟原虫CS蛋白中，相当于诺氏疟原虫N2片段的区域，其氨基酸按排序列是：精氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-组氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。
与此相似，恶性疟原虫CS蛋白中，相当于C片段的区域，其结构将是：赖氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-酷氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-异亮氨酸-谷氨酸。
一旦知道了这些氨基酸的序列，就可以算出相应核苷酸的序列。含有这些核苷酸的DNA片段就可用于遗传工程。用遗传工程的技术可将与上述肽区结构相应的DNA片段连接起来，以制备遗传工程的抗原。这些抗原，在宿主体内，不断地诱发抗体形成，从而增加抗子孢子的中和活性能力。这种动物种系之间交叉的活性能力，对创造保护哺乳动物抗疟原虫疫苗来说，是至关重要的成分之一。
表1：经抗N抗体处理的与未处的子孢子发病天数（前驱期）的比较与子孢子共同恒温孵育反应的血清
抗N抗体（试验） 正常血清（对照）
试验号 感染鼠数/ 发病天数±SD 感染鼠数/ 发病天数±SD
注射鼠数 注射鼠数
1 0/5 5/5 5.6±0.4
2 4/5 6.4±0.4 5/5 4.8±0.4
3 5/5 5.4±0.4 5/5 4.0
4 5/5 5.6±0.7 5/5 4.4±0.7
Claims (1)
1、生产包括氨基酸序列Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Ile-Tyr-Glu-Asn-Asp-Ile-Glu的肽抗原的方法，该抗原含有恶性疟原虫环周子孢子蛋白的非重复性抗原决定基，该肽能诱发与该抗原决定基结合的抗体的形成且其长度远远短于该蛋白质，该方法包括合成该肽。
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