CN102574834A - 氟化的2,6-二烷基-3,5-二氰基-4-(1h-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有蛋白酪氨酸激酶抑制活性的新的氟化的2,6-二烷基-3,5-二氰基-4-(1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶衍生物，其制备方法及其用于治疗c-Met-介导的疾病或c-Met-介导的病症，特别是癌症和其它增殖性疾病的用途。

Description

氟化的2,6-二烷基-3,5-二氰基-4-(1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶及其使用方法

本发明涉及具有蛋白酪氨酸激酶抑制活性的新的氟化的2,6-二烷基-3,5-二氰基-4-(1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶衍生物，其制备方法及其用于治疗c-Met-介导的疾病或c-Met-介导的病症，特别是癌症和其它增殖性疾病的用途。

癌症是最常见的广泛传播的疾病之一。在2002年，全世界超过440万人被诊断患有乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌或前列腺癌，并且超过250万人死于这些致病性疾病(Globocan 2002 Report, http://www-dep.iarc.fr/globocan/down­loads.htm)。仅在美国，预计在2005年有超过125万的新增病例并且有超过500 000人死于癌症。这些新增病例中的大多数预计是结肠(~100 000)、肺(~170 000)、乳腺(~210 000)和前列腺(~230 000)的癌症。预计在未来十年癌症的发病率和流行率都增加约15%，表现出1.4%的平均增长率(American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2005；http://www.cancer.org/docroot/STT/content/STT_1x_Cancer_Facts_Figures_2007.asp)。

癌症的发生可以有许多方式，这是它们的治疗很困难的原因之一。一种方式是细胞通过癌蛋白的转化，癌蛋白通过遗传突变来源于正常细胞蛋白质，转化导致这些蛋白质非生理学活化。许多癌蛋白来源的一个家族的蛋白质是酪氨酸激酶 (例如，src 激酶)，特别是受体酪氨酸激酶 (RTKs)。在过去的二十年中，许多方面的研究已经证实受体酪氨酸激酶 (RTK)-介导的信号在哺乳动物细胞生长调节中的重要性。近来，临床使用酪氨酸激酶的选择性小分子抑制剂作为抗肿瘤剂已经取得了成果。

c-Met受体也是受体酪氨酸激酶。在二十世纪八十年代初鉴定了其致癌潜能，那时从化学诱导的人骨肉瘤细胞系中分离到突变的Met，所述细胞系含有与其N-端的二聚体化功能域稠合的Met基因的激酶结构域[C.S. Cooper等，Nature 311：29-33 (1984)]。

细胞Met蛋白是合成为单链190 kd前体的异二聚化跨膜蛋白质[G.A. Rodrigues等，Mol. Cell Biol. 11：2962-70 (1991)]。该前体在氨基酸残基307之后进行细胞内裂解以形成50 kd 的α-链和145 kd的β-链，二者通过二硫键连接。α-链完全是细胞外的，而β-链可以跨越质膜。β-链由N-末端的sema结构域组成，该结构域与α-链一起调节配体结合。β-链外功能域的剩余部分由半胱氨酸富集结构域和四个免疫球蛋白功能区组成，其随后为跨膜区域和细胞内结构域。细胞内结构域含有近膜域、激酶结构域和C-末端结构域，其调节下游信号。一旦配体结合，诱导受体的二聚化，激酶结构域通过近膜区域(Y1003)、激酶 (Y1234和Y1235)的活化环和羧基-末端结构域(Y1349和Y1356)中的酪氨酸自磷酸化步骤的级联活化。磷酸化的Y1349和Y1356包含下游c-Met发信号所需的结合接头蛋白的多底物停靠位点 [C. Ponzetto等，Cell 77：261-71 (1994)]。c-Met发信号最重要的底物之一是支架（scaffolding） 接头蛋白Gab1，其通过异常磷酸酪氨酸结合位点(术语mbs：met结合位点)与Y1349或Y1356结合，导致独特的延长的细胞内信号。另一重要的底物是接头蛋白Grb2。根据细胞环境，这些接头物调节各种细胞内信号途径的活化，例如通过ERK/MAPK、PI3K/Akt、Ras、JNK、STAT、NFκB和β-连环蛋白发信号的那些。

c-Met独特地通过肝细胞生长因子(HGF) (还称为分散因子)及其剪接变体活化，这是其已知的唯一生物学活性配体 [L. Naldini等，Oncogene 6：501-4 (1991)]。HGF具有独特的结构，其显示与纤溶酶原家族的蛋白水解酶的相似性。它由非酶活性的氨基-末端结构域组成，氨基-末端结构域之后为四个kringle结构域和丝氨酸蛋白酶同源性结构域。与c-Met相似，HGF被合成为非活性单链前体(前-HGF)，非活性单链前体被丝氨酸蛋白酶(例如，纤溶酶原活化剂和凝血因子)细胞外裂解并转化为二硫化物连接的活性α-和β-链异二聚体。HGF以高亲和力结合硫酸类肝素蛋白多糖，这使其保持主要与细胞外基质结合并限制其扩散。晶体结构分析表明HGF形成二聚体，其一旦与c-Met结合即诱导受体的二聚化。

HGF由间质细胞表达，其与特别是在上皮细胞中广泛表达的c-Met结合在各种组织包括上皮细胞、内皮细胞、神经元细胞和造血细胞中导致多效性。该效应通常包括下列现象的一种或全部：i) 刺激有丝分裂发生；通过对肝细胞的有丝分裂促进活性鉴定出HGF；ii) 刺激侵入和迁移；在独立的实验方法中，基于其细胞运动性(“分散”)的诱导作用，HGF被鉴定为分散因子；和iii) 刺激形态发生(小管发生)。HGF诱导来自犬肾细胞的分枝小管在胶原基质中的形成。此外，来自遗传修饰的小鼠和细胞培养试验的证据表明c-Met可以作为存活受体并保护细胞免于凋亡 [N. Tomita等，Circulation 107：1411-1417 (2003)；S. Ding等，Blood 101：4816-4822 (2003)；Q. Zeng等，J. Biol. Chem. 277：25203-25208 (2002)；N. Horiguchi等，Oncogene 21：1791-1799 (2002)；A. Bardelli等，Embo J. 15：6205-6212 (1996)；P. Longati等，Cell Death Differ. 3：23-28 (1996)；E.M. Rosen, Symp. Soc. Exp. Biol. 47：227-234 (1993)]。HGF的这些生物学进程的协调执行会产生特异的遗传程序，其被称为“侵袭性生长”。

在正常条件下，c-Met和HGF对于小鼠的胚胎发育，特别是对于胎盘和肝的发育以及四肢体节的成肌细胞的定向迁移是必不可少的。c-Met或HGF基因的遗传中断导致相同的表型，这表明它们独特的相互作用。人们对成年生物体中c-Met/HGF的生理学作用了解较少，但实验证据表明它们与伤口愈合、组织再生、造血作用和组织稳态有关。

癌蛋白TPR-MET的鉴别是c-Met在肿瘤发生中可能发挥作用的最重要的暗示。其它重要的证据来源于许多不同的实验方法。人和鼠细胞系中c-Met或HGF的过表达诱导肿瘤发生和转移表型(当在裸鼠中表达时)。c-Met或HGF的转基因过表达诱导小鼠的肿瘤发生。

更有趣地，已经在散发性和遗传性乳头状肾癌(HPRC)以及其它癌类型例如肺癌、胃癌、肝癌、头和颈癌、卵巢癌和脑癌中鉴定了c-Met的错义突变或活化受体的突变。重要地，HPRC家族的特异性c-Met突变与疾病隔离，形成c-Met活化和人癌症之间的因果关系[L. Schmidt等，Nat. Genet. 16：68-73 (1997)；B. Zbar等，Adv. Cancer Res. 75：163-201 (1998)]。具有最强转化活性的活化突变位于活化环(D1228N/H和Y1230H/D/C)和邻近的P+1环(M1250T)。已经发现其它较弱的突变接近催化环并在激酶结构域的A叶。此外，在肺肿瘤中已经观察到c-Met近膜域中的某些突变，其不直接活化激酶，而是通过使蛋白质对遍在蛋白化和随后的降解耐受来稳定蛋白质[M. Kong-Beltran等，Cancer Res. 66：283-9 (2006)；T.E. Taher等，J. Immunol. 169：3793-800 (2002)；P. Peschard等，Mol. Cell 8：995-1004 (2001)]。有趣地是，c-Met的体细胞突变与各种癌症中增加的侵润性和广泛的转移相关。当种系和体细胞突变的频率较低(低于5%)时，已经观察到其它主要机制，在没有突变的情况下，其通过旁泌性或自身内分泌机制导致c-Met信号脱调节。在来源于间质细胞的肿瘤例如在生理学上产生HGF的骨肉瘤或横纹肌肉瘤中，以及在外胚层来源的胶质母细胞瘤和乳癌中已经观察到旁泌性活化。

然而，最常见的病例是其中c-Met过表达的癌，如在结肠、胰、胃、乳腺、前列腺、卵巢和肝的癌中观察到的。例如，通过基因扩增可以发生过表达，如在胃和肺肿瘤细胞系中观察到的。最近，在获得对EGF 受体抑制作用的抗性的肺肿瘤细胞系中检测到c-Met的过表达 [J.A. Engelmann等，Science 316：1039-1043 (2007)]。某些过表达c-Met的上皮性肿瘤也共表达HGF，导致自分泌c-Met/HGF刺激环并从而规避间质细胞来源的HGF的需要。

一般而言，已经发现无论其具体机制如何，人癌症中c-Met的异常活化通常与预后不良相关 [J.G. Christensen等，Cancer Lett. 225：1-26 (2005)]。

总之，已经进行了许多证实c-Met为重要的癌靶点的体外和体内研究，全面的列表可以在 http://www.vai.org/met上查看 [C. Birchmeier等，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4：915-25 (2003)]。已经采用许多策略来减弱人肿瘤中异常的Met发信号，包括HGF拮抗剂和小分子抑制剂等等。目前许多小分子抑制剂正处于临床研发中，例如ARQ-197 (Arqule)、foretinib (XL-880, Exelixis/GSK)和PH-2341066 (Pfizer)；最近已经对它们进行了综述 [J.J. Cui, Expert Opin. Ther. Patents 17：1035-45 (2007)]。

在WO2006/066011-A2中，在4-位具有芳基或杂芳基的卤代烷基-取代的3-氰基-1,4-二氢吡啶衍生物已经描述为甾体受体和钙通道活性的调节剂，由此特别适用于治疗心血管疾病。使用4-苯基-1,4-二氢吡啶衍生物治疗阿尔茨海默氏病的方法已经在WO 2006/074419-A2中被要求保护。

具有 c-Met激酶抑制活性的各种取代的3-氰基-4-杂芳基-1,4-二氢吡啶近来被公开在WO2008/071451-A1。在这种新结构类型的 c-Met抑制剂的进一步研究中，然而，出现了候选化合物经常受到不能令人满意的口服生物利用率的连累，该口服生物利用率结果是显著低于在大鼠的血液清除率测定中的最初预期。由于口服生物利用率还取决于化合物吸收的多好，和考虑到这些化合物的药物动力学和物理化学性质，假定穿过胃肠道的低溶解度和/或不充分的渗透性可能导致在吸收方面的限制。

根据本发明要解决的技术问题因此可以看成鉴别对c-Met激酶具有有效抑制活性的备选化合物，其将(would)显示增加的溶解性和/或渗透性，随后在经口给予这些化合物之后产生增加的级分吸收。

令人惊讶地，现在已经发现某些氟化的3,5-二氰基-4-(1H-吲唑-5-基)-2,6-二烷基-1,4-二氢吡啶衍生物，其中在2和6位的烷基之一具体地代表二氟甲基或三氟甲基基团，展现显著改进的体外渗透性质（如在公认的肠细胞实验中评价）。

­­由此，在一个方面中，本发明涉及通式(I)的氟化的2,6-二烷基-3,5-二氰基-4-(1H-吲唑-5-基)-1,4-二氢吡啶衍生物

(I)，

其中

R¹是氢或氟，

R²是任选地被至多五个氟原子所取代的(C₁-C₅)-烷基，

R³是氢或氟，

R⁴是氢或(C₁-C₄)-烷基，

和

R⁵是氢或甲基。

本发明化合物还可以它们的盐、水合物和/或溶剂化物的形式存在。

用于本发明的盐优选为本发明化合物的药学上可接受的盐 (例如，参见S. M. Berge等，"Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19)。

本发明化合物或它们的盐的水合物为化合物或盐与水的化学计量组合，例如，半水合物、一水合物或二水合物。

本发明化合物或它们的盐的溶剂化物为化合物或盐与溶剂的化学计量组合物。

­本发明的范围中(C₁-C₅)- 烷基和 (C₁-C₄)- 烷基代表直链或者支链的饱和烃基团，分别地具有1-5和1-4个碳原子。具有1-4个碳原子的直链或者支链烷基是优选的。­非限制性实例包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基， 1-乙基丙基，正戊基，和新戊基。

本发明化合物可以因为不对称中心的性质或旋转受限而以异构体(对映体，非对映体)的形式存在。任何异构体都可以存在，其中不对称中心为(R)-、(S)-或(R,S)构型。

还应当理解，当本发明化合物中存在两个或多个不对称中心时，例示结构的若干非对映体和对映体通常是可能的，纯的非对映体和纯的对映体代表着优选的实施方案。

本发明化合物的所有异构体，无论是否分离、纯净、部分纯净或者非对映体或外消旋混合物，都包含在本发明的范围内。所述异构体的纯化和所述异构体混合物的分离可以通过本领域已知的标准技术实现。例如，通过色谱方法或结晶可以将非对映体混合物分离为单独的异构体，通过在手性相上的色谱方法或拆分可以将外消旋化合物分离为各自的对映体。

此外，本发明包括上述化合物的所有可能的互变异构形式。

在优选实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中

R¹是氢或氟，

R²是任选地被至多三个氟原子所取代的(C₁-C₄)-烷基，

R³是氢或氟，

R⁴是氢，甲基或乙基，

和

R⁵是氢。

在特别优选的实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中

R¹是氢或氟，

R²是甲基，乙基，2,2,2-三氟乙基，丙基，3,3,3-三氟丙基或2-甲基丙基，

R³是氢或氟，

R⁴是氢或甲基，

和

R⁵是氢。

在另一实施方案中，本发明涉及用于制备通式(I)的化合物的方法，其特征在于通式(II)的吲唑基醛

(II),

其中R³和R⁴具有上述含义，

在酸、酸/碱组合和/或脱水剂存在的情况下与式(III)的酮腈或其烯醇化钠反应

(III)，

其中R²具有上述含义，

­以得到式(IV)的化合物

(IV),

其中R²，R³和R⁴具有上述含义，

且后者然后与式(V)的烯氨基腈(enaminonitrile)缩合

(V),

其中R¹具有上述含义，

以得到式(I-A)的化合物

(I-A),

其中R¹，R²，R³和R⁴具有上述含义，

任选地随后在碱存在下使用式(VI)的化合物进行二氢吡啶N-甲基化

CH₃－X (VI),

其中

X代表离去基团例如卤素，甲磺酸酯基，三氟甲基磺酸酯基，甲苯磺酸酯基或硫酸酯基，

以得到式(I-B)的化合物

(I-B),

其中R¹，R²，R³和R⁴具有上述含义，

­­­­和任选地视需要随后(i)将化合物(I-A)和(I-B)分离成其各自的对映体和/或非对映体，优选地使用色谱法，和/或(ii)通过用相应溶剂处理将化合物(I-A)和(I-B)转化成其各自的水合物或溶剂化物。

­该方法序列(II)+(III)→(IV)，(IV)+(V)→(I-A)可以如上所述在两个分开的步骤中进行，或通过使用1-罐法程序，即­­­­­没有明显分离中间体化合物(IV)；在一些情况下，取决于单独反应物的活性，还可以进行化合物(II)，(III)和(V)的1-烧瓶/3组分缩合反应 [针对1,4-二氢-吡啶类的合成通常参见例如，D.M. Stout, A.I. Meyers, Chem. Rev. 1982, 82, 223-243; H. Meier 等人, Liebigs Ann. Chem. 1977, 1888; H. Meier 等人, 如前述 1977, 1895; H. Meier 等人, 如前述 1976, 1762; F. Bossert 等人, Angew. Chem. 1981, 93, 755]。

­­方法步骤(II)+(III)→(IV)和(IV)+(V)→(I-A)通常在惰性溶剂中在从+20℃到溶剂沸点的温度范围在大气压力下进行。

­­­­­­­­­­适于此目的的溶剂例如是醇例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇或正戊醇，烃例如己烷、环己烷、苯、甲苯或二甲苯，卤代烃例如二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、三氯乙烷、1,2-二氯乙烷、氯苯或氯甲苯，醚例如四氢呋喃、1,4-二氧杂环己烷或1,2-二甲氧基乙烷，或其它溶剂例如乙腈或乙酸。也可使用这些溶剂的混合物。­­­­反应(II)+(III)→(IV)优选在二氯甲烷，甲苯，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇或正戊醇中在各自的回流温度在大气压下进行，和反应(IV)+(V)→(I-A)优选在乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，正戊醇，二甲苯或乙酸中也是在回流温度在大气压下进行。

­反应(II)+(III)→(IV)可以有利地在酸，酸/碱组合和/或脱水剂，例如分子筛的存在下发生。­­­合适的酸的实例是乙酸，三氟乙酸，甲烷磺酸和对甲苯磺酸；合适的碱特别地为哌啶或吡啶。­­取决于组分活性，转化(IV)+(V)→(I-A)可以在没有进一步辅助反应剂下进行，或其可以通过酸催化促进，优选地使用乙酸。

­­­­­­­­­用于甲基化反应(I-A)+(VI)→(I-B)的惰性溶剂例如是醚类例如二乙醚，甲基叔丁基醚，四氢呋喃，1,4-二氧杂环己烷或1,2-二甲氧基乙烷，烃例如苯，甲苯，二甲苯，己烷或环己烷，卤代烃例如二氯甲烷，氯仿，四氯甲烷，1,2-二氯乙烷，三氯乙烷，四氯乙烷，氯苯或氯甲苯，或其它溶剂例如乙腈，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲基亚砜(DMSO)，N,N'-二羟甲基亚丙基脲(DMPU)， N-甲基吡咯烷酮(NMP)或吡啶。也可使用这些溶剂的混合物。­­优选地，使用二氯甲烷，四氢呋喃，N,N-二甲基甲酰胺或其混合物。

­­­­­适合方法步骤(I-A)+(VI)→(I-B)的碱特别地是碱金属或碱土金属碳酸盐例如碳酸锂、钠、钾、钙或铯，氢化碱金属例如氢化钠或钾，空间位阻的醇化碱金属例如叔丁醇钠或钾，空间位阻的氨基碱金属例如双(三甲代甲硅烷基)氨基化锂、钠或钾或二异丙基氨基锂，或有机胺例如三乙胺，N-甲基吗啉，N-甲基哌啶，N,N-二异丙基乙胺或吡啶。­­优选使用碳酸钾，碳酸铯或氢化钠。

­­反应(I-A)+(VI)→(I-B)通常在大气压下在温度范围为-20℃至+100℃，优选地在0℃到+50℃进行。

­­式(II)，(III)，(V)和(VI)的化合物是可商购的、文献已知的或可以从可容易获得的原材料通过调整描述于文献中的标准方法制备(作为进一步的参照，参见以下实验章节)。

本发明化合物的制备可以通过以下合成方案举例说明。­更多详细程序存在于以下描述实施例的实验章节中。

方案 1

使用的方法

­本发明的化合物是受体酪氨酸激酶，特别是c-Met受体酪氨酸激酶的活性或表达的有效抑制剂。­­­­­此外，本发明化合物的特征为在肠的上皮细胞中的高渗透率，促进这些化合物在经口给予以后从胃肠道的吸收。­­­­因此，预期式(I)的化合物可用作治疗剂。

因此，在另一实施方案中，本发明提供在需要这种治疗的患者中治疗与c-Met 激酶活性相关或由其介导的病症的方法，包含给予患者有效量的上文所定义的式(I)化合物。在某些实施方案中，与c-Met 激酶活性相关的病症为细胞增殖性疾病，特别是癌症。

如本文中所述的术语“治疗”或“处理”是常规使用的，例如，以对抗、缓解、减少、减轻、改善疾病或病症例如癌的情况为目的而对受试者的处理或护理。

术语“受试者”或“患者”包括能够患有细胞增殖性疾病或者其它能够由本发明化合物的给药获益的生物体，例如人类或非人类动物。优选的人类包括患有或者易于患有如本文所述的细胞增殖性疾病或相关状态的人类患者。术语“非人类动物”包括脊椎动物，例如，哺乳动物，例如非人类灵长类动物、羊、牛、狗、猫，和啮齿动物，例如鼠，以及非人类哺乳动物，例如鸡、两栖动物、爬行动物等。

术语“与c-Met相关或由c-Met介导的病症”包括与c-Met活性相关或涉及c-Met活性的疾病，例如c-Met的活性过强，以及伴有这些疾病的病症。“与c-Met相关或由c-Met介导的病症”的实例包括因异常大量的c-Met或c-Met中突变而由c-Met过度刺激导致的病症，或者因异常大量的c-Met或c-Met中突变而由异常大量的c-Met活性导致的病症。

术语“c-Met的活性过强”是指正常不表达c-Met的细胞中表达c-Met，或者正常不具有活性c-Met的细胞产生c-Met活性，或者导致不希望的细胞增殖的增加的c-Met表达，或者导致c-Met组成性激活(constitutive activa­tion)的突变。

术语 “细胞增殖性疾病”包括涉及细胞不希望的或不受控制的增殖的病症。本发明化合物可以用于预防、抑制、阻止、减少、降低、控制等细胞增殖和/或细胞分化，和/或产生细胞调亡。该方法包含给予需要其的患者，包括哺乳动物（包括人类），一定量的有效治疗或预防病症的本发明化合物，或其药学上可接受的盐、异构体、多晶型物、代谢物、水合物或溶剂化物。

本发明中的细胞增殖或过度增殖病症包括但不限于，例如，牛皮癣、瘢痕疙瘩和影响皮肤的其它增殖、骨骼障碍、血管原性或血管增殖障碍、肺动脉高压、纤维变性障碍、肾小球系膜细胞增殖性疾病、结肠息肉、多囊性肾病、良性前列腺增殖(BPH)和实体瘤，例如乳腺、呼吸道、脑、生殖器官、消化道、泌尿道、眼、肝脏、皮肤、头和颈、甲状腺、甲状旁腺的癌症和它们的远端转移。这些障碍还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。

乳癌的实例包括但不限于侵润性导管癌、侵润性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌

呼吸道癌症的实例包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌以及支气管腺瘤和胸膜肺胚细胞瘤。

脑癌的实例包括但不限于脑干和下丘脑神经胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜细胞瘤以及神经外胚层瘤和松果体瘤。

雄性生殖器官的肿瘤包括但不限于前列腺癌和睾丸癌。雌性生殖器官的肿瘤包括但不限于子宫内膜、子宫颈、卵巢、阴道和外阴的癌症，以及子宫的肉瘤。

消化道的肿瘤包括但不限于肛门、结肠、结肠直肠、食道、胆囊、胃、胰腺、直肠、小肠和唾液腺的癌症。

泌尿道的肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、尿道癌以及遗传性和散发性乳头状肾癌。

眼部癌症包括但不限于眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤。

肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(有或没有羽层状变化的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)、和混合的肝细胞胆管癌。

皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌、卡波济氏肉瘤、恶性黑色素瘤、默克尔细胞皮肤癌和非黑素瘤皮肤癌。

头颈癌包括但不限于喉、下咽、鼻咽、口咽的癌症、唇和口腔癌和鳞状细胞。

淋巴瘤包括但不限于AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金氏病、和中枢神经系统的淋巴瘤。

肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。

白血病包括但不限于急性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞性白血病。

可以使用本发明化合物和方法治疗的纤维变性增殖性病症，即细胞外基质异常形成包括肺纤维化、动脉粥样硬化、再狭窄、肝硬化、和肾小球系膜细胞增殖性疾病，包括肾病例如肾小球肾炎、糖尿病肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病综合征、移植排斥和肾小球病。

可以通过给予本发明化合物治疗的人或其它哺乳动物的其它病症包括肿瘤生长、视网膜病，包括糖尿病性视网膜病、缺血性视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病和与年龄相关的黄斑退行性改变、类风湿性关节炎、银屑病和与表皮下水疱形成相关的大疱性病症，包括大疱性类天疱疮、多形性红斑和疱疹样皮炎。

本发明化合物还可以用于预防或治疗气道和肺部疾病、胃肠道疾病以及膀胱和胆管疾病。

上述疾病在人类中已经得到充分地表征，但也以相似病因存在于其它动物中，可以通过给予本发明的药物组合物进行治疗。

式(I)化合物可以作为单独的药剂给药，或者与一种或多种其它治疗剂联合给药，其中所述联合不引起不可接受的有害作用。该联合治疗包括给予含有式(I)化合物和一种或多种其它治疗剂的单一药物制剂，以及以各自单独药物制剂形式给予式(I)化合物和各种其它治疗剂。例如，可以将式(I)化合物和治疗剂以单一口服剂型组合物例如片剂和胶囊一起给药，或者可以将每种药物以单独的制剂给药。

在使用单独的制剂时，式(I)化合物和一种或多种其它治疗剂可以基本上同时（例如同时）或者在分开交错的时间（例如连续）给药。

特别地，本发明化合物可以固定或单独的组合与其它抗肿瘤剂使用，例如烷化剂、抗代谢物、植物来源的抗肿瘤剂、激素治疗剂、拓扑异构酶抑制剂、喜树碱衍生物、激酶抑制剂、靶向药物、抗体、干扰素和/或生物学反应修饰剂、抗血管生成化合物和其它肿瘤药物。在这方面，下文为可以与本发明化合物组合使用的第二药物实例的非限制性列表：

● 烷化剂，包括但不限于，氮芥N-氧化物、环磷酰胺、异磷酰胺、塞替派、雷莫司汀、尼莫司汀、替莫唑胺、六甲蜜胺、apaziquone、brostallicin、苯达莫司汀、卡莫司汀、雌莫司汀、福莫司汀、葡磷酰胺、马磷酰胺、苯达莫司汀和二溴卫矛醇；铂-配位的烷化化合物，包括但不限于，顺铂、卡铂、依他铂、洛铂、奈达铂、奥沙利铂和沙铂；

● 抗代谢物，包括但不限于，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤核糖苷、巯嘌呤、5-氟尿嘧啶单独或与亚叶酸组合、替加氟、去氧氟尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐、依诺他滨、吉西他滨、氟达拉滨、5-氮杂胞苷、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨、地西他滨、依氟鸟氨酸、ethynylcytidine、阿糖胞苷、羟基脲、美法仑、奈拉滨、诺拉曲塞、ocfosfite、培美曲塞二钠、喷司他丁、pelitrexol、雷替曲塞、triapine、三甲曲沙、阿糖腺苷、长春新碱和长春瑞滨；

● 激素治疗剂，包括但不限于，依西美坦、醋酸亮丙瑞林、阿那曲唑、度骨化醇、法倔唑、福美坦、11-β羟基类固醇脱氢酶1型抑制剂、17-α羟化酶/17,20 裂解酶抑制剂例如醋酸阿比特龙、5-α还原酶抑制剂例如非那雄胺和依立雄胺、抗雌激素类例如枸橼酸他莫昔芬和氟维司群、Trelstar、托瑞米芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、来曲唑、抗雄激素类例如比卡鲁胺、氟他胺、米非司酮、尼鲁米特、康士德和抗孕酮类及其组合；

● 植物来源的抗肿瘤物质，包括，例如，选自有丝分裂抑制剂的那些，例如埃坡霉素，例如沙戈匹隆、ixabepilone和埃坡霉素B、长春碱、长春氟宁、多西他赛和紫杉醇；

● 细胞毒性拓扑异构酶抑制剂，包括但不限于, 阿柔比星、多柔比星、氨萘非特、belotecan、喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、diflomotecan、伊立替康、托泊替康、edotecarin、epimbicin、依托泊苷、依沙替康、gima­tecan、勒托替康、米托蒽醌、pirambicin、pixantrone、卢比替康、索布佐生、tafluposide及其组合；

● 免疫药，包括干扰素例如干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-1a和干扰素γ-n1、和其它免疫增强剂例如L19-IL2和其它IL2衍生物、非格司亭、香菇多糖、裂裥多糖、TheraCys、乌苯美司、阿地白介素、阿仑单抗、BAM-002、达卡巴嗪、达克珠单抗、地尼白介素、吉姆单抗、奥佐米星、ibritumomab、咪喹莫特、来格司亭、香菇多糖、黑瘤疫苗(Corixa)、莫拉司亭、沙格司亭、他索纳明、替西白介素、胸腺法新、托西莫单抗、Vimlizin、依帕珠单抗、米妥莫单抗、oregovomab、帕尼单抗和Provenge；

● 生物学反应修饰剂为修饰生命体防御机制或生物学反应例如组织细胞存活、生长或分化以使它们具有抗肿瘤活性的试剂；这类试剂包括，例如，云芝多糖、香菇多糖、西佐喃、溶链菌、ProMune和乌苯美司；

● 抗血管生成化合物，包括但不限于，阿昔曲丁、aflibercept、血管他丁、aplidine、asentar、阿昔替尼、贝伐单抗、brivanib alaninat、cilengtide、考布他汀、内皮他丁、芬维A胺、溴氯哌喹酮、帕唑帕尼、ranibizumab、rebimastat、recentin、regora­fenib、removab、来那度胺、索拉非尼、角鲨胺、舒尼替尼、拉帕替尼、沙利度胺、ukrain、瓦他拉尼和vitaxin；

● 抗体，包括但不限于，曲妥单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、ticilimumab、ipilimumab、lumiliximab、catumaxomab、atacicept、oregovomab和阿仑单抗；

● VEGF 抑制剂，例如，sorafenib、regorafenib、贝伐单抗、sunitinib、recentin、axi­tinib、afli­bercept、telatinib、brivanib alaninate、vatalanib、pazopanib和Ranibizumab；

● EGFR (HER1)抑制剂，例如，西妥昔单抗、panitumumab、vectibix、gefitinib、erlotinib和Zactima；

● HER2 抑制剂，例如，lapatinib、tratuzumab和 pertuzumab；

● mTOR 抑制剂，例如，temsirolimus、西罗莫司/雷帕霉素和依维莫司；

● c-Met 抑制剂；

● PI3K和AKT 抑制剂；

● CDK 抑制剂，例如roscovitine和flavopiridol；

● 纺锤体组装检查点抑制剂和靶向抗有丝分裂剂，例如PLK 抑制剂、Aurora 抑制剂(例如，Hesperadin) 、检查点激酶抑制剂和 KSP 抑制剂；

● HDAC 抑制剂，例如，panobinostat、vorinostat、MS275、belinostat和LBH589；

● HSP90和HSP70 抑制剂；

● 蛋白酶体抑制剂，例如bortezomib和carfilzomib；

● 丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，包括MEK 抑制剂和Raf 抑制剂，例如sora­fenib；

● 法尼基转移酶抑制剂例如，tipifarnib；

● 酪氨酸激酶抑制剂，包括例如，dasatinib, nilotibib, regorafenib, bosutinib, sora­fenib, 贝伐单抗, sunitinib, cediranib, axitinib, aflibercept, telatinib, 甲磺酸伊马替尼, brivanib alaninate, pazopanib, ranibizumab, vatalanib, 西妥昔单抗, panitumumab, vectibix, gefitinib, erlotinib, lapatinib, tratuzumab, pertuzumab和c-Kit 抑制剂；

● 维生素D 受体激动剂；

● Bcl-2 蛋白质抑制剂，例如obatoclax、奥利默森钠和棉酚；

● 分化抗原簇20 受体拮抗剂，例如，利妥昔单抗；

● 核糖核苷酸还原酶抑制剂，例如，吉西他滨；

● 肿瘤坏死凋亡诱导配体受体1 激动剂，例如，mapatumumab；

● 5-羟色胺受体拮抗剂，例如，rEV598、xaliprode、盐酸帕洛司琼、格拉司琼、Zindol和AB-1001；

● 整联蛋白抑制剂，包括α5-β1 整联蛋白抑制剂，例如，E7820、JSM 6425、volociximab和内皮他丁；

● 雄激素受体拮抗剂，包括例如，癸酸诺龙、氟甲睾酮、甲睾酮、Prost-aid、andromustine、比卡鲁胺、氟他胺、apo-环丙孕酮、apo-氟他胺、醋酸氯地孕酮、环丙氯地孕酮、Tabi、醋酸环丙氯地孕酮和尼鲁米特；

● 芳香酶抑制剂，例如，阿那曲唑、来曲唑、睾内酯、依西美坦、氨基氨鲁米特和福美坦；

● 基质金属蛋白酶抑制剂；

● 其它抗癌剂，包括例如，阿利维A酸, 聚肌胞, 阿曲生坦贝沙罗汀, borte­zomib, 波生坦, 骨化三醇, 依昔舒林, 福莫司汀, 伊班膦酸, 米替福新, 米托蒽醌, I-门冬酰胺酶, 丙卡巴肼, 达卡巴嗪, 羟基脲, 培门冬酶, 喷司他丁, 他扎罗汀, velcade, 硝酸镓, canfosfamide, darinaparsin和维甲酸。

在优选的实施方案中，本发明化合物可以与化学治疗(即细胞毒性剂)、抗激素和/或靶向治疗例如其它激酶抑制剂(例如，EGFR 抑制剂)、mTOR 抑制剂和血管发生抑制剂联合使用。

本发明化合物还可以与放射治疗和/或外科手术结合用于癌症治疗。

此外，式(I)化合物以其自身或者在组合物中使用，用于研究和诊断中或者用作分析参照标准等，这些都是本领域熟知的。

药物组合物和治疗方法

在另一个方面，本发明提供包含如上文所定义的式(I)化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

在另一个方面，本发明提供制备药物组合物的方法。该方法包括包含将至少一种如上文所定义的式(I)化合物与至少一种药学上可接受的载体混合，和使得到的组合物成为合适的给药形式的步骤。

式(I)化合物可以全身和/或局部起效。对于该目的，其可以适合的方式应用，例如口服、胃肠外、肺、鼻、舌下、舌、口腔、直肠、经皮、结膜、耳、或作为植入剂或支架。

对于这些应用途径，式(I)活性组分可以适合的应用方式给药。

有用的口服应用形式包括快速和/或以改进形式释放活性组分的应用形式，例如片剂(未包衣和包衣片剂，例如具有肠溶衣)、胶囊剂、糖衣片剂、颗粒剂、小丸剂、散剂、乳液剂、混悬剂、溶液剂和气雾剂。

可以实施胃肠外应用而避免吸收步骤(静脉内、动脉内、心脏内、脊柱内或腰椎内)或包括吸收(肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内)。有用的胃肠外应用形式包括以溶液剂、混悬剂、乳液剂、冻干剂和无菌粉末形式的注射制剂和输注制剂。

适用于其它应用途径的形式包括，例如，可吸入药物形式(包括粉状吸入剂、喷雾剂)、滴鼻剂、溶液剂或喷雾剂、舌、舌下或口腔给药的片剂或胶囊剂、栓剂、耳和眼用制剂、阴道用胶囊剂、含水混悬剂(洗剂、震荡合剂)、亲脂性混悬剂、软膏剂、乳膏剂、乳剂、糊剂、扑粉、植入剂或支架。

在优选的实施方案中，以适用于口服给药的形式提供如上文所定义的包含式(I)化合物的药物组合物。在更优选的实施方案中，以适用于静脉给药的形式提供如上文所定义的包含式(I)化合物的药物组合物。

式(I)活性组分本身可以按照已知方式转化为所述应用形式。这可以用惰性无毒、药学上合适的赋形剂进行。这些包括，尤其是载体(例如微晶纤维素)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂(例如十二烷基硫酸钠)、分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成或天然生物聚合物(例如白蛋白)、稳定剂(例如抗氧化剂例如抗坏血酸)、着色剂(例如无机色素例如氧化铁)或味道和/或气味矫正剂。

在另一实施方案中，本发明提供治疗需要这种治疗的患者细胞增殖性疾病的方法，包含给予患者有效量的如上文所定义的式(I)化合物。在某些实施方案中，细胞增殖性疾病为癌症。

在另一个方面，本发明提供如上文定义的式(I)化合物用于制备治疗或预防细胞增殖性疾病的药物组合物的用途。在某些实施方案中，细胞增殖性疾病为癌症。

当本发明化合物作为药物给予人类和动物时，它们可以其自身或者作为药物组合物给药，所述药物组合物含有例如0.1-99.5% (更优选0.5-90%)的活性成分以及药学上可接受的载体。

无论选择何种给药途径，本发明化合物（可以合适的水合物形式应用）和/或本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平和给药时程可以改变，以便获得对于特定患者、组合物和给药方式达到需要的治疗反应而对患者无毒性的活性成分的量。示例性的剂量范围为每天0.01-100 mg/kg或每天0.1-150 mg/kg。

在某些实施方案中，本发明化合物可以与常规肿瘤化疗药物联合使用。用于白血病和其它肿瘤的常规治疗方案包括辐射、药物或二者的结合。

本发明化合物治疗有效的抗增殖量或预防有效的抗增殖量的确定，可以通过利用已知的技术和观察在类似情况下所获得的结果，由作为本领域技术人员的医师或兽医（“主治医师”）容易地实现。剂量可以根据主治医师所判断的患者需要、所治疗的症状的严重度和所使用的特定化合物而改变。在确定治疗有效抗增殖量或剂量、预防有效抗增殖量或剂量中，主治医师会考虑许多因素，包括但不限于：所涉及的具体细胞增殖性疾病；具体药剂的药效学特征及其给药方式和途径；所需要的治疗时程；哺乳动物的种类；其大小、年龄和一般健康；所涉及的具体疾病；疾病的程度或严重度；个体患者的反应；所给予的具体化合物；给药方式；所给予制剂的生物利用特征；所选择的剂量方案；同时治疗的种类（即本发明化合物与其它共同给予疗法的相互作用）；及其它相关情况。

治疗可以使用低于化合物最佳剂量的较低的剂量起始。此后，剂量可以小幅度的增加，直至达到在这种情况下的最佳效果。为了方便起间，如果需要，总的日剂量可以在一天内分成几份给药。预期本发明的治疗有效抗增殖量或预防有效抗增殖量从约0.01毫克每千克体重每天（mg/kg/天）至约100mg/kg/天不等。

本发明化合物的优选剂量是患者可以忍受并且不产生严重副作用的最大剂量。示例性地，本发明化合物可以约0.01 mg/kg至约100 mg/kg体重、约0.01 mg/kg至约10 mg/kg体重或约0.1 mg/kg至约10 mg/kg体重的剂量给药。上文列举的数值的中间范围也是本发明的一部分。

除非另外指明，下文试验和实施例中的百分比按重量计算；份数按重量计算。用于报告液体/液体溶液的溶剂比例、稀释比例和浓度各自基于体积计。

A.实施例

缩写和缩略语：

Ac 乙酰基

aq. 含水 (溶液)

br. s 宽单峰 (NMR)

cat. 催化

conc. 浓缩的

d 双峰 (NMR)

DCI 直接化学电离 (MS)

dd 双二重峰 (NMR)

DMF N,N-二甲基甲酰胺

DMSO 二甲亚砜

DMSO-d₆ 二甲亚砜-d₆

ee 对映体过量

EI 电子碰撞电离 (MS)

equiv. 当量

ESI 电喷雾电离 (MS)

Et 乙基

GC-MS 气相色谱法-联用质谱法

h 小时

¹H-NMR 质子核磁共振波谱法

HOAc 乙酸

HPLC 高效/高压液相色谱法

LC-MS 液相色谱法-联用质谱法

m 多重峰(NMR)

Me 甲基

min 分钟

MS 质谱法

m/z 质荷比

NMP N-甲基吡咯烷-2-酮

of th. 理论值的 (化学产率)

q 四重峰(NMR)

quin 五重峰 (NMR)

R_f TLC保留因子

RP 反相 (HPLC)

rt 室温

R_t 保留时间 (HPLC)

s 单峰(NMR)

sept 七重峰 (NMR)

sext 六重峰 (NMR)

TBAF 四-正丁基氟化铵

tBu 叔丁基

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

TLC 薄层色谱法

t 三重峰(NMR)

v/v 体积/体积比

w/v 重量/体积比

w/w 重量/重量比。

LC-MS和GC-MS方法：

方法 1 (LC-MS) ：

仪器：装有 HPLC Waters Alliance 2795的Micromass ZQ；柱：Phenomenex Synergi 2.5µ MAX-RP 100A Mercury，20 mm x 4 mm；洗脱液 A：1 L 水 + 0.5 mL 50%甲酸，洗脱液 B：1 L 乙腈+ 0.5 mL 50%甲酸；梯度：0.0 min 90% A → 0.1 min 90% A → 3.0 min 5% A → 4.0 min 5% A → 4.01 min 90% A；流速：2 mL/min；炉：50℃；UV 检测：210 nm。

方法 2 (LC-MS) ：

仪器：装有HPLC Waters UPLC Acquity的Micromass Quattro Premier；柱：Thermo Hyper­sil GOLD 1.9µ，50 mm x 1 mm；洗脱液 A：1 L水 + 0.5 mL 50%甲酸，洗脱液 B：1 L 乙腈+ 0.5 mL 50%甲酸；梯度：0.0 min 90% A → 0.1 min 90% A → 1.5 min 10% A → 2.2 min 10% A；炉：50℃；流速：0.33 mL/min；UV 检测：210 nm。

方法 3 (LC-MS) ：

仪器: Micromass Quattro Micro，装有HPLC Agilent 1100 Series; 柱: Thermo Hyper­sil GOLD 3µ, 20 mm x 4 mm; 洗脱液A: 1 L 水 + 0.5 mL 50%甲酸, 洗脱液 B: 1 L 乙腈 + 0.5 mL 50% 甲酸; 梯度: 0.0 min 100% A → 3.0 min 10% A → 4.0 min 10% A → 4.01 min 100% A (流速2.5 mL/min) → 5.00 min 100% A; 炉: 50℃; 流速: 2 mL/min; UV 检测: 210 nm。

方法 4 (LC-MS) ：

仪器：Waters Acquity SQD UPLC 系统；柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µ，50 mm x 1 mm；洗脱液 A：1 L水 + 0.25 mL 99%甲酸，洗脱液 B：1 L 乙腈+ 0.25 mL 99%甲酸；梯度：0.0 min 90% A → 1.2 min 5% A → 2.0 min 5% A；炉：50℃；流速：0.40 mL/min；UV 检测：210-400 nm。

方法 5 (GC-MS) ：

仪器: Micromass GCT, GC 6890; 柱: Restek RTX-35, 15 m x 200 µm x 0.33 µm; 具有氦的恒定流速: 0.88 mL/min; 炉: 70℃; 入口: 250℃; 梯度: 70℃, 30℃/min → 310℃ (保持3 min)。

原料和中间体：

实施例1A

3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛

在氩气氛下将四氢呋喃 (600 ml)冷却至-78℃。在该温度下，逐滴加入1.7 M叔丁基锂的正戊烷 (200 ml) 溶液。在-78℃下保持15分钟后，以溶液的温度不超过-70℃的速率逐滴加入22.4 g (106.1 mmol) 5-溴-3-甲基-1H-吲唑的THF (300 ml)溶液。将混合物搅拌30分钟，然后逐滴加入N,N-二甲基甲酰胺 (24.5 ml)。20min后，除去冰浴，继续搅拌1h，然后小心加入水(250 ml)。使用乙酸乙酯 (500 ml)萃取混合物数次。使用饱和的氯化钠水溶液洗涤合并的有机层，通过硫酸钠干燥，减压浓缩得到18.5g 粗的3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛，其用于下一步骤而未进一步纯化。

¹H-NMR (DMSO-d₆)：δ = 13.13 (br. s, 1H), 10.01 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 7.81 (d, 1H), 7.58 (d, 1H), 2.56 (s, 3H) ppm。

实施例2A

(2E)-2-[(3-甲基-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈

将含有4Å 分子筛的5.0 g (31.2 mmol) 3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例1A)、3.61 g (34.3 mmol) (1Z)-1-氰基丙-1-烯-2-油酸钠、2.23 ml (39 mmol) 乙酸和0.31 ml (3.12 mmol) 哌啶在干燥的二氯甲烷 (250 ml)中的混合物搅拌回流12h。冷却后，过滤收集形成的沉淀，使用饱和的碳酸氢钠水溶液和水洗涤。将固体溶解于乙醇中，滤除分子筛。减压浓缩滤液，使用乙酸乙酯和饱和的碳酸钠水溶液处理残余物。使用水洗涤有机层，干燥，减压浓缩得到标题化合物 (3.5 g，理论值的50%)，为淡黄色固体，其用于下一步骤而未进一步纯化。

LC-MS (方法1)：R_t = 1.32 min；MS (ESIpos)：m/z = 226 (M+H)⁺

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆)：δ = 13.18 (br. s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.19 (d, 1H), 7.69 (d, 1H), 2.55 (br. m, 6H) ppm。

实施例3A

6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛

将30 g (131 mmol) 5-溴-6-氟-3-甲基-1H-吲唑 [制备描述于WO 2005/085227-A1中，实施例104 c]；也是商业可获得的，CAS Reg.-No. 864773-66-0]的THF (525 ml)溶液冷却至-45℃。在-45℃下逐滴加入甲基氯化镁的 THF (3 M；50.2 ml, 151 mmol)溶液，将得到的溶液在该温度下搅拌40min。使用定量泵，加入253 ml (354 mmol) 2-丁基锂溶液(1.4 M在环己烷中)，以便温度不超过-40℃。将得到的混合物在-40℃下搅拌30min，然后逐滴加入30.2 ml (393 mmol) N,N-二甲基甲酰胺，保持温度为-40℃。将得到的混合物在-40℃下搅拌30min，然后加热至室温，缓慢倒入到冷却至5℃ (冰水浴)的体积为2.8 L的2 N盐酸中。使用乙酸乙酯萃取混合物数次。使用盐水洗涤合并的有机层，通过硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。将残留物溶解于二氯甲烷中，在硅胶上通过色谱法纯化 (洗脱液：戊烷/乙酸乙酯 6 : 4 v/v)得到19.6 g (理论值的78%) 标题化合物，为淡黄色固体。

MS (ESIpos)：m/z = 179 (M+H)⁺

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆)：δ = 13.14 (s, 1H), 10.17 (s, 1H), 8.33 (d, 1H), 7.37 (d, 1H), 2.54 (s, 3H) ppm。

实施例4A

(2E)-2-[(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈

按照实施例2A描述的方法，使用2.74 g (15.5 mmol) 6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例3A)和2.6 g (24.8 mmol) (1Z)-1-氰基丙-1-烯-2-油酸钠制备标题化合物，生成1.6 g (理论值的42%) 的粗产物，其用于下一步骤而未进一步纯化。

LC-MS (方法4)：R_t = 0.83 min；MS (ESIpos)：m/z = 244 (M+H)⁺。

实施例5A

1-(5-溴-2-氟苯基)-1-丙醇

向15克(73.9毫摩尔)5-溴-2-氟苯甲醛在二乙醚(100毫升)中的溶液中在0℃慢慢地添加27.1毫升(81.3毫摩尔)乙基溴化镁溶液(3 M，在二乙醚中)。­在0℃ 搅拌3小时以后，小心地添加水(20毫升)，于是形成白色沉淀物。固体被滤出和用叔丁基甲基醚洗涤。­用盐水洗涤合并的滤液，用硫酸钠干燥和在减压下浓缩。­­­这样获得的粗制品标题化合物(16.1克，理论值的93%)在没有进一步提纯的情况下用于下一步。

GC-MS(方法5): R_t = 4.54 min; MS(EIpos): m/z = 232(M)⁺。

实施例6A

1-(5-溴-2-氟苯基)-1-丙酮

­在室温搅拌10克(42.9毫摩尔)1-(5-溴-2-氟苯基)-1-丙醇(实施例5A)，8.75克(85.8毫摩尔)中性氧化铝和18.5克(85.8毫摩尔)氯铬酸吡啶

在二氯甲烷(100毫升)中的混合物4小时。混合物然后滤过硅胶(0.06-0.2毫米，200克)，其用二氯甲烷(1000毫升)充分地洗涤。­­用盐水洗涤合并的滤液，用硫酸钠干燥和在减压下浓缩。­­这样获得的粗制品标题化合物(8.6克，理论值的87%)在没有进一步提纯的情况下用于下一步。

GC-MS(方法5): R_t = 4.30 min; MS(EIpos): m/z = 230(M)⁺。

实施例7A

5-溴-3-乙基-1H-吲唑

用3.25克(3.16毫升, 64.9毫摩尔)水合肼处理7.50克(32.5毫摩尔)1-(5-溴-2-氟苯基)-1-丙酮(实施例6A)在1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP；100毫升)中的溶液和在回流温度搅拌16小时。一旦冷却，将混合物倾倒入冰和水的混合物。通过过滤收集该沉淀物和充分地用水洗涤，得到4.56克(理论值的62%)的标题化合物，为浅褐色固体。

LC-MS(方法4): R_t = 1.00 min; MS(ESIpos): m/z = 225(M+H)⁺。

实施例8A

3-乙基-1H-吲唑-5-甲醛

6.90克(30.7毫摩尔)5-溴-3-乙基-1H-吲唑(实施例7A)在THF(300毫升)中的溶液被冷却至-78℃。在这一温度，慢慢地添加63.1毫升(107毫摩尔)的叔丁基锂溶液(1.7 M在正戊烷中)。在-78℃搅拌该混合物30分钟，随后慢慢地添加N,N-二甲基甲酰胺(80.0毫升)。除去冷却浴，且继续搅拌直到达到室温。然后，小心地添加水(250毫升)。用乙酸乙酯(500毫升)提取混合物几次。­­用饱和氯化钠水溶液洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，和在减压下浓缩，得到4.5克(理论值的84%)的粗制品标题化合物，其用于下一步而无需进一步纯化。

LC-MS(方法4): R_t = 0.73 min; MS(ESIpos): m/z = 175(M+H)⁺。

实施例9A

(2E)-2-[(3-乙基-1H-吲唑-5-基)亚甲基]-3-氧代丁腈

在回流条件下搅拌0.50克(2.87毫摩尔)3-乙基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例8A)，0.33克(3.16毫摩尔)(1Z)-1-氰基丙-1-烯-2-酸钠，0.21毫升(3.6毫摩尔)乙酸和0.028毫升(0.29毫摩尔)哌啶在包含4Å分子筛的干燥二氯甲烷(25毫升)中的混合物16小时。一旦冷却，形成沉淀物，其通过过滤收集和用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤。­将固体溶解于乙醇，和滤掉分子筛。­在减压下浓缩该滤液，和用乙酸乙酯和饱和碳酸钠水溶液处理残余物。用水洗涤有机层，干燥，和在减压下浓缩，得到标题化合物(0.60克，理论值的88%)，为浅黄色固体，其在没有进一步提纯的情况下用于后面的步骤。

LC-MS(方法1): R_t = 1.50 min; MS(ESIpos): m/z = 240(M+H)⁺

¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆): δ = 13.17(br. s, 1H), 8.59(s, 1H), 8.51(s, 1H), 8.17(d, 1H), 7.67(d, 1H), 2.97(q, 2H), 2.55(br. m, 3H), 1.36(t, 3H)ppm。

实施例10A

(2E)-2-(1H-吲唑-5-基亚甲基)-3-氧代丁腈

­在干燥二氯甲烷(500毫升)中的10克(68.4毫摩尔)1H-吲唑-5-甲醛[其制备描述于US2005/0227968-A1(中间体1)]，7.91克(75.2毫摩尔)(1Z)-1-氰基丙-1-烯-2-酸钠，4.89毫升(85.5毫摩尔)乙酸和0.68毫升(6.84毫摩尔)哌啶在回流温度使用逆向的脱水器搅拌7小时。一旦冷却，形成沉淀物，其通过过滤收集和用二氯甲烷洗涤。固体在真空中被干燥，得到粗制品标题化合物(19克，依据LC-MS为75%纯度，理论值的96%)，­其在没有进一步提纯的情况下用于后面的步骤。

LC-MS(方法2): R_t = 0.82 min; MS(ESIpos): m/z = 212(M+H)⁺。

实施例11A

6-甲基-3-氧代庚腈

四氢呋喃(35mL)在惰性气体气氛条件下被冷却至-70℃。­­在该温度，滴加4.44毫升(11.1 mmol)的正丁基锂溶液(2.5 M在己烷中)，然后滴加0.51毫升(9.71 mmol)乙腈。在-70℃3 min以后，以该溶液温度不超过-66℃的速率滴加1.15毫升(6.93 mmol)4-甲基戊酸乙酯。在-45℃搅拌该混合物2小时，随后滴加22.2 毫升的1N盐酸。在减压下浓缩反应混合物，剩余物与二乙醚混合。过滤通过硅胶后，在减压下蒸发该滤液，得到1.05 g的粗制标题化合物，其用于下一步而无需进一步纯化。

GC-MS(方法5): R_t = 3.23 min; MS(EIpos): m/z = 138(M-H)⁺

¹H-NMR(DMSO-d₆): δ = 4.03(s, 2H), 2.51(t, 2H), 1.50(sext, 1H), 1.38(q, 2H), 1.35(d, 6H)ppm。

以下化合物从相应酯和乙腈以类似于实施例11A中描述的程序制备：

制备实施例：

实施例1

­2-(3-甲基丁基)-4-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(三氟甲基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二甲腈

­­250毫克(1.56毫摩尔)3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例1A)，850mg(6.24毫摩尔)3-氨基-4,4,4-三氟丁-2-烯腈[制备：A.W. Lutz, US专利3,635,977; C.G. Krespan, J. Org. Chem. 34，42(1969)]，346毫克(2.19毫摩尔)6-甲基-3-氧代庚腈(实施例11A)和75毫克粉状4 Å分子筛在1-戊醇(1.6毫升)中的悬浮体被加热到105℃过夜。­冷却后，反应混合物用乙腈稀释并过滤，该滤液通过制备RP-HPLC(乙腈/水+ 0.1% TFA梯度)直接纯化，产生161毫克(理论值的26%)的外消旋标题化合物。

LC-MS(方法4): R_t = 1.06 min; MS(ESIpos): m/z = 400(M+H)⁺

¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆): δ = 12.78(br. s, 1H), 10.72(s, 1H), 7.59(s, 1H), 7.56(d, 1H), 7.28(d, 1H), 4.78(s, 1H), 2.52-2.39(m, 5H), 1.65-1.40(m, 3H), 0.90(dd, 6H)ppm。

以下化合物从实施例1A以类似针对实施例1所述程序制备；通过制备RP-HPLC使用乙腈/水+ 0.05% TFA梯度进行纯化。

。

实施例7

­4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-2-(三氟甲基)-6-(3,3,3-三氟丙基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二甲腈

­151毫克(0.85毫摩尔)6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例3A)，346毫克(2.54毫摩尔)3-氨基-4,4,4-三氟丁-2-烯腈[制备：A.W. Lutz, US专利3,635,977; C.G. Krespan, J. Org. Chem.34，42(1969)]，200毫克(0.85毫摩尔，约70%纯度)6,6,6-三氟-3-氧代庚腈(实施例12A)和41毫克的粉状4 Å分子筛在1-戊醇(0.85毫升)中被加热到105℃过夜。­冷却后，反应混合物用THF稀释并过滤，该滤液通过制备RP-HPLC(乙腈/水+ 0.1% TFA梯度)直接纯化，产生99毫克(理论值的25%)的外消旋标题化合物。

LC-MS(方法4): R_t = 1.00 min; MS(ESIpos): m/z = 444(M+H)⁺

¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆): δ = 12.82(br. s, 1H), 10.47(s, 1H), 7.72(d, 1H), 7.35(d, 1H), 5.04(s, 1H), 2.75-2.55(m, 4H), 2.49(s, 3H)ppm。

实施例8和实施例9

­4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-2-(三氟甲基)-6-(3,3,3-三氟丙基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二甲腈(对映体1和2)

­­­­­来自实施例7的外消旋化合物(70mg)通过在手性相上的HPLC色谱法分离成对映体[柱：基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-叔丁基酰胺)的手性硅胶相(参考EP 0379917，EP 0780408)，10微米，400毫米x30毫米；洗脱剂：异己烷/乙酸乙酯 20:80→0:100 v/v梯度；流速：50 ml/min；温度：24℃；UV检测：265 nm ]:

实施例 8( 对映体 1) ：

收率：37毫克(99% ee)

­­R_t= 2.13 min [柱：基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-叔丁基酰胺)的手性硅胶相，10微米，250毫米 x 4.6毫米；洗脱剂：异己烷/乙酸乙酯1:1 v/v；流速：2 mL/min；UV检测：265 nm ]。

­­通过制备RP-HPLC(甲醇/水+ 0.1% TFA梯度)进一步纯化该材料产生11毫克的标题对映体。

实施例 9( 对映体 2) ：

收率：25毫克(>98% ee)

­­R_t= 2.92 min [柱：基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-叔丁基酰胺)的手性硅胶相，10微米，250毫米 x 4.6毫米；洗脱剂：异己烷/乙酸乙酯1 : 1 v/v；流速：2 mL/min；UV检测：265 纳米 ]。

­­通过制备RP-HPLC(甲醇/水+ 0.1% TFA梯度)进一步纯化该材料产生17毫克的标题对映体。

实施例10

­2-(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(3,3,3-三氟丙基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二甲腈

­­227毫克(1.27毫摩尔)6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-甲醛(实施例3A)，150毫克(1.27毫摩尔)3-氨基-4,4-二氟丁-2-烯腈[可通过乙腈与2,2-二氟乙腈的Thorpe反应获得，参考Org. React. 15，1(1967)，如前，31，1(1984)]，300毫克(1.27毫摩尔，约70%纯度)6,6,6-三氟-3-氧代庚腈(实施例12A)和61毫克的粉状4Å分子筛在1-戊醇(1.3毫升)中的混合物被加热到105℃过夜. ­­在冷却后，用THF稀释反应混合物并过滤且该滤液被制备RP-HPLC(乙腈/水+ 0.1% TFA梯度)直接纯化得到248毫克(理论值的43%)的外消旋标题化合物。

LC-MS(方法2): R_t = 1.07 min; MS(ESIpos): m/z = 426(M+H)⁺

¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆): δ = 12.82(br. s, 1H), 10.20(s, 1H), 7.69(d, 1H), 7.31(d, 1H), 6.82(t, 1H), 4.96(s, 1H), 2.72-2.55(m, 4H), 2.49(s, 3H)ppm。

实施例11和实施例12

­2-(二氟甲基)-4-(6-氟-3-甲基-1H-吲唑-5-基)-6-(3,3,3-三氟丙基)-1,4-二氢吡啶-3,5-二甲腈(对映体1和2)

­­­­来自实施例10的外消旋化合物(225毫克)通过HPLC色谱法在手性相上[柱：手性硅胶相，基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-叔丁基酰胺)(参考EP 0379917，EP 0780408)，10微米，680毫米x 40毫米；洗脱剂：异己烷/乙酸乙酯20:80 v/v；流速： 80毫升/分钟；温度：24℃；UV检测：265纳米]分离成对映体：

实施例 11( 对映体 1) ：

收率：40毫克(>97% ee)

­­R_t= 2.10 min [柱：手性硅胶相，基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-叔丁基酰胺)，10微米，250毫米x 4.6毫米；洗脱剂：乙酸乙酯；流速：2毫升/分钟；UV检测：265纳米]。

实施例 12( 对映体 2) ：

收率：45毫克(>97% ee)

­­R_t= 2.47 min [柱：手性硅胶相，基于选择剂聚(N-甲基丙烯酰基-L-亮氨酸-叔丁基酰胺)，10微米，250毫米x 4.6毫米；洗脱剂：乙酸乙酯；流速：2毫升/分钟；UV检测：265纳米]。

以下化合物从实施例1A以类似针对实施例10所述程序制备；通过制备RP-HPLC使用乙腈/水+ 0.1% TFA梯度进行纯化。

¹⁾ 在通过制备RP-HPLC进一步纯化以后[柱：Sunfire C18 OBD， 5微米，19毫米x 150毫米；洗脱剂：水/甲醇80:20→0:100 v/v梯度；流速：25毫升/分钟；温度：40℃；UV检测：254纳米]；

²⁾ 在通过制备RP-HPLC进一步纯化以后 [柱：Sunfire C18 OBD，5微米，19毫米 x 150毫米；洗脱剂：水/甲醇80:20→0:100 v/v梯度；流速：25毫升/分钟；温度：40℃；UV检测：254纳米]，随后在硅胶上的快速色谱法(洗脱剂：甲苯/二氯甲烷/甲醇10:10:1 v/v/v)。

­以下化合物以类似针对所述实施例7程序制备；通过制备RP-HPLC使用甲醇/水+ 0.05% TFA梯度进行纯化。

³⁾ ­在通过制备RP-HPLC进一步纯化以后[柱： Sunfire C18，5微米，19毫米x 150毫米；洗脱剂：水/乙腈60:40 v/v；流速：25毫升/分钟；温度：40℃；UV 检测：210纳米]。

B.生物学活性评价

本发明化合物的活性的证实可以通过本领域熟知的体外、离体和体内试验来实现。例如，为了证实本发明化合物的活性，可以使用下列试验。

c-Met受体酪氨酸激酶活性试验 (NADH read-out)：

使用重组人c-Met蛋白 (Invitrogen, Carlsbad, 加利福尼亚, USA)。作为激酶反应的底物，使用肽 KKKSPGEYVNIEFG (JPT, 德国)。对于该试验，将试验化合物的1 µL 51倍在DMSO中的浓溶液吸取到白色384-孔微量滴定板中(Greiner Bio-one, Frickenhausen, 德国)。加入25 µL c-Met (最终浓度为30 nM)和丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(Roche Diagnostics, 曼海姆, 德国；最终浓度为8 mg/L)在试验缓冲液[3-(N-吗啉代基)­丙磺酸(MOPS), 50 mM, pH 7；MgCl₂, 10 mM；牛血清白蛋白(BSA), 0.01%；Triton X 100, 0.01%；DTT, 2 mM]中的溶液，并在室温下将混合物培育5min。然后，通过加入25 µL三磷酸腺苷(ATP, 最终浓度为30 µM)、底物(最终浓度为100 µM)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH, 最终浓度为50 µM) 和二硫苏糖醇(DTT, 最终浓度为2 mM)在试验缓冲液中的溶液引发激酶反应，在32℃下将得到的混合物培育100 min的反应时间。

随后，通过测量NADH荧光的减少来评价磷酸化底物的量。因此，在荧光分析仪中测量在340nm激发后在465nm的荧光发射，例如Tecan Ultra (Tecan, Männedorf, 瑞士)。标准化数据（没有抑制剂的酶反应 = 0%抑制；除酶外的其它所有试验组分 = 100%抑制）。通常，在相同的微量滴定板上在10 µM-1 nM的范围内以9个不同浓度(10 µM、3.1 µM、1.0 µM、0.3 µM、0.1 µM、0.03 µM、0.01 µM、0.003 µM、0.001 µM；在试验前以51-倍浓母液的浓度通过连续1 : 3稀释制备的稀释系列)测试试验化合物，每个浓度一式两份，使用内部软件计算IC₅₀值。

一些代表性的IC₅₀ 值列于下表1，还有针对来自现有技术（参见WO2008/071451）的结构上相关的、非氟化的化合物的相应数据：

表 1

实施例编号	IC50 [µM]
		1	0.016
7	0.052
		10	0.026
13	0.009
		14	0.017
16	0.029
		WO 2008/071451 中的合成实施例 4	0.008

c-Met受体酪氨酸激酶均相时间分辨荧光试验 (备选形式)：

使用人c-Met (氨基酸960–1390)的N-端His6-标记的重组激酶域，所述人c-Met在昆虫细胞(SF21)中表达并通过Ni-NTA亲和色谱法和连续分子排阻色谱法 (Superdex 200) 纯化。或者，可以使用商业可获得的 c-Met (Millipore)。对于激酶反应的底物，使用生物素化的聚-Glu,Tyr (4 : 1)共聚物(# 61GT0BLC, Cis Biointernational, Marcoule, 法国)。

对于试验，将50 nL试验化合物的100-倍在DMSO中的浓溶液吸取到黑色小容量的384-孔微量滴定板中 (Greiner Bio-One, Frickenhausen, 德国)。加入2 µL c-Met在试验缓冲液 [25 mM Hepes/NaOH, pH 7.5；5 mM MgCl₂；5 mM MnCl₂；2 mM 二硫苏糖醇；0.1% (v/v) 吐温20 (Sigma)；0.1% (w/v) 牛血清白蛋白]中的溶液，将混合物在22℃下培育15min，以使试验化合物在激酶反应开始前与酶预结合。这样，通过加入3 µL三磷酸腺苷(ATP, 16.7 µM；在5 µL测试体积中的最终浓度为10 µM) 和底物(2.27 µg/mL, 在5 µL测试体积中的最终浓度为1.36 µg/mL ~ 30 nM) 在试验缓冲液中的溶液引发激酶反应，将得到的混合物在22℃下培育30min的反应时间。试验中c-Met的浓度可以根据酶组的活性进行调节并适当地选择以使试验在线性范围内；典型的酶浓度在约0.03 nM (在5 µL测试体积中的最终浓度)的范围内。通过加入5 µL HTRF 检测试剂[40 nM抗生蛋白链菌素-XLent和2.4 nM PT66-Eu-螯合物，铕-螯合物标记的抗磷酸酪氨酸抗体(Perkin-Elmer)]在EDTA水溶液[100 mM EDTA, 0.2% (w/v) 牛血清白蛋白在50 mM HEPES/NaOH中, pH 7.5]中的溶液中止反应。

将得到的混合物在22℃下培育1h，以使生物素化的磷酸化肽与抗生蛋白链菌素-XLent 和PT66-Eu-螯合物结合。随后，通过测量由PT66-Eu-螯合物向抗生蛋白链菌素-Xlent的共振能量转移评价磷酸化底物的量。因此，在HTRF读数器中测量在350nm激发后在620 nm和665 nm的荧光发射，例如，Rubystar (BMG Lab­technologies, Offenburg, 德国)或Viewlux (Perkin-Elmer)。将665 nm和622 nm的发射比例作为磷酸化底物的量的测量值。标准化数据（没有抑制剂的酶反应 = 0%抑制；除酶外的其它所有试验组分 = 100%抑制）。通常，在相同的微量滴定板上在20 µM-1 nM的范围内以10个不同浓度(20 µM、6.7 µM、2.2 µM、0.74 µM、0.25 µM、82 nM、27 nM、9.2 nM、3.1 nM和1 nM；在试验前以100-倍浓母液的浓度通过连续1 : 3稀释制备的稀释系列)测试试验化合物，每个浓度一式两份，使用内部软件通过4-参数拟合计算IC₅₀值。

一些代表性的IC₅₀ 值列于下表2，还有针对来自现有技术（参见WO2008/071451）的结构上相关的、非氟化的化合物的相应数据：

表 2

实施例编号	IC50 [µM]
		4	0.011
10	0.011
		WO 2008/071451 中的合成实施例 4	0.002

磷酸化-c-Met试验：

这是基于细胞的ELISA-样试验[Meso Scale Discovery (MSD), Gaithersburg, MD, USA]，使用没有生长因子刺激的MKN-45肿瘤细胞(胃癌, 购自ATCC)。第一天将细胞涂布于96-孔板中的完全生长培养基(10 000个细胞/孔)中。第二天，在不含有血清的培养基中使用两小时药物处理后，洗涤细胞，然后将细胞溶解(60 μl/孔，使用MSD推荐的溶解缓冲液)并在-80℃下冷冻。同样是第二天，在4℃下使用MSD封闭溶液A过夜封闭MSD 磷酸化-Met板上的非特异性抗体结合位点。第三天，在冰上解冻冷冻的溶解产物，在使用Tris-缓冲盐水 + 0.05% 吐温20 (TBST)洗涤1次后，将25 µl溶解产物转移到MSD 磷酸化-Met板，振摇1小时。在除去未结合的蛋白后，以在抗体稀释缓冲液中5 nM的最终浓度（按照MSD的方案）向板中加入来自的MSD的Sulfa-TAG 抗-Met抗体，振摇1小时。然后在加入1x MSD读数缓冲液前，将板使用TBST缓冲液洗涤3次。然后在MSD Discovery 工作站仪器上读板。将包括具有10 μM参照化合物（最小信号）的孔，和没有任何药物处理的DMSO孔（最大信号）的原始数据输入到用于IC₅₀值测定的分析5程序。

细胞磷酸化-c-Met试验：

在37℃下使用5% CO₂下将播种于384-孔微量滴定板 (9000个细胞/孔)上的人胃腺癌细胞(MKN45, 购自ATCC)在25 µl完全培养基中培育24h。第二天，在含有0.1% FCS的减少血清的培养基中进行2小时的药物处理后，洗涤并溶解细胞。在使用 Tris-缓冲盐水 + 0.05% 吐温20 (TBST)洗涤1次后，使用预结合的c-Met捕获抗体[购自Mesoscale Discovery (MSD), Gaithersburg, MD, USA]将溶解产物转移到BSA-封闭的板中，振摇1小时。按照MSD方案，在RT下以在抗体稀释缓冲液中5 nM的最终浓度向板中加入Sulfa-TAG 抗-磷酸化-c-Met 检测抗体，振摇1小时。在使用Tris缓冲液洗涤孔后，加入1x读数缓冲液，在Sector Imager 6000 (购自Mesoscale)上测量板。使用Marquardt-Levenberg-Fit由剂量-反应曲线计算IC₅₀值。

体外肿瘤细胞增殖试验：

用于测试本发明化合物的附着肿瘤细胞增殖试验涉及称为 Cell Titre-Glo的读出装置，Cell Titre-Glo由Promega研发[B.A. Cunningham, "A Growing Issue：Cell Proliferation Assays. Modern kits ease quantification of cell growth", The Scientist 2001, 15 (13), 26；S.P. Crouch等，"The use of ATP bioluminescence as a measure of cell pro­liferation and cytotoxicity", Journal of Immunological Methods 1993, 160, 81-88]。发光信号的生成对应于存在的ATP的量，其是与代谢活性（增殖）细胞的数量直接成比例的。

以3000个细胞/孔将H460细胞（肺癌，购自ATCC）涂板于96孔板上具有10%胎牛血清的完全培养基中，并在37℃下培育24小时。在涂板24小时后，以在最终DMSO浓度为0.2%的系列稀释液中最终浓度范围为10 nM-20 µM加入试验化合物。在加入试验化合物后，在37℃下将细胞在完全生长培养基中培育72小时。第四天，使用Promega Cell Titre-Glo Luminescent^® 试验试剂盒，溶解细胞，向每个孔中加入100 µl底物/缓冲液混合物，混合并在室温下培育8分钟。在发光计上读取样品以测量每个孔的细胞溶解产物中存在的ATP的量，其对应于该孔中活细胞的数量。在24小时培育时读取的值被扣除为0天的值。为了测定IC₅₀值，可以使用线性回归分析以测定使用该试验形式导致细胞增殖50%抑制的药物浓度。可以将该方案应用于感兴趣的不同细胞系，其包括但不限于，CAKI-1、MNK-45、GTL-16、HCC2998、K562、H441、K812、MEG01、SUP15和HCT116。

Caco-2渗透性实验：

受试化合物穿过Caco-2细胞单层的体外渗透是预测从胃肠道的渗透性的公认实验体系[参考P. Artursson 和J. Karlsson: Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permea­bility coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells, Biochem. Biophys. 175(3), 880-885(1991)]。­本发明的化合物在该Caco-2细胞中的渗透性如下所述测定：

人类Caco-2细胞(ACC No. 169, DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cul­tures, Braun­schweig, Germany)被种在24-孔嵌入板并且被允许生长达14－16天。­用于渗透性研究，将测试化合物溶解在DMSO中且用传输缓冲剂[Hanks'缓冲盐溶液，Gibco/Invitrogen，进一步补充有葡萄糖(最终浓度19.9 mM))和HEPES(最终浓度9.8 mM))]稀释至2μM的最后试验浓度。­针对基底外侧渗透性的顶点(P_appA-B)的测定而言，测试化合物溶液被添加到细胞单层的顶面和将传输缓冲剂添加到单层的基底外侧；针对基底外侧至顶点渗透性的测定(P_appB-A)而言，测试化合物溶液被添加到细胞单层的基底外侧和将传输缓冲剂添加到单层的顶面。­­­在实验开始，样品取自供体室，以确定质量平衡。在37℃培养2小时以后，样品从两室取出。­­通过LC-MS/MS分析样品，和计算表观渗透性系数。­­对各细胞单层测试Lucifer Yellow渗透性以确保细胞单层完整性，和对于各批料确定Atenolol(低渗透性标记物)和Sulfasalazine(针对活性排泄的标记物)的渗透性作为质量控制。

来自该实验的代表性的结果连同针对来自现有技术(参考WO 2008/071451)的在结构上相关的非氟化化合物的相应数据列在下表3中：

表 3

实施例编号	Caco-2 渗透性PappA-B [nm/s]
		1	217
7	204
		13	259
WO 2008/071451 中的合成实施例 4	124

虽然已经参照具体实施方案公开了本发明，但显而易见的是本领域技术人员可以设计本发明的其它实施方案和变化而不背离本发明的真正精神和范围。权利要求应当解释为包括所有这种实施方案和等价变化。

C.与药物组合物相关的实施例

本发明的药物组合物可以如下阐述：

无菌静脉溶液：

使用无菌可注射水制备本发明所需的化合物的5 mg/ml 溶液，如果需要则调节pH。用无菌5%葡萄糖将溶液稀释用于给药1-2 mg/ml，并且作为静脉输注在约60分钟内给药。

用于静脉给药的冻干粉末：

可以使用(i)100－1000 mg本发明所需的化合物作为冻干粉末、(ii) 32－327 mg/ml 柠檬酸钠和(iii) 300－3000 mg右旋糖酐40制备无菌制剂。使用无菌可注射盐水或5% 葡萄糖将制剂重构为10 -20 mg/ml的浓度，其进一步用盐水或5% 葡萄糖稀释至0.2-0.4 mg/ml，作为静脉推注或静脉输注在15－60分钟内给药。

肌肉内悬浮剂：

可以制备以下溶液或悬浮液用于肌肉内注射：

50 mg/ml本发明所需的水不溶性化合物；5 mg/ml羧­甲基纤维素钠；4 mg/mL 吐温80；9 mg/ml 氯化钠；9 mg/ml 苄醇。

硬壳胶囊：

通过填充标准的两段硬明胶胶囊制备大量的单位胶囊，每个装有100 mg 粉末状活性成分、150 mg乳糖、50 mg 纤维素和6 mg 硬脂酸镁。

软明胶胶囊：

制备活性成分在可消化的油例如豆油、棉子油或橄榄油中的混合物并且通过容积式泵注入到熔融明胶中以形成含有100 mg活性成分的软明胶胶囊。洗涤并干燥胶囊。可将活性成分溶解于聚乙二醇、甘油和山梨醇的混合物中，以制备可与水混溶的药物混合物。

片剂：

通过常规方法制备大量片剂，以便剂量单位为100 mg活性成分、0.2 mg胶态的二氧化硅、5 mg 硬脂酸镁、275 mg 微晶纤维素、11 mg 淀粉和98.8 mg 乳糖。可以使用合适的含水和无水包衣以提高适口性、改善外观和稳定性或延迟吸收。

Claims (15)

1.式(I)的化合物

(I)，

其中

R¹是氢或氟，

R²是(C₁-C₅)-烷基，任选地被至多五个氟原子所取代，

R³是氢或氟，

R⁴是氢或(C₁-C₄)-烷基，

和

R⁵是氢或甲基，

或其药学上可接受的盐，水合物和/或溶剂化物。

2.根据权利要求 1的式(I)的化合物，其中

R¹是氢或氟，

R²是(C₁-C₄)-烷基，任选地被至多三个氟原子所取代，

R³是氢或氟，

R⁴是氢，甲基或乙基，

和

R⁵是氢，

或其药学上可接受的盐，水合物和/或溶剂化物。

3.根据权利要求 1或2的式(I)的化合物，其中

R¹是氢或氟，

­R²是甲基，乙基，2,2,2-三氟乙基，丙基，3,3,3-三氟丙基或2-甲基丙基，

R³是氢或氟，

R⁴是氢或甲基，

和

R⁵是氢，

或其药学上可接受的盐，水合物和/或溶剂化物。

4.­一种用于制备权利要求1至3中定义的式(I)的化合物的方法，特征在于式(II)的吲唑基醛

(II)，

其中R³和R⁴具有在权利要求1至3中显示的含义，

在酸、酸/碱组合和/或脱水剂存在的情况下与式(III)的酮腈或其烯醇化钠反应

(III)，

其中R²具有在权利要求1至3中显示的含义，

­以得到式(IV)的化合物

(IV)，

其中R²，R³和R⁴具有在权利要求1至3中显示的含义，

且后者然后与式(V)的烯氨基腈缩合

(V)，

其中R¹具有在权利要求1至3中显示的含义，

以得到式(I-A)的化合物

(I-A)，

其中 R¹， R²， R³和R⁴具有在权利要求1至3中显示的含义，

任选地随后在碱存在下使用式(VI)的化合物进行二氢吡啶N-甲基化

CH₃－X (VI),

其中

X代表离去基团例如卤素，甲磺酸酯基，三氟甲基磺酸酯基，甲苯磺酸酯基或硫酸酯基，

以得到式(I-B)的化合物

(I-B)，

其中 R¹， R²， R³和R⁴具有在权利要求1至3中显示的含义，

­­­­­和任选地视需要随后(i)将化合物(I-A)和(I-B)分离成其各自的对映体和/或非对映体，优选地使用色谱法，和/或(ii)通过用相应溶剂处理将化合物(I-A)和(I-B)转化成其各自的水合物或溶剂化物。

5.用于治疗或预防疾病的权利要求1-3中任一定义的化合物。

6.权利要求1-3中任一定义的化合物在制备用于治疗或预防细胞增殖性疾病的药物组合物中的用途。

7.权利要求6的用途，其中该细胞增殖性疾病为癌症。

8.药物组合物，包含权利要求1-3中任一定义的化合物或其药学上可接受的水合物或溶剂化物，以及药学上可接受的赋形剂。

9.权利要求8的药物组合物，还包含一种或多种其它治疗剂。

10.权利要求9的药物组合物，其中其它治疗剂为抗肿瘤剂。

11.用于治疗或预防细胞增殖性疾病的权利要求8-10中任一定义的药物组合物。

12.治疗或预防哺乳动物细胞增殖性疾病的方法，包含给予需要其的哺乳动物治疗有效量的一种或多种权利要求1-3中任一定义的化合物，或权利要求8-10中任一定义的药物组合物。

13.权利要求12的方法，其中该细胞增殖性疾病为癌症。

14.权利要求13的方法，其中该癌症为乳腺、呼吸道、脑、生殖器官、消化道、泌尿道、眼、肝、皮肤、头或颈、甲状腺、甲状旁腺的癌症或者实体瘤的远端转移。

15.权利要求13的方法，其中权利要求1-3中任一定义的化合物或权利要求8-10中任一定义的药物组合物与外科手术或放射治疗结合施用。