CN102573874A - 用于辐射后保护的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及在辐射暴露后24小时以上之后给予RLIP76或其活性片段的方法,其中给药有效地保护和治疗暴露于辐射的哺乳动物。此外,公开了包含RLIP76和其他辐射保护剂例如抗氧化剂的组合物。
Description
发明领域
本公开总体涉及辐射暴露,更具体地涉及包含RLIP76蛋白部分的组合物和这种组合物在哺乳动物的辐射后保护中的应用。
发明背景
辐射损伤由几种机制发生,并且各机制的相对作用取决于暴露量。在极高量下,辐射引起细胞死亡,该细胞死亡是由于造成DNA双螺旋链完全断裂(双链断裂,DSB)的直接DNA损伤。但是,随暴露水平下降,其他作用变得显著。其中包括过氧化过程,这是由于辐射电离能量产生高活性自由基,特别是与元素氧(活性氧物质;ROS)有关,甚至在核避开直接撞击的细胞中。活性氧物质具有毒性,因为其倾向于结合和修饰其途径中的几乎任何物质,包括蛋白质、脂质和核酸。随时间过去,具有显著ROS水平的细胞可与具有直接DNA影响的细胞受到相等损害。由于基因组不稳定性,ROS损伤也可导致最终致死的DNA异常。因此,细胞遭受的损伤量将取决于受到的辐射剂量,并将表现为直接DNA损伤、ROS损伤和源于ROS影响的间接DNA损伤的组合。对生物体总体损伤的定时和程度因此很大程度上取决于受到的辐射量,导致存活率与暴露量之间渐进的非线性关系。
辐射中毒的候选治疗通常是试图增强抵抗ROS影响的正常细胞防御的试剂。实例包括自由基清除剂(如依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)、维生素E及类似物)、超氧化物歧化酶类似物(如tempol(4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧))及试图降低胞内ROS浓度的其他试剂。这些候选治疗被设计以在辐射暴露前给予或在辐射暴露后立即给予。对这些试剂的任何益处的评价通常被设计以探寻暴露后一个月存活率的提高,因为到那时任何毒性均是上述间接过程的结果。
常用的基准测量是剂量减少系数(DRF),其被定义为用候选试剂治疗小鼠时在暴露后30天给出50%死亡率的辐射剂量与不给予治疗(或给予对照治疗)达到该LD50/30的辐射剂量的比。该测量是非线性的,从而DRF的微小增加表示对辐射抵抗力的略大改变。对于被认为将有希望由国防部(Department of Defense)进一步评价的候选试剂,通常要求1.2或更高的DRF。该要求可以是极大的障碍。依达拉奉和tempol在体外系统均具有显著效果,但在全动物研究中,仅控制所报道的1.3的DRF。该限制可出现是由于细胞已防御自由基,包括多种可在其结合其他组分前结合ROS的蛋白质。但是,这种结合没有赋予完全的保护,因为复合蛋白质本身对细胞有毒。因此,额外消耗的清除剂在有益的同时并不表现为细胞防御级联中的“限速”步骤,因为一旦基团不再“自由”,其不能防止任何后续影响。
此外,目前可用的辐射保护剂必须在辐射暴露前被给予或在辐射暴露后被立即给予,例如在辐射暴露后4小时内。Landauer等,“Genistein treatment protects micefrom ionizing radiation injury.”J APPL TOXICOL 23(6):379-85(2003);Vijay-Kumar etal.,“Flagellin treatment protects against chemicals,bacteria,viruses,and radiation.”JIMMUNOL 180(12):8280-5(2008)。但不幸地,可能不可能在辐射暴露4小时内治疗该暴露。因此,本领域迫切需要有效的辐射保护剂,特别是在辐射暴露后24小时以上之后给予时有效的辐射后保护剂。
发明概述
本公开总体涉及在生物体已暴露于辐射后,例如在生物体已暴露于辐射后24小时以上之后,良好地治疗或控制对象或生物体——例如,哺乳动物,如人——的辐射暴露效应(影响)的方法。这些方法包括在辐射暴露后——即辐射后——向生物体给予治疗有效量的RLIP76蛋白或RLIP76蛋白的有效部分。令人惊讶地,如本文公开,生物体在辐射暴露后24小时以上之后继续受益于RLIP76蛋白或其有效部分的给予。如本文所用,“RLIP76蛋白的有效部分”或“其有效部分”或“活性片段”是促进对细胞或生物体中的辐射暴露效应的治疗的任意RLIP76蛋白质片段(一个或多个)、蛋白质部分(一个或多个)或其组合。RLIP76蛋白可以是重组的RLIP76蛋白或其片段或部分。在此公开的方法不包括在辐射暴露前(before或prior)给予生物体RLIP76蛋白或其有效部分。
在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其有效部分在辐射暴露后24小时以上之后被给予生物体一次或多次。RLIP76蛋白或其有效部分可在辐射暴露后约25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、42小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天、8天、8.5天、9天、9.5天、10天、10.5天、11天、11.5天、12天、12.5天、13天、13.5天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或以后被给予一次或多次。
在其他实施方式中,RLIP76蛋白或其有效部分在辐射暴露后被给予生物体两次或更多:第一,在辐射暴露后24小时以内至少一次,第二,在辐射暴露后24小时以上之后至少一次。第一剂量的RLIP76蛋白或其有效部分可在辐射暴露后约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时被给予生物体。在辐射暴露后24小时内可给予一个或多个该剂量。第二剂量的RLIP76蛋白或其有效部分可在辐射暴露后约30小时、36小时、42小时、48小时、60小时、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天、8天、8.5天、9天、9.5天、10天、10.5天、11天、11.5天、12天、12.5天、13天、13.5天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或以后被给予生物体。在辐射暴露后24小时以上之后可给予一个或多个该剂量。在辐射暴露后24小时以内和24小时以上之后给予的剂量可具有近似相等量的RLIP76蛋白或其活性片段,或可具有不同量。此外,如果在这些各个时限中的每一个内给予两个或更多个剂量,则各剂量可具有近似相等量的RLIP76蛋白或其活性片段,或可具有不同量。
在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段可在辐射后24小时后被给予1次至10次。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段可在辐射后24小时后被给予1次至5次。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段可在辐射后24小时后被给予3次至10次。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段可在辐射后24小时后被给予2次至8次。
在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段在辐射后24小时后被给予至少3次。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段可在辐射后24小时后被给予至少5次。
在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段在辐射后24小时内被给予一次或多次和/或在辐射后24小时后被给予一次或多次。在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段在辐射后24小时内被给予一次,并在辐射后24小时后被给予一次或多次。在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段在辐射后24小时内被给予一次或多次,并且在辐射后24小时后不被进一步给予。在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段可在辐射后25小时与3个月之间被给予一次或多次。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段可在辐射后25小时与1个月之间被给予一次或多次。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段可在辐射后2个月与3个月之间被给予一次或多次。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段可在辐射后48小时与2个月之间被给予一次或多次。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段可在辐射后1周与1个月之间被给予。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段在辐射后24小时后被给予,目的是延长之前给予的RLIP76蛋白或其活性片段的药效动力学。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段在辐射后24小时后被给予,目的是延长之前给予的RLIP76蛋白或其活性片段的药效。
在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段被包含在脂质体中,该脂质体也可被称为脂蛋白体或脂蛋白体组合物。在一些实施方式中,RLIP脂蛋白体在药学上可接受的载体中被递送。
本公开的某些实施方式涉及治疗在需要这种治疗的生物体中的辐射暴露效应的方法,包括在辐射暴露后24小时以上之后向生物体给予有效量的RLIP76蛋白或其有效部分。其他实施方式涉及治疗在需要这种治疗的生物体中的辐射暴露效应的方法,包括(a)在辐射暴露后24小时以内向生物体给予至少第一剂量的有效量RLIP76蛋白或其有效部分;和(b)在辐射暴露后24小时以上之后向生物体给予至少第二剂量的有效量RLIP76蛋白或其有效部分。在一些实施方式中,生物体是哺乳动物,例如,人。生物体暴露的辐射可以是电离辐射,包括但不限于X-辐射、γ-辐射、高能电子辐射、紫外辐射、热辐射、宇宙辐射、电磁辐射、核辐射或其组合。还有其他实施方式中,高能电子辐射是β-粒子辐射,或辐射是质子或重离子辐射。
在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其有效部分在暴露于辐射后24小时以上之后被给予。在其他实施方式中,RLIP76蛋白或其有效部分在暴露于辐射后24小时以内——例如,约在暴露于辐射时——和在暴露于辐射后24小时以上之后被给予。在此公开的RLIP76蛋白或其有效部分可在任一个或两个相关的时期——即,在暴露于辐射后24小时以内和/或在暴露于辐射后24小时以上之后,以一个或多个剂量被给予哺乳动物。例如,这些实施方式中的任一个可以是这样的:使得RLIP76蛋白以不同组合多次被给予哺乳动物,包括但不限于在暴露于辐射后24小时以上之后;或在暴露于辐射后24小时以内和在暴露于辐射后24小时以上之后。在相关上述实施方式中的每一个中,剂量可包含大约相等量的RLIP76蛋白或其有效部分,或可包含不同量的RLIP76蛋白或其有效部分。
在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其有效部分在辐射暴露后24小时以上之后、36小时以上之后、48小时以上之后、60小时以上之后、72小时以上之后、84小时以上之后和/或96小时以上之后被给予生物体。例如,在某些实施方式中,剂量可分别在辐射暴露后+24小时、+48小时、+72小时和+96小时被给予。在其他实施方式中,剂量可在辐射暴露后48小时和96小时、在辐射暴露后24小时和72小时、在辐射暴露后0小时、48小时和96小时、在辐射暴露后14小时和48小时、在辐射暴露后16小时和64小时、或在辐射暴露后1小时、24小时和48小时被给予。
RLIP76蛋白或其有效部分可以如下剂量被给予本文所公开的对其有需要的哺乳动物:约0.5mg/kg体重与约14.0mg/kg体重之间,例如,约1.0mg/kg体重、约1.5mg/kg体重、约2.0mg/kg体重、约2.5mg/kg体重、约3.0mg/kg体重、约3.5mg/kg体重、约4.0mg/kg体重、约4.5mg/kg体重、约5.0mg/kg体重、约5.5mg/kg体重、约6.0mg/kg体重、约6.5mg/kg体重、约7.0mg/kg体重、约7.5mg/kg体重、约8.0mg/kg体重、约8.5mg/kg体重、约9.0mg/kg体重、约9.5mg/kg体重、约10.0mg/kg体重、约10.5mg/kg体重、约11.0mg/kg体重、约11.5mg/kg体重、约12.0mg/kg体重、约12.5mg/kg体重、约13.0mg/kg体重或约13.5mg/kg体重。
在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段以至少0.01μg/kg体重的剂量被给予。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段以至少0.1μg/kg体重的剂量被给予。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段以至少1μg/kg体重的剂量被给予。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段以至少5μg/kg体重的剂量被给予。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段以至少0.1mg/kg体重的剂量被给予。
在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段以约0.01μg/kg体重与约100mg/kg体重之间的剂量被给予。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白以约0.1μg/kg体重与约50mg/kg体重之间的剂量被给予。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白以约1μg/kg体重与约40mg/kg体重之间的剂量被给予。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白以约5μg/kg体重与约25mg/kg体重之间的剂量被给予。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白以约0.1mg/kg体重与约10mg/kg体重之间的剂量被给予。
在某些实施方式中,RLIP76蛋白或其活性片段通过选自如下的给药途径被给予:静脉内、肌内、皮下、腹膜内和口服给药。在进一步的实施方式中,RLIP76蛋白通过选自静脉内(iv)、皮下(sc)和口服给药(po)的给药途径被给予。
在某些实施方式中,辐射暴露或暴露于辐射为至少2Gy或200cGy。在进一步的实施方式中,辐射暴露或暴露于辐射为至少5Gy或500cGy。在进一步的实施方式中,辐射暴露或暴露于辐射为至少7.5Gy或750cGy。在进一步的实施方式中,辐射暴露或暴露于辐射为至少10Gy或1000cGy。在进一步的实施方式中,辐射暴露或暴露于辐射为至少20Gy或2000cGy。在进一步的实施方式中,辐射暴露或暴露于辐射在约200cGy与约5000cGy之间。在进一步的实施方式中,辐射暴露或暴露于辐射在约2Gy与约100Gy之间。在进一步的实施方式中,辐射暴露或暴露于辐射在约3Gy与约50Gy之间。
在某些实施方式中,辐射暴露或暴露于辐射是至少0.2Gy的延长辐射暴露。在某些实施方式中,辐射暴露或暴露于辐射是至少0.5Gy的延长辐射暴露。在某些实施方式中,辐射暴露或暴露于辐射是约0.5Gy与约2.0Gy之间的延长辐射暴露。在进一步的实施方式中,延长辐射暴露为至少2小时。在进一步的实施方式中,延长辐射暴露为至少12小时。在进一步的实施方式中,延长辐射暴露在约2小时至48小时之间。
在某些实施方式中,利用辐射损伤的生物标记监测所给予的RLIP76蛋白或其有效部分的药物效应。在进一步的实施方式中,辐射损伤的生物标记包括DNA异常。在进一步的实施方式中,辐射损伤的生物标记包括外周网状细胞中的微卫星体。在进一步的实施方式中,辐射损伤的生物标记包括外周网状细胞中的DNA异常或微卫星体。在进一步的实施方式中,辐射损伤的生物标记包括外周网状细胞中的DNA异常和微卫星体。在其他实施方式中,用测试对象的死亡率监测所给予的RLIP76蛋白或其有效部分的药物效应。
在上述任意实施方式中,第二辐射保护剂可与RLIP76蛋白或其有效部分同时或组合被给予生物体。在某些实施方式中,第二辐射保护剂可以是自由基清除剂、抗氧化剂或超氧化物歧化酶类似物。在此公开的RLIP76蛋白或其有效部分可以以药物组合物或脂蛋白体组合物被给予。在其他实施方式中,药物组合物或脂蛋白体组合物进一步包括凝集素、糖脂、磷脂或其组合。在其他实施方式中,RLIP76蛋白或其有效部分是重组蛋白或其部分。本公开的药物组合物或脂蛋白体组合物可被如下给予:皮下、静脉内、局部、口服、非口服或其组合。
在本公开中,除非上下文另外表示,单词“包括(comprise)”或变体(如“comprises“或”comprising“)被认为意为“包括但不限于”,使得未被明确述及的其他成分也可被包括在内。进一步,除非上下文另外表示,术语“a(一)”的应用可意为单数对象或成分,或者其可意为复数或一个或多个该对象或成分。此外,除非另外特别陈述,本文中“或”的使用意为“和/或”。同样,除非另外特别陈述,术语如“成分”或“组分”包括含有一个单元的成分和组分以及含有多于一个单元的成分或组分。
要理解的是,前文的总体描述和后文的详细描述均仅是示例性的和说明性的,并不限制所要求保护的本发明。在此所用的章节标题仅以组织为目的,并不被解释为限制所述的主题。在此将本发明所引用的所有文件或文件部分——包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文——其全部明确引入作为参考,用于任何用途。在一个或多个所引入的文献或类似材料以与本发明的术语定义矛盾的方式定义术语的情况下,本申请起决定作用。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分,并被囊括以进一步示范本发明的某些方面。本发明可通过参考这些附图中的一个或多个结合本文所示具体实施方式的详细描述而被更好地理解。
图1.不同毒性损伤造成细胞死亡的机制。
图2.RLIP76的生理学意义的实例。
图3A和图3B.用不同的X-辐射剂量治疗的小鼠的基准存活率曲线。图3A.不同辐射剂量下对照治疗的小鼠的存活率。图3B.相对于辐射剂量的平均死亡时间。
图4.RLIP76对辐射敏感性的影响。所示的三组为:不用脂质体的治疗(圆形);用不带有RLIP76的脂质体治疗(方形);和用带有RLIP76的脂质体治疗(三角形)。
图5.在较高的X-辐射剂量后RLIP76对存活率的影响。将四只野生型(+/+)RIP1小鼠和四只纯合型(-/-)小鼠各自暴露于750cGy X-辐射,并通过i.p.注射给予对照脂质体进行治疗(三角形,纯合型RIP1小鼠;菱形,野生型RIP小鼠),或通过i.p.注射给予400μg RLIP76脂质体进行治疗(方形,纯合型RIP1小鼠;圆形,野生型RIP1小鼠),该治疗在暴露后12小时给予。
图6.在500cGy暴露后RLIP76对于存活率的剂量反应:菱形,对照(未治疗)小鼠;方形,在暴露后14小时和48小时用25μg RLIP76脂质体治疗的小鼠;三角形,在暴露后14小时和48小时用50μg RLIP76脂质体治疗的小鼠;X,在暴露后14小时和48小时用100μg RLIP76脂质体治疗的小鼠;星形,在暴露后24小时和72小时用100μg RLIP76脂质体治疗的小鼠;圆形,在暴露后48小时和96小时用100μg RLIP76脂质体治疗的小鼠。
图7.测量未治疗和RLIP76治疗的小鼠的50%存活率相对于辐射剂量的剂量-减少系数图。
图8.在500cGy暴露后RLIP76的给药时间对存活率的影响:菱形,对照(未治疗)小鼠;方形,在暴露后14小时和48小时用25μg RLIP76脂质体治疗的小鼠;三角形,在暴露后0小时、48小时和96小时用25μg RLIP76脂质体治疗的小鼠。
图9.较高辐射剂量下RLIP76的影响:菱形,750cGy对照(未治疗);方形,在暴露后0小时、48小时和96小时用100μg RLIP76脂质体治疗的750cGy;三角形,1000cGy对照(未治疗);X,在暴露后16小时和64小时用100μg RLIP76脂质体治疗的1000cGy。
图10显示小鼠在γ辐射后的总体存活率。14周龄的CD2FI雄性小鼠被分为每组16只小鼠的单独小组,并暴露于9.25Gy全身γ辐射,该辐射通过钴60源以0.6Gy/分钟输送。如所示,通过i.p.注射用多个剂量的脂质体、RLIP76蛋白和抗氧化剂(BHT)的不同制剂治疗小鼠。RLIP76蛋白、脂质体和抗氧化剂BHT的复合体被称为TO-80Cx(80指脂质体的平均尺寸为80nm,其将该脂质体归类为中等尺寸的小泡);TO-80LA指在缓冲液中由BHT组成但不具有RLIP76蛋白的脂质体。在辐射暴露前或后的时间的参考是小时,并且50μg的剂量是以各个剂量输送的TO-80Cx的总体积中所含的RLIP76蛋白量。该量表示各小鼠每千克体重1.67mg RLIP76蛋白的剂量。X轴是在辐射暴露后的天数,y轴是各小组在那一天的存活百分率。
图11是各小组小鼠在γ辐射后30天仍存活的百分率的不同描述。
图12显示在与所述相同条件下治疗的另外CD2F1小鼠小组的总体存活率,其中治疗是在暴露后指定时间输送的不同输送载体和对照。在图例中,5AED指5-雄烯二醇。
图13显示在较低暴露于γ辐射后C57/Bl6小鼠的总体存活率,该γ辐射为5Gy全身暴露,通过6-MeV光子束以4Gy/分钟的速率输送。在该实验中,在暴露后14和48小时给予用两个剂量的TO-80Cx治疗小鼠,该TO-80Cx通过口服管饲法输送。所示剂量水平是输送的TO-80Cx体积中所含的RLIP76蛋白量,并被表示为单位总体重的蛋白量。X轴是在辐射暴露后的天数,y轴是各小组在那一天的存活百分率。
发明详述
本公开至少部分源自发明者的如下发现:RLIP76蛋白及其有效部分(例如,活性片段)(在此也被称为RLIP76)令人惊讶地有效保护生物体免受辐射暴露的毒性影响——甚至在辐射暴露后许多时间之后给予时。因此,不像其他辐射保护候选者,RLIP76在辐射暴露后24小时以上之后继续保护生物体免受辐射暴露的毒性影响。尽管RLIP76治疗辐射暴露的应用已被公开于U.S.序号11/741,447、U.S.公布号20080279919——在此将其引入作为参考,RLIP76在辐射暴露许多时间后继续向生物体提供治疗保护或益处的能力是令人惊讶且具有重要的益处——在导致显著辐射暴露的事件后治疗数量众多的人的逻辑困难存在的情况下。RLIP76的另一显著益处是其可被口服给予,例如,利用RLIP76脂蛋白体组合物,其得到初步动物研究的支持。然而,要理解的是,输送也可通过本领域已知的其他给药途径实现,包括但不限于,舌下、口腔、腹膜内、吸入、静脉内、肌内、跨粘膜或透皮输送。除RLIP76的输送外,考虑在此公开的RLIP76脂蛋白体也有效用于向生物体输送其他辐射保护剂。
RLIP76
RLIP76(也被称为RALBP1或RIP1)是发现于果蝇(Drosophila)中的对于人类普遍存在的蛋白质,其在细胞生理学中充当多个角色。当与膜相关时,该蛋白质充当多种化合物——包括两亲性小分子如长春花(Vinca)生物碱和蒽环类,其为常见的抗癌药物——的多特异性排出泵。但是,RLIP76的运输也包括自由活性氧物质(ROS)形成的内源性谷胱甘肽亲电子结合体(GSE)的细胞的移动。ROS由多种损伤如辐射和多种有机化学剂生成,并在许多层面上对细胞具有毒性。顾名思义,ROS具有高度活性,并结合其途径中的几乎任何物质,包括蛋白质、脂质和核酸,改变它们接触的其中每一种。ROS对脂质造成的损伤(脂质过氧化)特别有害,因为产生的过氧化产物本身具有毒性。其包括促凋亡活性烯醛,如4羟基壬烯醛(4-HNE),其长期存在并可在细胞中积累,最终导致进一步损伤和死亡。因此,RLIP76是培养细胞的应激反应的重要组分,并提供对应激物——包括热、氧化化学剂、化疗剂、UV辐射和X-辐射——的防御。
正常细胞具有被设计以结合(bind up或conjugate)这些ROS相关毒素——其中主要是谷胱甘肽——的防御机制。谷胱甘肽结合亲电子化合物,从而隔离活性电子。但是,产生的结合体(GS-E)如果允许其累积则对于细胞是有害或致死的,因此其必须被细胞清除。虽然不希望受任何具体理论约束,但呈现的是衍生自这些毒性中间体的GS-E的主动排出是RLIP76赋予对氧化应激物和辐射应激物的抵抗力所凭借的主要机制(图1)。
RLIP76的保护作用超出其对潜在毒性化学替代物及其副产物的防御。例如,通过在辐射过程中生成的活性氧物质产生的脂质过氧化物酶(LPO)的亲电子产物可部分地解释辐射引起的细胞死亡。如在此的详细描述,RLIP76介导的这些亲电子体的GSH结合体的运输提供对辐射的防御。这种保护可容易较大规模地转化为保护哺乳动物免受损伤性辐射,包括电离、电磁、热和激光辐射,其中涉及远程或短程电子。
因此,RLIP76介导内源生成的化学剂、代谢产物、其副产物和外源给予的药物或辐射及其副产物的运输。RLIP76介导大多数化学剂和副产物——也包括GS-E(例如,4-HNE的结合体)——的运输。例如,RLIP76-富集细胞对化学毒性(有机或无机)形式的毒性或来自损伤(例如,来自应激、氧化、烷化、辐射)的毒性具有抵抗力。RLIP76通过ATP依赖性外来物质(例如,GS-E以及外源性和内源性亲电子体)排出的作用显示在图2。在此,外来物质、辐射、其代谢物、线粒体电子运输和金属离子产生可引起膜脂质过氧化的ROS和可引起导致诱变、癌变和凋亡的DNA损伤的4-羟基壬烯醛(有毒的脂质过氧化终产物),并调控应激介导的信号途径。RLIP76介导真核细胞多种代谢、应激和药物副产物——如两亲性药物、外生和内生抗生素的GSH-结合体(GS-E)、GS-HNE和白细胞三烯——的ATP依赖性排出。GS-E的运输对保持GST和谷胱甘肽还原酶(GR)的功能性是重要的,因为这些酶受GS-E抑制。RLIP76通过与细胞GSTs的协调机制调节4-HNE的胞内浓度。
RLIP76的结构
RLIP76的一级结构显示几个令人感兴趣的特征。蛋白质可被分为四个区域——其中两个中心结构域负载Rac1/CDC42 GAP活性——和一个Ral结合结构域。两个侧翼结构域的作用仍未知。代表性的人RLIP76(GenBank登录号NM_006788)和小鼠RLIP76(NM_009067)的核苷酸序列和人RLIP76(GenBank登录号NP_006779)和小鼠RLIP76(GenBank登录号NP_033093)的氨基酸序列已被描述。人RLIP76氨基酸序列包括N-糖基化(氨基酸341-344)、cAMP(氨基酸113-116)、cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化(氨基酸650-653)、酪氨酸激酶磷酸化(氨基酸308-315)、N-豆蔻酰化(氨基酸21-26、40-45和191-196)、亮氨酸拉链模式(氨基酸547-578)和几种蛋白激酶C磷酸化、酪蛋白激酶II磷酸化的位点、胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点。RLIP76一级结构中这种基序的存在及其容易的蛋白质水解降解表明RLIP76参与几个胞内和胞外过程(例如,蛋白质加工、胞内信号传导、蛋白质降解、识别、标记等),并表明RLIP76的蛋白质水解过程是多种功能所需要的。单独或组合其他片段的RLIP76肽片段可催化这些不同的功能。例如,RLIP76的N末端和C-末端片段——单独不能介导ATP依赖性运输的片段——在脂蛋白体中重构在一起时可催化带电荷药物(例如,DOX、秋水仙碱)的运输。
在一些实施方式中,本发明的RLIP76蛋白包含具有GenBank登录号NP 006779所示655个氨基酸的序列。在一些实施方式中,本发明的RLIP76蛋白包含US 2005/0123594、US 2006/0182749、US 2008/0279919、US 2010/0124566或WO 2009/100446A1所公开的序列,在此将其全部内容引入作为参考。
不像ABC运载体,RLIP76序列中无明显的跨膜α-螺旋。但是,RLIP76与膜的结合已得到利用特异性抗体进行的免疫组织化学研究的证明(Awasthi,et al,Proceedings of the American Association for Cancer Research,43:Abst.4717,2002;在此引入作为参考)。RLIP76自细胞裂解液的提取需要洗涤剂,表明了膜结合——对运输重要的特征。这些发现显示该运载体比与目前所接受的运载体在限定ATP结合的结构成分和膜插入方式方面更大的多样性。此外,阴离子运载体相对于中性或阳离子基底的区别是不明显的,因为RLIP76催化二者的运输,并且与MRP 1相比,如此进行而不共同运输GSH。
培养细胞或大肠杆菌(E.coli)中表达的RLIP76在纯化过程中进行容易的蛋白质水解。最显著的肽,N-RLIP761-367和C-RLIP76410-655,分别从RLIP76的N和C末端产生,在SDS-凝胶中表现为49kDa和38kDa的带。这两种肽均显示组成型ATP酶活性,该活性可在RLIP76运输的阴离子或阳离子配体存在的情况下被刺激。两肽结合ATP,如光亲和标记所示,该光亲和标记在钒酸盐存在的情况下增加,表明反应中间体在ATP结合位点被捕获。这两个片段在单独脂蛋白体中重构时均不催化运输。但是,重构在一起时,观察到带电化学剂(例如,DNP-SG、DOX)的ATP依赖性运输具有与RLIP76类似的动力学参数。N-RLIP761-367和CRLIP76410-655的ATP结合位点分别被确定为氨基酸69-74和氨基酸418-425。N和C-末端肽中K74和K425的突变分别终止了ATP酶活性、ATP结合能力和运输功能。这些ATP结合位点的序列不与P-环的共有序列(Walker基序)一致。
除上述人RLIP76核酸序列外,人RLIP76基因中的多个单核苷酸多态性(SNP)也已在本领域中得到描述,其中三个(编码序列核苷酸660的A至G突变、编码序列核苷酸838的G至A突变和编码序列核苷酸2065的C至T突变)落入RLIP76编码序列。这些核苷酸的改变造成氨基酸序列分别在氨基酸位点149从赖氨酸变为谷氨酸盐,在氨基酸位点208从精氨酸变为谷氨酰胺,以及在氨基酸位点617从丙氨酸变为缬氨酸。这些SNP连同存在于人RLIP76基因的内含子中的SNP以及存在于人RLIP76基因的5′和3′非翻译区域的SNP均在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站的单核苷酸多态性(SNP)数据库中得到描述。
在本公开的某些方面,“RLIP76蛋白”可指GenBank登录号NP 006779所示的全长人RLIP76氨基酸序列、人RLIP76氨基酸序列的一个或多个单独或组合保留RLIP76运输活性的片段、或保留RLIP76运输活性的人RLIP76氨基酸序列的突变。在某些实施方式中,RLIP76可指与GenBank登录号NP_006779所示的人RLIP76氨基酸序列具有约99%同一性或同源性,与GenBank登录号NP_006779所示的人RLIP76氨基酸序列具有约98%同一性或同源性、约95%同一性或同源性、约90%同一性或同源性、约85%同一性或同源性或者约80%同一性或同源性的氨基酸序列。序列同一性或同源性的百分率可反映出序列的某些添加、缺失、置换、沉默或保守突变。
脂质体
脂质体是由排列在一个或多个同心双层中的两亲性脂质组成的小泡。当将脂质置于水介质中时,脂质的头部基团与水的亲水相互作用导致看似球壳形式的生物膜的多层和单层系统或小泡的形成。脂质体可以是由小(0.025-0.05μm)至大(0.05-10μm)的多层小泡。用于制备脂质体的脂质可包括但不限于,磷脂、鞘脂、糖脂、饱和甘油酯、类固醇(例如,胆固醇)和合成磷脂。脂质体一般通过将脂质与乳化剂如POE在水溶剂中融解在一起而制备。然后添加试剂,并通过混合或超声处理生成脂质体。试剂通常陷入小泡结构。这些基本的脂质体有时被称为“常规脂质体”。几种其他类型的脂质体制备物存在,包括(1)空间上稳定的脂质体,其表面覆盖有惰性亲水性聚合物,如聚乙二醇;(2)靶向脂质体,其连接靶向配体,如抗体或其片段、凝集素、低聚糖或肽(例如,霍乱毒素B(CTB)被用于将脂质体靶向胃肠道上皮);和(3)活性或“多态性”脂质体,其响应于具体相互作用而改变其状态和结构(这一组包括对离子(pH、阳离子)、热和光以及其他刺激敏感的脂质体)。
在某些实施方式中,组合物包括脂蛋白体。如本文所用,“脂蛋白体”一般是蛋白质和凝集素或糖脂或磷脂的组合,该组合形成球形胶束状或小泡状结构。该结构可自发地或通过化学或机械操作或其组合而形成。脂蛋白体利用脂质(或凝集素)的两亲性的优势,该两亲性使其在溶液中形成双层,生成如下若干形状中的至少一种:包括:(a)尾部向内的球形胶束或(b)双分子层——疏水尾部夹在亲水性头部基团之间的双层。一般,脂蛋白体在撕裂或破坏时可重新封闭自身。脂蛋白体可包含仅一种凝集素或脂质或多种和各种的组合。磷脂的实例包括磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、肌醇磷脂和磷脂酰乙醇胺。在使用时,脂蛋白体可带电或电中性,并一般在生理学pH下使用。其也可以是与洗涤剂混合的结构(例如,洗涤剂/脂质/蛋白质、洗涤剂/凝集素/蛋白质)。制备具有限定的脂质-蛋白质或凝集素-蛋白质比和尺寸的脂蛋白体的方法对于分子生物学和蛋白/脂质生物化学领域的普通技术人员来说是众所周知的。本公开的脂蛋白体可通过本领域已知的任何方法制备,包括U.S.专利申请序号10/713,578——以US 2005/0123594 A1公布——公开和描述的方法,在此将其公开的全部引入作为参考,用于所有目的。
另外的辐射保护剂
在本公开的某些方面,包含RLIP76例如RLIP76脂蛋白体的组合物可与一种或多种另外的辐射保护剂组合使用,该辐射保护剂包括但不限于自由基清除剂、抗氧化剂和超氧化物歧化酶类似物。无保护的RLIP76易于蛋白质水解,致使暴露的蛋白质的给予遭遇挑战。为促进蛋白质的稳定性,RLIP76可以脂质封装的脂蛋白体的形式被给予。此外,RLIP76蛋白可与一种或多种辐射保护剂——例如,抗氧化剂、自由基清除剂或超氧化物歧化酶类似物——一起被给予,从而促进蛋白质的稳定性。
可与RLIP76组合使用的另外的自由基清除剂或抗氧化剂包括但不限于丁基羟基甲苯(BTH)、N-乙酰半胱氨酸、硫代硫酸钠、谷胱甘肽乙酯、谷胱甘肽、D-蛋氨酸、半胱胺、胱胺、氨丙基甲基异硫脲、Ethyol、维生素E、依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)、褪黑激素、聚硝酰-白蛋白、艾地苯醌、一氧化氮、卡维地洛(Carvedilol)、α-硫辛酸、别嘌呤醇、2O十八烷基抗坏血酸、N-2-巯基丙酰基甘氨酸、超氧化物歧化酶(SOD)、重组的人CuZn-SOD、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、一氧化氮合成酶、抗坏血酸(维生素C)、硒、乙酰半胱氨酸、seleginine碧萝芷(pycnogenol)、辅酶Q10、β胡萝卜素、PC 01、SC-55858、铁(III)卟啉、光神霉素、色霉素、道诺霉素、橄榄霉素和WP-631或其组合。
可与RLIP76组合使用的另外的辐射保护剂包括但不限于富勒烯(Fullerene)DF-1、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、碳纳米管、自体和异体骨髓得到的干细胞、CD34阳性细胞、Rad51或Rad52的蛋白质和/或cDNA和/或mRNA和相关基因、TGF βII型受体基因和/或产物和p53基因和/或产物或其组合。
药物组合物和给药途径
包含RLIP76的治疗组合物在此作为用于向患者或对象全身、表面(topical)或局部(local)给药的药物制备物而提供。在此所用的术语“患者”或“对象”指人或动物对象(尤其用作具体组合物临床效力模型的动物)。适当药物制备物的选择取决于所选的给药方法,并可根据药物化学师熟知的方案制备。
在某些实施方式中,在此公开的组合物还包含药学上可接受的载体。如本文所用,“药学上可接受的载体”包括任何以及所有溶剂、分散介质、外衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂及类似物。这种药学上可接受的载体与药物活性剂的联合使用在本领域熟知。除任何常规介质或试剂与活性剂不相容的情况外,考虑其在本文公开的组合物中的应用。补充性活性成分也可被掺入组合物中。
如本文所用,“药学上可接受的盐”指在此公开的RLIP76或其他化合物的衍生物,其中母体化合物通过制成其酸盐或碱盐被改变。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的矿物盐或有机酸盐;酸性残基如羧酸的碱盐或有机盐;及类似物。因此,术语“酸加成盐”指已通过添加酸制备的母体化合物的相应盐衍生物。药学上可接受的盐包括但不限于由例如无机或有机酸形成的母体化合物的常规盐或季铵盐。例如,这种常规盐包括但不限于得自无机酸的盐,该无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸及类似酸;和由有机酸制备的盐,该有机酸如醋酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸(palmoic)、马来酸、羟基马来酸、苯基醋酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸及类似酸。某些酸性或碱性化合物可作为两性离子存在。活性剂的所有形式,包括游离酸、游离碱和两性离子,均被考虑在本公开的范围内。
蛋白质可被制成在中性或盐形式的组合物中。药学上可接受的盐包括但不限于与无机酸如例如盐酸或磷酸或有机酸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸及类似酸形成的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐也可得自无机碱如例如,钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物和有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因及类似物。
RLIP76组合物可与聚乙二醇(PEG)、金属离子络合,或被掺入聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶、葡聚糖等中,或掺入脂质体、微乳液、胶束、单层或多层小泡、红细胞血影(ghost)或球芽(spheroblast)中。这种组合物将影响物理状态、溶解性、稳定性、体内释放速率和/或体内清除速率,因此根据目标应用进行选择。
此外,RLIP76或其一个或多个活性片段可例如通过共价键、非共价键、离子键或疏水键与任意数量的不同输送载体键合,该输送载体包括但不限于脂质体、脂蛋白体、小泡、纳米粒子、noisosome、载体蛋白、金粒子、几丁质、聚合物、有机“笼”、病毒和细菌。此外,一种或多种特异性器官、组织或细胞类型对任意上述RLIP76组合物的优先摄取可通过包含一个或多个具有RLIP76的特异性靶向部分或任意以上列举的输送载体而实现。这种靶向部分包括但不限于具有特定二维或三维结构的抗体或其片段、肽、脂质、化学剂、带电粒子、受体、蛋白质、病毒启动子、转录因子、DNA启动子和核酸。
公开的化合物可例如随惰性稀释剂或可同化的食用载体被口服给予,或其可被封入硬壳明胶胶囊或软壳明胶胶囊,或其可被直接掺入饮食的食物中。对于口服治疗给药,活性化合物可被掺入有赋形剂,并以片剂、含片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂及类似的形式应用。这种组合物和制备物应包含至少0.1%的活性剂。组合物和制备物的百分率当然可改变,并可方便地在单位重量的约2至约60%之间改变。这种治疗上有用的组合物中的活性剂的量使得适当的剂量将被获得。
片剂、含片、丸剂、胶囊及类似物也可包含如下:结合剂,如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶;赋形剂,如磷酸二钙;崩解剂,如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸及类似物;润滑剂,如硬脂酸镁;和甜味剂,如蔗糖、乳糖或糖精可被添加,或调味剂,如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当组合物是胶囊时,其除上述材料类型外还可包含液体载体。多种其他材料可作为外衣存在,或以另外方式改变组合物的物理形式。例如,片剂、丸剂或胶囊可用虫胶、糖或二者涂布。酏剂的糖浆可包含蔗糖作为甜味剂,尼泊金甲酯和尼泊金丙酯作为防腐剂、染色剂和如樱桃味或橙味的调味剂。当然,制备任意组合物所用的任何材料应当是药学上纯的,并且在所用量下基本是无毒的。此外,活性剂可被掺入持续释放制备物和制剂。
活性剂也可经胃肠外或腹膜内给予。可在水中制备活性剂如游离碱或药理学上可接受的盐的溶液,适当地混合表面活性剂,如羟丙基纤维素。也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和在油中制备分散液。在普通储存和使用条件下,这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。
对于以水溶液进行胃肠外给药,例如,如必要溶液应适当进行缓冲,并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些具体的水溶液特别适于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。在这方面,可应用的无菌水介质将根据本公开为本领域技术人员所知。例如,一个剂量可被溶于1mL等渗NaCl溶液,并且被添加至1000mL皮下输液,或在拟向的输入位点被注入(参见,例如,″Remington′sPharmacertical Sciences″15th Edition,第1035-1038和1570-1580页)。取决于所治疗的对象的情况,剂量可必要地发生一些改变。负责给药的人员在任何情况下将确定适于各个对象的剂量。
适于注射应用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于无菌注射溶液或分散液即时制备的无菌粉末。在所有情况下,各形式必须无菌,并且必须适当地具有流动性。其在制备和储存条件下必须具有稳定性,并且必须被保存以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质,包括例如,水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇和液体聚乙二醇及类似物),其适当的混合物以及植物油。适合的流动性可通过如下保持:例如,通过应用外衣如卵磷脂,在分散液的情况下通过保持所需的粒子尺寸,通过应用表面活性剂。微生物作用的预防可通过多种抗细菌和抗真菌试剂实现,例如,对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及类似物。在多种情况下,将优选包含等渗试剂,例如,糖或氯化钠。注射用组合物的延长吸收可通过延迟吸收的剂——例如,单硬脂酸铝和明胶——在组合物中的应用而实现。
无菌注射溶液是通过以需要的量将活性剂以及如需要与以上列举的几种其他成分掺入适当溶剂中,然后过滤除菌制备的。一般,通过将多种除菌后的活性剂掺入无菌载体制备分散液,该无菌载体包含基本分散介质和以上列举的成分中的所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术,使活性成分和任意另外的所需成分的粉末由其之前的无菌过滤溶液生成。
在某些实施方式中,公开的组合物可配制成通过皮肤贴剂或透皮输送系统的应用被给予。透皮给药也可通过本领域已知的多种系统中任意种实现。可用于在此所述的组合物的系统的实例包括U.S.专利号4,816,252;U.S.专利号5,122,382;U.S.专利号5,198,223;U.S.专利号5,023,084;U.S.专利号4,906,169;U.S.专利号5,145,682;U.S.专利号4,624,665;U.S.专利号4,687,481;U.S.专利号4,834,978;和U.S.专利号4,810,499所述的那些透皮给药系统,将其分别引入作为参考。
这些方法一般包括粘性基质或药物储存系统,并可包括皮肤渗透增强剂,如乙醇、聚乙二醇200二月桂酸酯、肉豆蔻酸异丙酯、三油酸甘油酯、亚麻酸饱和乙醇、甘油单油酸酯、甘油单月桂酸酯、正癸醇、癸酸和某些饱和和不饱和脂肪酸及其酯、醇、单甘油酯、醋酸酯、二乙醇酰胺和N,N-二甲基酰胺(参见,例如,U.S.专利号4,906,169)。
有效剂量
在某些方面,本公开包括治疗或控制例如源自辐射暴露的疾病或病症的方法,包括给予需要这种治疗或控制的患者或对象治疗有效量的RLIP76或RLIP76与另一种活性剂——例如,另一种辐射保护剂——的治疗组合。在某些实施方式中,这种包含RLIP76的化合物或剂量单位被称为活性剂。还考虑公开的组合物在制备用于治疗或控制疾病或病症的药物中的应用。本公开还包括包含生物或治疗有效量的一种或多种货物分子的组合物,该货物分子用于制备用于治疗或控制疾病或病症的药物。
如本文所用,并且除非另外表示,术语“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)指当患者患有疾病或病症时发生的行为,其降低疾病或病症或相关疾病或病症的一种或多种症状或影响的严重程度。如本文所用,并且除非另外表示,术语“控制”(”manage”、”managing”和”management”)包括防止、延迟已患有疾病或病症的患者的疾病或病症的复发或降低其严重程度。该术语包括调控疾病或病症的阈、发展和/或持续时间,或改变患者响应疾病或病症的途径。
如本文所用,并且除非另外指明,化合物的“治疗有效量”是足以提供疾病或病症的治疗或控制中的任何治疗益处或足以延迟或最小化一种或多种与疾病或病症相关症状的量。化合物的治疗有效量意为单独或与一种或多种其他治疗和/或治疗试剂组合的化合物在疾病或病症或相关疾病或病症的治疗或控制中提供任何治疗益处的量。术语“治疗有效量”可包括治愈疾病或病症、改善或减轻疾病或病症、减轻或避免疾病或病症的症状或起因、改善总体治疗或增强另一种治疗试剂的治疗效力的量。
所述化合物和组合物的毒性和治疗效力可通过在细胞培养物或实验动物中的标准药物程序确定,例如,用于确定LD50(群体的50%致死的剂量)和ED50(群体的50%治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比为治疗指数,表示为比LD50/ED50。优选呈现高治疗指数的化合物。呈现毒性副作用的化合物可被用于某些实施方式,但通常应谨慎设计优先将这种化合物靶向至感染组织位点的输送系统,从而最小化对未感染细胞潜在的损害,从而减少副作用。
可应用得自细胞培养物分析和动物研究的数据来配制对人应用的剂量范围。在本公开的某些方面,这种化合物的剂量在包括几乎无毒或无毒的ED50的循环浓度范围内。该剂量可取决于所用的剂型和所用的给药途径在该范围内改变。对于本公开方法所用的任意化合物,治疗有效剂量可在最初由细胞培养物分析而得到评估。可在动物模型中制定剂量以达到包括如细胞培养物中所测定的IC50(即,达到最大症状抑制一半的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可用于更准确地确定对人的可用剂量。血浆水平可例如由高效液相色谱测量。
当考虑治疗性处理时,适当的剂量也可利用动物研究而确定,从而确定每千克重量的测试对象生物活性剂的最大耐受剂量或MTD。一般,至少一个测试动物物种是哺乳动物。本领域技术人员按规律外推有效并避免对其他物种——包括人——的毒性的剂量。在进行对人的效力研究前,I期临床研究有助于确立安全剂量。此外,生物活性剂可与多种完善确立的化合物或结构复合,该完善确立的化合物或结构例如增强生物活性剂的稳定性或增强其药理学性质(例如,增加体内半衰期、降低毒性等)。
在本公开的某些实施方式中,组合物或剂量单位的有效剂量可在如下范围内:约14mg/kg至约0.01mg/kg、约14mg/kg至约0.025mg/kg、约14mg/kg至约0.05mg/kg、约14mg/kg至约0.1mg/kg、约14mg/kg至约0.25mg/kg、约14mg/kg至约0.5mg/kg、约14mg/kg至约1mg/kg、约14mg/kg至约2.5mg/kg、约14mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约0.01mg/kg、约2.5mg/kg至约0.01mg/kg、约1mg/kg至约0.01mg/kg、约0.5mg/kg至约0.01mg/kg、约0.25mg/kg至约0.01mg/kg、约0.1mg/kg至约0.01mg/kg、约0.05mg/kg至约0.01mg/kg、约0.025mg/kg至约0.01mg/kg、约5mg/kg至约0.025mg/kg、约2.5mg/kg至约0.05mg/kg、约1mg/kg至约0.1mg/kg、约0.5mg/kg至约0.25mg/kg或约3mg/kg至约0.1mg/kg或类似范围。因此,在具体的实施方式中,组合物或剂量单位的有效剂量为约0.01mg/kg、约0.025mg/kg、约0.05mg/kg、约0.075mg/kg、约0.1mg/kg、约0.25mg/kg、约0.5mg/kg、约0.75mg/kg、约1mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约7.5mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg或类似有效剂量。
试剂盒
一般的试剂盒包含组合物的一个或多个剂量单位,该组合物包含RLIP76或其药学上可接受的盐、前体药物、溶剂化物、水合物或立体异构体。在某些实施方式中,另一种试剂例如辐射保护剂的单个剂量单位形式可与本公开的化合物组合应用。本公开的试剂盒可进一步包含用于给予活性成分的装置。该装置的实例包括但不限于,注射器、滴液袋、贴剂和吸入器。
本公开的试剂盒可进一步包含可用于给予一种或多种公开的组合物的药学上可接受的载体。例如,如果公开的组合物是以将重构用于胃肠外给药的固体形式提供的,试剂盒可包含适当载体的密封容器,其中本公开的组合物可溶解以形成适于胃肠外给药的无颗粒的无菌溶液。药学上可接受的载体的实例包括但不限于:用于注射USP的水;水载体,如但不限于氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液以及乳酸化林格注射液;水混溶载体,如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇;以及非水载体如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。但是,在具体的实施方式中,本公开的制剂不包含任何醇或其他共溶剂、油或蛋白质。
以下实例被包括以示范本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解的是,后文实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好功能的技术,因此可被认为构成其实践的优选实施方式。但是,根据本公开,本领域技术人员应理解,可在公开的具体实施方式中进行多种改变,并仍得到同样或类似的结果,而没有背离本发明的宗旨和范围。本发明不限于本文所述的具体实施方式的范围,该实施方式意为本发明各个方面的单独示例,并且功能上等同的方法和组分也在本发明的范围内。事实上,除本文所示和所述的改变外,本发明的多种改变将由于前文描述而对于本领域技术人员显而易见。这种改变意欲落入所附权利要求的范围内。
实施例
实施例1
RLIP76的辐射保护
在所有动物模型中,辐射暴露与存活率之间的关系将取决于实验参数而改变,因此必须对于每一个不经治疗的具体模型(对照)进行确定。进行研究以显示X-辐射对小鼠存活率的影响。基准存活率曲线得自用不同X-辐射剂量处理的C57/Bl6种的小鼠。图3A显示对照处理小鼠在不同辐射剂量下的存活率,而图3B描述相对于辐射剂量的平均死亡时间。显然,存活时间随X-辐射剂量增加而减少。
令人惊讶地,向野生型小鼠给予RLIP76提高其存活率。四只野生型小鼠被暴露于1000cGy,并用通过i.p.注射给予对照脂质体进行治疗(图4,菱形),或通过i.p.注射给予400μg RLIP76脂质体进行治疗(图4,方形),该治疗在+3天给予。如示,RLIP76脂质体的给予提高了野生型小鼠的存活率。
实施例2
利用敲除型小鼠的RLIP76和辐射敏感性
补充RLIP76水平在小鼠正常水平以上能增加该小鼠对辐射毒性影响的抵抗力的发现暗示了RLIP76在保护过程中充当“限速”步骤的作用。因此,RLIP76含量的增加可以通过利用正常的生理功能以剂量和时间响应性方式来增强保护。其证实是在多种条件下考察RLIP76的给予对被辐射小鼠的存活率的影响的研究中确立的。
如U.S.序号11/741,447公开,利用Cre-Lox技术(Lexicon Genetics,Incorporated,The Woodlands,TX)生成携带RIP1(RLIP76小鼠形式)基因(野生型;+/+)的两个拷贝、携带RIP1基因的一个拷贝(杂合型;+/-)或不携带RIP1基因拷贝(纯合型;-/-)的C57B小鼠,该Cre-Lox技术可选择性地抑制基因。在i.p.注射RLIP76-脂质体后进行对纯合型RIP1敲除小鼠的组织的蛋白质印迹分析。在500cGy、750cGy和1000cGy全身X-辐射野生型(+/+)、杂合型(+/-)和纯合型(-/-)RIP1小鼠(每组6只小鼠)下检测减少RIP1表达对辐射敏感性的影响,然后监测存活率。如表1所示,野生型(+/+)RIP1小鼠与杂合型(+/-)RIP1小鼠相比在所有测试辐射剂量下具有增加的存活时间,杂合型(+/-)RIP1小鼠与纯合型(-/-)RIP1小鼠相比在所有测试辐射剂量下具有增加的存活时间。因此,在RIP1表达减少时观察到辐射敏感性增加。
表1
如果RIP1的缺失是所得辐射敏感性的主要决定因素,则该缺失的取代应逆转辐射抵抗力。因此,应用用于向敲除型动物的组织提供重组人RLIP76的脂质体输送系统。在大肠杆菌中表达重组人RLIP76并通过氨基酸组成分析纯化表达的蛋白质至高纯度>96%以及在人造脂质体中重建其运输功能的方法与本领域所述的方法(Awasthi,et al.,Biochemistry 39:9327-9334,2000;在此引入做为参考)相同。制备足量的脂质体,并将其通过腹膜内(i.p.)注射给予纯合型RIP1小鼠。
较高辐射暴露下可见该效果(图5)。四只野生型RIP1小鼠暴露于750cGy,并通过i.p.注射给予对照脂质体进行治疗(图5,菱形),或通过i.p.注射给予400μg RLIP76脂质体进行治疗(图5,方形),该治疗在暴露后12小时给予;以及四只RIP-/-小鼠暴露于750cGy,并通过i.p.注射给予对照脂质体进行治疗(图5,三角形),或通过i.p.注射给予400μg RLIP76脂质体进行治疗(图5,圆形),该治疗在暴露后12小时给予。显然,RLIP76脂质体的给予增加了RIP1/小鼠的存活率,但其也显著增加野生型RIP1小鼠的存活率。显然,补充RLIP76的RIP1-/-小鼠与甚至RIP1+/+小鼠相比具有显著提高的存活率。这些发现最终结论性地证明RLIP76的辐射保护作用。
实施例3
剂量反应研究
为考察RLIP76在辐射暴露后24小时以上之后输送时能否有效,进行一系列研究以探讨RLIP76在以不同的剂量、暴露水平和暴露后时间给予时的保护益处。所有小鼠均是C57BL6/白化种——用于辐射影响模型的最常见种。在德克萨斯癌症中心(Texas Cancer Center)(阿林顿,德克萨斯)用Varian Clinac线性加速器(2100C)通过全身X-辐射输送暴露。在400cGy/分钟的速率下应用6-MeV光子束。将小鼠隔离至其笼子的一侧、1.5cm的superflab bolus顶部,并将治疗区集中于其上。通过将加速器机架旋转180度将总剂量分为两部分,前部分和后部分。除非另外指明,所有实验均是对每组六只小鼠进行。显然,有效的蛋白质输送通过口服给予RLIP76脂蛋白体实现;因此,所有实验均以该给药途径进行。
在一定辐射暴露范围内考察剂量和时间依赖性。首先,六组野生型小鼠暴露于500cGy辐射,然后不以RLIP76脂蛋白体进行治疗(对照)或以不同剂量的RLIP76脂蛋白体进行治疗,该治疗在辐射暴露后的不同时间给予。图6显示与未给予RLIP76对照小鼠(菱形)相比如下的给药剂量反应:25μg RLIP76脂蛋白体,在辐射暴露后14和48小时给予(方形);50μg RLIP76脂蛋白体,在辐射暴露后14和48小时给予(三角形);100μg RLIP76脂蛋白体,在辐射暴露后14和48小时给予(X);100μg RLIP76脂蛋白体,在辐射暴露后24和72小时给予(*);或100μg RLIP76脂蛋白体,在辐射暴露后48和96小时给予(圆形)。显然,如果提供另外的RLIP76蛋白,甚至在正常补足RLIP76蛋白的小鼠中,也赋予大幅增加的辐射抵抗力。事实上,暴露于通常导致到第30天全部致死的辐射剂量的野生型小鼠显示在通过口服给药给予2剂量的100毫克RLIP76蛋白时存活率200%增加(图6)。令人惊讶地,测量未治疗小鼠和RLIP76脂蛋白体治疗的小鼠的50%存活率相对于辐射剂量的剂量减少系数图(图7)显示在辐射暴露后在给予最初剂量前甚至等待整24小时仍导致1.7-1.8的明显剂量减少系数(“DRF”)。在辐射暴露后24小时以上之后给予RLIP76并仍得到治疗受益的能力是显著的。
将三组野生型小鼠暴露于500cGy辐射,然后一组不用RLIP76脂蛋白体进行治疗(对照;菱形),一组在辐射暴露后14和48小时给予25μg RLIP76脂蛋白体进行治疗(方形),一组在辐射暴露后0、48和96小时给予25μg RLIP76脂蛋白体进行治疗(三角形)。结果显示在图8中,并清楚地证明RLIP76脂蛋白体的辐射保护效果通过更早和更频繁给予脂蛋白体而得到提高。
RLIP76脂蛋白体的辐射保护效果在较高的辐射剂量下也得到证明。将两组野生型小鼠暴露于750cGy辐射,然后一组不用RLIP76脂蛋白体进行治疗(对照;菱形),一组在辐射暴露后0、48和96小时给予100μg RLIP76脂蛋白体进行治疗(方形)。此外,两组野生型小鼠暴露于1000cGy辐射,然后一组不用RLIP76脂蛋白体进行治疗(对照;三角形),一组在辐射暴露后16和64小时给予100μgRLIP76脂蛋白体进行治疗(X)。结果显示在图9中,表明RLIP76脂蛋白体在750cGy下提供良好的辐射保护,甚至在1000cGy下提供一些保护。总之,RLIP76,由于其显著的存活益处、口服输送的能力和在暴露后明显的时间延后,相对于现存的辐射保护候选方案具有大大的优势。
实施例4
RLIP76脂质体和抗氧化剂的辐射保护
未被保护的RLIP76蛋白易于蛋白质水解,致使暴露的蛋白质的给予遭遇挑战。在本研究中,RLIP76以脂质封装的脂蛋白体的形式被给予。为减少或防止在等候给予时氧化降解,RLIP76重构成脂质体的缓冲液包含抗氧化剂,例如,丁基羟基甲苯(BTH)。一种或多种其他抗氧化剂也可被加入包含RLIP76的液体封装脂蛋白体。众所周知,BHT已在科学文献中被报道其本身具有辐射保护效果。脂质体也已被用于输送候选辐射对策药物,但脂质体本身提供保护的能力在文献中并不明确。
假设基于脂质的RLIP76输送可提高药物制剂中蛋白质的稳定性,生成RLIP76蛋白、脂质体和抗氧化剂(如BHT)的复合物,并命名为TO-80Cx(80指脂质体的平均尺寸为80nm,该平均尺寸将其归类为中间尺寸的小泡)。更多命名包括TO-80LA,其指在缓冲液中与抗氧化剂(BHT)重构的脂质体;和TO-80L,其指缓冲液中无抗氧化剂或RLIP76蛋白的脂质体。接着,RLIP76脂蛋白体与抗氧化剂如BHT的复合物被检测,以确定在单独或组合的脂质体和BHT的过度作用下其能否赋予对辐射毒性的防御和/或治疗效果。
在暴露于来自钴60源、剂量速率0.60Gy/min的9.25Gyγ辐射后测定称重平均30.0g的14周龄CD2F1雄性小鼠的总体存活率。小鼠被分为16只小鼠/组的小组,并采用多种时间方案通过腹膜内给予TO-80Cx 50μg(RLIP76蛋白的重量)/小鼠或相同体积/浓度的各个药物组分接受多个剂量,并与对照进行比较。研究30天的小鼠存活率。
如图10所示,在暴露前24小时给予完整的TO-80Cx复合物实现最大获益。该实验中如果延迟给药直到大约暴露时间,则显示存活率的获益较低,尽管其他实验已发现即使延迟给药若干小时的较好效果。该数据也显示在图11中。在实验中,仅包含BHT的缓冲液产生微小的效果(缓冲液+BHT),而脂质体和BHT组合产生较好的效果(TO-80LA)。在该实验中,TO-80LA具有类似于暴露前后给予的TO-80Cx的作用。但在之前的一组实验中,在较低的总辐射暴露剂量下TO80LA明显劣于完整的TO-80Cx,如图13所示。值得注意的是,如图12所示,不具有RLIP76的不同输送载体的比较显示,TO 80LA与仅包含BHT的缓冲液相比具有一些保护效果,这表明脂质体本身可具有一些辐射保护作用。
因此,TO-80Cx的各活性组分具有一些辐射保护剂的作用。但是,最大效果显示于完整的复合物。脂质体或脂质体与BHT在量方面的具体贡献仍然可变,并可取决于辐射暴露水平。
实施例5
RLIP76作为空间辐射对策(Space Radiation Countermeasure)
由于空间探索的性质已被从临时任务转变为长期项目(如国际空间站(theInternational Space Station)),这些探索的风险也已被从纯机械问题转变为关于空间本身的固有危险的顾虑。其中主要的是关于延长的辐射暴露的顾虑。空间中充满辐射,包括电磁辐射(X射线和γ射线)和宇宙射线(质子和重离子),其通常在地球表面被阻止或削弱。粒子辐射当它们与物质相互作用时也产生二次辐射,如中子和γ射线。该事实与保护航天器及其中物品的问题有关;不仅保护重物(shielding heavy),其可产生更危险的辐射。
地球上的普通人一年经受低于5×10-3Gy。在外太空,太阳耀斑可产生高达3Gy的暴露水平,但对于大部分暴露来说还是低得多。但是,电离辐射不同于x射线、γ射线和高能电子(包括β粒子),每单位吸收能量比这些辐射引发更大的生物损伤,因此测量由被称为相对生物效应(RBE)的因子校正。RBE的概念在空间辐射健康中非常重要,特别是因为在人类在地球大气层外整个过程中损伤随持续的暴露而积累。由于这些辐射而对于太空旅行者存在的风险包括慢质子和宇宙射线暴露引起的癌症、高量太阳质子风暴引起的免疫失败和单轨道的宇宙射线重核在神经元组织中引起的可能的神经系统影响。这些影响包括认知功能障碍和视网膜闪烁(已在一个阿波罗宇航员中描述)。
RLIP76有效性的证据得到实验数据的支持,如上详细描述。RLIP76蛋白遗传缺陷的小鼠对广范围的辐射暴露水平十分敏感,该敏感性可利用通过静脉内或口服给药补充RLIP76蛋白逆转。显然,如果提供另外的RLIP76蛋白,甚至在正常补足RLIP76蛋白的小鼠中,也赋予对辐射大幅增加的抵抗力。事实上,暴露于通常导致到第30天全部致死的辐射剂量的野生型小鼠显示在通过口服给药给予2剂量的100毫克RLIP76蛋白时存活率200%增加。如预期,RLIP76越早被给予,则效果越显著,但即使在给予最初剂量前、辐射暴露后等待整24小时或更久仍产生显著挽救作用。
然而也许最明显地,是如下发现:即便是通过口服给药,脂蛋白体封装的RLIP76也穿过血脑屏障。因此,RLIP76的保护效果将延伸至中枢神经系统组织,如海马,其位于重离子轰击的大鼠中观察到的神经系统损伤中多数的位点。因此,作用机制、给药容易性和解剖输送的组合使RLIP76成为空间辐射对策值得关注的候选物。
根据本公开,在不存在不当的实验的情况下,在此公开和要求保护的所有组合物和/或方法均可被制备或实施。虽然本发明的组合物和方法已按照优选实施方式被描述,但对于本领域技术人员明显的是,改变可被施加于在此所述的组合物和/或方法和该方法的步骤或步骤顺序,而没有背离本发明的构思、宗旨和范围。更具体地,将显而易见的是,化学和生理学上相关的某些试剂可替代在此所述的试剂,同时将实现相同或相似的结果。所有这种对于本领域技术人员显而易见的类似的取代或改变被认为在所附权利要求限定的本发明的宗旨、范围和构思内。
Claims (34)
1.治疗在需要这种治疗的对象中的辐射暴露效应的方法,包括在辐射暴露后24小时以上之后向生物体给予有效量的RLIP76蛋白或其活性片段。
2.权利要求1所述的方法,其中所述对象是哺乳动物对象。
3.权利要求1所述的方法,其中所述辐射是电离辐射。
4.权利要求3所述的方法,其中所述电离辐射选自X-辐射、γ-辐射、高能电子辐射、紫外辐射、热辐射、宇宙辐射、电磁辐射、核辐射或其组合。
5.权利要求1所述的方法,其中所述RLIP76蛋白或其活性片段在辐射暴露后36小时以上之后被给予所述对象。
6.权利要求1所述的方法,其中所述RLIP76蛋白或其活性片段在辐射暴露后48小时、60小时、72小时、84小时或96小时以上之后被给予所述对象。
7.权利要求1所述的方法,其中所述RLIP76蛋白或其活性片段被以脂质体或脂蛋白体给予。
8.权利要求1所述的方法,其中所述RLIP76蛋白或其活性片段被以一个或多个剂量给予所述对象。
9.权利要求4所述的方法,其中所述高能电子辐射是β-粒子辐射。
10.权利要求1所述的方法,其中所述辐射是质子或重离子辐射。
11.权利要求1所述的方法,进一步包括向所述对象给予第二辐射保护剂。
12.权利要求11所述的方法,其中第二辐射保护剂是自由基清除剂、抗氧化剂或超氧化物歧化酶类似物。
13.治疗在需要这种治疗的对象中的辐射暴露效应的方法,包括(a)在辐射暴露后24小时内向所述对象给予至少第一剂量的有效量的RLIP76蛋白或其活性片段,和(b)在辐射暴露后24小时之上以后向所述对象给予至少第二剂量的有效量的RLIP76蛋白或其有效部分。
14.权利要求1或13所述的方法,其中所述对象是人。
15.权利要求13所述的方法,其中所述辐射是电离辐射。
16.权利要求15所述的方法,其中所述电离辐射选自X-辐射、γ-辐射、高能电子辐射、紫外辐射、热辐射、宇宙辐射、电磁辐射、核辐射或其组合。
17.权利要求13所述的方法,其中所述第一剂量被在大约暴露于电离辐射时给予。
18.权利要求13所述的方法,其中所述RLIP76蛋白或其有效部分被以脂质体或脂蛋白体给予。
19.权利要求13所述的方法,进一步包括在辐射暴露后24小时以内、在辐射暴露后24小时以上之后或在辐射暴露后24小时以内和24小时以上之后均向所述对象给予一个或多个额外剂量的有效量的所述RLIP76蛋白或其有效部分。
20.权利要求13所述的方法,其中所述第一剂量和所述第二剂量包含约等量的所述RLIP76蛋白或其活性片段。
21.权利要求13所述的方法,其中所述第一剂量和所述第二剂量包含不等量的所述RLIP76蛋白或其活性片段。
22.组合物,包含RLIP76蛋白或其活性片段和第二辐射保护剂。
23.权利要求22所述的组合物,其中第二辐射保护剂是自由基清除剂、抗氧化剂或超氧化物歧化酶类似物。
24.权利要求22所述的组合物,其中所述组合物以脂质体或脂蛋白体被给予。
25.权利要求23所述的组合物,其中所述抗氧化剂是丁基羟基甲苯(BTH)。
26.权利要求1或13所述的方法,其中所述RLIP76蛋白或其活性片段在辐射后24小时后被给予1次至10次。
27.权利要求1或13所述的方法,其中所述RLIP76蛋白或其活性片段在辐射后24小时后被给予至少3次。
28.权利要求1或13所述的方法,其中所述RLIP76蛋白或其活性片段在辐射后24小时内被给予一次并在辐射后24小时后被给予一次或多次。
29.权利要求1或13所述的方法,其中所述RLIP76蛋白或其活性片段在辐射后25小时与3个月之间被给予一次或多次。
30.权利要求1或13所述的方法,其中所述RLIP76蛋白或其活性片段以至少0.01μg/kg体重的剂量被给予。
31.权利要求1或13所述的方法,其中所述RLIP76蛋白或其活性片段以约0.01μg/kg体重与约100mg/kg体重之间的剂量被给予。
32.权利要求1或13所述的方法,其中所述RLIP76蛋白或其活性片段通过选自静脉内、肌内、皮下、腹膜内和口服给药的给药途径被给予。
33.权利要求1或13所述的方法,其中所述辐射暴露为至少2Gy。
34.权利要求1或13所述的方法,其中所述辐射暴露在约2Gy与约100Gy之间。
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