CN102573850A - Ddah i 激动剂的筛选方法和用ddah i 激动剂的疗法 - Google Patents

Abstract

本发明来源于以下发现：DDAH I水平降低与门静脉压升高关联，且通过增加体内DDAH I水平可降低门静脉压。因此，本发明提供降低门静脉血压的方法，包括向需要其的受治疗者施用DDAH I的激动剂。

Description

DDAH I 激动剂的筛选方法和用DDAH I 激动剂的疗法

发明领域

本发明来源于出人意料的发现：DDAH I水平降低与门静脉压升高关联，且通过增加体内DDAH I水平可降低门静脉压。本发明利用这一发现来鉴定和提供可用于降低门静脉压，例如用于治疗门静脉高压的DDAH I激动剂。

发明背景

NIH对1976-80年时间段的统计表示，肝硬化在美国造成的死亡多于26,000例。如果将这一数据外推至包括目前在西方和在不发达世界日益增加的病毒性肝病和酒精性肝病负担，这个数字将超过全世界每年数百万例。随着日益被认识到为具有进展风险的慢性肝病的非酒精性脂肪肝病的新实体(与糖尿病和代谢综合征关联)的识别，这一数字可能会继续增加。

肝硬化伴随有主要来自门静脉高压的严重发病率和死亡率。门静脉血管中血压增加可能是因为流经血管的血体积增加或/和对经过肝脏的血流的阻力增加。在西方国家中，门静脉高压的最常见原因是肝硬化中肝脏的广泛结疤导致对血流的阻力增加，肝硬化通常是由于长期过量的酒精摄取。

门静脉高压导致新静脉(称为侧副管)的发育，其绕过肝脏直接连接门静脉血管与体循环。由于这一旁路，通常被肝脏从血管去除的物质(诸如毒素)可进入体循环。侧副管尤其在食道下端部和胃的上部发育。在这里，血管可变得静脉曲张。这些充血的静脉曲张血管是脆弱的并容易出血，有时是严重的，偶尔有致命结果。

部分由于诸如β-阻滞剂的药剂的耐受性，降低门静脉压以减少静脉曲张出血风险的现有疗法局限于约40％效力。而且，有意见认为这种药剂减少肝脏灌注，可能进一步危害肝脏功能，因为尽管有系统性血管舒张，肝硬化中肝部血流已经是低的。

发明概述

本发明涉及降低门静脉血压的方法。根据本发明，这通过施用DDAHI的激动剂来实现，所述DDAH I的激动剂即能够增加或保持DDAH I的活性或量，尤其是待治疗的受治疗者肝脏中存在的DDAH I的活性或量的药剂。

因此，本发明提供降低门静脉血压的方法，包括向需要其的受治疗者施用DDAH I的激动剂，其中所述激动剂优选不减少受治疗者的血浆TNFα水平。

该激动剂可导致(a)受治疗者肝脏中DDAH I的表达增加；和/或(b)受治疗者肝脏中DDAH I的水平增加。例如，该激动剂可促进受治疗者细胞中DDAH I的转录，或该激动剂可以是能够在受治疗者肝脏中表达DDAHI的载体。

该激动剂可增加个体肝脏中DDAH I的活性。因此，激动剂可导致个体肝脏中(a)非对称性二甲基精氨酸(ADMA)水平减少；和/或(b)一氧化氮合酶(NOS)水平增加。

待治疗的受治疗者可以是需要降低的门静脉压的任何受治疗者，诸如患有门静脉高压的受治疗者。受治疗者可患有肝硬化。

本发明还提供可用于鉴定在这些治疗方法使用的适合的DDAH I激动剂的筛选方法。因此，本发明提供鉴定适用于治疗门静脉高压的药剂的方法，所述方法包括确定受试药剂是否能够增加或保持DDAH I的量或活性，其中增加或保持DDAH I的量或活性的能力指示该化合物可适用于治疗门静脉高压。

筛选方法可包括以下步骤：将包含DDAH I的细胞或组织与受试药剂接触并确定受试药剂的存在是否导致细胞或组织中DDAH I的量或活性的增加。

DDAH I的量或活性可在肝脏或来源于肝脏的组织或细胞中评价。例如，筛选方法可在胆管结扎的大鼠中进行，该方法可包括以下步骤：向胆管结扎的大鼠施用受试药剂并确定受试药剂的存在是否导致所述大鼠肝脏中DDAH I的量或活性的增加。

本发明的筛选方法还可包括确定受试药剂是否能够抑制TNFα，其中增加DDAH I的量或活性的能力联合不存在对TNFα的抑制作用指示该化合物可适用于治疗门静脉高压。

附图简述

图1报告每分钟每毫克蛋白的14C-瓜氨酸计数。这是eNOS活性的量度。在胆管结扎的(BDL)或模拟处理(sham treated)的大鼠中进行实验。用英夫利昔单抗(BDL+英夫利昔单抗)或运载体(vehicle)(BDL)治疗胆管结扎的大鼠。本图显示，胆管结扎明显减少eNOS活性，但随后以英夫利昔单抗治疗恢复eNOS活性到与在模拟动物中观察到的相似水平。

图2报告在模拟大鼠或BDL大鼠肝脏组织中的ADMA水平。以英夫利昔单抗(BDL+INF)或运载体(BDL)治疗BDL大鼠。胆管结扎导致与模拟动物相比组织ADMA浓度显著升高。然而，以英夫利昔单抗治疗显著减少ADMA水平。有趣的是，与模拟动物相比，BDL动物肝脏组织中ADMA的相对浓度/积累比血浆ADMA浓度差异大得多。

图3说明BDL大鼠肝脏中DDAH-1同种型的明显减少的表达。用英夫利昔单抗治疗后，DDAH-1表达水平恢复到模拟动物水平。

图4报告在模拟大鼠或BDL大鼠中的门静脉压。BDL肝硬化大鼠中的门静脉压比正常模拟动物门静脉压明显升高(14±0.7vs.5.5±0.3mmHg)。以英夫利昔单抗介入后，门静脉压被减少多于30％(9.5±0.6mmHg)。

图5和图6报告肝脏eNOS活性(图5)和肝脏eNOS蛋白表达(图6)。发现尽管eNOS蛋白表达增加(**-p＜0.01)，BDL动物中的eNOS活性与模拟相比显著减少(*-p＜0.05)。以INT-747治疗后，eNOS活性恢复到模拟动物水平(*-p＜0.05)，eNOS蛋白表达也类似地正常化(*-p＜0.05)。

图7和图8报告肝脏ADMA蛋白表达(图7)和肝脏DDAH1蛋白表达(图8)。发现BDL动物中ADMA表达显著增加(**-p＜0.01)，伴随着DDAH-1蛋白表达显著减少(**-p＜0.01)。施用INT-747后，与仅BDL相比，DDAH-1表达显著增加(**-p＜0.01)和ADMA显著减少(*-p＜0.05)。

图9报告在模拟大鼠或BDL大鼠中的门静脉压。BDL大鼠中的门静脉压与模拟相比显著增加(***-p＜0.0001)。在INT-747治疗后，与BDL+运载体相比门静脉压降低30％(**-p＜0.01)。

图10报告DDAH I cDNA的重构对模拟大鼠或BDL大鼠中门静脉压的作用。

发明详述

二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)是见于所有哺乳动物细胞的酶。存在两种同种型DDAH I和DDAH II，两种同种型的组织分布有一些差异。DDAH降解甲基精氨酸，具体为非对称性二甲基精氨酸(ADMA)和NG-单甲基-L-精氨酸(MMA)。甲基精氨酸ADMA和MMA抑制一氧化氮合酶产生。因此，DDAH在去除由蛋白降解产生并抑制一氧化氮产生的甲基精氨酸的积累方面是重要的。

DDAH II此前已被与内皮NO合酶表达程度以及与血管发生相关联。因此，DDAH同种型DDAH II是此前研究的目标。发明人现在出人意料地发现，在肝硬化的建立模型中(诸如胆管结扎的大鼠-BDL，与模拟大鼠相比)DDAH I同种型的表达显著减少。发现在加上炎症/感染(通过内毒素攻击)的情况中DDAH I同种型的表达进一步减少。而且，发明人发现，通过增加DDAH I活性或通过增加其表达激动DDAH I，导致eNOS活性增加、甲基精氨酸(诸如ADMA)水平减少和门静脉压显著降低。

因此，本发明在于增强DDAH I表达和/或活性，以降低肝脏ADMA，增加肝脏NO产生和降低门静脉压。这在临床情形尤其是肝硬化中有治疗门静脉高压升高的效用，其中门静脉高压升高与静脉曲张出血增加直接关联。

DDAH I激动剂

本发明涉及DDAH I的激动。DDAH I的激动剂可以是增加DDAH I活性、功能或量的任何化合物或分子。优选地，激动剂在患者肝脏中具有其功能。优选地，激动剂导致施用激动剂的个体肝脏中DDAH I活性、功能或量的增加。激动剂可优先在肝脏中作用，或可在包括肝脏的多个位置作用。如以下进一步讨论，激动剂可在施用期间被靶向于肝脏。

优选激动剂是与不存在激动剂时观察到的量相比增加DDAH I的活性或量至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的那些。例如，这些大小的增加可在已施用激动剂的受治疗者的肝脏或肝脏组织观察到。

激动剂可特异性地作用以激动DDAH I。即，激动剂对DDAH I的作用可大于激动剂的任何其他生物作用。这样的激动剂可以是对DDAH I的激活特异性的，即其可增加或保持DDAH I但不是其他酶的活性。这样的激动剂可以是对DDAH I的表达特异性的，即其可增加或保持DDAH I但不是其他蛋白的表达。根据本发明使用的激动剂可以是如本文所述的DDAH I的激动剂，其不作为TNFα拮抗剂起作用。根据本发明使用的激动剂可优先于DDAH II对DDAH I起作用。例如，根据本发明使用的DDAHI的激动剂可具有如本文所述的DDAH I激动剂的一个或多个特征，但对于DDAH II可能不具有所述特征，或可能对于DDAH II具有的所述特征与DDAH I相比水平较低。例如，增加DDAH I活性的激动剂可能不增加DDAH II活性，或可能与其对DDAH I的作用相比增加DDAH II活性的程度较小，诸如较低的百分比增加。增加DDAH I的表达或量的激动剂可能不增加DDAH II的表达或量，或可能与其对DDAH I的作用相比增加DDAH II表达的程度较小，诸如较低的百分比增加。

能够刺激DDAH I活性或功能的任何药剂可适用于本发明的方法。DDAH I的主要功能是酶促降解甲基精氨酸诸如非对称性二甲基精氨酸(ADMA)。因此，本发明的激动剂可作用以增加甲基精氨酸被DDAH I的降解，诸如ADMA的降解。本发明的激动剂可作用以增加DDAH I的活性、功能或量，从而导致优选肝脏中的甲基精氨酸诸如ADMA的水平减少。因此，可根据导致肝脏中ADMA水平减少的能力鉴定激动剂活性。

甲基精氨酸诸如ADMA抑制一氧化氮合酶(NOS)产生。因此，本发明的激动剂可作用以增加DDAH I的活性、功能或量，从而增加NOS的水平，优选在肝脏中的NOS的水平。因此，可根据增加肝脏中NOS水平的能力鉴定激动剂活性。

根据本发明使用的激动剂可以是直接或间接DDAH I激动剂。

直接激动剂是其活性直接针对DDAH I的药剂。例如，直接激动剂可以是直接作用于DDAH I酶以增加或保持其活性的药剂。直接激动剂可以是阻止DDAH I降解或增加其体内半衰期的药剂。直接激动剂可以是稳定DDAH I酶的药剂。直接激动剂可通过向患者提供另外的DDAH I来增加DDAH I的量。直接激动剂可以是作用于DDAH I基因、启动子或其他基因调节区以增加或保持DDAH I表达的药剂。直接激动剂可通过刺激或保持从内源DDAH I基因的表达来增加或保持DDAH I表达。直接激动剂可通过向相关细胞提供另外的DDAH I基因从而可实现从这种另外多核苷酸表达，来增加或保持DDAH I表达。

例如，类法尼醇(Farnesoid)受体激动剂INT-747是胆汁酸响应性核受体，促进包括DDAH I的多种靶基因表达。如实施例中所示，发明人已经显示，INT-747作用以增加肝脏中DDAH I表达。DDAH I水平的这一增加导致肝脏组织中ADMA水平的相伴减少，NOS活性增加，和最终门静脉压降低。因此，根据本发明使用的DDAH I的激动剂可以是促进DDAHI表达的药剂，诸如类法尼醇受体激动剂，诸如类法尼醇受体激动剂INT-747。

间接药剂是其活性导致DDAH I激动，但不直接作用于DDAH I的药剂。例如，间接激动剂包括可能作为下游作用刺激DDAH I的药剂诸如抗炎剂或抗TNFα剂。因此，DDAH I的激动剂可以是具有导致DDAH I的活性、功能或量增加的作用的药剂。

例如，发明人已发现，抗TNFα抗体英夫利昔单抗能够增加胆管结扎的大鼠的肝脏中的DDAH I水平。如实施例中所示，DDAH I水平的这一增加导致肝脏组织中ADMA水平的相伴减少，NOS活性增加，和最终门静脉压降低。

因此，本文所述的任何激动剂可用于激动DDAH I，即增加DDAH I的存在量、和/或DDAH I的活性或功能。优选地，这些激动作用发生在肝脏。

能够激动DDAH I的一些药剂可能不适于作为本文所述治疗的一部分而体内施用。能够激动DDAH I的一些药剂尤其是一些间接激动剂，可能对患者具有其他有害作用。医师将能够为个体患者权衡这些有害副作用是否超出本文所述的DDAH I激动作用的可能益处，以便为本文所述的用途选择适当的DDAH I激动剂。

例如，Naveau等(Hepatology(2004)39：1390-1397)报道，向急性酒精性肝炎患者系统施用英夫利昔单抗联合泼尼松龙导致高水平严重感染，其被认为是不可接受的。因此，根据本发明使用的激动剂可以是如本文所述激动DDAH I，但不具有免疫调节作用的药剂。例如，该激动剂可以是如本文所述激动DDAH I，但不减少促炎性细胞因子水平和/或不具有抗TNFα作用的药剂。该激动剂可以对体内促炎性细胞因子水平无影响和/或可以对体内血浆TNFα水平无影响。例如，该激动剂可以是如本文所述激动DDAH I，并非抗TNFα抗体诸如英夫利昔单抗的药剂。

DDAH I的激动剂可以是增加内源DDAH I产生的药剂。例如，该药剂可在受治疗者细胞中作用以增强或刺激DDAH I的表达。这样的药剂可以是作用于DDAH I基因以促进基因表达的转录因子或增强子。例如，这样的药剂可以是核受体，诸如类法尼醇受体激动剂INT-747。

DDAH I的激动剂可以是为个体的细胞提供产生另外的DDAH I的能力的药剂。例如，该药剂可以是能够表达DDAH I的载体，诸如包含DDAHI基因和表达该基因必需的其他序列的表达载体。因此，可通过向细胞递送这样的载体并允许发生从载体转录来提供DDAH I。该药剂可以是能够表达DDAH I的多核苷酸，诸如包含DDAH I基因和将DDAH I基因整合入宿主基因组并允许从该插入的DDAH I基因序列表达所必需的其他序列的载体。用于基因递送的方法是本领域中已知的。参见例如，美国专利号5,399,346、5,580,859和5,589,466。多核苷酸可在适当的启动子控制下表达。例如，DDAH I多核苷酸的表达可通过利用肝脏特异性启动子被靶向于肝脏。因此，激动剂可以是包含DDAH I基因和肝脏特异性启动子的多核苷酸或载体。例如，如实施例4所述，可使用肝脏特异性LP1启动子。如实施例4所述，肝脏局限性转基因产生可利用包含人类apoE/CI肝脏控制区(HCR)和α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)基因启动子的区段的截短的肝脏特异性启动子LP1实现，如Osman等.Atherosclerosis 2009，204：121-6所述。

核酸分子可被直接引入接受的受治疗者，或可被活体外引入已从受治疗者取出的细胞中。在后一种情形，包含DDAH I载体的细胞可被再引入受治疗者的适当部位，诸如引入受治疗者的肝脏。用于这种基因递送的不同方法是本领域已知的，本领域读者将会领会。例如，DDAH I基因可被作为裸核酸构建体递送，优选还包括宿主细胞基因组同源的侧翼序列。DDAH I基因可在载体诸如质粒载体或病毒载体中递送。适当的重组病毒载体包括但不限于腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体。例如，已报道利用腺病毒载体转导肝病的啮齿动物模型中的肝细胞和其他细胞类型(Yu等.Am J Phys 2002，282：G565-G572，Garcia-Banuelos等.Gene Therapy2002，9：127-134)。这样的腺病毒载体可根据本发明使用。类似地，还已报道以带有AAV8衣壳的AAV2基因组(AAV2/8)转导肝脏(Osman等。Atherosclerosis 2009，204：121-6)。这样的AAV2/8载体也可根据本发明使用。DDAH I基因可在脂质体制品诸如阳离子脂质体制品中施用。

筛选方法

本发明还提供鉴定适用于治疗门静脉高压的药剂的方法。例如，本发明提供鉴定适用于降低门静脉压的DDAH I激动剂的方法。这一方法鉴定的激动剂可以是具有上述任何特征或作用的DDAH I激动剂。

因此，本发明提供鉴定用于治疗门静脉高压的药剂的方法，该方法包括确定受试药剂是否能够增加或保持DDAH I的活性或表达。例如，所述方法可包括确定受试药剂是否能够增加或保持DDAH I的量或活性，其中增加DDAH I的量或活性的能力或保持DDAH I的量或活性的能力指示该化合物可适用于治疗门静脉高压。

用在本发明筛选方法中的受试药剂是指可能潜在地激动DDAH I的任何化合物、分子或药剂。受试药剂可以是，或可包括，例如经由合理药物设计从已知DDAH I激动剂出发而设计的肽、多肽、蛋白、多核苷酸、小分子或其他化合物。

受试药剂可以是具有如上述DDAH I激动剂的一种或多种特征的任何药剂。例如，受试药剂可以是能够增加肝脏中NOS水平的药剂。

待筛选的受试药剂可从化学组合物或人造化合物衍生或合成。候选药剂可从包括合成化合物或天然化合物文库的多种来源获得。可在以上检验中测试的适当的受试药剂包括从组合文库、小分子文库和天然产物文库，诸如展示(如，噬菌体展示)文库衍生的化合物。可利用本发明方法筛选多种受试药剂以鉴定对DDAH I具有适当作用，诸如刺激DDAH I活性或表达的一种或多种药剂。

本发明的筛选方法可体内、活体外或体外进行。具体地，将受试药剂与DDAH I或与包含DDAH I的细胞或组织接触的步骤可体内、活体外或体外进行。本发明的筛选方法可在基于细胞的系统或无细胞系统中进行。例如，本发明的筛选方法可包括以下步骤：将包含DDAH I的细胞或组织与受试药剂接触并确定受试药剂的存在是否导致细胞或组织中DDAH I量或活性的增加。

例如，受试药剂增加或保持DDAH I活性或表达的能力可在表达DDAH I的宿主细胞或组织中测试。例如，DDAH I的量或活性可在肝脏或来源于肝脏的组织或细胞中体外、体内或活体外评价。

在这样的基于细胞的检验中，DDAH I和/或受试药剂可以是宿主细胞或组织内源的，可被引入宿主细胞或组织，可通过促使或允许表达构建体或载体的表达而被引入宿主细胞或组织，或可通过刺激或激活从细胞中的内源基因表达而被引入宿主细胞或组织。

在这样的基于细胞的方法中，存在或不存在受试药剂时DDAH I的活性可通过评价细胞或组织中DDAH I水解甲基精氨酸诸如ADMA的能力来确定。例如，可对细胞或组织提供ADMA或细胞或组织可包含ADMA。在这样的基于细胞的方法中，可在存在或不存在受试药剂时评价DDAH I的量以确定该药剂是否改变细胞或组织中DDAH I的量，诸如通过调节细胞或组织中的DDAH I表达或通过稳定细胞或组织中的DDAH I蛋白。在任一种情形中，在受试药剂存在时细胞或组织中存在更高DDAH I活性或DDAH I量增加，指示该受试药剂可以是用于根据本发明降低门静脉压的适当的DDAH I激动剂。

在一个实施方案中，这样的基于细胞的检验可对来源于待治疗的患者的细胞或组织体外或活体外进行。因此可确定受试药剂是否能够增加或保持该受治疗者的细胞或组织中DDAH I的活性或量。例如，这样的方法可对来自患者肝脏的细胞或组织样品进行。

本发明的方法可使用无细胞检验。例如，DDAH I可在无细胞环境中存在。适当的无细胞检验可在细胞提取物中进行。例如，本发明方法的接触步骤可在可表达、产生或以其他方式包含DDAH I和/或甲基精氨酸诸如ADMA和/或受试药剂的细胞获得的提取物中进行。包含DDAH I的无细胞系统可与本发明方法的其他组分诸如受试药剂和/或甲基精氨酸诸如ADMA一起孵育。另外，无细胞系统可在使得DDAH I能够作用以水解甲基精氨酸诸如ADMA的条件下在受试药剂不存在时孵育。在这样的无细胞方法中，存在或不存在受试药剂时DDAH I的活性可通过评价DDAH I水解甲基精氨酸诸如ADMA的能力来确定。在这样的无细胞方法中，可在存在或不存在受试药剂时评价DDAH I的量以确定该药剂是否改变细胞或组织中DDAH I的量，诸如通过稳定DDAH I蛋白。在任一种情形中，在受试药剂存在时存在更高DDAH I活性或DDAH I量增加，指示该受试药剂可以是用于根据本发明降低门静脉压的适当的DDAH I激动剂。

本发明方法的接触步骤可包括孵育各组分。这样的孵育可在任何适当的温度进行，通常4℃至40℃。可为了最优活性选择孵育时间段，但也可被优化以便于快速高通量筛选。在接触步骤和任选的孵育步骤后，本发明方法可进一步包括洗涤步骤以去除未结合的组分，其中通常在需要去除检测中产生背景信号的标记诸如放射性或荧光标记的非特异性结合的组分时采用这样的洗涤步骤。

细胞系统或无细胞检验系统中的孵育可在微量滴定板(如，96孔板或其他微孔板)中进行。另外，孵育可以自动方式进行(如，对于高通量筛选)。

本发明的筛选方法可体内进行。例如，筛选方法可在动物模型中进行。在这样的体内模型中，受试药剂的作用可在肝脏中评价。优选地，动物是非人类动物诸如大鼠。例如，如实施例中所述，筛选方法可在胆管-结扎的大鼠模型中进行。如实施例所示，大鼠的胆管结扎导致大鼠肝脏中DDAHI水平减少。因此，这样的模型可适于鉴定能够增加DDAH I水平的药剂。因此，本发明的筛选方法可包括以下步骤：向胆管结扎的大鼠施用受试药剂并确定受试药剂的存在是否导致大鼠肝脏中DDAH I的量或活性的增加。

这样的模型可用于评价受试药剂的体内作用。例如，这样的模型可用于评价受试药剂是否能够体内增加或保持DDAH I的活性或量。在这样的方法中，可评价DDAH I的量，可评价酶活性，可评价甲基精氨酸(如，ADMA)的水平或可评价NOS的量。体内模型也可用于确定受试药剂是否具有任何有害副作用。例如，本发明的方法可比较受试药剂对DDAH I的作用与其对其他酶的作用以确定受试药剂是否是特异性的。

如本文所述，在一些实施方案中用于降低门静脉压的药剂对促炎性细胞因子或TNFα的水平无影响可能是优选的。本发明的筛选方法可包括在用受试药剂治疗后测量动物中TNFα或促炎性细胞因子的水平以确定该药剂是否调节动物中细胞因子或TNFα的量的步骤。本发明的筛选方法可包括确定受试药剂是否能够抑制TNFα的步骤，其中增加DDAH I的量或活性的能力联合不存在对TNFα的抑制作用指示该化合物可适用于治疗门静脉高压。

在这样的体内方法中，存在或不存在受试药剂时DDAH I的活性可通过评价DDAH I水解甲基精氨酸诸如ADMA的能力或通过评价其下游结果诸如NOS水平来确定。在这样的体内方法中，可在存在或不存在受试药剂时评价DDAH I的量以确定药剂是否改变细胞或组织中DDAH I的量，诸如通过稳定DDAH I蛋白改变细胞或组织中DDAH I的量。在任一种情形中，在受试药剂存在时存在更高DDAH I活性或DDAH I量增加，指示该受试药剂可以是用于根据本发明降低门静脉压的适当的DDAH I激动剂。

为DDAH I激动剂的受试药剂可导致在存在受试药剂时比不存在受试药剂时DDAH I活性或水平增加至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少60％、至少75％、至少100％或更多。这样的增加可在被测试的样品中观察到，或例如当该方法在动物模型中进行时，尤其是来自动物的组织诸如肝脏中观察到。

DDAH I的水平或量可通过评价DDAH I基因的表达来测量。基因表达可通过观察mRNA产生或水平或观察蛋白产生或水平来评价。表达产物诸如mRNA和蛋白可通过本领域已知方法鉴定或定量。这样的方法可利用杂交来特异性地鉴定目标mRNA。例如这样的方法可包括PCR或实时PCR方法。鉴定或定量目标蛋白的方法可包括使用结合该蛋白的抗体。例如，这样的方法可包括蛋白印迹法。DDAH I基因表达的调节可在存在和不存在受试药剂时比较。如此，可鉴定以比不存在受试药剂时观察到的水平更高的水平增加DDAH I基因表达或保持DDAH I表达的受试药剂。这样的受试药剂可以是根据本发明的适当的DDAH I激动剂。

DDAH I的活性可通过评价DDAH I酶活性产物的水平来测量。例如，DDAH I的活性可通过评价甲基精氨酸诸如ADMA或水平被DDAH I调节的下游产物诸如NOS的量来测量。例如，DDAH活性可如下评价：如Ogawa等(J.Biol Chem(1989)264：10205-10209)所述或如实施例所述通过确定L-瓜氨酸形成，或通过直接评价ADMA水平，如，通过HPLC或串联质谱。

药物制剂

如本文所述的适当的DDAH I激动剂通常为了施用与药学上可接受的载体或稀释剂一起配制。激动剂可以是如本文定义的任何激动剂，包括本发明筛选方法鉴定的任何激动剂。因此，可用制药领域常规的一种或多种标准药学上可接受的载体和/或赋形剂，将激动剂配制成药物。制剂的确切性质将依赖于包括期望施用途径的多种因素。通常可将激动剂配制成用于口服、静脉内、胃内、血管内或腹膜内施用。

药物载体或稀释剂例如可为等渗溶液例如生理盐水。固体口服形式可含有与活性化合物一起的：稀释剂例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙、和/或聚乙二醇；粘合剂例如淀粉、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；解聚剂例如淀粉、藻酸、藻酸盐或羟乙酸淀粉钠；泡腾混合物；染料；增甜剂；湿润剂，例如卵磷脂、聚山梨酯、硫酸月桂酯；以及药物制剂中通常使用的无毒和无药理学活性的物质。这类药物制剂可通过已知方式制备，例如通过混合、制粒、压片、糖包衣或膜包衣工艺制备。

口服施用的液体分散剂可以是糖浆剂、乳剂或悬浮剂。糖浆剂可含有作为载体的例如蔗糖，或者蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇。

悬浮剂和乳剂可含有作为载体的例如天然树胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。用于肌内注射的悬浮剂或溶液可含有与鸟氨酸和乙酸苯酯和丁酸苯酯中的至少一种一起的药学上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇例如丙二醇，以及若需要，还可含适量的利多卡因盐酸盐。

当待施用的激动剂是核酸分子时，例如当激动剂以表达载体形式时，核酸的摄取和/或表达的某些促进剂(“促进转染剂(transfection facilitatingagent)”)也可被包括在组合物中，例如，促进剂诸如布比卡因、心脏毒素和蔗糖，以及常规用于递送核酸分子的促进转染运载体诸如脂质体制品或脂质制品。

根据本发明的药物制剂可进一步包含一种或多种另外的治疗剂。例如，该制剂可包含一种或多种如本文定义的DDAH I激动剂。该制剂可包含一种或多种如本文所述的DDAH I激动剂还有一种或多种另外的治疗剂。优选地，一种或多种另外的治疗剂是协助治疗或预防待治疗的个体的药剂。例如，一种或多种有效治疗门静脉高压的药剂可作为本文所述的制剂的一部分而施用。一种或多种有效治疗患者潜在肝脏病况或其症状的药剂可作为本文所述的制剂的一部分而施用。

治疗

本发明提供用于降低例如患有门静脉高压的受治疗者的门静脉血压的方法。因此，本发明提供降低门静脉血压的方法，包括向需要其的受治疗者施用DDAH I激动剂。同样地，可提供用在降低门静脉血压的方法中的DDAH I激动剂。还提供DDAH I激动剂在制备用于降低门静脉血压的药物中的用途。在任何这些方法和用途中，DDAH I激动剂可以是并非TNFα拮抗剂的药剂，即，该药剂在被治疗的受治疗者中不减少TNFα水平和/或不减少TNFα活性。DDAH I激动剂对被治疗的受治疗者的TNFα水平和/或TNFα活性可不具有显著影响。

该激动剂可以是如本文所述的任何激动剂，包括由本发明筛选方法鉴定的任何激动剂。激动剂可以在如本文所述的制剂中提供。如此，向受治疗者施用如本文所述的DDAH I激动剂以降低受治疗者的门静脉压。如此，可施用如本文所述的DDAH I激动剂以改进受治疗者的病况，例如患有门静脉高压的受治疗者。可施用如本文所述的DDAH I激动剂以减轻受治疗者的症状，例如与门静脉高压相关的症状。可施用如本文所述的DDAH I激动剂以抗击或延迟门静脉高压或与其相关的任何症状诸如静脉曲张的发作。因此，本发明可阻止门静脉高压的医学结果。使用如本文所述的DDAH I激动剂可因此延长肝病患者的生命。

如本文所述，DDAH 1激动剂可导致受治疗者肝脏中DDAH I的表达增加和/或水平增加。例如，该激动剂可以是促进DDAH I在受治疗者细胞中转录的药剂或该药剂可以是能够在受治疗者肝脏中表达DDAH I的载体。例如，可通过基因治疗方法增加DDAH I表达，如本文所述的包含DDAH I基因的多核苷酸或载体藉以向个体施用。经由靶向施用诸如直接施用于肝脏，或诸如利用肝脏特异性启动子的靶向表达，多核苷酸或载体可靶向于肝脏。能够表达DDAH I的此类多核苷酸或载体的施用可用于将个体中DDAH I的病理生理学低水平重构。这可通过向个体单次或多次施用这样的多核苷酸或载体来实现。

如本文所述，DDAH I激动剂可导致个体肝脏中DDAH I活性增加。例如，激动剂可导致个体肝脏中非对称性二甲基精氨酸(ADMA)水平降低和/或一氧化氮合酶(NOS)水平增加。

受治疗者用如本文所述的DDAH I激动剂治疗。如上所述，DDAH I激动剂可单独施用或以药物制剂形式施用。制剂可包含一种或多种DDAHI激动剂并可包含一种或多种另外的治疗剂或预防剂。

两种或多种不同的如本文所述的DDAH I激动剂可联合使用以治疗受治疗者。两种或多种激动剂可一起、以单个制剂、同时、以两种或多种分别的制剂、或分别或顺序地作为联合施用方案的一部分而施用。

本发明的激动剂或制剂可通过任何适当的途径施用。优选地其通过口服、静脉内、胃内、腹膜内或血管内途径施用。激动剂或制剂可直接施用于受治疗者的肝脏。

激动剂以治疗有效量施用。本发明激动剂的适当剂量可根据多种参数确定，诸如待治疗的受治疗者的年龄、体重和状态；肝病的类型和严重度；施用途径；和所需方案。可为单独的激动剂确定适当的剂量。例如，对一些激动剂，典型剂量可以在从1mg/kg/天至30g/kg/天的数量级。医师能够对激动剂和为任何具体受治疗者确定所需剂量。

本发明广泛适用于治疗方法并与预防性治疗和/或治疗性治疗的开发相关。应理解的是，本文提及的所有治疗包括根治性治疗、姑息性治疗和预防性治疗。

预防或治疗包括但不限于引起DDAH I量、功能或活性的有效增加，以导致门静脉压降低，或阻止或减少门静脉压增加。例如，预防或治疗可导致患有门静脉压增加的受治疗者诸如患有门静脉高压的受治疗者的门静脉压降低。预防或治疗可导致门静脉压增加或预期门静脉压将增加的患者保持门静脉压的特定水平。预防或治疗可导致个体门静脉压的增加与在不存在这种治疗时将会观察到或将会预期的增加相比被减少或减慢。

预防或治疗对于本文所述的门静脉高压的任何症状或结果可具有类似作用。即，根据本发明的治疗可导致此类症状或结果的严重度的减少，维持此类症状或结果的现有水平，或减慢或减少此类症状或结果的恶化。

待治疗的患者

本发明涉及降低有相应需要的个体的门静脉压。因此，根据本发明待治疗的受治疗者可患有门静脉高压或可处于门静脉高压的增加风险中。例如，受治疗者可患有肝硬化。门静脉高压可定义为门静脉和其支流中血压增加。门静脉是将血液从肠带到肝脏的大静脉。当门静脉压梯度(插入肝静脉或门静脉的导管的测量值与肝静脉或下腔静脉中的无阻血压读数(free pressure reading)之间的压力差)为≥10mm Hg或更大时，门静脉高压可定义为临床显著。

用于诊断门静脉高压的方法是本领域公知的，尤其是本领域中的临床医师和兽医公知的。优选地，受治疗者已被例如医学或兽医专业人员诊断为患有门静脉高压。受治疗者可展示与门静脉高压相关的一种或多种症状。

例如，门静脉高压可导致腹水积累。这可导致患者的腹部肿胀。患者还可具有增大的脾脏。超声扫描可用于检查门静脉和附近血管中的血流并检测腹部的液体。

侧副管可以是腹壁上方或直肠周围的皮肤上可见的。食管和胃静脉曲张容易出血，且有时是大规模出血。超声或计算机断层摄影术(CT)扫描可用于寻找和检查侧副管。

由于大多数患有门静脉高压的人群还患有严重的肝脏功能障碍，所以他们可能具有肝衰竭的症状，诸如出血的倾向。

门静脉压可被直接测量。例如，可将导管通过切口插入颈部并穿过血管到肝脏或脾脏中以直接测量门静脉血管中的压力。

待治疗的个体可例如通过这些方法中的任何一种被诊断为患有门静脉高压。待治疗的个体可被诊断为处于门静脉高压风险中。例如，个体可被诊断为具有与门静脉高压相关的一种或多种症状。例如，门静脉高压通常见于肝硬化患者。待治疗的个体可患有肝硬化。门静脉高压还可以是晚期肝病导致的，所述晚期肝病包括酒精性肝炎、特发性非硬变性门静脉高压、先天性肝脏纤维变性、部分结节样转化(partial nodular transformation)、巴-希二氏综合征(Budd-Chiari syndrome)、门静脉血栓形成、右心衰竭或血吸虫病感染。待治疗的个体可患有这些病况中的任何一种或多种。

待治疗的受治疗者可以是易于增加门静脉压诸如门静脉高压的任何个体。受治疗者可以是男性或女性。女性对酒精的不良作用可能比男性更敏感。相对男性而言，女性可在更短的时间段内，由更少量的酒精产生酒精性慢性肝病。

待治疗的受治疗者可以是人类。待治疗的受治疗者可以是非人类动物。待治疗的受治疗者可以是家畜例如母牛或公牛、绵羊、猪、牛、山羊或马，或者可以是驯养动物例如狗或猫。受治疗者可以是或可以不是肝病动物模型。动物可以是任何年龄的，但通常应是成熟的成年受治疗者。

实施例

材料和方法

BDL大鼠

这些实验利用建立的肝硬化动物模型，即胆管结扎的(BDL)大鼠。BDL大鼠可通过本领域已知的方法产生。例如，雄性Sprague-Dawley大鼠(200-250g)可用于这一程序。在麻醉后，可进行中线剖腹术，暴露胆管，以4.0缝合丝线三重结扎，并在第二和第三结扎线之间切断。然后以可吸收的缝线按层封闭伤口，允许动物在安静房间中恢复，随后返回动物保管设施。

DDAH-活性检验

以下实验条件用于确定DDAH活性。在存在蛋白酶抑制剂下将肝脏组织样品(每300μL裂解缓冲液100mg冷冻组织)在Tris-HCl缓冲液中均化。将匀浆在预冷(4℃)离心机中以10,000rpm离心90分钟。对于DDAH活性检验，将50μL等份的所得上清液加入含1μL ¹⁴C L-NMMA(0.02mCi)和2μL 100mM未标记L-NMMA的50μL等份的PBS缓冲液中并在37℃孵育60分钟。孵育后，准备样品以确定[¹⁴C]瓜氨酸含量：与1ml 50％(w/v)Dowex(pH 7.0)涡旋混合，以10,000rpm离心5分钟；然后将500μL上清液与5ml液体闪烁液混合并在液体闪烁分析仪(Packard Biosciences，Berks，UK.)上评价闪烁计数。一单位酶活性定义为在37℃每分钟催化从ADMA形成1μM L-瓜氨酸的量。

分子分析：蛋白印迹法

将包含等量蛋白的提取物变性并在4-12％NuPAGE Bis-Tris凝胶上分离并印迹到PVDF膜(Invitrogen，UK)上。然后将膜利用不同的山羊抗DDAH 1&2(分别是1∶1000)和小鼠抗eNOS和iNOS(分别是1∶500&1∶10,000；Transduction Laboratories/Pharmingen，San Jose，CA)、兔抗TNF-α(1∶1000；abcam)、兔抗ADMA(1∶1000；immundiagnostik)和小鼠抗CTH(1∶1000；abnova)抗体孵育，并随后与各自的HRP-共轭的二抗孵育。利用强化的ECL检测试剂盒显现条带，并通过光密度测定法定量。上样准确度经由以针对小鼠和兔抗-α微管蛋白的抗体(分别是1∶1000；upstate and Cell Signaling Technology)再次杂交膜来评价。

ADMA、SDMA和精氨酸测量：

利用片段化特异性稳定同位素稀释电喷射串联质谱(fragmentationspecific stable isotope dilution electrospray tandem mass spectrometry)测量ADMA、SDMA和精氨酸。简言之，对含氘化ADMA、SDMA和精氨酸的去蛋白化(de-proteinized)的样品在替考拉宁保护柱10mm×2.1mm ID(Chirobiotic T，ASTEC Ltd，Congleton，UK)上进行层析(乙腈∶水1∶1，带有0.025％甲酸)，利用SCIEX API4000(Applied Biosystems，Warrington，UK)以正离子多反应监测模式分析。

实施例1：英夫利昔单抗治疗增加DDAH1水平并降低门静脉压

这些实验中使用三组大鼠：以运载体治疗的BDL大鼠、以抗TNF单克隆抗体英夫利昔单抗治疗的BDL大鼠、和模拟处理的大鼠。

如图1所示，发现胆管结扎明显减少eNOS活性，但以英夫利昔单抗治疗BDL大鼠将eNOS活性恢复到与在模拟动物观察到的相似的水平。

如图2所示，胆管结扎也导致与模拟动物相比肝脏组织ADMA浓度显著升高。然而以英夫利昔单抗治疗显著减少ADMA水平。

如图3所示，胆管结扎明显减少肝脏中DDAH-1同种型的表达。以英夫利昔单抗治疗后，DDAH-1表达水平恢复到模拟动物水平。

如图4所示，BDL肝硬化大鼠中的门静脉压比正常模拟动物门静脉压明显增加(14±0.7vs.5.5±0.3mmHg)。以英夫利昔单抗介入后，门静脉压减少多于30％(9.5±0.6mmHg)。

因此，发明人已发现以英夫利昔单抗治疗BDL大鼠导致

-肝脏组织DDAH 1表达显著增加。

-肝脏ADMA产生减少。

-肝脏NO产生增加(NOS活化)。

-与用等体积盐水注射治疗的BDL大鼠相比门静脉压减少大于33％。

实施例2：类法尼醇受体激动剂INT-747增加DDAH1水平并降低门 静脉压

类法尼醇受体(FXR)是胆汁酸响应性核受体，此前显示其对大鼠中的胆管结扎(BDL)损伤具有肝保护作用。FXR激动剂具有包括DDAH1的多种靶基因。这一研究测试以下假设：FXR激动剂(INT-747)将恢复DDAH-1水平从而恢复eNOS活性，降低门静脉压。

在对Sprague-Dawley大鼠(n＝14)BDL或模拟手术后四周，对BDL大鼠强饲运载体(玉米油)中的5mg/kg FXR激动剂INT-747(6-乙基鹅去氧胆酸，Intercept Pharmaceuticals Inc.)5天或仅强饲运载体。

在治疗5天后对大鼠进行直接门静脉压评价然后处死，收集血浆和肝脏组织用于分析。通过标记的放射性精氨酸向瓜氨酸的转化以放射性测量方法来确定eNOS活性。通过标准蛋白印迹法技术测量eNOS、iNOS、DDAH-1和DDAH-2的蛋白表达。评估肝脏活组织切片的以H+E、VanGiesen和网硬蛋白染色的组织病理学。

如图5和图6所示，以INT-747治疗后，BDL大鼠中的eNOS活性恢复到模拟动物水平(*-p＜0.05)，eNOS蛋白表达也类似地正常化(*-p＜0.05)。

如图7和*所示，INT-747施用于BDL大鼠导致与仅BDL相比，DDAH-1表达显著增加(**-p＜0.01)和ADMA显著减少(*-p＜0.05)。

如图9所示，BDL大鼠的INT-747治疗导致与BDL+运载体相比门静脉压降低30％(**-p＜0.01)。以INT-747介入后这种门静脉压的降低发生在不存在组织纤维化或炎症上的任何显著改变的情况下。

与BDL+运载体动物相比，以INT-747治疗的动物中的血浆TNFα水平未显著改变。

实施例3

已经证明，注射带有在哺乳动物细胞中有效的启动子的裸质粒DNA导致目标基因在啮齿动物中的有效肝脏转导(Maruyama等.J Gene Med2002，4：333-41)。这一方法称为‘水流动力学基因治疗’，用于确定在BDL大鼠中转导DDAH-1对门静脉压的作用。

将含人类DDAH-1cDNA的质粒经颈静脉的分支注射到如上产生的BDL啮齿动物或模拟啮齿动物中。含GFP的对照质粒用作在BDL动物中介入的对照。在介入后48小时对动物进行直接门静脉压测量，并且收集血浆和组织用于分析肝脏DDAH-1mRNA(rtPCR)和蛋白表达(蛋白印迹法)、以及常规组织学和生物化学。

被治疗的所有动物均良好耐受水流动力学注射，被提供随意获得食物和水的机会。48小时后，在处死时，进行门静脉压评价。模拟大鼠具有的平均门静脉压显著低于注射GFP质粒的BDL大鼠(6.5±0.7mmHg vs.17.8±1.8mmHg)。然而，以并入DDAH-1的质粒治疗的组与GFP治疗组相比具有38％门静脉压下降(11±0.9mmHg)。参见图10。这一数据证实了以下推断：通过重构DDAH-1cDNA的遗传治疗可作为治疗门静脉高压的疗法起作用。

实施例4

腺相关病毒(AAV)载体是最常用的基因治疗病毒载体之一。已经证实当经静脉内注射到小鼠时，带有AAV8衣壳的AAV2基因组(AAV2/8)的高效肝脏转导(Osman等；Atherosclerosis 2009，204：121-6)。目标基因的表达由包含人类apoE/CI肝脏控制区(HCR)和α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)基因启动子的区段的截短的肝脏-特异性启动子LP1驱动，提供强的肝脏局限性转基因产生。

我们已经克隆了在AAV2/8质粒中含在肝脏特异性LP1启动子控制下的人类DDAH1 cDNA的DNA构建体。

产生AAV载体随后的步骤是：(a)转染DDAH-AAV2/8质粒以及辅助质粒和包装质粒到感受态细胞中，(b)以AVB Sepharose柱纯化DDAH-AAV2/8，和(c)以rtPCR定量DDAH-AAV2/8。

将DDAH-AAV2/8载体由尾静脉注射而注射到BDL大鼠或模拟大鼠中。无目标基因的阴性对照AAV2/8也被注射到BDL大鼠中。门静脉压可通过直接插管来评价。DDAH-1的转导可通过测量mRNA(rtPCR)和蛋白(蛋白印迹法)来评价。

实施例5

已经显示腺病毒载体示范了在肝病的啮齿动物模型中高效转导肝细胞和其他细胞类型(Yu等，Am J Phys 2002，282：G565-G572；Garcia-Banuelos等，Gene Therapy 2002，9：127-134)。

构建了表达DDAH-1的腺病毒。构建后，DDAH-腺病毒构建体可用于确定向肝细胞和非实质细胞(包括窦内皮细胞)转导DDAH-1对BDL大鼠中eNOS活性和门静脉压的作用。

将DDAH-腺病毒载体由尾静脉注射而注射到BDL模拟大鼠中。无目标基因的阴性对照AAV2/8也被注射到BDL大鼠中。门静脉压可通过在5天时对门静脉直接插管来评价。DDAH-1的转导可通过测量mRNA(rtPCR)和蛋白(蛋白印迹法)来评价。

Claims (13)

1.一种降低门静脉血压的方法，包括向需要其的受治疗者施用DDAHI的激动剂，其中所述激动剂不减少受治疗者的血浆TNFα水平。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述激动剂导致：

(a)受治疗者肝脏中DDAH I的表达增加；和/或

(b)受治疗者肝脏中DDAH I的水平增加。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述激动剂促进受治疗者细胞中DDAH I的转录。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述激动剂是能够在受治疗者肝脏中表达DDAH I的载体。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述激动剂增加个体肝脏中DDAH I的活性。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述激动剂导致个体肝脏中：

(a)非对称性二甲基精氨酸(ADMA)的水平减少；和/或

(b)一氧化氮合酶(NOS)的水平增加。

7.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述受治疗者患有门静脉高压。

8.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述受治疗者患有肝硬化。

9.一种鉴定适用于治疗门静脉高压的药剂的方法，所述方法包括确定受试药剂是否能够增加或保持DDAH I的量或活性，其中增加DDAH I的量或活性的能力指示该化合物可适用于治疗门静脉高压。

10.如权利要求9所述的方法，包括以下步骤：将包含DDAH I的细胞或组织与受试药剂接触并确定所述受试药剂的存在是否导致所述细胞或组织中DDAH I的量或活性的增加。

11.如权利要求9或10所述的方法，其中在肝脏或来源于肝脏的组织或细胞中评价DDAH I的量或活性。

12.如权利要求9或10所述的方法，包括以下步骤：向胆管结扎的大鼠施用受试药剂并确定所述受试药剂的存在是否导致所述大鼠肝脏中DDAH I的量或活性的增加。

13.如权利要求9至12任一项所述的方法，还包括确定所述受试药剂是否能够抑制TNFα，其中增加DDAH I的量或活性的能力联合不存在对TNFα的抑制作用指示该化合物可适用于治疗门静脉高压。

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