CN102560733A - 基于plga-lap复合纳米纤维双载药体系的制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，包括：(1)绘制药物水溶液的浓度-吸光度标准曲线；(2)在药物水溶液中加入LAP纳米粉末，搅拌，使药物分子与LAP充分混合；然后离心、分离，吸出上清液，冷冻干燥沉淀，得到载药的LAP纳米颗粒；测量所得上清液的吸光值，根据药物水溶液的浓度-吸光度标准曲线计算上清液中剩余的药物浓度，得出药物的负载量；(3)将载药的LAP纳米颗粒分散在PLGA静电纺丝溶液中，进行静电纺丝，干燥，即得。本发明工艺简单，产品易得，成本低；制备的双载药体系具有良好药物缓释性能，且对药物药效的发挥无影响，应用前景广阔。

Description

基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备

技术领域

本发明属于基于纳米纤维的药物载体的制备领域，特别涉及一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法。

背景技术

静电纺丝技术是目前唯一能够直接、连续制备聚合物纳米纤维的新型纺丝技术。用静电纺丝技术制得的纤维具有孔隙率高、比表面积大、纤维精细度与均一度高、长径比大等特点。自从Kenawy等人第一次报道了静电纺纳米纤维可以用做药物载体后，基于静电纺纳米纤维的药物负载体系得到了长足的发展。截止目前，通过静电纺技术制备药物载体的方法主要包括传统静电纺丝法、同轴静电纺和乳液静电纺等。

传统静电纺丝法即将药物简单地与高分子溶液混合，然后将混有药物的高分子溶液直接纺丝。通过这种方法制备的载药纳米纤维，药物通常会均匀的分散在纤维中，并形成“药物-基质”结构。此结构中，药物与基质间的作用力不强，常常伴有药物突释现象的发生，且随着释放时间的延长，药物的释放速度会降低，影响药效的发挥。

同轴静电纺和乳液静电纺是两种改进了的静电纺丝技术。通过此技术准备的载药纳米纤维中，药物往往存在于纤维的内部，并形成所谓的“核-壳”结构，药物处于核层，壳层为高分子层。在这种“核-壳”结构中，药物首先要从核层中释放到壳层，再从壳层扩散到纤维外。壳层的纤维对药物起到了额外的屏障作用，因此可以很好的控制药物的释放速度。

但是，这两种静电纺丝技术仍然存在着一定的弊端。同轴静电纺需要进行大量的仪器参数和溶液参数的调试，而在乳液静电纺技术中，很难使内层的溶剂彻底挥发，残留的溶剂将会影响纤维的生物活性和药物的药效的发挥。因此，需要探索以静电纺为基础的更加新颖的药物载体的制备方法。

锂皂石(Laponite，LAP)是一种含镁、锂、硅的层状粘土矿物，其晶体结构为三八面体型。有研究报道了通过离子交换的方法将小分子药物包裹在锂皂石的层状结构内，得到了LAP-药物纳米粒子。但是，单纯的无机纳米颗粒并不能有效地控制药物的释放速度。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide)，PLGA)是一种已经被美国食品与药物管理局(FDA)批准使用，具有良好的生物相容性和生物降解性的高分子聚合物。研究已经充分表明，PLGA具有良好的可纺丝性能。

截止目前，尚没有文献报道通过静电纺丝法制备PLGA/LAP复合纳米纤维用作双重载药体系，并进一步评价该双重载药体系的药物释放特性和药效的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，该方法简单，成本低，制备的PLGA/LAP/药物复合纳米纤维具有良好的缓释性能，且不影响药物药效的发挥。

本发明的一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，包括：

(1)绘制药物水溶液的浓度-吸光度标准曲线；

(2)在药物水溶液中缓慢加入锂皂石LAP纳米粉末，搅拌，使药物分子与LAP充分混合，得到LAP和药物的混合溶液；然后离心、分离，吸出上清液，冷冻干燥沉淀，得到载药的LAP纳米颗粒；测量所得上清液的吸光值，根据步骤(1)绘制的药物水溶液的浓度-吸光度标准曲线计算上清液中剩余的药物浓度，进而得出药物的负载量；

(3)将步骤(2)得到的载药的LAP纳米颗粒分散在PLGA静电纺丝溶液中，得PLGA/LAP/药物静电纺丝溶液，进行静电纺丝，制备PLGA/LAP/药物复合纳米纤维；最后干燥，即得PLGA/LAP复合纳米纤维双载药体系。

步骤(1)中所述的绘制药物水溶液的浓度-吸光度标准曲线的具体步骤为：将药物溶于水中，制备n组不同浓度的药物水溶液，其中n≥4；然后测量所得n组不同浓度的药物水溶液的吸光值，绘制浓度-吸光度标准曲线。

绘制浓度-吸光度标准曲线时，利用Lambda 25紫外-可见分光光度计(美国珀金埃尔默仪器公司)测量所得n组不同浓度的药物水溶液在230nm波长处的吸光值。

上述的药物为阿莫西林AMX，其中n＝4，4组阿莫西林水溶液的浓度为0.1，0.3，0.5，1和2mg/mL；所得到的浓度-吸光度标准曲线的方程为Y＝0.02175+25.04109X，R²＝0.99966，其中Y代表吸光值，X代表药物浓度，X的单位为毫克/毫升。

步骤(2)中所述的药物水溶液中药物的浓度为0.1-2mg/mL。

步骤(2)中所述的LAP和药物的混合溶液中LAP浓度为2-10mg/mL。

步骤(2)中所述的LAP和药物的混合溶液中LAP浓度为3、5或10mg/mL。

步骤(2)中所述的磁力为磁力搅拌，搅拌时间为12-24小时。

步骤(2)中所述的离心的离心速度为8000-10000rpm，离心时间为3-5min。

当所述的药物为阿莫西林AMX时，步骤(2)中得到的载药的LAP纳米颗粒的最佳载药物负载率为9.76±0.57％，此时药物水溶液中AMX的浓度为2mg/mL，LAP的浓度为3mg/mL。

步骤(3)中所述的PLGA静电纺丝溶液中的溶剂为THF/DMF混合溶剂，其中THF和DMF的体积比为3∶1；PLGA静电纺丝溶液中载药的LAP纳米颗粒的质量与PLGA的质量百分比为4-6％。

步骤(3)中所述的静电纺丝的工艺参数为：电压18-22kV，流速0.8-1.0mL/h，接收距离15-20cm。

步骤(3)中所述的干燥为真空干燥，干燥的时间为24-48h。

为了对比研究PLGA/LAP/AMX的药物释放特性，需设置两组对照组实验，分别为LAP/AMX载药纳米颗粒和与PLGA/LAP/AMX双载药体系中药物含量相同的PLGA/AMX纳米纤维。

对照组中AMX的质量分数与PLGA/LAP/AMX中药物的质量分数相同，优选为PLGA质量的0.5％。

本发明首先将模型药物AMX包覆在LAP层状结构中，得到LAP/AMX纳米颗粒，然后将此LAP/AMX纳米颗粒包裹在PLGA纳米纤维中，得到一种基于PLGA纳米纤维和LAP层状纳米颗粒的双重载药体系。

本发明工艺简单，产品易得，所用PLGA和LAP成本低；制备的双载药体系具有良好药物缓释性能，且对AMX的药效发挥无影响，在伤口包覆材料、术后防止伤口感染材料等领域具有广阔的应用前景。

本发明使用紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)、傅里叶变换-红外光谱(FT-IR)、X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)等表征手段验证本发明方法的可行性。此外，本发明还对材料的体外抗菌活性进行了评价。具体测试结果如下：

(1)通过改变LAP和AMX的药物浓度，优化AMX的负载率

本发明首先通过调控LAP和AMX的药物浓度，优化AMX的负载率(如图1所示)。LAP对AMX的负载率随着AMX浓度的增加而增加，但却随LAP浓度的增加而降低。这主要是因为当LAP的浓度过高时，LAP纳米颗粒发生团聚，导致药物的负载率下降。当LAP和AMX的浓度分别为3mg/mL和2mg/mL时，LAP对AMX的负载达到最优值，为9.76±0.57％(AMX的质量与LAP/AMX纳米颗粒的质量比)。

(2)FT-IR测试结果

本发明通过FT-IR技术对LAP和LAP/AMX进行表征，结果如图2所示。图2(a)为AMX的红外图谱。其中，在1687cm^-1，1519cm^-1，和1235cm^-1的三个吸收峰可以归属为AMX结构中酰胺I键，酰胺II键和酰胺III键的特征吸收峰；1770cm^-1和1397cm^-1处的弱吸收峰可以分别归属为AMX结构中酮羰基和羧基的特征吸收峰。图2(b)为LAP和LAP/AMX的红外图谱。在1640cm^-1处的中等强度的吸收峰是因为LAP吸收空气中的水分所致。1012cm^-1和3440cm^-1处的强峰分别为LAP结构中硅氧键和羟基的伸缩振动峰。通过对比图2(b)中两红外图谱可以发现，在LAP/AMX的红外图谱的1770cm^-1处新出现一个弱峰。这一弱峰为AMX结构中酮羰基的特征吸收峰，说明本研究已经成功的制备了LAP/AMX纳米颗粒。

(3)X-射线衍射(XRD)的测试结果

通过对衍射图谱(图3)的比较和分析，载药前后LAP的XRD谱图各个晶面位置吻合，表明本发明报道的载药方法不会改变LAP的晶体结构。

(4)扫描电子显微镜(SEM)的测试结果

图4所示为本发明制备的PLGA、PLGA/LAP、PLGA/AMX和PLGA/LAP/AMX纳米纤维的SEM测试结果。SEM观察结果显示，所得到的四种纳米纤维形貌规则、表面规整，纤维直径分别为929±274nm、550±183nm，842±171nm和591±184nm。当一定量的AMX和LAP纳米粒子掺杂于PLGA纺丝液中时，在同样的纺丝条件下，所得纳米纤维的直径有所降低，主要是因掺杂的LAP，AMX和LAP/AMX纳米粒子引起PLGA纺丝液性质(如电导率、表面张力以及粘度等)变化而致。

(5)PLGA/LAP/AMX复合纳米纤维载药系统的药物释放研究

如图5所示，与LAP/AMX载药纳米颗粒和PLGA/AMX载药纳米纤维相比，PLGA/LAP/AMX双载药纳米纤维可以很好地控制药物的释放，说明了本发明方案的可行性。

(6)PLGA/LAP/AMX复合纳米纤维的抗菌效果研究

如图6所示，在不同培养时间下，PLGA/AMX纳米纤维和PLGA/LAP/AMX双载药纳米纤维均可以很好抑制细菌的生长，说明了本发明方案的双载药体系并不影响AMX药效的发挥。

有益效果

(1)本发明工艺简单，产品易得，所用PLGA和LAP成本低；

(2)制备的双载药体系具有良好药物缓释性能，且对药物药效地发挥无影响，在伤口包覆材料、术后防止伤口感染材料等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明涉及的LAP对AMX的负载率随LAP和AMX浓度变化示意图；

图2为本发明涉及的AMX粉末、LAP粉末和AMX/LAP粉末的红外图谱；

图3为本发明涉及的LAP粉末和AMX/LAP粉末的X射线衍射图谱；

图4为本发明涉及的(a)PLGA、(b)PLGA/LAP、(c)PLGA/AMX和(d)PLGA/LAP/AMX纳米纤维的SEM图及其对应的纳米纤维的直径分布图；

图5为本发明涉及的载药LAP/AMX粉末、PLGA/AMX纳米纤维和PLGA/LAP/AMX纳米纤维中AMX药物在37℃、pH＝7.4条件下的释放曲线；

图6为在固体培养基中，不同培养时间下(1)PLGA、(2)PLGA/LAP、(3)PLGA/AMX，和(4)PLGA/LAP/AMX纳米纤维的抑菌效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

绘制阿莫西林AMX的浓度-吸光度标准曲线：

将模型药物阿莫西林(AMX)粉末溶于水中，制备AMX的浓度分别为0.1，0.3，0.5，1和2mg/mL的AMX水溶液；然后用利用Lambda 25紫外-可见分光光度计(美国珀金埃尔默仪器公司)测量这一系列不同浓度的AMX水溶液在230nm波长处的吸光值，绘制浓度-吸光度标准曲线；

得到AMX的浓度-吸光度标准曲线的方程为Y＝0.02175+25.04109X，R²＝0.99966，其中Y代表吸光值，无单位；X代表药物浓度，单位为毫克/毫升。

实施例2

取三份各10mg的AMX粉末，各溶于5mL的高纯水中，然后向三份AMX溶液中各加入15mg LAP，辅以磁力搅拌24小时。离心分离沉淀，通过标准曲线确定上清液中AMX的浓度，得到此浓度下LAP对AMX的负载率为9.76±0.57％。

实施例3

取三份各5mg的AMX粉末，各溶于5mL的高纯水中，然后向三份AMX溶液中各加入25mg LAP，辅以磁力搅拌24小时。离心分离沉淀，通过标准曲线确定上清液中AMX的浓度，得到此浓度下LAP对AMX的负载率为4.67±0.11％。

实施例4

取三份各2.5mg的AMX粉末，各溶于5mL的高纯水中，然后向三份AMX溶液中各加入50mg LAP，辅以磁力搅拌24小时。离心分离沉淀，通过标准曲线确定上清液中AMX的浓度，得到此浓度下LAP对AMX的负载率为0.834±0.12％。

实施例5

取4份各1g PLGA，分别与3mL THF和1mL DMF混合，室温下搅拌使PLGA完全溶解。分别向第2，3和4份PLGA溶液中加入50mg LAP，5mg AMX和50mg实施例2中制备的LAP/AMX粉末。使用磁力搅拌使LAP、AMX和LAP/AMX均匀地分散于PLGA溶液中，得到PLGA/LAP、PLGA/AMX及PLGA/LAP/AMX纺丝液。通过静电纺丝法制备PLGA、PLGA/LAP、PLGA/AMX和PLGA/LAP/AMX纳米纤维。其中，接收距离为15cm，电压为20kV，流速为0.8mL/h，制备的复合纳米纤维置于真空干燥箱内干燥48h以除去残留的水分和溶剂。

SEM观察结果显示(附图4)，所得到的PLGA、PLGA/LAP、PLGA/AMX和PLGA/LAP/AMX纳米纤维形貌规则、表面规整，纤维直径分别为929±274nm、550±183nm、842±171nm和591±184nm。当一定量的LAP、AMX和LAP/AMX纳米粒子掺杂于PLGA纺丝液中时，在同样的纺丝条件下，所得纳米纤维的直径有所降低，主要是因掺杂LAP纳米粒子引起PLGA纺丝液性质(如电导率、表面张力以及粘度等)变化而致。

实施例6

取3份各24mg的实施例5中得到的PLGA/LAP/AMX纳米纤维，置于装有3mL的PBS缓冲液的样品瓶中，保证纤维全部浸没于PBS缓冲液中。然后，将样品瓶置于37℃的摇床中震荡，在预先设计好的时间点，从试剂瓶中各取出1mL溶液，并补充1mL新的PBS缓冲液。

用紫外-可见分光光度计测试上述取出的1mL PBS缓释液在230nm处的吸光值，根据标准曲线计算出释放出来的AMX的浓度，并绘制出PLGA/LAP/AMX纳米纤维对AMX的释放动力学曲线。从附图5可以看出，PLGA/LAP/AMX可以很好地控制AMX的释放速度。

实施例7

用内径1cm打孔器分别制备圆形的PLGA、PLGA/LAP、PLGA/AMX和PLGA/LAP/AMX纤维毡，并置于紫外灯下杀菌6小时(纤维每面杀菌3小时)。将杀菌后的纳米纤维贴在涂布200μL金黄色葡萄球菌的固体培养基平板上，置于37℃恒温振荡培养箱中培养，在12、24和48小时拍照，观察抑菌圈变化情况，验证缓释体系释放出的药物的药效。从附图6可以看出，PLGA/AMX(3)和PLGA/LAP/AMX(4)复合纳米纤维均出现了明显的抑菌圈，表现出很好的抑菌效果，而PLGA(1)和PLGA/LAP(2)复合纳米纤维不具备抑菌效果。

对比例1

取3份各6mg实施例2中制备的LAP/AMX粉末，置于预先装入1mL PBS缓冲液、截留量为10000的透析袋中，固定好后将透析袋分别置于装有2mL PBS的样品瓶中。然后，将样品瓶置于37℃的摇床中震荡，在预先设计好的时间点，从试剂瓶中各取出1mL溶液，并补充1mL的新的PBS缓冲液。

用紫外-可见分光光度计测试上述取出的1mL PBS缓释液在230nm处的吸光值，根据标准曲线计算出释放出来的AMX的浓度，并绘制出LAP/AMX粉末对AMX的释放动力学曲线。从附图5可以看出，LAP/AMX存在着严重的突释现象。

对比例2

取3份各24mg的实施例5中得到的PLGA/AMX纳米纤维，置于装有3mL的PBS缓冲液的样品瓶中，保证纤维全部浸没于PBS缓冲液中。然后，将样品瓶置于37℃的摇床中震荡，在预先设计好的时间点，从试剂瓶中各取出1mL溶液，并补充1mL新的PBS缓冲液。

用紫外-可见分光光度计测试上述取出的1mL PBS缓释液在230nm处的吸光值，根据标准曲线计算出释放出来的AMX的浓度，并绘制出PLGA/AMX纳米纤维对AMX的释放动力学曲线。从附图5可以看出，药物从PLGA/AMX纳米纤维中的释放速度介于LAP/AMX粉末和PLGA/LAP/AMX纳米纤维之间。

Claims (10)

1.一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，包括：

(1)绘制药物水溶液的浓度-吸光度标准曲线；

(2)在药物水溶液中缓慢加入锂皂石LAP纳米粉末，搅拌，使药物分子与LAP充分混合，得到LAP和药物的混合溶液；然后离心、分离，吸出上清液，冷冻干燥沉淀，得到载药的LAP纳米颗粒；测量所得上清液的吸光值，根据步骤(1)绘制的药物水溶液的浓度-吸光度标准曲线计算上清液中剩余的药物浓度，进而得出药物的负载量；

(3)将步骤(2)得到的载药的LAP纳米颗粒分散在PLGA静电纺丝溶液中，得PLGA/LAP/药物静电纺丝溶液，进行静电纺丝，制备PLGA/LAP/药物复合纳米纤维；最后干燥，即得PLGA/LAP复合纳米纤维双载药体系。

2.根据权利要求1所述的一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的绘制药物水溶液的浓度-吸光度标准曲线的具体步骤为：将药物溶于水中，制备n组不同浓度的药物水溶液，其中n≥4；然后测量所得n组不同浓度的药物水溶液的吸光值，绘制浓度-吸光度标准曲线。

3.根据权利要求2所述的一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，其特征在于：绘制浓度-吸光度标准曲线时，利用Lambda 25紫外-可见分光光度计测量所得n组不同浓度的药物水溶液在230nm波长处的吸光值。

4.根据权利要求2所述的一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，其特征在于：所述的药物为阿莫西林AMX，n＝4，4组阿莫西林水溶液的浓度为0.1，0.3，0.5，1和2mg/mL；所得到的浓度-吸光度标准曲线的方程为Y＝0.02175+25.04109X，R²＝0.99966，其中Y代表吸光值，X代表药物浓度，X的单位为毫克/毫升。

5.根据权利要求1所述的一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的药物水溶液中药物的浓度为0.1-2mg/mL；所述的LAP和药物的混合溶液中LAP浓度为2-10mg/mL。

6.根据权利要求5所述的一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的LAP和药物的混合溶液中LAP浓度为3、5或10mg/mL。

7.根据权利要求1所述的一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的磁力为磁力搅拌，搅拌时间为12-24小时；所述的离心速度为8000-10000rpm，离心时间为3-5min。

8.根据权利要求1所述的一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，其特征在于：所述的药物为阿莫西林AMX，步骤(2)中得到的载药的LAP纳米颗粒的最佳载药物负载率为9.76±0.57％，此时药物水溶液中AMX的浓度为2mg/mL，LAP的浓度为3mg/mL。

9.根据权利要求1所述的一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的PLGA静电纺丝溶液中的溶剂为THF/DMF混合溶剂，其中THF和DMF的体积比为3∶1；PLGA静电纺丝溶液中载药的LAP纳米颗粒的质量与PLGA的质量百分比为4-6％。

10.根据权利要求1所述的一种基于PLGA-LAP复合纳米纤维双载药体系的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的静电纺丝的工艺参数为：电压18-22kV，流速0.8-1.0mL/h，接收距离15-20cm；所述的干燥为真空干燥，干燥的时间为24-48h。

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