CN102549429B - 使用大颗粒标记的高灵敏性免疫测定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测样品中的分析物的免疫测定，所述测定包括多个能够结合所述分析物的部分，其中对相同表位不具有特异性的捕获部分被结合至固体基底，以及至少一个表位特异性检测部分被结合至可检测标志物；并且，其中所述表位特异性检测部分所结合的可检测标志物为大颗粒标志物，其具有≥50nm且≤5000nm的颗粒大小。

Description

使用大颗粒标记的高灵敏性免疫测定

技术领域

本发明涉及使用一种大颗粒标记的高灵敏性免疫测定。

背景技术

免疫测定广泛用于健康护理和其他领域以确定诸如蛋白、激素、DNA、RNA或酶的特定分子的存在与否。

一种用于测定体液中的特异性靶标(抗原)浓度的公知方法是所谓的“酶联免疫测定”(ELISA)。其中将来自样品的分析物固定于固体支持物上，然后向该固体支持物加入特异于所述分析物的抗体，从而其可以结合所述分析物。所述抗体连接至酶。然后向所述固体支持物加入可以被酶转化以产生诸如荧光团的可检测部分的基底。洗涤步骤后，固体基底经过使得可以对可检测部分进行检测的处理，例如在荧光读取器上进行处理。由此，这可以确定所述样品中是否存在所述分析物。

夹心免疫测定包括两种抗体，其结合抗原上不同且不重叠的表位。第一抗体(捕获抗体)接合至固体支持物，然后加入包含抗原的样品以允许形成抗原与捕获抗体之间的复合物。通过洗涤步骤除去未结合的分子，然后加入标记的第二抗体(检测抗体)，并允许其结合抗原与捕获抗体的复合物，由此形成“夹心”。进行洗涤步骤以除去未结合的检测抗体之后，通过测量标记的检测抗体的量来测定靶分子的量。使用许多标记技术，包括荧光、化学发光、放射性或磁性标记。

在大部分情况下，使用识别靶标的不同位点的两种单克隆抗体。在另一变体中，使用单克隆捕获抗体和针对抗原上不同表位的亲和力纯化的多克隆检测抗体。

在健康护理中，测量许多不同分子以诊断或监测疾病。例如，测量血糖含量以监测糖尿病。葡萄糖是以较高浓度存在于血液中的分子，其浓度为每mL约几百μg至约1mg，对应于每mL约3至6毫摩尔的浓度。测量装置以手持装置的形式提供，包括测试带。

相比之下，其他分子，如用于监测心力衰竭的生物标记NT-proBNP则以明显较低的浓度存在于血液中。在健康个体中，NT-proBNP在血液中的浓度为约20pg-150pg/mL，对应于约24-176皮摩尔/mL。高于500pg/mL的值通常视为是急性充血性心力衰竭(CHF)的指征。

目前，测量极低浓度的生物标记以诊断疾病(例如心血管疾病)要求实验室分析、大样品体积以及15分钟至数小时的时间结果(time-to-result)延滞。尽管这些测试是小型台面测试，但是较长的运行时间和大样品体积使得它们不适合于更高要求的情况，例如医院急诊部门、诊室和救护车，其中要求小样品体积、易于使用、快速以及高灵敏度。

Dittmer W.U.et al.，Sensitive and rapid immunoassay for parathyroid hormone using magnetic particle labels and magnetic actuation，Journal of immunological methods，Elsevier Science publishers B.V.，Amsterdam，NL，vol.338，no 1-2，30September 2008(2008-09-30，pages 40-46，XPO25400186，ISSN：0022-1759，DOI：10.1016/J.JIM.2008.07.001)描述了一种利用磁驱动颗粒标记(用巨磁阻(GMR)生物传感器来测量)来灵敏地检测蛋白的快速方法。这种技术涉及不进行流体替代步骤的一步夹心免疫测定。各种测定结合反应以及结合/自由分离完全受传感器芯片上面和下面的电磁体所诱导的磁力控制。在测定期间，与示踪剂抗体缀合的颗粒被驱动通过样品以用于靶标捕获，并被快速带至传感器表面，并在那里结合固定的捕获抗体。通过远离GMR传感器表面的磁力除去弱或未结合的标记。对于甲状旁腺激素(PTH)的测量，当使用300nm的颗粒时，通过15min的总测定时间获得10pm范围的检测极限。当使用500nm的颗粒时，在5min内获得相同的灵敏度。

D2公开了用于检测和/或定量来自个体血液的样品中的心肌肌钙蛋白I(cTnl)的免疫测定，所述方法基于使用至少两种捕获抗体和至少一种示踪剂抗体的夹心免疫测定。

D3描述了用于测定诸如血液的各种体液中的NT-proBNP蛋白水平的体外ELISA测定和诊断试剂盒。

定义

本文所用的术语“抗体”指任何同种型(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)的多克隆和/或单克隆抗体或其抗原结合部分，包括但不限于F(ab)和Fv片段、单链抗体、嵌合抗体和人源化抗体。

本文所用的术语“分析物”指要确定其浓度或存在的任何分子。靶分子的实例为分子靶标，例如肽、蛋白、激素、DNA、RNA和酶。术语“分析物”和“靶标”在本申请中可互换使用。

本文所用的术语“同源”指肽或蛋白与所述肽或蛋白基本上相似。术语“基本上相似”为本领域技术人员所公知。特别地，变体可以是与人群体中最优势的肽同种型的氨基酸序列相比表现出氨基酸交换的同种型或等位基因。优选地，这样的基本上相似的肽与所述肽最优势的同种型的序列相似性为至少70％，优选至少80％、85％、90％、95％、97％、98或99％。基本上相似还指降解产物，如蛋白水解降解产物，其仍然被诸如抗体的结合部分或被针对各自的全长肽的配体所识别。术语“变体”还指剪接变体。

本文所用的术语“固体基底”指对相同表位不具有特异性的捕获部分所结合的基底。术语“固体基底”和“固体支持物”在本申请中可互换使用。

本文所用的术语“结合部分”分别指表位特异性检测部分或者对相同表位不具有特异性的捕获部分。

本文所用的术语“表位特异性检测部分”指结合诸如分析物蛋白的给定靶标的一个相同表位的至少一个部分。

这样的表位特异性检测部分例如单克隆抗体、表位特异性适体、表位特异性anticalin、表位特异性凝集素、表位特异性亲和体(affibody)、表位特异性化学配体或表位特异性肽。术语“表位特异性检测部分”和检测部分在本申请中可互换使用。

本文所用的术语“对相同表位不具有特异性的捕获部分”指结合给定靶标的不同表位，或者结合给定靶标的相同表位的不同亚区的至少两个部分的集合。一个部分结合给定靶标的表位的氨基酸1-10，而结合相同表位的氨基酸2-11的第二部分的两个部分因而充当本发明表述中“对相同表位不具有特异性的捕获部分”。

这样的对相同表位不具有特异性的捕获部分例如多克隆抗体(尽管以单数形式使用，其仍然是至少两种不同抗体的复数形式)、亲和力纯化的多克隆抗体(也是至少两种不同抗体的复数形式)、非表位特异性适体、非表位特异性anticalin、非表位特异性凝集素、非表位特异性亲和体、非表位特异性化学配体或非表位特异性肽。术语“对相同表位不具有特异性的捕获部分”和“捕获部分”在本申请中可互换使用。

发明内容

本发明的目的是提供克服上文所列的局限的免疫测定。

本发明的另一目的是提供促进使用大标志物或标记的免疫测定。

本发明的又一目的是提供一种检测样品中的分析物的方法，其中使用本发明的免疫测定。

本发明的另一目的是提供一种能够根据本发明的方法检测分析物的生物传感器装置。

这些目的通过独立权利要求的测定、方法以及生物传感器装置实现。

本发明提供一种检测样品中的分析物的免疫测定，所述测定包括多个能够结合所述分析物的部分，其中

a)对相同表位不具有特异性的捕获部分被结合至固体基底，以及

b)至少一个表位特异性检测部分被结合至可检测标志物；

其中所述表位特异性检测部分所结合的可检测标志物为大颗粒标志物，其具有≥50nm且≤5000nm的颗粒大小。

重要的是，对相同表位不具有特异性的捕获部分结合给定靶标的至少两个不同表位，或者结合给定靶标的相同表位不同亚区。

本发明人出乎意料地发现，当将大颗粒标志物用于标记检测部分时，特别是在要检测靶标相对较小时，使用结合靶标的不同表位的捕获部分非常有效地改善了免疫测定的灵敏度。

本发明人发现，使用大颗粒标志物导致表位特异性检测部分、靶标和大颗粒标志物的复合物的转动自由度的丧失。而且，大颗粒标志物还降低取决于颗粒半径的平移和/或扩散速度。

由于标志物的大体积，表位特异性检测部分、靶标和大颗粒标志物的 复合物无法像表位特异性检测部分和具有小标志物的靶标的复合物那样快地移动和转动。在短测定时间的情况下，这是不利的，因为一些捕获部分不具有足够的时间来偶联与携带大颗粒标志物的表位特异性检测部分结合的靶标。因此，并非所有的表位特异性检测部分、靶标和大颗粒标志物的复合物都会偶联捕获部分，并因而偶联固体支持物。这些未结合的复合物会在洗涤步骤中被除去，从而降低测定的灵敏度。

当将具有大标记的检测部分用于检测小靶标时，大标记的上述效果甚至会更明显，因为这进一步降低表位特异性检测部分、靶标和大颗粒标志物的复合物移动至正确的位置以结合捕获部分的自由度。

在这一背景下，本发明人出乎意料地发现，当将对相同表位不具有特异性的捕获部分用作捕获部分时，提供了非常大的帮助。由于对相同表位不具有特异性的捕获部分结合分析物的不同表位，所以它们可以采取任何位置或角度来结合分析物。这意味着检测部分携带的大标记所导致的转动自由度的丧失通过使用对相同表位不具有特异性的捕获部分得到弥补。如果一个标志物携带多于一个检测部分，因而多于一个分析物结合一个标志物，则上述效果甚至会更明显。

对相同表位不具有特异性的捕获部分和检测部分优选结合分析物或其同源物的不同位点(表位)。

在一实施方案中，结合固体支持物的对相同表位不具有特异性的捕获部分针对分析物上的至少两个不同的表位，或者相同表位的至少两个不同的亚区。最优选的对相同表位不具有特异性的捕获部分针对≥2且≤10个不同表位或者相同表位的≥2且≤10个不同亚区。优选地，对相同表位不具有特异性的捕获部分为多克隆抗体。在一优选实施方案中，对相同表位不具有特异性的捕获部分为绵羊多克隆抗体和/或山羊或兔多克隆抗体。

在优选实施方案中，所述分析物为心激素。更优选地，所述心激素为利尿钠肽。所述肽可以是BNP和/或NT-pro BNP。最优选地，所述肽为人BNP和/或人NT-pro BNP。

脑利尿钠肽(BNP)及相关的分子NT-proBNP是释放入血流并用于诊断和监测心力衰竭的物质。

测定BNP和/或NT-proBNP对精度有严格要求并且对灵敏度要求很高， 因为数皮摩尔或更高的BNP和/或NT-proBNP的患者血液水平具有重要的临床结果。由于心力衰竭的紧急性，期望能够在短时间内给出实验室质量的结果的测试，所述结果可以用于现场(point-of-care)情况，例如急诊部门或救护车

BNP(pre-proBNP)的前肽原具有134个氨基酸，并且包含短信号肽，其被酶促切割以释放具有108个氨基酸的肽原(proBNP)。肽原被进一步切割成包含proBNP的氨基酸77-108的BNP，以及N端肽原(NT-proBNP)。NT-proBNP是仅由76个氨基酸残基组成的小肽，分子量为约8.5kDa。BNP是32个氨基酸的甚至更小的肽，分子量为约3.5kDa。

当靶标为人proBNP或人NT-proBNP时，对相同表位不具有特异性的捕获部分针对至少一个选自SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-12、1-21、5-12、13-27、28-45、39-50、46-60和/或61-76的表位。

优选地，所述表位特异性检测部分针对至少一个选自氨基酸残基1-10、5-12、11-22、13-27、26-32和/或61-76的表位。

特别优选使用至少两个表位特异性检测部分，其中一个检测BNP表位，而另一个检测NT pro BNP表位。

检测部分所结合的可检测标志物为大颗粒标志物。颗粒的大小可以为≥50nm至数微米，更优选≥50nm至≤5000nm，例如≥250nm至≤5000nm。最优选地，粒径为≥500nm至≤1000nm。

术语“大颗粒标记”或“标记”以及“大颗粒标志物”或“标志物”在本申请中可互换使用。

当将大颗粒标志物用于免疫测定时，会降低表位特异性检测部分的移动性，从而导致所述大颗粒标志物对固体表面的结合效率的丧失。

这种之前未知的效应的原因在于限制了结合大颗粒标志物的表位特异性检测部分的自由度。这意味着由携带至少一个表位特异性检测部分的大颗粒标志物与结合的靶标所组成的复合物的旋转速度明显受到限制。这可以导致这样的情况，其中标志物/检测部分/靶标复合物不能结合表位特异性捕获部分，因为所述复合物的旋转角度不允许捕获部分与各自的靶表位之间的结合。

为此，本发明人出乎意料地发现，可以有利地使用对相同表位不具有 特异性的捕获部分，例如多克隆抗体。后者允许标志物/检测部分/靶标复合物结合，而无论旋转角度是多少，由此促进标志物/检测部分/靶标复合物的结合，所述复合物的转动自由度由于大标志物的大小而降低。

在本申请中，当使用大颗粒标志物时，期望使用对相同表位不具有特异性的捕获部分，因为所述对相同表位不具有特异性的捕获部分通过改进所述大颗粒标志物对固体表面的结合效率来增加免疫测定的灵敏度。

在本发明的免疫测定的另一优选实施方案中，表位特异性检测部分所结合的可检测标志物可以是光学或非光学标志物。优选地，所述光学标志物为至少一种选自光散射标志物、酶促标志物、荧光标志物、发色基团、电发光标志物、化学发光标志物、磷光标志物、反射标志物和/或放射性标志物的标志物。

荧光标志物包括荧光素染料，如5-(和6-)羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素和5羧基荧光素；罗丹明染料，如5-(和6-)羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明和6-羧基罗丹明X；酞菁，如甲基亚硝酰基、磺酰基和氨基酞菁；偶氮染料；甲亚胺；菁；和黄嘌呤，如甲基、硝基、亚磺基(sulphano)和氨基衍生物；以及琥珀酰基荧光素。其他合适的标记为来自菁二聚体和单体的组的荧光团，例如TOTO、YOYO、TO-PRO、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7，或者诸如LCRed 705的染料可以用作荧光标志物。其他荧光标志物为荧光蛋白，如GFP等。

光散射标志物优选用于FTIR(受抑全内反射)被用作检测技术的情况中，后者在下文中进行描述。光散射发生在，例如当光束通过交替分散系时，颗粒或液滴在所有方向上散射一部分光。当颗粒与入射光的波长相比非常小时，散射光的强度在所有方向上是均匀的(Rayleigh散射)。对于较大的颗粒(直径大于约250nm)，强度是角度依赖性的(Mie散射)。

这样的光散射标志物例如直径大于250nm的小球，从而其可以以角度依赖性的方式散射入射光。这些小球是不透明的，从而它们不让光通过。它们可以例如由染色塑料、金属等制成。

当使用光散射标志物时，大小大于250nm的大标记是优选的。如上文所述，使用大标志物会导致结合大颗粒标志物的表位特异性检测部分的转动自由度降低。

在优选实施方案中，可检测标志物为磁性标志物或者连接至磁性颗粒的标志物。使用磁性标志物作为可检测标志物是优选的，因为它们通过使用磁驱动加速反应动力学，从而减少测定时间。此外，通过利用脉冲的磁驱动，使用磁性标志物有助于改进测定的灵敏度。而且，使用磁性标志物允许检测部分-靶标复合物结合固体支持物。而且，使用磁性标记促进除去结合或未结合检测部分的任何标记，所述检测部分未通过磁场结合至传感器表面。这种实施方案避免需要额外的洗涤步骤来鉴定相对于背景结合的特异性信号。

因此，可检测标志物还可以用作操控物质，促进检测部分-靶标复合物结合固体支持物。优选地，可检测标志物作为操控物质而起双重作用。

当磁性标志物被用作可检测标志物时，所述磁性标志物可以光学或磁性进行检测。优选地，所述磁性标志物经光学检测，优选通过受抑全内反射(FTIR)检测。

本发明所用的磁性标志物或颗粒的性质并不重要。合适的磁性标记包括完全无机标记和包含无机和有机材料(如，聚合物)的标记。磁性标记可商购自例如Dynal，Estapor，Seradyn，并且广泛用于可得自一些诊断公司的生物学分析中。

磁性标记连接至表位特异性检测部分可以通过本领域已描述的方法进行。例如，磁性标记可以携带一个或多个官能团，例如羟基、羧基、醛或氨基。这些官能团通常可以，例如通过下述方法提供：处理未包覆的单分散性、超顺磁性标记以提供携带这些官能团之一的聚合物的表面包覆，例如提供聚氨基甲酸酯以及聚二醇(polyglycol)以提供羟基，或者提供纤维素衍生物以提供羟基，提供丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物以提供羧基，或者提供氨基烷基化的聚合物以提供氨基。表位特异性检测部分与颗粒的偶联可以是不可逆的，但是通过使用交联标记与表位特异性检测部分的接头分子也可以是可逆的。这样的接头的实例包括具有蛋白水解识别位点的肽、具有某些限制性内切酶识别位点的寡核苷酸、诸如链霉抗生物素/生物素的结合配对(binding partner)、或者包含可还原的二硫基的化学可逆交联基团。各种可逆交联基团可以得自Pierce Biotechnology Inc.(Rockford，IL，USA)。

非光学标记可以是声学标记。

在本发明的免疫测定的另一优选实施方案中，所述分析物为小肽或蛋白。本文所用的术语“小肽或蛋白”指具有≥20且≤180个氨基酸残基的肽或蛋白。BNP具有例如32个氨基酸残基(3.47kD)，而NT-proBNP具有76个氨基酸残基(8.46kD)。类似地，术语“小肽或蛋白”指分子量≥2且≤17kDa的肽或蛋白。

当具有大标记的检测部分用于检测小靶标时，对于理解本发明的上述大标记的效果的重要性甚至是更明显的。当使用大标志物与小靶标的组合时，比大标志物用于检测大靶标的情况更明显地限制转动自由度。因此，检测部分/靶标复合物需要更多的时间移动至正确的位置以结合捕获部分，并由此结合固体支持物。因此，在使用短测定时间的情况下，甚至更小的靶蛋白会偶联至固体支持物。这些未结合的靶蛋白会在洗涤步骤中除去，这导致测定的灵敏度降低。在要求小样品体积、易于使用、快速以及高灵敏度的情况下，这是不利的。

优选地，所述肽为心激素。更优选地，所述心激素为利尿钠肽。所述肽可以是BNP和/或NT-pro BNP。特别地，所述肽为人BNP和/或人NT-proBNP。

如上文所述，NT-proBNP为仅由76个氨基酸残基组成的小肽，分子量为约8.5kDa。BNP为32个氨基酸的甚至更小的肽，分子量为约3.5kDa。

当要求包含NT-proBNP或BNP的大颗粒结合固体传感器表面以通过这种小肽进行检测时，这种性质是非常不利的。如上文所述，但偶联至大标志物时，诸如NT-proBNP和/或BNP的小靶蛋白要求更多的时间以移动至正确的位置来结合捕获部分，并因而结合固体支持物，因为检测部分-靶标复合物的转动自由度在这种情况下是高度受限的。

在这一背景下，本发明人出乎意料地发现，使用诸如多克隆抗体的对相同表位不具有特异性的捕获部分来测定NT-proBNP是非常有利的。使用对相同表位不具有特异性的捕获部分允许标志物/检测部分/靶标复合物的结合，而无论旋转角度是多少，由此促进标志物/检测部分/靶标复合物的结合，所述复合物的转动自由度由于标志物的大尺寸和NT-proBNP的小尺寸而降低。

在一实施方案中，所述分析物包含于样品中。术语“样品”在本文中以广泛的含义使用，并旨在包括大范围的生物学材料以及源自或提取自这样的生物学材料的组合物。优选地，所述分析物包含于体液或组织样品中，并且测量所述样品中的分析物的量。

在一优选实施方案中，可以测量组织、细胞和体液样品中的分析物，即优选体外进行。优选地，测量体液样品中感兴趣的分析物。本发明的组织样品指获得自死或活的人或动物体的任何类型的组织。组织样品可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得，例如通过活组织检查或刮除术。

本发明的体液包括血液、血清、血浆、淋巴、脑液、唾液、粘液、精液、粪便、脊髓液、尿和/或痰或者上述体液的任何部分。

特别地，体液是选自血液、血清、血浆、尿、唾液和/或痰中的至少一种。体液样品可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得。示例性样品包括全血、红细胞、白细胞、血棕黄层(buffy coat)、毛发、指甲和角质层材料、拭子(包括但不限于口腔拭子、喉咙拭子、阴道拭子、尿道拭子、宫颈拭子、直肠拭子、病灶拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子、鼻拭子等)、淋巴液、羊水、脑脊液、腹膜积液、胸腔积液、囊肿液体、滑液、玻璃体液、房水、粘液囊液体、洗眼水、眼抽吸物、血浆、血清、肺灌洗物、肺抽吸物、身体任何组织的活组织检查材料。本领域技术人员应当理解，获得自上述示例性样品的裂解物、提取物或材料也视为样品。组织培养细胞(包括移植材料、原代细胞、次级细胞系等)以及得自任何细胞、组织或器官的裂解物、提取物、上清或材料也在本文所用的术语生物学材料的含义之内。上文所列举的并非是完全的。

在本发明的具体实施方案中，将样品预处理以促进用检测方法检测所述样品。例如，预处理所述样品导致靶标的半分离或分离通常是可理解的。许多方法和试剂盒可以用于预处理各种类型的样品。最优选的样品是血液。

表位特异性检测部分可以是单克隆抗体、亲和力纯化的多克隆抗体、表位特异性适体、表位特异性anticalin、表位特异性凝集素、表位特异性亲和体、表位特异性化学配体或表位特异性肽。最优选的表位特异性检测部分是单克隆抗体。

通过使用全部结合相同表位的检测部分，可以在介质中避免形成复合 物。当使用大颗粒标记时，多于一个检测部分可以结合至一个标记颗粒。在检测部分结合不同表位的情况下，不同的检测部分-标记复合物可以结合多于一个靶标。这可以导致形成最后可能沉淀的大复合物。对相同表位或相同表位的亚区具有特异性的检测部分避免这个问题，因为它们总是结合相同表位。

检测部分可以通过任何合适的方式连接至大颗粒标记。这种连接可以通过任何合适的方法完成，例如共价连接或非共价连接或吸附。本领域技术人员已知的Ademtech方法可以用于将磁性标记连接至表位特异性检测部分。在该方法中，在EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)的存在下，检测部分如浓度例如为20ug抗体/mg磁性标记的单克隆抗体偶联至25个羧基化的磁性标记。

当靶标为人proBNP或人NT-proBNP时，对相同表位不具有特异性的捕获部分针对至少一个选自SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-12、1-21、5-12、13-27、28-45、39-50、46-60和/或61-76的表位。

优选地，所述表位特异性检测部分针对至少一个选自氨基酸残基1-10、5-12、11-22、13-27、26-32和/或61-76的表位。

特别优选地，使用至少两个表位特异性检测部分，其中一个检测BNP表位，而另一个检测NT pro BNP表位。

在一优选实施方案中，所述固体基底的形状基本上选自珠、条带、载片和/芯片。而且，表面可以是平坦、弯曲、多孔或结构化的，例如当使用光学检测技术时以实现用于增强灵敏度的结构化光学表面。

固体基底可以是传感装置的表面。通常，传感装置的表面是致密、均匀的表面。表面可以是传感器表面，即涉及检测的表面。或者，传感器可以位于附近，例如在传感装置的表面之下，这允许检测接近检测表面的标记。

所述传感装置可以是适合于检测标记的任何传感装置。合适的传感装置可以是非光学传感装置或光学传感装置。非光学传感装置能够检测非光学信号，例如但不限于磁性信号、磁阻和/或霍尔效应。光学传感装置能够检测光学信号，例如反射、吸收、散射、荧光、放射性、化学发光、RAMAN和/或FTIR。

受抑全内反射是发生在这样的情况下的现象：倏逝波延伸穿过分离介质进入更高折射率的材料所占据的区域，能量可以流过边界。这种现象类似于量子力学的隧道或能垒穿越。当以这种方式穿越边界传递时，“全内反射”不再是完全的，因为折射波以损失内反射波的情况下传递。

在实际中，当全反射发生时，光束直射玻璃片。然而，部分光进入玻璃片并产生倏逝场。接近玻璃片的散射标志物导致倏逝场中的光散射，由此可以通过诸如CCD相机的单独装置检测。

本申请人在上述发明中首次公开受抑全内反射技术在诊断测定中的用途。据证实，这种方法提供高灵敏度、短测定时间，并且仅要求小样品体积。这对于要求快速和高灵敏度的现场情况具有优势。

在具体的实施方案中，检测设备能够检测非光学信号，例如声学信号(石英晶体微量天平(QCM)、表面声波(SAW)或体声波(BAW)等)。这样的声学信号可以由诸如脂质体的囊泡、胶束或泡产生。这样的囊泡可以填充有液体、气体、气态前体和/或固体或溶质材料。

取决于要检测的信号的性质，检测表面可以是检测设备的组成部分(传感器表面)或者可以允许检测其表面上标记的存在。

在一实例中，反射性标记如发光或荧光标记包埋于或连接至所用的标记。可以利用辐射源，例如通过允许光学检测这样的标记的聚焦激光束或通过倏逝场激发来激发荧光标记。检测可以以任何合适的方式进行，例如利用共焦检测或利用高NA透镜。荧光标记的使用允许通过利用激发和/或发射波长不同的不同荧光团来多路操作。

光学检测还可以通过表面增强拉曼光谱(SERRS)来完成。SERRS是一种通过将光学标记的分子或物质吸附于诸如银颗粒的胶体标记上来检测分子或物质的超灵敏方法。光学标记为合适的染料分子(例如，罗丹明)，其在胶体颗粒为可控方式时导致等离子体和染料共振。已知，例如磁性标记带有金属包覆存在。如果，靶标如抗原(结合部分，即抗体与之结合)偶联至此类银包覆的磁性标记，同时所述靶标还偶联至合适的染料，则靶标特异性结合部分会导致所述染料连接至所述银包覆的磁性标记。磁驱动会导致形成簇/柱，其会导致染料共振。SERRS可以在倏逝场中驱动至非结合传感器表面后被检测。在这样的情况下，结合部分检测可以在省略洗涤步骤的单 室中完成，因为所述检测是是表面特异性的，并且不被来自的溶液的未结合染料所干扰。在另一实例中，可以使用磁性传感器，例如霍尔传感器、磁阻传感器，如GMR、TMR或AMR传感器。在一具体实例中，磁性传感可以利用这样的事实，特定的频率可以用于施加的AC磁场。在低频方案中，即频率低于100Hz，磁性传感器原件的1/f噪声占主导。1/f噪声由电流的点对点波动引起，并且与频率的逆元(inverse)成比例。在磁阻传感器中，1/f来自自由层的磁性波动。当产生的AC磁场的频率为100Hz或更高时，占主导的1/f噪声与现有技术相比明显降低，从而导致改进的信噪比(SNR)。当AC磁场的频率进一步升高至热白(Nyquist)噪声水平大于1/f噪声水平时，这是有利的。在fc＞＞50kHz的某些区域，GMR传感器的热白噪声占主导。白噪声水平限制了理论上可实现的检测极限。

如上文所述，可以通过本领域已知的任何直接或间接方法来确保检测检测表面上的磁性标记。具体的检测方法基于标记的磁性性质如GMR，或者基于磁性标记的光学性质如用受抑全内反射(FTIR)检测。整合于一次性流动室柱的小型GMR传感器芯片适合于进行本发明的方法，并且可以检测1500μm2芯片表面上3个300nm标记的标记密度。

在另一优选实施方案中，所述固体基底包含至少一种选自胶乳、塑料、金、硅、氮化硅和/或玻璃的材料。

对相同表位不具有特异性的捕获部分可以以任何合适的方式连接至固体支持物。连接可以通过任何合适的方法进行，例如共价连接、或非共价连接或吸附。例如，对相同表位不具有特异性的捕获部分可以通过喷墨印刷、微接触印刷、浸涂(在本体溶液中)和/或滴涂(从纳米或微米滴管)结合至固体支持物。

在本发明的一实施方案中，接合至磁性标记的表位特异性检测部分和结合至传感器表面的对相同表位不具有特异性的捕获部分存在于柱中。由于用于测定的试剂已经存在于该柱中，所以使用者仅需要通过样品如何加入样品流体，其再分散所述试剂和标记以产生预期的缓冲条件。无水试剂优选包含测定以及具有表位特异性检测部分的磁性标记所需的缓冲组分。无水试剂的组分可以分别沉积和干燥于柱的不同位置，或者一起沉积和干燥于相同位置。所述试剂可以通过包括冷冻干燥在内的几种干燥技术来沉 积。冷冻干燥防止形成晶体，并允许所述试剂干燥成无定形的玻璃态，其易于在加入流体时再分散。所述柱优选地适合于检测大颗粒标记。最优选地，所述柱适合于光学检测磁性标记。

在本发明的另一实施方案中，本发明提供用于检测样品中的分析物的方法，其中使用本发明的免疫测定。

优选地，可检测标志物用光学或非光学检测方法来检测。在另一优选实施方案中，可检测标志物用至少一种选自抑全内反射(FTIR)、发光测量、荧光测量、吸光度测量、重量测量和/或玻璃放射性测量的方法来检测。

而且，优选地，可检测标志物为磁性标志物，和/或可检测标志物用FTIR检测。

在本发明所述方法的具体实施方案中，靶标-结合部分相互作用的优化通过磁驱动来实现，在测定期间施加朝向检测表面的磁场和/或向携带表位特异性检测部分的磁性标记使用脉冲磁驱动力以确保与检测表面接触的优化。磁性标记可以以不同方式操作来优化与固定结合部分的接触。在具体实施方案中，测定中的磁驱动通过以下步骤进行。

在第一步骤中，在“收集”步骤中，使具有表位特异性检测部分的标记快速吸引(attract)至传感器表面。这通过施用传感器表面的方向的磁场来确保。在具体实施方案中，磁场确保磁性标记到达传感器表面，例如在表面上至少达到50％、75％或90％的单层形成，优选100％的单层形成。在第二步骤中，除去磁力，并允许标记以基本上不受阻碍的移动和转到自由度沿表面移动。在一定的时间后发生扩散，并且在具体实施方案中，再次施用第一步骤的定向磁场。这些步骤可以重复几次以确保具有结合至表位特异性检测部分的靶标的磁性标记结合至检测表面上的非表位特异性检测部分。通过交替开/关磁场获得脉冲驱动。

在本文所述的磁驱动条件的替代实施方案中，检测表面的转动和移动不仅是在不存在磁场的条件下的被动扩散的结果，而且是通过施加确保磁性标记沿检测表面移动的一个或多个磁场的主动保证。

在具体实施方案中，允许磁性标记沿检测表面移动的磁力通过所述标记的脉冲驱动来确保。这可以涉及，例如交替垂直于检测表面或平行于检测表面的磁场的方向，或者具有不同朝向的不同磁场的组合。每个脉冲的 时间和持续时间基于标记大小来设计，以最佳地允许所述标记沿结合表面以其轴进行至少一次完整的转动。在具体实施方式中，驱动力主要垂直于表面，因为与传感器表面平行的强力可以特异性地除去结合的磁性标记。

在本文所述的方法中，任选地在磁性标记与检测表面通过磁驱动接触后，施用使所述标记远离所述检测表面的磁力以确保除去未结合的标记。通过这种方式，不再需要额外的除去磁性标记的洗涤步骤。

据发现，涉及磁性标记在检测表面上移动和转动的交替脉冲驱动的方法比仅涉及将标记吸引至检测表面的恒定磁力的方法明显更有效。脉冲驱动还降低标记不可逆地聚集的可能性，因为标记互相接触的时间也减少了。

优选的驱动方案由约1分钟的样品与柱和磁性标记的温育，然后约4分钟的脉冲驱动和约10秒的通过顶部线圈除去标记组成。

免疫测定可以通过任何合适的测定形式进行。例如，免疫测定可以作为夹心测定、竞争性免疫测定或者作为抑制测定的方式进行。

所述测定还可以作为竞争性测定形式进行，其中肽或蛋白最主要的同种型与固定于大颗粒标记上的所述肽或蛋白的同源物竞争固体支持物上的多克隆结合位点。当将NT-proBNP用作靶标时，NT-pro BNP与固定于大颗粒标记上的NT-pro BNP同源物竞争固体支持物上的多克隆结合位点。

在一优选实施方案中，所述测定以一步形式进行，其包括以下步骤：

a)向疑似包含分析物的样品加入缀合至检测部分的磁性颗粒；

b)将所述样品与颗粒暴露于包含捕获部分的传感器表面；和

c)允许形成检测部分、分析物和捕获部分的复合物；

d)除去未结合的颗粒；以及

e)检测结合的检测部分的数目。

在另一方面，本发明提供一种检测样品中的分析物的方法，其中使用本发明的免疫测定。合适的分析物的水平或浓度可以表示疾病状况、疾病或并发症的存在或不存在，因而允许诊断和/或监测所述疾病状况、疾病或并发症。具体地，所述方法用于诊断和/或监测心力衰竭。

测定时间可以≤5分钟。样品体积可以≤30μL，例如≥1μL至≤30μL。

用于这些目的的标记或标志物为上文所述的标记。优选地，所述标志物为磁性标记。然而，这些磁性标记的具有较大的大小，优选在≥50nm且 ≤5000nm的范围内。

而且，本发明提供一种能够根据本发明的方法检测样品中的分析物的生物传感器装置。这样的生物传感器最优地适合于移动使用，例如手持装置，并允许快速检测仅为小浓度的分析物。

在另一方面，本发明提供一种适合于检测分析物的试剂盒，其包括

a)结合至固体基底的对相同表位不具有特异性的捕获部分，以及

b)结合至可检测标志物的表位特异性检测部分；

其中所述表位特异性检测部分所结合的可检测标志物为大颗粒标志物，其具有≥50nm且≤5000nm的颗粒大小。

应当理解，关于本发明的免疫测定所列的优选实施方案也适用于上文所述的试剂盒。

附图说明

参照下文所述的实施方案的描述，本发明的这些和其他方面会更加明显。

在附图中：

图1示出本发明的免疫测定10的原理。所述测定包括捕获部分，其包含至少两个部分11、12，其对分析物13的相同表位不具有特异性。所述捕获部分结合至固体基底14。所述测定还包括至少一个表位特异性检测部分15，其结合至可检测标志物16。所述两个部分11、12对分析物的相同表位不具有特异性，但是属于相同的多克隆抗体。所述表位特异性检测部分为单克隆抗体。

表位特异性检测部分15所结合的可检测标志物16为大颗粒标志物，其颗粒大小为≥50nm且≤5000nm。其可以是光学或非光学标志物，例如光散射标志物。而且，所述标志物可以充当操控物质，例如如果其具有磁性特性。如虚线箭头所示，由于标志物的大尺寸，标志物/检测部分/分析物复合物具有有限的转动自由度。然而，这使得可以使用对相同表位不具有特异性的捕获部分，所述捕获部分包含至少两个部分11、12，其对分析物13的相同表位不具有特异性。因此，标志物/检测部分/靶标复合物可以结合基底，即使其不具有相对于所述基底固定的转动角度。这增加了测定的速度 和灵敏度，并使得其可用于这样的应用，其中

a)使用大标志物(如光散射标志物)

b)检测小分析物(如NT-proBNP或BNP)

c)分析要快速进行(紧急装置，特别是手持装置所要求)，以及

d)分析物仅少量存在(pg/ml-ng/ml级别，对于NT-proBNP和BNP正是如此)。

图2示出存在于现有技术的免疫测定中的问题。其中，免疫测定20仅包含一种类型的表位特异性捕获部分21，即对分析物22的表位具有特异性的单克隆抗体。单克隆抗体21结合至固体基底23。所述测定还包括至少一个表位特异性检测部分24，其结合至可检测标志物25。复合物仅能结合表位特异性捕获部分21，如其具有正确的转动角度(见图2的左边部分)。由于标志物的大尺寸，标志物/检测部分/分析物复合物具有有限的转动自由度。因此，在标志物/检测部分/分析物复合物的转动角度不正确的情况下，所述复合物无法结合至固体基底23。这降低所述测定的速度和灵敏度，特别是满足上文所述的条件a)-d)中的至少一个的情况下。

图3示出根据本发明的优选实施方案的磁性方法的示意图。在这种情况下，标志物/检测部分/分析物复合物具有磁性性质，这是由于标志物是磁性的(其双重地充当标志物和处理物质)，或者向所述复合物加入磁性物质。

在步骤a)中，标志物/检测部分/分析物复合物31通过磁驱动器33所施加的磁场被吸引至固体基底32。而且，不携带分析物的标志物/检测部分34被吸引至固体基底及其所结合的标志物/检测部分35，例如通过非特异性结合不同的靶标。固体基底具有捕获部分，所述捕获部分包含至少两个部分36、37，其对标志物/检测部分/分析物复合物31中结合的分析物的相同表位不具有特异性。

在步骤b)中，标志物/检测部分/靶标复合物31结合至部分36、37，即使它们具有相对于基底不同的旋转角度。自由标志物/检测部分34和具有结合的不同靶标的标志物/检测部分35也由于磁力而结合至固体基底。

在步骤c)中，反向磁性驱动器的磁场，从而排斥所有未特异性结合固体基底的所有磁性物质。因此，自由标志物/检测部分34和具有结合的不同靶标的标志物/检测部分35被释放，而特异性结合至基底的标志物/检测 部分/靶标复合物31则被保留，并且可以例如通过FTIR技术来检测。

图4a示出每个标志物41可以携带多于一个表位特异性检测部分42，如单克隆抗体。这可以导致携带多于一个分析物43的标志物/检测部分/分析物复合物。

图4b示出如果标志物44携带多于一个检测部分所发生的情况，其中每个部分45、46、47结合分析物的不同表位，如多克隆抗体。如虚线箭头所示，这可以导致形成大复合物，其随后沉淀。因此，在本发明中优选使用表位特异性检测部分，如单克隆抗体。

图5示出利用针对NT-pro BNP的表位1-21的绵羊多克隆NT-pro BNP抗体作为捕获部分的NT-pro BNP的剂量应答曲线。根据本发明的定义，所述捕获部分对相同表位不具有特异性，因为它们结合给定靶标的相同表位的不同亚区。测量用受抑全内反射技术进行。进一步细节参见实验部分。由此可见，所述方法的速度和灵敏度是优异的。4分钟的脉冲磁驱动和10s的磁性标志物除去的温育步骤后，可以检测NT-pro BNP纳克分数浓度。

具体实施方式

尽管在附图和上述描述中示例和描述了本发明，但是这样的示例和描述应当视为描述性或示例性，而非限制性的。本发明并不限于公开的实施方案。

根据附图、公开以及所附权利要求书的研究，本领域技术人员在实施本发明中应当理解和完成公开的实施方案的其他变体。在权利要求书中，词语“包含”不排除其他元素或步骤，并且不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”不排除复数。互相不同的从属权利要求中所用的某些度量并不表示这些度量的组合不是有利的。权利要求书中任何参考符号不应当理解为限制本发明的范围。

实施例

实施例1利用磁性标记检测NT-proBNP

1.材料

●针对NT-proBNP的表位1-21的多克隆NT-proBNP抗体

●NT-pro BNP标准品(Hytest 8NT1)

●用15C4Hytest MAb抗体包覆的500nm磁性颗粒

2.方法

针对表位1-21的多克隆NT-pro BNP绵羊抗体是多克隆抗体，其以PBS中的150ug/mL抗体的浓度喷墨印刷于聚合物生物芯片的表面。将覆盖有用40ug 15C4Hytest MAb抗体/mg磁性颗粒的溶液官能化的Ademtech SA的颗粒涂层的直径为500nm的氧化铁颗粒稀释于测定缓冲液。将NT-pro BNP标准品(Hytest 8NT1)稀释于测定缓冲液。将磁性标记和NT-pro BNP溶液以1∶1稀释，并将1μL暴露于传感器表面。测量用受抑全内反射技术进行。

传感器表面的磁性纳米颗粒用倏逝场检测，所述倏逝场通过LED光的校准束产生，其波长为625nm，入射角相对于正常为70°，即相对于传感器表面20°的角度。反射光通过成像透镜(f＝7.5mm，Anteryon)到CCD相机上(Marlin F080B/C，Allied Vision Technologies)。根据纳米颗粒对传感器表面的结合来计算每个点的信号，对20像素x 20像素的面积平均。在纳米颗粒的结合之前，通过将反射光强度与测量的光强度相关联来测定信号。

使用的驱动方法由4分钟的脉冲驱动和10s的通过顶部线圈除去标记组成。在插入柱中之前将溶液温育30s以允许颗粒结合cTnI分子。将约10μL的流体插入柱中后，颗粒被吸引至传感器表面达225s，同时将磁场交替改变(3·10⁴A/m)。这导致包含NT pro BNP的颗粒结合至包含抗NT proBNP抗体的表面。在最后的步骤中，关闭底部的磁体，并打开上方的磁体(2·10⁴A/m)以将未结合的颗粒离开传感器表面。总测定时间为约5分钟。结果示于图1中。

Claims (12)

1.一种用于检测样品中的分析物人NT-proBNP和人BNP的免疫测定试剂盒，其包括：

a)结合至固体基底的捕获部分，所述捕获部分是结合给定靶标的不同表位或者结合给定靶标的相同表位的不同亚区的至少两个部分的集合，以及

b)结合至可检测标志物的至少一个表位特异性检测部分；

并且其中所述表位特异性检测部分所结合的可检测标志物为大颗粒标志物，具有≥50nm且≤5000nm的颗粒大小；

其中一种捕获部分针对至少一个选自NT-proBNP的氨基酸残基1-21、39-50和46-60的表位，并且另一种捕获部分针对BNP的表位。

2.权利要求1所述的免疫测定试剂盒，其中所述表位特异性检测部分所结合的可检测标志物为光学或非光学标志物。

3.权利要求1或2所述的免疫测定试剂盒，其中所述可检测标志物作为操控物质而起双重作用。

4.权利要求1所述的免疫测定试剂盒，其中所述分析物为肽或蛋白，其具有

a)≥20且≤180个氨基酸残基，和/或

b)≥2且≤17kDa的分子量。

5.权利要求1所述的免疫测定试剂盒，其中所述样品为体液或组织样品。

6.权利要求1所述的免疫测定试剂盒，其中所述表位特异性检测部分为单克隆抗体。

7.权利要求1所述的免疫测定试剂盒，其中所述捕获部分为多克隆抗体。

8.权利要求1所述的免疫测定试剂盒，其中所述固体基底的形状基本上选自珠、条带、载片和/芯片。

9.权利要求1所述的免疫测定试剂盒，其中所述固体基底包含至少一种选自胶乳、塑料、金、硅、氮化硅和/或玻璃的材料

10.一种用于检测样品中的分析物的方法，其中使用前述权利要求中任一项所述的免疫测定试剂盒。

11.权利要求10所述的方法，其中所述可检测标志物用光学或非光学检测方法来检测。

12.权利要求11所述的方法，其中

a)所述可检测标志物为磁性标志物，和/或

b)所述可检测标志物用FTIR来检测。