CN102533765A - 一种ERα36敲低PC12细胞株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ERα36敲低PC12细胞株的建立方法。具体是通过应用shRNA技术，利用ERα36-shRNA转染PC12细胞，建立ERα36敲低PC12细胞株。应用免疫细胞荧光、免疫细胞化学和Western blot技术检测细胞株中ERα36，证明细胞株建立成功。并测定细胞生长曲线和倍增时间。ERα36敲低PC12细胞株的建立为研究ERα36在中枢神经系统中作用提供了有力的实验材料。

Description

一种ERα36敲低PC12细胞株及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种ERα36敲低PC12细胞株及其构建方法。 

背景技术

雌激素(estrogen，E)在生物体内具有广泛的生物学活性，不但对众多靶组织如生殖道、乳腺、骨骼及心血管系统有调节作用，还可作用于与认知功能相关的神经回路，参与5-羟色胺、多巴胺、谷氨酸、GABA和乙酰胆碱等神经递质和多种神经肽活动的调节，影响突触可塑性和学习记忆。同时，雌激素在神经细胞的分化和发育、神经元存活和轴突生长的诱导以及新生神经元的形成等诸多过程中也发挥重要作用。阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种严重威胁老年人身体健康的神经退行性疾病。已知雌激素替代疗法能够改善脑功能的退化，降低绝经期后女性AD发病率，而生理水平的雌激素可减少伴随AD产生的神经毒性蛋白。雌激素替代(HT)能改善绝经期后女性学习记忆等脑功能，但同时又具有诱发子宫内膜癌和乳腺癌的封信啊。雌激素拮抗剂可作为乳腺癌术后复发防止药物，但同时也可减弱患者的记忆功能。 

雌激素受体(estrogen receptor，ER)是类固醇激素受体超家族的成员之一，能够与雌激素特异性结合，通过基因组作用模式调控靶基因的转录或激活细胞内信号，改变胞内蛋白功能和调控基因表达。雌激素受体主要分为ERα和ERβ两种类型。近年来，随着研究的不断深入，又陆续发现新的ERα受体亚型。目前，ERα分为ERα66、ERα46、ERα36三种亚型。其中，ERα36是由Wang等在2005年克隆并鉴定出的一种新型雌激素α受体。研究发现，在乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌等组织中，均有ERα36的表达，并参与肿瘤细胞的生长、增殖、分化等病理过程。但ERα36在神经系统中的表达及其功能还未见报道。 

shRNA是short hairpin RNA的缩写。翻译为“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由pol III启动子控制。随后在连上5～6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。在活体中输送“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(shRNA)，并被RNAi通道处理。 

PC12细胞株(pheochromocytoma cell line，PC12)源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株，神经嵴源性，有较典型的神经内分泌细胞特性，胞膜上有胆碱能M和N受体等，常作为多巴胺能神经元的细胞模型。通常，它们在含血清的培养基中可增殖，呈现未分化状态，而在加入NGF后细胞分化为交感神经元的形态。同时研究还发现，神经元样的PC12细 胞可以发生增殖，因此，常被用作研究神经细胞分化的体外细胞模型。 

目前对于ERα36的研究主要集中在乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌等组织或细胞中，对于其在神经系统中的表达及功能的研究还未见报道。雌激素的这种诱发乳腺癌和神经保护的双刃剑作用是否可以通过ERα36来调节，还值得我们进一步研究。因此，我们利用ERα36-shRNA转染PC12细胞建立ERα36敲低的PC12细胞模型，为探讨ERα36在中枢神经系统中的作用提供可行的细胞材料。 

发明内容

本发明为ERα36敲低的PC12细胞系的建立，通过应用siRNA技术，利用ERα36-shRNA转染PC12细胞，建立ERα36敲低的PC12细胞株，再利用免疫细胞荧光、免疫细胞化学和Western blot技术对细胞株进行检测，证明细胞株建立成功。 

本发明通过下述技术方案实现： 

本发明的一方面在于提供一种ERα36敲低PC12细胞株的构建方法，其包括如下步骤： 

(a)构建含有碱基序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的pRNAT-U6.1/Neo重组质粒； 

(b)利用如步骤(a)获得的重组质粒转染宿主细胞PC12得到重组细胞株； 

(c)将步骤(b)所得重组细胞株经过G418筛选培养基培养，每3～5天更换一次筛选培养基，筛选10～14天，获得阳性细胞株；其中，所述的G418筛选培养基为15％新牛血清的RPMI-1640培养基中，加入G418使其终浓度为500ug/mL； 

(d)在15％NCS的RPMI1640培养基中加入G418的终浓度为250μg/mL，在37℃的5％CO₂培养箱中维持筛选，每3～5天更换上述培养基； 

(e)将步骤(d)筛选所得的阳性细胞株利用免疫细胞荧光、Western Blot方法、免疫细胞化学法检测ERα36的表达； 

其检测结果为：与PC12细胞株相比，阳性细胞株中有98％以上的细胞表达绿色荧光蛋白，阳性细胞株中ERα36的表达量为PC12细胞的47％。 

具体的，在上述的构建方法中，步骤(a)所述的构建方法包括如下步骤： 

(f)取SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2两条单链DNA模板等浓度混匀后，经95℃加热10min，室温静置1h，稀释至终浓度10ng/ul； 

(g)用T₄DNA连接酶将步骤(f)所得产物与BamH I和HindIII酶切后的线性化载体pRNAT-U6.1/Neo在22℃连接2h； 

(h)将步骤(g)获得的连接产物转化感受态E.coli DH5α后，经细胞培养、提取质粒、测序鉴定结果如SEQ ID NO：3。 

本发明的另外一方面在于：通过上述的构建方法所获得的ERα36敲低PC12细胞株。 

ERα36敲低的PC12细胞系的建立，为研究ERα36在中枢神经系统中作用提供了有力的实验材料。 

附图说明

图1：ERα36-shRNA表达载体的构建示意图； 

图2：pRNAT-U6.1/Neo质粒DNA的酶切鉴定；其中，HindIII代表HindIII marker，DL2000代表DL2000marker，ShRNA代表经过双酶切的ERα36-shRNA质粒； 

图3：为建立ERα36敲低的PC12细胞株；其中，PC12代表PC12细胞株，PC12-36L代表转染了ERα36-shRNA质粒的PC12细胞株，PC12-36C代表转染了pRNAT-U6.1/Neo质粒的PC12细胞株； 

图4：Western blot法对细胞株中ERα36进行检测；其中，PC12代表PC12细胞株，PC12-36L代表转染了ERα36-shRNA质粒的PC12细胞株； 

图5：不同ERα36表达的PC12细胞株的生长曲线图(^*p＜0.05，^**p＜0.01)；其中，PC12代表PC12细胞株，PC12-36L代表转染了ERα36-shRNA质粒的PC12细胞株，PC12-36C代表转染了pRNAT-U6.1/Neo质粒的PC12细胞株。 

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 

pRNAT-U6.1/Neo：购自GenScript，SD1211； 

感受态E.coli DH5α：TaKaRa Code：D9057； 

SOC培养基：SOC培养基组份浓度：20g/L胰蛋白胨(Tryptone)，5g/L酵母膏(Yeast Extract)，0.5g/L NaCl，2.5mM KCl，10mM Mg²⁺，20mM葡萄糖(glucose)，定容至100ml。配制方法：①配制1M的葡萄糖溶液：将18g的葡萄糖溶解在90ml的去离子水中，定容至100ml，用0.22μm滤膜过滤除菌；②向100ml SOB培养基中加入除菌的1M葡萄糖溶液2ml，均匀混合；③4℃保存。 

LB液体培养基：配制每升培养基，在950ml去离子水中加入：胰化蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g；摇动容器直至溶质溶解。用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L。在15psi高压下蒸汽灭菌20min； 

LB固体培养基：配制方法同LB液体培养基，100ml LB液体培养基再加入1.5g琼脂粉； 

普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：天跟生化科技有限公司，DP209-02； 

PC12细胞株：大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，购自上海细胞所； 

6孔培养板：购自美国Corning公司，3516； 

无血清无抗生素的RPMI1640培养基：购自美国Gibco公司，31800022； 

Opti-MEM：购自美国Invitrogen公司，31985-062； 

Lipofectamine 2000转染试剂盒：购自Invitrogen，11668-019； 

新生牛血清(NCS)：购自美国Gibco公司，16010059； 

G418：购自美国Amresco公司，E859； 

胰酶：购自美国Amresco公司，0458-25g； 

兔Streptavidin-HRP试剂盒：购自北京康为世纪生物科技有限公司，CW0118； 

浓缩型DAB试剂盒：购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9031； 

GFP抗体：购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TA-06； 

羊抗兔IgG-HRP：购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ZDR-5209； 

羊抗鼠IgG-HRP：购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ZDR-5210； 

ERα36抗体：由美国Creighton大学医学研究中心王兆一博士馈赠； 

β-actin抗体：购自武汉博士德生物工程有限公司，BM0627。 

实施例1.质粒ERα36-shRNA的获得 

质粒ERα36-shRNA由美国Creighton大学医学研究中心王兆一博士馈赠，它是通过克隆DNA寡核苷酸序列：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的基因，并将其重组于pRNAT-U6.1/Neo载体，从而构建成的特异性的ERα36-shRNA。 

(1)shRNA序列、DNA模板的合成：对应ERα36基因的shRNA DNA模板为：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2并人工合成序列。 

(2)构建ERα36-shRNA表达载体 

ERα36-shRNA表达载体的构建示意图，如图1。取SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2两条单链DNA模板各1ug/ul，混匀，95℃加热10min，室温静置1h，稀释至终浓度10ng/ul待用，用T₄DNA连接酶与BamH I和HindIII酶切后的线性化载体pRNAT-U6.1/Neo在22℃连接2h；获得连接产物。 

连接反应体系含有： 

(3)转化 

取步骤(2)的5ul连接产物，转化100uL感受态E.coli DH5α，缓慢混匀，冰浴30min，42℃水浴90秒，冰浴2min，加入900ul的SOC培养基，37℃下150转/min摇床培养1h；收集菌液，分100ul和900ul涂布加入100ug/ml Amp的LB固体培养基，37℃过夜培养。 

(4)鉴定 

挑斑点最大的两个单菌落，接种到50ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)中，37℃振荡培养约12h，至对数生长后期。 

收集过夜培养的菌种，按照质粒提取试剂盒说明书(上海莱枫生物科技有限公司，商品货号：DK302-01)提取质粒DNA；将提取的质粒溶于20μl TE缓冲液(pH8.0)中，-20℃储存。用紫外分光光度计检测其浓度，浓度为2μg/μl。 

将提取的质粒DNA，取1μg进行酶切鉴定： 

酶切鉴定反应体系如下，反应温度：37℃，反应时间：2h；获得酶切产物。 

取酶切产物10μl，用1％凝胶电泳鉴定酶切后产物，结果如图2，得到分子量6500bp左右和100bp左右，将100bp片段切下，利用天跟生化科技有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将DNA回收，送去大连宝生物公司测序，测序结果如SEQ ID NO：3与质粒设计图谱相吻合，证明最终获得阳性质粒，将其命名为质粒ERα36-shRNA。 

实施例2.质粒ERα36-shRNA转染PC12细胞 

(1)转染前： 

于6孔板中接种细胞浓度为6×10⁵个/mL的PC12细胞，每孔2mL，放于37℃的5％CO₂培养箱培养，24h后细胞贴壁浓度达到90％进行转染； 

(2)转染过程：转染方法见Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)说明书。 

(a)将20μL的Lipofectmine 2000加入到250μL的Opti-MEM中，轻轻混匀，室温静置5min； 

(b)将2μL浓度为2μ/μL的ERα36-shRNA质粒与250μL的Opti-MEM轻轻混匀； 

(c)再将步骤(a)和(b)所得的混合液混匀，室温静置20min； 

(d)将步骤(1)的6孔板中的培养基换成无血清无抗生素的RPMI1640培养基，每孔2mL； 

(e)向步骤(d)的6孔板每孔中加入500μL步骤(c)所得的混合转染液，前后振荡混匀； 

(f)将6孔板放于37℃的5％CO₂培养箱，培养4小时后，将培养基更换为加有15％NCS的RPMI1640培养基2ml，继续在37℃的5％CO₂培养箱培养48h。荧光显微镜下观察GFP表达。 

向PC12细胞中转染空质粒的步骤同转染过程(a)到(f)，区别在于步骤(b)所述质粒以pRNAT-U6.1/Neo代替ERα36-shRNA，将获得的阳性细胞株命名为PC12-36C。 

实施例3.阳性细胞株的筛选 

(1)向步骤(f)的6孔板每孔中加入终浓度500μg/mL的G418，进行阳性细胞株的筛选，每3～5天更换含终浓度500μg/mLG418和15％新生牛血清(NCS)的RPMI1640的筛选培养基，在37℃的5％CO₂培养箱中培养10～14天； 

(2)挑取单克隆继续在37℃的5％CO₂培养箱中培养3～4周；将获得的阳性细胞株命名为PC12-36L； 

(3)在15％NCS的RPMI1640培养基中加入G418的终浓度为250μg/mL，在37℃的5％CO₂培养箱中维持筛选，每3～5天更换上述培养基； 

实施例4.阳性细胞株的检测 

1.免疫细胞荧光对细胞株中ERα36进行检测 

细胞荧光检测：由于转染的质粒中带有绿色荧光蛋白(GFP)基因，转染成功后即可以在荧光显微镜下观察到GFP。 

荧光显微镜下观察PC12细胞、以及分别经pRNAT-U6.1/Neo质粒、ERα36-shRNA质粒转染的PC12细胞的情况，从图3中可见，图3(A)为PC12细胞，即对照组细胞没有转染质粒，因此没有GFP表达；图3(B)为成功转染了空质粒载体pRNAT-U6.1/Neo的PC12细胞，发现转染的细胞株中有GFP表达，荧光显微镜下呈现绿色荧光；图3(C)为转染ERα36-shRNA质粒的PC12细胞，发现细胞株中有GFP表达，荧光显微镜下呈现绿色荧光，证明转染成功。 

2.免疫细胞化学对细胞株中ERα36进行检测 

接种对数生长期细胞(5x10⁴个/mL)于六孔板中，每孔2ml，细胞贴壁48h。4％多聚甲醛固定爬片细胞，2～24h内即可实验。用1xPBST(T：曲拉通-100)漂洗爬片细胞3次，每次5min。PBS浸泡5min。按兔Streptavidin-HRP试剂盒说明书操作，滴加兔Streptavidin-HRP试剂盒中的试剂1，内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10min。PBS充分淋洗。滴加兔Streptavidin-HRP试剂盒中的试剂2，正常羊血清封闭液，室温孵育10min。倾去封闭液，直接滴加一抗ERα36(1∶ 100)，湿盒37℃孵育2h。PBS充分淋洗。滴加兔Streptavidin-HRP试剂盒中的试剂3，生物素标记羊抗兔二抗工作液，室温孵育10min。PBS充分淋洗。滴加兔Streptavidin-HRP试剂盒中的试剂4，HRP标记的链霉亲和素，室温孵育10min。PBS充分淋洗。滴加DAB显色工作液，显色10min，自来水冲洗浮色。在避光处照相。 

利用免疫细胞化学检测发现细胞呈免疫阳性反应并且有免疫阳性颗粒说明转染成功，免疫组化检测转染后PC12细胞中ERα36的表达，图3(D)为PC12细胞对照组，细胞中观察到免疫阳性颗粒，证明存在ERα36表达；图3(E)为PC12细胞空质粒载体，与对照组相比免疫阳性颗粒没有明显变化，证明转染空质粒载体对ERα36表达没有影响；图3(F)为PC12细胞转染质粒ERα36-shRNA，发现ERα36敲低后表达量明显减少。 

3.Western blot技术对细胞株中ERα36进行检测 

利用Western blot检测发现有蛋白印迹的条带，即为细胞株中存在ERα36表达，蛋白印迹的条带变淡即为ERα36敲低成功。 

不同组细胞分别用PBS冲洗两次，加入细胞裂解液(1×10⁷个细胞/500μL)，得到细胞全蛋白，采用Bradford法测定全细胞蛋白质的浓度。10％SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加入相应一抗：ERα36(ERα36抗体0.33μL加入到PBS-Tween-20溶液2mL中)、β-actin(β-actin抗体2μL加入到PBST溶液2mL中)4℃孵育过夜，室温PBST洗膜，与对应的辣根过氧化物酶标记的二抗：检测ERα36需加羊抗兔IgG-HRP(羊抗兔IgG-HRP 0.6μL加入到PBST溶液6mL中)、检测β-actin需加羊抗鼠IgG-HRP(羊抗鼠IgG-HRP0.6μL加入到PBST溶液6mL中)室温孵育2h，PBST洗膜，ECL显色，进行X光胶片感光，冲洗胶片。扫描仪和凝胶成像系统记录相应条带的透色光积分吸光度值。 

图4为Western blot检测转染后PC12细胞中ERα36的表达，图4(A)为PC12细胞对照组，图4(B)为PC12细胞转染质粒ERα36-shRNA，转染组细胞中ERα36的表达都明显低于对照组，ERα36的表达量为母细胞的47％。图4(C、D)为两种细胞的β-actin，证明两种细胞全蛋白加样量一致。提示，ERα36敲低的PC12细胞株PC12-36L建立成功，可以用于其他实验研究。 

4.不同ERα36表达的PC12细胞株的生长曲线图 

接种对数生长期细胞1×1⁰4个/mL于24孔细胞培养板中，利用RPMI1640+15％NCS培养基在37℃的5％CO₂培养箱中培养，每天对细胞进行计数，每次三个平行孔。每次先弃去培养基，用PBS缓冲液，以500μL/孔的量清洗细胞，再用500μL/孔的胰酶消化细胞，利用血球计数板对细胞进行计数，绘制生长曲线，如图5。 

PC12-36C细胞与PC12细胞的生长曲线十分接近，并无特别明显的增殖加快的迹象，而 PC12-36L细胞的生长曲线明显区别于PC12细胞，增殖速度加快。 

5.不同ERα36表达的PC12细胞倍增时间的比较 

对通过上述方法测得的细胞数量和绘制的细胞生长曲线进行计算，利用倍增时间公式：T_d＝T×lg2/lg(N/N₀)计算，其中T_d为倍增时间，T为所取的对数生长期的天数，N₀为对数生长期首天的细胞数，N为对数生长期末天的细胞数。 

表1不同ERα36表达的PC12细胞倍增时间的比较 

注：^*p＜0.05。 

通过表1中倍增时间的比较可以发现，PC12-36C细胞的倍增时间为18.24h±0.41，与PC12细胞倍增时间接近，且不具有显著性差异，而PC12-36L细胞的倍增时间为12.56h±0.55，相对于PC12细胞来说，倍增时间明显缩短，细胞增殖速度明显加快，且具有显著性差异。 

当利用免疫细胞荧光检测发现细胞呈现绿色荧光反应说明转染成功，利用免疫细胞化学检测发现细胞呈免疫阳性反应并且有免疫阳性颗粒说明转染成功，利用Western blot检测发现有蛋白印迹的阳性条带，即细胞株中存在ERα36的表达，当免疫阳性颗粒减少、蛋白印迹的条带变淡即为ERα36敲低成功。 

申请人构建的ERα36敲低的即PC12-36L细胞，98％以上的细胞表达绿色荧光蛋白，经shRNA技术敲低了内源性的ERα36表达量53％，即ERα36的量仅为母细胞PC12细胞的47％。与母细胞PC12细胞相比，细胞生长缓慢，倍增时间延长。提示敲低ERα36的表达可以对PC12细胞的增殖产生一定影响，其应用方向： 

(1)研究ERα36对神经细胞生物学行为的影响及其机制：能够用于观察ERα36敲低后，细胞的生长状况及其功能的改变，探讨ERα36在神经细胞的生长、增殖、分化中的作用及其机理。 

(2)研究ERα36在各种神经细胞模型中的作用：可以作为细胞模型，以其母细胞PC12作为对照，分别加入MPP⁺、Aβ，或造成血清营养剥夺模型、氧糖缺乏模型，探讨ERα36在这些细胞模型中的作用及其机制。 

(3)研究雌激素在ERα36介导的信号通路中的作用：探讨ERα36敲低后，在各种细胞模型中加入不同浓度雌激素，观察ERα36敲低后的PC12细胞模型对雌激素的应答模式，及ERα36介导的雌激素信号通路的变化，并寻找潜在的药物靶点。 

Claims (3)

1.一种ERα36敲低PC12细胞株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

(a)构建含有碱基序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的pRNAT-U6.1/Neo重组质粒；

(b)利用如步骤(a)获得的重组质粒转染宿主细胞PC12得到重组细胞株；

(c)将步骤(b)所得重组细胞株经过G418筛选培养基培养，每3～5天更换一次筛选培养基，筛选10～14天，获得阳性细胞株；其中，所述的G418筛选培养基为15％新牛血清的RPMI-1640培养基中，加入G418使其终浓度为500ug/mL；

(d)在15％NCS的RPMI1640培养基中加入G418的终浓度为250μg/mL，在37℃的5％CO₂培养箱中维持筛选，每3～5天更换上述培养基；

(e)将步骤(d)筛选所得的阳性细胞株利用免疫细胞荧光、Western Blot方法、免疫细胞化学法检测ERα36的表达；

其检测结果为：与PC12细胞株相比，阳性细胞株中有98％以上的细胞表达绿色荧光蛋白，阳性细胞株中ERα36的表达量为PC12细胞的47％。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(a)所述的构建方法包括如下步骤：

(f)取SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2两条单链DNA模板等浓度混匀后，经95℃加热10min，室温静置1h，稀释至终浓度10ng/ul；

(g)用T₄DNA连接酶将步骤(f)所得产物与BamH I和HindIII酶切后的线性化载体pRNAT-U6.1/Neo在22℃连接2h；

(h)将步骤(g)获得的连接产物转化感受态E.coli DH5α后，经细胞培养、提取质粒、测序鉴定结果如SEQ ID NO：3。

3.如权利要求1或2所述的构建方法所获得的ERα36敲低PC12细胞株。

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