CN102533632B

CN102533632B - 一种用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面及制备方法

Info

Publication number: CN102533632B
Application number: CN201210014176.3A
Authority: CN
Inventors: 任辉; 董友玉; 秦炜; 韩蓝青; 张曙光
Original assignee: BEAVER NANO-TECHNOLOGIES Co Ltd
Current assignee: Suzhou beaver Biomedical Engineering Co., Ltd.
Priority date: 2012-01-17
Filing date: 2012-01-17
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2032-01-17
Also published as: CN102533632A

Abstract

本发明公开了一种用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面及其制备方法，该多肽生物纳米表面由以下步骤制备得到：通过等离子体预先处理细胞培养表面，接着将细胞培养表面暴露在空气或氧气中，再将多肽溶液铺展在细胞培养表面上，然后置于紫外光下照射，得到用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面。本发明所得到的多肽生物纳米表面稳定，可在常温下长时间储存，接枝表面接枝成分明确，可以替代市面上常规的各种蛋白的包被表面，使细胞在无血清条件下实现良好的贴壁和增殖；与各种动物来源的蛋白包被表面相比，短肽具有无异源性或弱异源性的特点，因此该化学合成多肽接枝表面大大降低了临床的应用风险，从而为后续的临床应用打下了坚实的基础。

Description

一种用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面及制备方法

技术领域

本发明属于细胞培养表面处理技术领域，具体涉及一种用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面及其制备方法。

背景技术

随着现代科学的不断发展，尤其是生物医学的快速进步，细胞培养成为很多研究及应用领域中十分重要的基础性工作。

一直以来，人们普遍采用聚苯乙烯材质的培养板或培养瓶作为细胞培养的工具。聚苯乙烯是一种无色透明的热塑性塑料，通常为无毒、无臭、无色的透明颗粒，似玻璃状脆性材料，通式是[(CH₂CHC₆H₅)_n]，英文名称为Polystyrene，简称PS。其制品具有优越的抗水、防潮性。在人们的生产生活中，聚苯乙烯的用途十分广泛，作为细胞培养材料便是其中的一大用途。

聚苯乙烯材质的细胞培养表面为非极性，亲水性很差，不利于细胞的贴壁生长。因此，人们在培养细胞之前常常会对培养表面进行改性处理，并由此衍生出生命科学领域中一个新的研究方向——细胞培养表面处理技术。

在过去的研究和应用中，针对细胞贴壁培养采用最多的方法是在培养基中添加血清成分来增强细胞贴壁能力，如间质干细胞(MSC)、肝癌细胞(HepG2)等；然而，这种方法所获得的细胞不能满足临床应用的要求，这主要是因为血清用于细胞培养存在成份不明确、来源复杂及每个批次之间由于个体的不同差异性较大等问题，给细胞培养的试验研究及临床应用增加了较大的风险。此外，在无血清培养体系下增强细胞粘附能力的方法主要有：在培养表面进行生物蛋白包被，如在神经干细胞培养中以层粘连蛋白(Laminin)对培养表面进行包被；或通过一些物理化学的方法对培养表面进行改性，如采用等离子体处理细胞培养表面，引入含氧、氮等元素的基团来改善其表面的亲水性，通过提高亲水性来改善细胞在其表面的贴壁性能；而这些传统的方法也都同样存在一些客观上的不足：首先，用作表面基底包被材料的各种包被蛋白(如Laminin)价格昂贵，对任何相关的课题中有限的经费都是一项严峻的考验，并且这些蛋白一般是动物来源的蛋白，会给人类临床治疗带来一定的风险；其次，而单纯采用等离子体技术的改性处理，在无血清培养条件下细胞贴壁效果并不理想。

此外，目前国内有关无血清细胞培养耗材研发的相关文献较多，但无相关产品推出市场；国外类似的研究性文章也层出不穷，但直到目前为止，只有一家公司推出了细胞无血清培养板，其工艺是将培养板经等离子体处理后，在其表面涂覆一层含有羧基的化学试剂，然后通过羧基经缩合试剂将含有氨基的多肽共价接枝到培养板表面，实现多肽的修饰表面，使所培养的细胞能特异识别并与接枝多肽结合，从而达到促进细胞在无血清条件下贴壁生长目的。然而，采用这种方式在进行培养板表面修饰的过程中，或多或少都会引入一些有机试剂来辅助完成这些特定多肽序列的接枝，而这些有机试剂同样会给后续的细胞培养带来尚未可知的风险。

因此，在细胞培养领域，急需一种使用简便、储存方便、表面成分明确、不引入各种有害试剂、适合细胞无血清培养的细胞培养耗材。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面。首先，该多肽生物纳米表面采用无异源性或弱异源性的人工合成的设计型序列多肽来替代传统的异源蛋白包被表面。与传统的异源蛋白包被表面相比，该多肽包被表面降低了临床应用风险。其次，在该设计型多肽的末端引入双键，并采用UV光照的方法，在不引入其他交联试剂的条件下使该多肽迅速共价接枝到细胞培养表面。再次，引入自组装多肽序列，使自组装后的多肽双键末端接枝到培养板表面，而多肽的功能性末端更好的暴露在培养板表面，从而使得培养板表面的功能性末端更容易与细胞相互作用，提高改性表面对细胞贴壁的促进作用。

本发明的另一目的在于提供上述用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面的制备方法，该方法简单易行，降低了能耗，有利于工业化的连续生产。

本发明的再一目的在于提供上述用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面，是在细胞培养表面接枝了特定多肽；

本发明所述的细胞培养表面是指细胞培养器具(如培养皿、培养板、培养瓶等)在培养细胞时与细胞接触的面；

所述细胞培养的材质为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚甲醛或聚对苯二甲酸乙二醇酯-1，4-环己烷二甲醇酯中的一种；

所述的特定多肽由自组装多肽(RADA)_x和功能多肽组成；所述特定多肽的序列为：(RADA)_x-GGRGDS、(RADA)_x-GGYIGSR、(RADA)_x-GGIKVAV、(RADA)_x-GGPRGDSGYRGDS、(RADA)_x-GGTAGSCLRKFSTM、(RADA)_x-GGFPGERGVEGPGP、(RADA)_x-GGKNRLTTELEVRT、(RADA)_x-GGFHRIKA、(RADA)_x-FFGFFGFFGPFSSTKT、(RADA)_x-FFGFFGFFGGPRGDSGYRGDS、(RADA)_x-FFGFFGFFGGPDSGRPDSGR、(RADA)_x-PPGPPGPPGYRGDS、(RADA)_x-GGPDSGR、(RADA)_x-GGRYVVLPR、(RADA)_x-GGALKRQGRTLYGF、(RADA)_x-GGAASIKVAVSADR、(RADA)_x-GGKAFDITYVRLKF、(RADA)_x-GGRKRLQVQLSIRT、(RADA)_x-GGKKQRFRHRNRKG、(RADA)_x-GGWQPPRARI、(RADA)_x-GGSKPPGTSS或(RADA)_x-GGPFSSTKT中的一种以上，x为1-6；所述特定多肽的自组装多肽(RADA)_x端均连接了CH₂＝CH-CONH-R-基团，基团中的R是y为0～14。

上述用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面的制备方法，是通过等离子体预先处理细胞培养表面，使表面活化产生自由基；然后将细胞培养表面暴露在空气或氧气中，表面会迅速被氧气氧化形成过氧化层；再将自组装多肽溶液铺展在细胞培养表面上，然后置于紫外光下照射，过氧化层及含有双键的多肽会分别分解产生活性接枝位点，多肽即连接到过氧化层上，从而实现将多肽引入到培养板表面的目的，达到利用特殊多肽序列促进细胞在无血清表面贴壁生长的效果。

上述用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将细胞培养表面放入等离子体反应室进行预处理；

(2)将预处理后的培养表面露置于空气或氧气中30s～24h；

(3)将特定多肽溶解于水中形成溶液A；将溶液A均匀地铺展到步骤(2)得到的培养表面形成薄的液面层；

(4)对铺有液面层的培养表面进行UV照射30s～30min；

(5)取出细胞培养表面，清洗，风干，得到用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面。

步骤(1)所述等离子体反应室的工作参数为：功率35～600W，压强1～80Pa，气体流速5～500cc/min，温度25～45℃；

步骤(1)所述等离子体预处理的时间为30s～10min；

步骤(3)所述的溶液A中，多肽的质量体积浓度为0.05～1％；

步骤(3)所述液面层的厚度为0.5mm～1cm；

步骤(4)所述的UV照射，其相关参数是：UV灯管功率300～1000W，照射时间30s～30min，UV灯管与培养表面的距离3～13cm；

步骤(5)所述的清洗是用去离子水超声清洗3次，每次10min。

上述的用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面可以用于细胞无血清培养。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明所制备得到的多肽生物纳米表面，首先利用自组装多肽将含有活性末端的多肽序列进行自组装呈纳米纤维或纳米颗粒，从而提高活性末端多肽序列的接枝效率；其次，利用多肽自带双键和表面过氧化物分解所产生的自由基直接共价接枝，处理工艺简单，能耗低，容易实现工业化生产，并且不引进其他对细胞有害的试剂，提高了处理后细胞培养表面的生物相容性。

(2)本发明所得到的多肽生物纳米表面稳定，可在常温下长时间储存，接枝表面接枝成分明确，可以替代市面上常规的各种蛋白的包被表面，使细胞在无血清条件下实现良好的贴壁和增殖；与各种动物来源的蛋白包被表面相比，该化学合成多肽接枝表面大大降低了临床应用风险，为后续的临床应用打下了坚实的基础。

附图说明

图1是聚苯乙烯培养板表面X射线光电子能谱(简称XPS)的碳谱分析结果图。

图2是聚苯乙烯培养板经等离子体预处理后XPS的碳谱结果图。

图3是实施例1制备得到的聚苯乙烯培养板多肽生物纳米表面XPS的碳谱结果图。

图4是实施例2制备得到的聚苯乙烯培养板多肽生物纳米表面XPS的碳谱结果图。

图5是实施例3制备得到的聚苯乙烯培养板多肽生物纳米表面XPS的碳谱结果图。

图6是聚苯乙烯培养板处理前后XPS的全谱结果图。其中曲线A为未处理前聚苯乙烯表面；曲线B为等离子体预处理后聚苯乙烯表面；曲线C为实施例1处理后的聚苯乙烯表面；曲线D为实施例2处理后的聚苯乙烯表面；曲线E为实施例3处理后的聚苯乙烯表面。

图7是采用实施例1制备得到的聚苯乙烯培养板多肽生物纳米表面培养神经干细胞的效果图。

图8是采用实施例1制备得到的聚苯乙烯培养板多肽生物纳米表面培养的神经干细胞巢蛋白表达水平示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将聚苯乙烯材质的细胞培养表面放入等离子体反应室进行预处理5min；等离子体反应室的工作参数为：功率35～600W，压强1～80Pa，气体流速5～500cc/min，温度25～45℃；

(2)将预处理后的培养表面露置于空气中5min；

(3)按文献(胡春玲，唐尹萍，施婧妮等.鳖甲抗肝纤维化活性多肽的固相合成.医药导报.2011，30(5)：561-562.)方法合成多肽CH₂＝CH-CONH-R-(RADA)₄-GGIKVAV(其中R是y＝0)；

(4)将所合成的多肽溶解于水中形成质量体积浓度为0.5％的溶液A；将溶液A均匀地铺展到步骤(2)得到的培养表面形成厚度为5mm的液面层；

(5)对铺有液面层的培养表面进行UV照射15min；UV照射，其相关参数是：UV灯管功率300～1000W，照射时间30s～30min，UV灯管与培养表面的距离3～13cm；

(6)取出细胞培养表面，用去离子水超声清洗3次，每次10min，自然风干后得到用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面。

对接枝前的聚苯乙烯培养板表面、等离子体预处理后的聚苯乙烯培养板表面和本实施例制备得到的聚苯乙烯培养板多肽生物纳米表面进行X射线光电子能谱分析(简称XPS)，结果如图1、图2、图3和图6所示。由图6可知，接枝前的聚苯乙烯培养板表面(曲线A)经等离子体预处理后引入了大量的氧元素而形成了过氧化的材料表面(曲线B)；经实施例1进一步处理并接枝多肽后的表面C氮元素含量明显增加，而整个处理过程只有多肽中含有氮元素，因此可以确定多肽被引入聚苯乙烯表面。此外，对比图1、2、3可以看出，经过多肽修饰后的表面出现明显的O＝C-NH基团分峰(酰胺键)，进一步证明了多肽序列已成功接枝到聚苯乙烯培养板表面。

实施例2

(1)将聚乙烯材质的细胞培养表面放入等离子体反应室进行预处理10min；等离子体反应室的工作参数为：功率35～600W，压强1～80Pa，气体流速5～500cc/min，温度25～45℃；

(2)将预处理后的培养表面露置于氧气中5min；

(3)按文献(胡春玲，唐尹萍，施婧妮等.鳖甲抗肝纤维化活性多肽的固相合成.医药导报.2011，30(5)：561-562.)方法合成多肽CH₂＝CH-CONH-R-(RADA)₄-GGYIGSR(其中R是y＝14)；并将所合成的多肽溶解于水中形成质量体积浓度为0.05％的溶液A；将溶液A均匀地铺展到步骤(2)得到的培养表面形成厚度为1cm的液面层；

(4)对铺有液面层的培养表面进行UV照射15min；UV照射，其相关参数是：UV灯管功率300～1000W，照射时间30s～30min，UV灯管与培养表面的距离3～13cm；

(5)取出细胞培养表面，用去离子水超声清洗3次，每次10min，自然风干后得到用于细胞无血清培养的多肽生物纳米表面。

对本实施例制备得到的聚苯乙烯培养板多肽生物纳米表面进行XPS分析，结果如图4所示。同实施例1中所分析，图3中经多肽修饰后的培养板表面也出现明显的酰胺键分峰，表明多肽序列已接枝到聚苯乙烯表面；此外，图4中的酰胺键分峰高度略低于图3中酰胺键分峰高度，这是因为实施例1中所使用的接枝多肽浓度大于实施例3，因此提高了多肽在聚苯乙烯表面的接枝量，从而提高了聚苯乙烯表面酰胺键的数量，这一结果进一步验证了该接枝过程的有效性。

实施例3

(2)将预处理后的培养表面露置于氧气中30s；

(3)按文献(胡春玲，唐尹萍，施婧妮等.鳖甲抗肝纤维化活性多肽的固相合成.医药导报.2011，30(5)：561-562.)方法合成多肽CH₂＝CH-CONH-R-(RADA)₄-GGAASIKVAVSADR(其中R是y＝0)；并将所合成多肽溶解于水中形成质量体积浓度为0.5％的溶液A；将溶液A均匀地铺展到步骤(2)得到的培养表面形成厚度为1cm的液面层；

(4)对铺有液面层的培养表面进行UV照射30min；UV照射，其相关参数是：UV灯管功率300～1000W，照射时间30s～30min，UV灯管与培养表面的距离3～13cm；

(5)取出细胞培养表面，用去离子水超声清洗3次，每次10min，自然风干后得到用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面。

对本实施例制备得到的聚苯乙烯培养板多肽生物纳米表面进行XPS分析，结果如图5所示。同实施例1中所分析，图5中经多肽修饰后的培养板表面出现明显的酰胺键分峰，表明多肽序列已接枝到聚苯乙烯表面；此外，图5中的酰胺键分峰高度略高于图3中酰胺键分峰高度，这是因为实施例3所使用的接枝多肽序列长于实施例3，所接枝的每条多肽含有的酰胺键数量增多，因此提高了聚苯乙烯表面酰胺键的数量，这一结果也进一步验证了该接枝过程的有效性。

实施例4

(1)将苯丙烯材质的细胞培养表面放入等离子体反应室进行预处理30s；等离子体反应室的工作参数为：功率35～600W，压强1～80Pa，气体流速5～500cc/min，温度25～45℃；

(2)将预处理后的培养表面露置于空气中24h；

(3)按文献(胡春玲，唐尹萍，施婧妮等.鳖甲抗肝纤维化活性多肽的固相合成.医药导报.2011，30(5)：561-562.)方法合成多肽CH₂＝CH-CONH-R-(RADA)₄-GGIKVAV(其中R是y＝0)和CH₂＝CH-CONH-R-(RADA)₄-GGSKPPGTSS(其中R是y＝0)；将两种多肽溶解于水中形成多肽质量体积浓度为1％的溶液A；将溶液A均匀地铺展到步骤(2)得到的培养表面形成厚度为0.5mm的液面层；

(4)对铺有液面层的培养表面进行UV照射30s；UV照射，其相关参数是：UV灯管功率300～1000W，照射时间30s～30min，UV灯管与培养表面的距离3～13cm；

实施例5

(1)首先将小鼠神经干细胞(C57NSC，该细胞购买于赛业(广州)生物科技有限公司)按常规操作进行复苏，将复苏后的细胞种植到TCT处理的(TCT＝tissue culture treatment)聚苯乙烯培养瓶中，加入适量的神经干细胞完全培养基(购自赛业(广州)生物科技有限公司，产品货号是MUBNF-9011；下同)进行细胞扩增；

(2)细胞扩增至足够量时，吸出细胞及培养基进行离心获得细胞，加入适量胰酶替代物(购自Invitrogen公司，产品货号是12563-011)进行消化，将细胞消化成单个细胞状态，再次离心后去上清，并加入适量的神经干细胞完全培养基重悬，获得细胞悬液，计数并准备接种细胞；

(3)将计数后的细胞按照1×10⁴个细胞/cm²的数量接种到实施例1所制备得到的多肽生物纳米表面在无血清条件下进行神经干细胞的培养，效果如图7所示。

由图7可以看出，无血清条件下的小鼠神经干细胞(C57 NSC，该细胞购买于赛业(广州)生物科技有限公司)在未进行多肽接枝处理的聚苯乙烯表面(TCT＝tissue culture treatment表面)不能贴壁生长，而在laminin包被的表面和实施例1制备得到的细胞培养多肽修饰表面可以很好地贴壁生长；并且在多肽处理表面及laminin包被表面，该细胞均能很好的增殖，达到了以本发明的细胞培养多肽修饰表面替代laminin包被表面的预期目的。

在上述的培养过程中，laminin包被表面及多肽修饰表面神经干细胞贴壁后，经过免疫荧光的方法测得其巢蛋白表达水平如图8所示。由图8可以看出，laminin包被表面及多肽修饰表面神经干细胞巢蛋白分泌水平基本一致，荧光率超过90％，这表明该多肽修饰表面既能实现细胞在无血清条件下地贴壁，又能很好的维持神经干细胞的干细胞特性。

本实施例仅以神经干细胞的无血清培养为例，但本发明的细胞培养多肽修饰表面同样适用于肿瘤细胞、成纤维细胞、间质干细胞、胚胎干细胞等各种细胞的无血清培养。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 一种用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面，其特征在于：是在细胞培养表面接枝特定多肽；

所述特定多肽的序列为 (RADA)_x-GGIKVAV，x为4；所述特定多肽的 (RADA)_x端连接CH₂=CH-CONH-基团。

2.根据权利要求1所述的用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面，其特征在于：所述细胞培养的材质为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚甲醛或聚对苯二甲酸乙二醇酯-1，4-环己烷二甲醇酯中的一种。

3.权利要求1或2所述的用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面的制备方法，其特征在于包括以下步骤：通过等离子体预先处理细胞培养表面，接着将细胞培养表面暴露在空气或氧气中，再将多肽溶液铺展在细胞培养表面上，然后置于紫外光下照射，得到用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面。

4.根据权利要求3所述的用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将细胞培养表面放入等离子体反应室进行预处理；

（2）将预处理后的培养表面露置于空气或氧气中30s～24h；

（3）将特定多肽溶解于水中形成溶液A；将溶液A均匀地铺展到步骤（2）得到的培养表面形成薄的液面层；

（4）对铺有液面层的培养表面进行UV照射30s～30min；

（5）取出细胞培养表面，用去离子水超声清洗3次，每次10min，自然风干后得到用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面。

5.根据权利要求4所述的用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述等离子体反应室的工作参数为：功率35～600W，压强1～80Pa，气体流速5～500cc/min，温度25～45℃。

6.根据权利要求4所述的用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述等离子体预处理的时间为30s～10min。

7.根据权利要求4所述的用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的溶液A中，多肽的质量体积浓度为0.05%～1%。

8.根据权利要求4所述的用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述液面层的厚度为0.5mm～1cm。

9.根据权利要求4所述的用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面的制备方法，其特征在于：

步骤（4）所述的UV照射，其相关参数是：UV灯管功率300～1000W，照射时间30s～30min，UV灯管与培养表面的距离3～13cm；

步骤（5）所述的清洗是用去离子水超声清洗3次，每次10min。

10.权利要求1或2所述的用于无血清细胞培养的多肽生物纳米表面在细胞无血清培养中的应用。