CN102526805A - 神经移植体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种神经移植体的制备方法，其包括：提供一培育层，所述培育层包括一疏水性基底、一碳纳米管膜结构及一蛋白质层，所述碳纳米管膜结构设置在所述疏水性基底的一表面，所述蛋白质层设置在该碳纳米管膜结构远离所述疏水性基底的表面；在该蛋白质层远离所述疏水性基底的表面种植多个神经细胞；以及培育该多个神经细胞直到该多个神经细胞生长出多个神经突起连接在所述多个神经细胞之间形成一神经网络。

Description

神经移植体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种神经移植体的制备方法，尤其是涉及一种可供生物体移植的神经移植体的制备方法。

背景技术

神经系统主要由神经元(neurons)以及神经胶质细胞(neuron glial cells)构成一复杂且特异的沟通网域，用以与其它组织或器官建立连结以进行功能协调。神经系统中，是由神经元来执行接收刺激、通过传导并输出神经递质(neuron transmitter)以进行组织或器官间讯息沟通，而神经胶质细胞则执行神经元物理性支持、营养提供以及调节沟通讯息速度等功能。每一神经元依据型态包含胞体(cell body)与神经突起(neurite)两部分，神经突起自胞体延伸并朝向其它神经元或是其它细胞(例如：肌肉细胞)生长，其中神经突起又分为轴突(axon)与树突(dendrite)两种。一般来说，刺激由树突接收并将冲动传向胞体，冲动经过轴突传导至轴突末端，并释放传导物质来触动其它细胞。

由于神经系统扮演生物体内各组织与器官之间的协调作用，其重要性不言可喻。目前，因神经系统受损而导致的神经缺损是临床常见的致残性疾病。其中，通过植入神经移植体来修复受损的神经系统，是神经外科手术用来修复因各种情况引起的神经系统损伤的一种重要手段。现有的神经移植体通常为“桥接”在神经系统受损部位两端的神经管，该神经管由生物降解材料制成的管状结构。神经系统受损部位一端的神经元沿所述神经管内壁生长出神经突起以到达所述神经系统受损部位的另一端。

通常，需要通过植入所述神经管的方式进行修复的的受损部位的长度较长，而所述神经突起的生长过程非常缓慢，因此，利用所述神经管来修复受损的神经系统所需的修复时间较长。

发明内容

有鉴于此，确有必要提供一种神经移植体的制备方法，由该制备方法制备的神经移植体能够减少受损的神经系统的修复时间。

一种神经移植体的制备方法，其包括：提供一培育层，所述培育层包括一疏水性基底、一碳纳米管膜结构及一蛋白质层，所述碳纳米管膜结构设置在所述疏水性基底的一表面，所述蛋白质层设置在该碳纳米管膜结构远离所述疏水性基底的表面；在该蛋白质层远离所述疏水性基底的表面种植多个神经细胞；以及培育该多个神经细胞直到该多个神经细胞生长出多个神经突起连接在所述多个神经细胞之间形成一神经网络。

一种神经移植体的制备方法，其包括如下步骤：提供一疏水性基底；在该疏水性基底的一表面铺设一碳纳米管膜结构；在该碳纳米管膜结构远离所述疏水性基底的表面形成一蛋白质层从而形成一培育层；在该蛋白质层远离所述疏水性基底的表面种植多个神经细胞；以及培育该多个神经细胞直到该多个神经细胞生长出多个神经突起连接在所述多个神经细胞之间形成一神经网络。

与现有技术相比较，所述神经移植体的制备方法通过在该碳纳米管膜结构表面设置蛋白质层形成培育层，并在所述培育层的表面形成所述神经网络。所述碳纳米管膜结构与疏水性基底均具有弹性佳与延展性良好等优点，因此，所述神经移植体可根据受损神经系统的受损部位的形状、大小进行裁剪、拉伸并植入受损部位。所述神经网络具有生物活性及信号传递能力，从而使得包括所述神经网络的神经移植体也具有生物活性及信号传递能力。当所述神经移植体植入生物体中的受损部位时，由于所述神经植入体中的神经元与所述受损部位两端或边缘的神经元的距离非常近，因此可通过直接缝合所述神经植入体中的神经元与受损部位边缘的神经元的方式使所述受损部位的两端建立起信号传递能力，完成受损部位的神经修复，从而节省所述神经突起的生长时间，减少受损的神经系统的修复时间。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的一神经移植体的制备方法的流程示意图。

图2为一碳纳米管絮化膜的扫描电镜照片。

图3为一碳纳米管碾压膜的扫描电镜照片。

图4为一碳纳米管拉膜的扫描电镜照片。

图5为本发明实施例所提供的神经移植体的侧视示意图。

图6为本发明实施例所提供的神经移植体的俯视示意图。

图7为本发明实施例所提供的碳纳米管膜结构的扫描电镜照片。

图8为本发明实施例所提供的碳纳米管膜结构的透射电镜照片。

图9为本发明实施例所提供的培育层的透射电镜照片。

图10为本发明实施例所提供的种植在所述培育层上的神经细胞分化出多个神经突起时的扫描电镜照片。

图11为本发明实施例所提供的未经染色的神经移植体的扫描电镜照片。

图12为本发明实施例所提供的神经移植体染色后的扫描电镜照片。

主要元件符号说明

神经移植体      100

培育层          10

疏水性基底      11

碳纳米管膜结构  12

蛋白质层        14

神经网络        20

神经细胞        22

神经突起        24

具体实施方式

请参阅图1，本发明提供一种神经移植体的制备方法，其包括：

S10，提供一培育层，所述培育层包括一疏水性基底、一碳纳米管膜结构及一蛋白质层，所述碳纳米管膜结构设置在所述硅胶基底，所述蛋白质层设置在该碳纳米管膜结构表面；

S20，在该蛋白质层表面种植多个神经细胞；以及

S30，培育该多个神经细胞直到该多个神经细胞生长出多个神经突起连接在所述多个神经细胞之间形成一神经网络。

在所述步骤S10中，所述碳纳米管膜结构由多个碳纳米管组成。所述多个碳纳米管的延伸方向可基本平行于所述碳纳米管膜结构的表面。优选地，所述多个碳纳米管之间通过范德华力连接，从而形成一自支撑结构。所谓“自支撑”即该碳纳米管膜结构无需通过设置于一基体表面，也能保持自身特定的形状。由于该自支撑的碳纳米管膜结构中大量的碳纳米管通过范德华力相互吸引，从而使该碳纳米管膜结构具有特定的形状，形成一自支撑结构。所述碳纳米管膜结构为自支撑结构时，该碳纳米管膜结构可为由至少一碳纳米管膜形成的膜状结构，当所述碳纳米管膜结构包括多个碳纳米管膜时，该多个碳纳米管膜层叠设置，相邻的碳纳米管膜之间通过范德华力相结合。由于所述碳纳米管膜基本由碳纳米管组成且碳纳米管之间通过范德华力连接，因此所述碳纳米管膜结构具有弹性佳、延展性良好及密度低等优点，便于裁剪和拉伸。

请参阅图2，所述碳纳米管膜可为一碳纳米管絮化膜，该碳纳米管絮化膜为将一碳纳米管原料絮化处理获得的一自支撑的碳纳米管膜。该碳纳米管絮化膜包括相互缠绕且均匀分布的碳纳米管。碳纳米管的长度大于10微米，优选为200微米到900微米，从而使碳纳米管相互缠绕在一起。所述碳纳米管之间通过范德华力相互吸引、分布，形成网络状结构。由于该自支撑的碳纳米管絮化膜中大量的碳纳米管通过范德华力相互吸引并相互缠绕，从而使该碳纳米管絮化膜具有特定的形状，形成一自支撑结构。所述碳纳米管絮化膜各向同性。所述碳纳米管絮化膜中的碳纳米管为均匀分布，无规则排列，形成大量尺寸在1纳米到500纳米之间的间隙或微孔。所述间隙或微孔能够增加所述碳纳米管膜的比表面积及浸润更多的蛋白质。

所述碳纳米管膜可为一碳纳米管碾压膜，该碳纳米管碾压膜为通过碾压一碳纳米管阵列获得的一种具有自支撑性的碳纳米管膜。该碳纳米管碾压膜包括均匀分布的碳纳米管，碳纳米管沿同一方向或不同方向择优取向排列。所述碳纳米管碾压膜中的碳纳米管相互部分交迭，并通过范德华力相互吸引，紧密结合，使得该碳纳米管膜具有很好的柔韧性，可以弯曲折迭成任意形状而不破裂。且由于碳纳米管碾压膜中的碳纳米管之间通过范德华力相互吸引，紧密结合，使碳纳米管碾压膜为一自支撑的结构。所述碳纳米管碾压膜中的碳纳米管与形成碳纳米管阵列的生长基底的表面形成一夹角β，其中，β大于等于0度且小于等于15度，该夹角β与施加在碳纳米管阵列上的压力有关，压力越大，该夹角越小，优选地，该碳纳米管碾压膜中的碳纳米管平行于该生长基底排列。该碳纳米管碾压膜为通过碾压一碳纳米管阵列获得，依据碾压的方式不同，该碳纳米管碾压膜中的碳纳米管具有不同的排列形式。具体地，碳纳米管可以无序排列；请参阅图3，当沿不同方向碾压时，碳纳米管沿不同方向择优取向排列；当沿同一方向碾压时，碳纳米管沿一固定方向择优取向排列。该碳纳米管碾压膜中碳纳米管的长度大于50微米。

该碳纳米管碾压膜的面积与碳纳米管阵列的尺寸基本相同。该碳纳米管碾压膜厚度与碳纳米管阵列的高度以及碾压的压力有关，可为0.5纳米到100微米之间。可以理解，碳纳米管阵列的高度越大而施加的压力越小，则制备的碳纳米管碾压膜的厚度越大；反之，碳纳米管阵列的高度越小而施加的压力越大，则制备的碳纳米管碾压膜的厚度越小。所述碳纳米管碾压膜之中的相邻的碳纳米管之间具有一定间隙，从而在碳纳米管碾压膜中形成多个尺寸在1纳米到500纳米之间的间隙或微孔。所述间隙或微孔能够增加所述碳纳米管膜的比表面积及浸润更多的蛋白质。

所述碳纳米管膜可为一碳纳米管拉膜，所述碳纳米管拉膜是由若干碳纳米管组成的自支撑结构。请参阅图4，所述若干碳纳米管为沿该碳纳米管拉膜的长度方向择优取向排列。所述择优取向是指在碳纳米管拉膜中大多数碳纳米管的整体延伸方向基本朝同一方向。而且，所述大多数碳纳米管的整体延伸方向基本平行于碳纳米管拉膜的表面。

进一步地，所述碳纳米管拉膜中多数碳纳米管是通过范德华力首尾相连。具体地，所述碳纳米管拉膜中基本朝同一方向延伸的大多数碳纳米管中每一碳纳米管与在延伸方向上相邻的碳纳米管通过范德华力首尾相连。当然，所述碳纳米管拉膜中存在少数偏离该延伸方向的碳纳米管，这些碳纳米管不会对碳纳米管拉膜中大多数碳纳米管的整体取向排列构成明显影响。所述自支撑为碳纳米管拉膜不需要大面积的载体支撑，而只要相对两边提供支撑力即能整体上悬空而保持自身膜状状态，即将该碳纳米管拉膜置于(或固定于)间隔一定距离设置的两个支撑体上时，位于两个支撑体之间的碳纳米管拉膜能够悬空保持自身膜状状态。所述自支撑主要通过碳纳米管拉膜中存在连续的通过范德华力首尾相连延伸排列的碳纳米管而实现。具体地，所述碳纳米管拉膜中基本朝同一方向延伸的多数碳纳米管，并非绝对的直线状，可以适当的弯曲；或者并非完全按照延伸方向上排列，可以适当的偏离延伸方向。因此，不能排除碳纳米管拉膜的基本朝同一方向延伸的多数碳纳米管中并列的碳纳米管之间可能存在部分接触。具体地，该碳纳米管拉膜包括多个连续且定向排列的碳纳米管片段。该多个碳纳米管片段通过范德华力首尾相连。每一碳纳米管片段由多个相互平行的碳纳米管组成。该碳纳米管片段具有任意的长度、厚度、均匀性及形状。该碳纳米管拉膜具有较好的透光性，可见光透过率可以达到75％以上。

当该碳纳米管膜结构包括多个碳纳米管拉膜时，所述多个碳纳米管拉膜层叠设置形成一层状结构。该层状结构的厚度不限，相邻的碳纳米管拉膜通过范德华力结合。优选地，所述层状结构包括的碳纳米管膜的层数小于或等于10层，从而使单位面积内的碳纳米管数量较少，使该碳纳米管自身的拉曼光强保持在较小的范围，从而减小拉曼光谱中碳纳米管的拉曼峰强。该层状结构中相邻的碳纳米管拉膜中的碳纳米管之间具有一交叉角度α，且该α大于0度且小于等于90度。当相邻的碳纳米管拉膜中的碳纳米管之间具有一交叉角度α时，所述多个碳纳米管拉膜中的碳纳米管相互交织形成一神经移植体，使所述碳纳米管膜结构的机械性能增加。在本实施例中，所述碳纳米管膜结构包括多层碳纳米管拉膜层叠设置，相邻的碳纳米管膜中的碳纳米管之间的交叉角度α大致等于90度，即，相邻碳纳米管拉膜中的碳纳米管的延伸方向大致平行。

所述疏水性基底用于承载该所述碳纳米管膜结构及蛋白质层。所述疏水性基底具有疏水性及良好的柔韧性。所述疏水性基底可由硅胶制成，或表面涂敷有硅胶。所述疏水性基底的形状与厚度可根据所述碳纳米管膜结构的形状与厚度设计。譬如，所述疏水性基底表面的面积及形状可大致与所述碳纳米管膜结构的面积及形状大致相当。可以理解，当所述碳纳米管膜结构的厚度较薄时，该碳纳米管膜结构具有较小机械强度及具有较大的比表面积，因此，该碳纳米管膜结构溶液受外力产生破损或容易粘附在其他亲水性物体上。将该碳纳米管膜结构设置在所述疏水性基底表面形成一生物基底时，该生物基底的机械强度较所述碳纳米管膜结构大，从而使该碳纳米管膜结构更难受外来作用而产生破损，同时便于移动及防止该碳纳米管膜结构粘附在亲水性物体上。

所述蛋白质层设置在所述碳纳米管膜结构的表面，用于使所述碳纳米管层具有亲水性及生物兼容性，从而使得所述培育层能够为所述神经细胞的种植及生长提供一个合适的环境。具体地，所述蛋白质层设置在所述碳纳米管膜结构远离所述疏水性基底的表面。优选地，所述蛋白质层中的蛋白质(protein)为可溶性蛋白质。所述蛋白质可选自纤维状蛋白质、血浆蛋白质及酶蛋白质等。在本实施例中，所述蛋白质为哺乳动物的血清，如猪血清、牛血清或人血清。所述血清不仅能够为所述神经细胞的种植及生长提供一个合适的环境，还能够在所述神经细胞生长时，为所述神经细胞提供生长因子。

所述培育层的制备方法不限，只要能够使蛋白质层与所述碳纳米管膜结构混合在一起即可。譬如，可通过将所述碳纳米管膜结构浸泡在一蛋白质溶液中，使所述蛋白质溶液浸润所述碳纳米管膜结构，从而使得所述蛋白质溶液中的蛋白质附着在所述碳纳米管膜结构的远离所述疏水性基底的表面形成蛋白质层。也可将所述蛋白质溶液喷涂在所述碳纳米管膜结构远离所述疏水性基底的表面，使所述蛋白质层设置在该表面。还可将蛋白质溶液滴在所述碳纳米管膜结构远离所述疏水性基底的表面，再采用甩膜的方式使所述蛋白质层设置在该表面。所述蛋白质溶液除所述蛋白质外，还可包括溶解所述蛋白质的生物媒介(biological media)，所述生物媒介的种类不限，可根据蛋白质的种类的不同而调制。通常，所述蛋白质溶液中的蛋白质的浓度大于等于50％小于等于100％。在本实施例中，所述蛋白质溶液中的蛋白质浓度为100％，即，所述蛋白质溶液为纯蛋白质，无需溶剂溶解。

由于所述碳纳米管膜结构包括多个碳纳米管且多个碳纳米管之间存在间隙形成多个微孔，当所述蛋白质溶液浸润所述碳纳米管膜结构时，所述蛋白质溶液可渗透入所述碳纳米管膜结构内部浸润所述多个碳纳米管的表面。当然，在所述培育层中，并不是所有碳纳米管的表面均可浸润有蛋白质层，但，只需位于需培育神经细胞的碳纳米管膜结构的表面的部分碳纳米管浸润有蛋白质溶液，即可在所述碳纳米管膜结构表面形成蛋白质层，使所述碳纳米管膜结构具有亲水性及生物兼容性，实现使培育层具有作为神经细胞生长的载体的功能。这是因为，由于碳纳米管具有疏水性，由碳纳米管组成的碳纳米管膜结构并不能为神经细胞生长提供适合的亲水性环境。而当碳纳米管表面覆盖有具有亲水性及无毒性的蛋白质层后，由覆盖有蛋白质的碳纳米管组成的结构即能为细胞生长提供适合的亲水性环境。在本实施例中，所述培育层的制备方法可进一步包括如下步骤：

在本实施例中，所述培育层的制备方法可进一步包括如下步骤：

S11，提供所述疏水性基底；

S12，将所述碳纳米管膜结构设置在所述疏水性基底表面；

S13，使所述碳纳米管膜结构浸润有蛋白质溶液；以及

S14，对浸润有蛋白质溶液的碳纳米管膜结构进行灭菌处理形成所述培育层。

在步骤S11中，所述疏水性基底由硅胶制成，或表面涂敷有硅胶。硅胶为生物体常用的植入材料，对生物体无毒性，且具有较好的柔韧性。因此，由该硅胶基底制备形成或者涂敷有硅胶的疏水性基底可直接植入人体。

在步骤S12中，为使所述碳纳米管膜结构与所述硅胶基底表面结合更紧密，可对所述碳纳米管膜结构进行有机溶剂处理。具体地，可在设置在所述硅胶基底表面的碳纳米管膜结构覆盖或者滴上容易挥发的溶剂，如有机溶剂，再使所述溶剂挥发，从而可减小该碳纳米管膜结构的比表面及增加该碳纳米管膜结构与所述硅胶基底的附着力。

在步骤S13中，使所述碳纳米管膜结构浸润有蛋白质溶液的方式不限，只要使蛋白质溶液中的蛋白质附着在碳纳米管膜结构表面形成一蛋白质层即可。譬如，可通过将所述碳纳米管膜结构浸泡在所述蛋白质溶液中，实现蛋白质溶液的浸润。也可通过在所述碳纳米管膜结构喷涂所述蛋白质溶液，实现蛋白质溶液的浸润。在本实施例中，为实现蛋白质溶液的浸润，选择将所述碳纳米管膜结构浸泡在纯蛋白质中。所述碳纳米管膜结构的浸泡时间依碳纳米管膜结构的具体结构及蛋白质溶液的具体组分而定，只要能使所述碳纳米管膜结构中的大部分碳纳米管浸润有蛋白质溶液即可。通常，所述碳纳米管膜结构的浸泡时间在1小时以上。所述碳纳米管膜结构的浸泡的环境不限，只要不使所述蛋白质变质即可。通常，所述浸泡过程可在常温、常压环境下进行。

当所述碳纳米管膜结构浸泡在所述蛋白质溶液中时，所述蛋白质溶液可浸润所述碳纳米管膜结构中的部分碳纳米管，也可浸润所述碳纳米管膜结构中的全部碳纳米管。通常地，当所述碳纳米管膜结构的厚度较薄时，譬如所述碳纳米管膜结构的厚度小于等于10微米时，所述蛋白质溶液可浸润所述碳纳米管膜结构中的全部碳纳米管。当所述碳纳米管膜结构的厚度较厚时，譬如所述碳纳米管膜结构的厚度大于等于10微米时，所述蛋白质溶液可浸润所述碳纳米管膜结构中远离所述疏水性基底部分的碳纳米管。需要指出的是，所述蛋白质溶液是否浸润所述碳纳米管膜结构中的全部碳纳米管除了与碳纳米管膜结构的厚度有关外，还与浸润时间与所述蛋白质溶液的浓度有关。譬如，当浸润时间较短时，即便所述碳纳米管膜结构较薄，所述蛋白质溶液也可能仅浸润所述碳纳米管膜结构中的部分碳纳米管。

在步骤S14中，对浸润有蛋白质溶液的碳纳米管膜结构进行灭菌处理的方式不限，只要能够杀死蛋白质溶液中的大部分细菌即可。譬如可采用高温灭菌或紫外光灭菌的方式对所述蛋白质溶液进行灭菌。在本实施例中，采用高温杀菌的方式对该蛋白质溶液进行灭菌。当然，为使所述蛋白质溶液中的蛋白质不至于被破坏，高温灭菌时的温度不得超过220度。在本实施例中，所述高温灭菌时的温度大致为120度。可以理解，当所述蛋白质溶液中本身细菌较少，则该步骤S14则可省略。当对浸润在碳纳米管膜结构中的蛋白质溶液进行灭菌处理时，所述蛋白质溶液中的溶剂或水分将减少。通常地，浸润在所述碳纳米管膜结构中的蛋白质溶液随着溶剂或水分的减少而固化，从而在所述碳纳米管膜结构的表面形成所述蛋白质层。

在步骤S10中，为增加该培育层对神经细胞的附着性及提供更适合神经细胞的生长环境，在形成蛋白质层后，该步骤S10还可进一步包括如下步骤：S15，在所述蛋白质层远离所述疏水性基底的表面形成一多聚赖氨酸(Poly-D-lysine，PDL)层。具体地，可将所述培育层浸泡在一多聚赖氨酸溶液中，所述多聚赖氨酸溶液中多聚赖氨酸的浓度大致为20微克每毫升。

在步骤S20中，所述神经细胞包括哺乳动物的神经细胞，优选地，所述神经细胞为海马神经元。在该培育层表面种植多个神经细胞的方法不限，可采用在该培育层远离所述疏水性基底的表面喷射或涂覆含有该神经细胞的溶液，也可采用将该培育层浸泡在所述含神经细胞的神经细胞溶液中，只要使所述神经细胞溶液覆盖所述培育层即可。为使所述神经细胞液覆盖所述培育层，所述神经细胞液可盛放在一培养皿中。所述培育层可悬空设置在所述培养皿中。也可设置在所述培养皿的一底面上，只要能使所述培养液覆盖所述神经细胞即可。当所述培育层设置在所述培养皿的底面时，所述疏水性基底与所述底面接触，从而使得所述神经细胞仅分布在蛋白质层表面。

在步骤S30中，所述神经细胞的培育环境不限，只要能够生长出神经突起即可。通常，所述神经细胞在常温、常压环境中即可生长。即，将所述神经细胞放置在室内环境中，所述神经细胞即可生长，而培育层中的蛋白质如牛血清可提供生长因子，促进该神经细胞生长。当然，也可使该培育环境接近提供该神经细胞的生物体的体内生长环境也可。譬如，当所述神经细胞为取自老鼠的海马神经细胞时，可模拟所述老鼠体内的生长环境。

所述神经细胞在培育时，能够长出多个神经突起(Neurite)。所述神经突起包括树突(Dendrite)与轴突(Axon)。当所述培育层表面仅有一个神经细胞时，所述神经细胞的神经突起沿培育层的表面朝各个方向随机生长。但由于神经细胞本身会释放出诱导神经突起定向生长的因子，因此，当所述培育层表面设置有多个神经细胞时，该神经细胞的神经突起具有沿向相邻的神经细胞生长的趋势，从而使相邻的神经细胞得以连接沟通。因此，控制神经细胞在所述培育层的分布，即可控制所述神经突起的生长方向。譬如，如果所述神经细胞是随机均匀分布在所述培育层的表面，所述神经细胞将各自生长出神经突起与相邻的细胞连接，当所述多个神经细胞的全部或大多数神经细胞均生长出连接在相邻的神经细胞之间的神经突起时，所述多个神经细胞借由所述神经突起形成所述神经网络，使该多个神经细胞之间能相互沟通。相邻的神经细胞的神经突起如果相遇，则会合为同一个神经突起。再譬如，当所述神经细胞在该培育层表面以线状或者阵列的方式排列时，且沿纵向方向的神经细胞相距较近，而沿横向方向的神经细胞相距较远，此时，所述神经细胞所生长的神经细胞可基本沿所述纵向方向延伸。为使所述神经细胞能够在所述培育层表面以线状或者阵列的方式排列，可选择使所述碳纳米管膜中的碳纳米管基本沿同一方向延伸。通过培育，彼此相邻的神经细胞大多通过神经突起建立起连接，从而形成所述神经网络。所述神经网络与所述培育层一起形成所述神经移植体。

所述移植体的制备方法通过在该疏水性基底表面设置碳纳米管膜结构，再在该碳纳米管膜结构远离所述疏水性基底表面设置蛋白质层形成培育层，从而能在该培育层中蛋白质层表面种植多个神经细胞，并使所述多个神经细胞生长出多个神经突起连接起多个神经细胞。所述硅胶基底具有疏水性，不能使所述神经细胞吸附其上，即不能提供供所述神经细胞生长的环境，因此，所述神经细胞将仅在所述设置有蛋白质层表面生长。

所述碳纳米管膜结构为一宏观的膜状结构，其面积一般都可达到15毫米×15毫米以上，具体地，该碳纳米管膜结构的长度可达300米以上，宽度可达0.5米以上。所述疏水性基底也为一宏观结构，其形状与面积可根据所述碳纳米管膜结构的形状与面积进行调整。且该碳纳米管膜结构与所述疏水性基底均具有弹性佳、延展性良好及不含金属等优点，可直接植入生物体。因此，由所述碳纳米管膜结构及疏水性基底做主要载体的神经移植体可根据受损神经系统的受损部位的形状、大小进行裁剪、拉伸并植入受损部位。所述神经网络具有生物活性及信号传递能力，从而使得包括所述神经网络的神经移植体也具有生物活性及信号传递能力。当所述神经移植体植入生物体中的受损部位时，由于所述神经植入体中的神经元与所述受损部位两端或边缘的神经元的距离较短，因此可通过直接缝合所述神经植入体中的神经元与受损部位边缘的神经元的方式使所述受损部位的两端建立起信号传递能力，完成受损部位的神经修复，从而节省所述神经突起的生长时间，减少受损的神经系统的修复时间。可以理解，即便是在所述神经植入体植入受损部位时，不进行直接缝合，由于所述神经植入体中的神经元所述受损部位边缘的神经元的距离小于所述受损部位两端的神经元的距离，因此，通过植入所述神经植入体，也能减少神经突起的生长时间，从而减少受损的神经系统的修复时间。

需要指出的是，通常情况下，所述碳纳米管膜结构中的碳纳米管是指未经过化学或物理处理的碳纳米管，如未经过表面亲水性处理的碳纳米管，即，所述碳纳米管为纯碳纳米管。当然，碳纳米管膜结构中的碳纳米管如果是经过改性的碳纳米管，只要是对神经细胞没有毒性，也应在在本发明的保护范围之内，只是，所述碳纳米管的改性并不会对实现本发明有任何实质性贡献，因为，当所述蛋白质层覆盖该碳纳米管后，所述神经细胞与所述碳纳米管并不直接接触，该碳纳米管的表面结构实际上是可忽略的。

本发明提供的神经移植体可包括由上述神经移植体的制备方法在包括碳纳米管膜结构及蛋白质层的培育层表面培养由多个神经细胞及神经突起形成的神经网络所得到产品。

请参阅图5，所述神经移植体100包括一培育层10及分布在该培育层10表面的一神经网络20。

所述培育层10包括一疏水性基底11、一碳纳米管膜结构12及一蛋白质层14。所述碳纳米管膜结构12设置在所述疏水性基底11的一个或者相对的两个表面。所述蛋白质层14设置在所述碳纳米管膜结构12远离所述疏水性基底11的表面。在本实施例中，所述碳纳米管膜结构12仅设置在所述疏水性基底11的一个表面。

所述疏水性基底11可由硅胶制成，或表面涂敷有硅胶。硅胶为生物体常用的植入材料，对生物体无毒性，且具有较好的柔韧性。因此，由该硅胶制备形成或者涂敷有硅胶的疏水性基底11可直接植入人体。

所述碳纳米管膜结构12包括多个碳纳米管基本平行于所述碳纳米管膜结构的表面，且相邻的碳纳米管之间通过范德华力相互连接形成一自支撑结构。所述碳纳米管膜结构12包括至少一碳纳米管膜，该碳纳米管膜可为如图2中的碳纳米管絮化膜、图3中的碳纳米管碾压膜及图4中的碳纳米管拉膜。在本实施例中，所述碳纳米管膜结构12包括多个层叠设置的拉膜，相邻的拉膜通过范德华力相互结合。在相邻的拉膜中，碳纳米管的的延伸方向可具有一个交叉角度，优选地，所述交叉角度为90度。所述碳纳米管膜结构12的厚度可根据具体需求而设置。通常，所述碳纳米管膜结构12厚度大于0.3微米小于60微米。在本实施例中，所述碳纳米管膜结构12的厚度大致为0.6微米。

所述蛋白质层14为由可溶性蛋白质组成。所谓可溶性蛋白质即该蛋白质具有较好的亲水性。所述蛋白质层14的厚度不限，只要能够提供一个亲水性环境即可。通常，所述蛋白质层14的厚度为0.3微米到2微米。在本实施例中，所述蛋白质层的厚度大致为0.5微米。在宏观上，所述蛋白质层14可选择仅设置在所述碳纳米管膜结构12远离所述疏水性基底11的表面。在微观上，所述蛋白质层14中的蛋白质容易渗透到所述碳纳米管膜结构12的内部，并包覆所述碳纳米管膜结构12中的部分或者全部碳纳米管，此时，所述蛋白质层14与该碳纳米管膜结构12之间并没有明显的分界面。通常，当所述碳纳米管膜结构12的厚度较薄时，譬如，所述碳纳米管膜结构12的厚度小于等于3微米时，所述蛋白质层14中的蛋白质容易渗透到所述碳纳米管膜结构12的内部，并基本包覆所述碳纳米管膜结构12中的所有的碳纳米管。而当所述碳纳米管膜结构12的厚度较厚时，譬如，所述碳纳米管膜结构12的厚度大于等于3微米时，所述蛋白质层14中的蛋白质虽然也可渗透到所述碳纳米管膜结构12内部，但通常仅包覆所述碳纳米管膜结构12靠近所述神经网络20的碳纳米管。在本实施例中，所述蛋白质层14中的蛋白质基本包覆所述碳纳米管膜结构12中的所有的碳纳米管。

所述神经网络20设置在所述蛋白质层14远离所述碳纳米管膜结构12的一个表面。当所述神经移植体100仅包括一个碳纳米管膜结构12且该碳纳米管膜结构12远离疏水性基底11的表面设置有一个蛋白质层14时，所述神经移植体100仅包括一个神经网络20设置在所述蛋白质层14表面。当所述神经移植体100包括两个碳纳米管膜结构12分别设置在该疏水性基底11的两个表面，且每一碳纳米管膜结构12远离疏水性基底11的表面均设置有一个蛋白质层14时，所述神经移植体100可包括两个神经网络20分别设置在所述两个蛋白质层14的表面，也可仅包括一个神经网络20设置在其中一个蛋白质层14的表面。在本实施例中，所述神经移植体100仅包括一个碳纳米管膜结构12、一个设置在所述碳纳米管膜结构12表面的蛋白质层14、及一个设在所述蛋白质层14表面的神经网络20。

可以理解，为提高所述生物移植体100的抑菌性，提高该神经移植体100的寿命，所述神经移植体100还可进一步包括一多聚赖氨酸层设置在所述神经网络20与所述蛋白质层14之间。

请参阅图6，所述神经网络20包括多个神经细胞22及自所述多个神经细胞22延伸出来的多个神经突起24。每一个神经细胞22延伸出来的神经突起24的个数不限，只要能够使所述多个神经细胞22之间建立起生物连接使所述多个神经细胞22能够相互沟通即可。譬如，其中一个神经细胞22可延伸出多个神经突起24或不延伸出任何神经突起24。

本发明中的神经移植体100，具有修复生物体中神经系统中的神经网络20设置在该培育层10表面。而所述培育层10中的疏水性基底11具有较好的，具有不含金属、弹性佳、不易腐蚀及延展性良好等优点。所述培育层10中的碳纳米管膜结构12为基本由碳纳米管组成的自支撑结构，具有不含金属、弹性佳、不易腐蚀、延展性良好及低密度等优点。因此，该培育层10可随同该由多个神经突起14连接的多个神经细胞12一起植入到生物体中，用于修复生物体中受损的神经系统，且可以根据生物体中神经系统的创伤面积对所述神经移植体100进行裁剪或拉伸。

以下将结合附图并以具体实施例方式详细说明本发明的神经移植体的制备方法及神经移植体。

本发明提供一种神经移植体的制备方法，其包括如下步骤：

S210，提供一硅胶基底。

所述硅胶基底的尺寸与厚度可根据实际需求而确定。譬如，如果所需神经移植体的面积为3平方厘米，则所述硅胶基底的面积可大于等于3平方厘米。所述硅胶基底不含金属，对生物体基本无毒性。

S220，将一碳纳米管膜结构铺设在所述硅胶基底的一表面。

为使所述碳纳米管膜结构与所述硅胶基底表面结合更紧密，可对所述碳纳米管膜结构进行有机溶剂处理。具体地，可在设置在所述硅胶基底表面的碳纳米管膜结构覆盖或者滴上容易挥发的溶剂，如有机溶剂，再使所述溶剂挥发，从而可减小该碳纳米管膜结构的比表面及增加该碳纳米管膜结构与所述硅胶基底的附着力。所述碳纳米管膜结构包括多层碳纳米拉膜，相邻的碳纳米管拉膜之间的碳纳米管的延伸方向具有一交叉角度。请参阅图7及图8，优选地，所述交叉角度大致等于90度。

S230，将铺设有碳纳米管膜结构的硅胶基底浸泡在一蛋白质溶液中。

由于所述碳纳米管膜结构设置在所述硅胶基底表面，当所述碳纳米管膜结构连同硅胶基底一起浸泡到所述纯蛋白质中时，所述碳纳米管膜结构受液体表面张力影响而产生破损的概率将大为降低。所述蛋白质溶液纯牛血清溶液。请参见图9，当所述碳纳米管膜结构从所述蛋白质溶液中浸泡1.5个小时左右，所述碳纳米管膜结构中的大部分碳纳米管表面可浸润有蛋白质溶液。

S240，从所述蛋白质溶液中取出所述铺设有碳纳米管膜结构的硅胶基底，在120摄氏度下进行高温灭菌处理，形成一培育层。

将所述铺设有碳纳米管膜结构的硅胶基底从所述蛋白质溶液中取出后，可在一干燥箱中进行加热灭菌处理。所述干燥箱的灭菌温度大致在120度左右，灭菌处理后后，所述蛋白质溶液中的蛋白质基本固化，在所述碳纳米管膜结构表面形成一蛋白质层，从而形成所述培育层。

S250，将所述培育层浸泡在一多聚赖氨酸溶液中。

所述多聚赖氨酸溶液中的多聚赖氨酸的浓度大致为20微克每毫升。通过浸泡，所述培育层表面附着有多聚赖氨酸，并提供一个水性环境。且通过浸泡，该培育层对神经细胞的吸附性得到加强。

S260，在所述浸泡后的培育层滴加一神经细胞液直到该神经细胞液覆盖该培育层。

由于所述培育层中具有硅胶基底，该培育层可直接设置在一容器如培养皿中，通过所述硅胶基底是所述碳纳米管膜结构不与所述容器的内表面接触。种植在所述硅胶基底神经细胞为未分化的神经元。

S270，培育所述附着在所述培育层的多个神经细胞，使该多个神经细胞生长出多个神经突起连接在所述多个神经细胞之间，从而在所述培育层形成一神经网络。

所述神经细胞的培育环境为普通的室内环境，培育时间可根据实际需求而定。因此，在步骤S260的环境下，请参阅图10，保持各种条件不变，在室内环境培养15天左右，即可使所述神经细胞分化出出多个神经突起。所述神经细胞生长时，所述蛋白质如牛血清，能够提供供所述神经细胞生长的生长因子。所述多个神经细胞上的多个神经突起相互连接后，形成所述神经网络及移植体，请参阅图11及图12，为所述神经移植体未经染色的扫描电镜照片及经过染色后的透射电镜照片。从上述投射电镜照片可以清晰看出，所述神经移植体中的多个神经细胞通过神经突起连接在一起。同时，如图11所示，部分神经细胞虽然延伸出多个神经突起，但并未通过该多个神经突起与其他神经细胞连接在一起，但这并不影响该神经移植体在整体上具有生物活性的性质。

需要指出的是，由于所述培育层中的硅胶基底将所述碳纳米管膜结构所述容器隔开，而该硅胶基底本身具有疏水性。因此，所述神经细胞将仅吸附在设置在所述碳纳米管膜结构上蛋白质层表面且在该表面生长，而不会在所述硅胶基底表面或容器的内表面上生长。

另外，本领域技术人员还可在本发明精神内做其它变化，当然，这些依据本发明精神所做的变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (18)

1.一种神经移植体的制备方法，其包括如下步骤：

提供一培育层，所述培育层包括一疏水性基底、一碳纳米管膜结构及一蛋白质层，所述碳纳米管膜结构设置在所述疏水性基底的一表面，所述蛋白质层设置在该碳纳米管膜结构远离所述疏水性基底的表面；

在该蛋白质层远离所述疏水性基底的表面种植多个神经细胞；以及

培育该多个神经细胞直到该多个神经细胞生长出多个神经突起连接在所述多个神经细胞之间形成一神经网络。

2.如权利要求1所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述神经网络中的每一神经细胞均包括至少一个神经突起并通过该至少一个神经突起与相邻的神经细胞连接。

3.如权利要求1所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述神经突起包括树突及轴突。

4.如权利要求1所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述蛋白质层中的蛋白质为可溶性蛋白质。

5.如权利要求1所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述蛋白质层中的蛋白质包括哺乳动物的血清。

6.如权利要求1所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述培育层的制备方法进一步包括如下步骤：

提供所述疏水性基底；

将所述碳纳米管膜结构设置在所述疏水性基底表面；

使所述碳纳米管膜结构浸润有蛋白质溶液；以及

对浸润有蛋白质溶液的碳纳米管膜结构进行灭菌处理形成所述培育层。

7.如权利要求6所述的神经网络的制备方法，其特征在于，将所述碳纳米管膜结构设置在所述疏水性基底表面的步骤进一步包括如下步骤：

对设置在所述的疏水性基底表面的碳纳米管膜结构进行有机溶剂处理。

8.如权利要求6所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，使所述碳纳米管膜结构浸润有蛋白质溶液的步骤进一步包括如下步骤：

将所述碳纳米管膜结构及承载该碳纳米管膜结构的疏水性基底浸泡在所述蛋白质溶液中。

9.如权利要求6所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，使所述碳纳米管膜结构浸润有蛋白质溶液的步骤进一步包括如下步骤：

在所述碳纳米管膜结构喷涂所述蛋白质溶液。

10.如权利要求6所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述蛋白质溶液中的蛋白质浓度大于等于50％小于等于100％。

11.如权利要求6所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理的方式包括高温灭菌及紫外灭菌。

12.如权利要求6所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述培育层的制备方法进一步包括如下步骤：

在所述蛋白质表面形成一多聚赖氨酸层。

13.如权利要求1所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述碳纳米管膜结构包括至少一碳纳米管膜，所述碳纳米管膜包括碳纳米管絮化膜、碳纳米管碾压膜或碳纳米管拉膜。

14.如权利要求13所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述碳纳米管膜结构包括多个碳纳米管膜层叠设置，相邻的碳纳米管膜之间通过范德华力连接。

15.如权利要求1所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述碳纳米管膜结构由多个碳纳米管组成，且碳纳米管膜结构中的多个碳纳米管通过范德华力首尾相连且轴向沿同一方向择优取向延伸。

16.如权利要求15所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述神经细胞中的神经突起基本沿所述同一方向延伸。

17.如权利要求1所述的神经移植体的制备方法，其特征在于，所述疏水性基底由硅胶制成，或表面涂敷有硅胶。

18.一种神经移植体的制备方法，其包括如下步骤：

提供一疏水性基底；

在该疏水性基底的一表面铺设一碳纳米管膜结构；

在该碳纳米管膜结构远离所述疏水性基底的表面形成一蛋白质层从而形成一培育层；

在该蛋白质层远离所述疏水性基底的表面种植多个神经细胞；以及培育该多个神经细胞直到该多个神经细胞生长出多个神经突起连接在所述多个神经细胞之间形成一神经网络。

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