CN102526034B - 恒河猴爆发性肝功能衰竭模型的建立 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鹅膏蕈碱联合内毒素脂多糖在制备用于筛选治疗爆发性肝功能衰竭时促肝细胞再生药物以及评价组织工程肝支持系统或肝细胞、干细胞移植治疗效果的动物模型。其中鹅膏蕈碱的施用方法和剂量为：单次腹腔滴注，0.1mg/kg，内毒素为1μg/kg。本发明还提供了一种制备恒河猴爆发性肝功能衰竭的方法，及该方法制备的爆发性肝功能衰竭动物模型。本发明动物模型可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药的评价，还可以用于组织工程肝脏、生物人工肝、肝细胞及干细胞移植治疗技术的评价。

Description

恒河猴爆发性肝功能衰竭模型的建立

技术领域

本发明涉及一种恒河猴爆发性肝功能衰竭模型的制备方法。

背景技术

急性肝衰竭(fulminant hepatic failure，FHF)临床常见，多由病毒感染、广泛肝组织切除、急性药物或毒物损伤等引起，其基本病理改变为肝实质细胞大片状变性坏死。病人预后凶险，死亡率非常高。除肝移植外，尚无更好的办法对其进行治疗。受限于供器官的严重短缺，细胞移植(成熟肝细胞或干细胞移植)、生物人工肝、组织工程肝等成为当前研究热点，但其有效性多是在小动物(基本上都是大鼠)上获得。促进肝细胞再生也是当前研究热点，但远未取得让人满意的进展，尚未找到能短期内显著促进肝细胞再生的理想药物。大动物，尤其是灵长类动物的实验数据极为缺乏，制约了这些新的治疗方案向临床过度。建立最接近于人类的灵长类动物AHF模型(急性肝功能衰竭(acute hepatic failure，AHF))，用以评估这些新的治疗方法的有效性和安全性，是将其最终应用于临床治疗的必经途径。

目前爆发性肝功能衰竭治疗研究最常用模型动物是啮齿类。由于啮齿类在进化关系上与人类相距甚远，以其为研究对象所获得的实验数据对临床指导意义不大。所用到的大动物模型仅限于猪和犬，同样与人存在巨大差异。恒河猴的解剖特点、各系统生理功能及对疾病和治疗药物的反应性与人类极为相近，是进行免疫学相关治疗和干细胞移植、异种移植临床前有效性和安全性评价的敏感动物。利用恒河猴FHF模型评价新型FHF治疗药物，研究肝脏干细胞或肝细胞移植以及辅助性肝支持措施，如组织工程肝和生物人工肝的治疗效果，是国际公认的临床前实验体系，对未来这些治疗方案的临床应用具有重要的指导意义。因此建立非人灵长类FHF模型成为FHF治疗研究和临床前药物评价的迫切需要。

建立大动物AHF的有以下基本原则：(1)可逆性(Reversibility)：给予有效治疗措施可使动物存活；(2)重现性(Reproducibility)：不给予治疗，所有动物都将死亡；(3)肝衰竭的致死性(Death from liver failure)：肝损伤最终将导致动物死亡；(4)治疗窗(Therapeutic window)：在动物死亡前有足够时间给予治疗并能评估其疗效；(5)大动物模型(Large animal model)：能连续取样检测、更接近人类特点；(6)对实验者无害(Minimal hazard topersonnel)：药品须尽可能对实验人员无害；(7)接近人的代谢和生理学(Appropriate metabolism/physiology)：以便将实验结果推广至人类；(8)动物需有意识(Conscious animal model)：用于观察肝性脑病；(9)符合伦理(Compliance with ethical standards)：必须保证实验动物的福利和伦理规范。

目前肝毒性药物是建立FHF模型最常用手段。这些药物包括醋氨酚(Acetaminophen)、半乳糖酐(D-Galactosamine)、硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)等。这些药物诱导的FHF模型均存在各种缺陷，如醋氨酚，其重现性差，相同剂量下动物存活时间差异巨大；伴发高铁血红蛋白血症、难治性贫血及其他器官损伤。半乳糖酐(D-Galactosamine)重现性差(死亡率和至死亡的时间差异非常大)；费用高(1-2g/kg)，不适合在大动物中应用。硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)易导致严重低血压、低血糖、低体温以及肾衰竭，能直接导致神经损伤，与肝性脑病无法区分；对实验人员有较大毒性。病毒也可诱导FHF发生，但其复制困难，生物安全性差。

手术切除全部或大部分肝脏，或完全去血流化，也可建立HFH模型，但由于手术耗时、创伤大，血流动力学干扰大；除非原位肝移植，否则动物无法存活；肝脏本身并未受到损伤。这类模型适合研究肝移植及肝支持系统。

鹅膏蕈碱是有毒蘑菇的主要毒性物质，为环肽类生物碱，通过抑制RNA聚合酶造成细胞损伤，其靶器官主要为肝脏和胃肠道。内毒素脂多糖为革兰氏阴性细菌细胞壁主要成分，本身可引起肝细胞损伤。同时，通过激活肝脏内单核巨噬细胞，分泌大量炎性介质，引起肝细胞凋亡。通过门静脉系统直接给药，可最大限度降低药物对其他组织器官的损伤。目前尚未见以大型灵长类动物建立FHF动物模型的报道。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种鹅膏蕈碱联合内毒素脂多糖在制备用于筛选治疗爆发性肝功能衰竭药物和方法的动物模型中的用途。本发明的另一技术方案是提供了恒河猴爆发性肝功能衰竭模型的建立。

本发明提供了鹅膏蕈碱联合内毒素脂多糖在制备用于筛选治疗爆发性肝功能衰竭药物、评价组织工程肝支持系统或肝细胞、干细胞移植治疗效果的灵长类动物模型中的用途，其中鹅膏蕈碱的施用剂量为0.1mg/kg，内毒素施用剂量为1μg/kg。

其中，鹅膏蕈碱与脂多糖内毒素同时施用，施用方法为：单次腹腔滴注。

本发明还提供了一种爆发性肝功能衰竭动物模型的制备方法，它是将鹅膏蕈碱和脂多糖内毒素施用于灵长类动物，鹅膏蕈碱的施用剂量为：0.1mg/kg，脂多糖内毒素的施用剂量为1μg/kg。

其中，所述灵长类动物为恒河猴。

其中，所述的施用方法为：单次腹腔滴注。

本发明还提供了该方法制备得到的爆发性肝功能衰竭动物模型。

本发明提供了所述的动物模型在筛选治疗爆发性肝功能衰竭的药物、评价组织工程肝支持系统或肝细胞、干细胞移植治疗效果中的应用。

一种评价组织工程肝支持系统或肝细胞、干细胞移植效果的方法，包括如下步骤：

a、它是将鹅膏蕈碱联合脂多糖内毒素施用于灵长类动物，制备爆发性肝功能衰竭动物模型，鹅膏蕈碱的施用剂量为：0.1mg/kg，脂多糖内毒素的施用剂量为1μg/kg；

b、采用细胞移植或器官移植于该动物模型；

c、观察移植后动物的肝功能影响情况，评价组织工程肝支持系统或肝细胞、干细胞移植效果。

其中，a步骤所述灵长类动物为恒河猴。

其中，所述的鹅膏蕈碱与脂多糖内毒素同时施用，施用方法为：单次腹腔滴注。

本发明采用鹅膏蕈碱联合内毒素脂多糖，通过腹腔给药，建立恒河猴爆发性肝功能衰竭模型，本发明动物模型可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药的评价、以及组织工程肝、生物人工肝和肝细胞、干细胞移植治疗技术的评价。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

附图说明

图1本发明动物模型给药前后肝功能、肾功能、心肌酶谱、血淀粉酶、血糖指标的改变。图1A为谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的改变；图1B为胆红素(总胆红素TBIL，直接胆红素DBIL，间接胆红素IBIL)的改变；图1C为PT和APTT改变。

图2本发明动物模型肝脏大体改变。图2A为正常恒河猴肝脏；图2B显示尸检病变肝脏呈黄色萎缩，肝包膜皱缩，肝边缘锐利。图3B为尸检恒河猴肝脏剖面观。

图3本发明动物模型肝组织切片油红O染色及HE染色。图3A为给药后36h活检油红O染色，显示肝细胞严重脂肪变；图3B为尸检肝细胞呈大片状坏死，

图4本发明动物模型肝脏超声及超声增强造影影像学改变。图示给药48h后肝脏回声稍增强，特别是左内叶局部区域，超声造影可观察到该区域呈低灌注，门静脉血流改变不明显，肝动脉阻力指数增高。给药60h后肝脏实质回声稍增强，彩色多普勒显示门静脉流速降低，肝动脉阻力指数增高。

图5本发明动物模型肝脏、脑的MRI影像学改变。给药后24h肝左叶信号稍增高，提示细胞水肿。给药后48h肝实质信号增高，不均匀。增强减弱区域增多。给药后66h，肝实质信号不均匀区增多，广泛，造影剂摄取不均匀区增多广泛，肝胆期信号普遍减低。头部MRI提示给药后48h无明显异常，给药后66h弥散图像显示出双侧颞叶、额叶片带状异常信号区，提示有超急性期缺血。

具体实施方式

实施例1本发明动物模型的制备

1、材料与方法：

1.1实验材料

3-4岁雌性和雄性恒河猴3只，无B疱疹病毒、猴逆转录病毒、猴白血病病毒和免疫缺陷病毒感染；购自成都平安动物繁育基地。

1.2主要试剂

鹅膏蕈碱(α-amanitin)，购自瑞士Alexis Biochemicals公司；

内毒素脂多糖(LPS)购自美国SigmaAldrich公司。

其他药品和耗材均购自华西医院利康药房。

1.3主要溶液的配制

鹅膏蕈碱溶液的配制：

A液：取原装1mg/支鹅膏蕈碱粉剂，加入5ml生理盐水溶解，作为储存液，4℃短期存放。

B液：根据猴体重，按照0.1mg/kg体重，吸取A液稀释至50ml生理盐水中，作为工作液。

内毒素脂多糖溶液的配制：

A液：秤取脂多糖100μg，溶解于1ml生理盐水，作为储存液，4℃短期存放。

B液：根据猴体重，按照1μg/kg体重，吸取A液，稀释至鹅膏蕈碱工作液中。

工作液现用现配。

1.4主要仪器

1)全自动生化分析仪

2)CT：PHILIPS BRILLIANCE 64排/16排

3)磁共振：SIEMENS TRIO 3T；SIEMENS AVANTO 1.5T(MR对比剂：莫迪司(Gd-BOPTA，multihance))

4)超声：PHILIPS BRILLIANCE IU22(超声对比剂：声诺维(SonoVue，注射用六氟化硫微泡))

1.5实验方法

1.5.1恒河猴肝功能、肾功能生化指标，心肌酶谱，血淀粉酶指标测定

通过测定上述指标，了解肝、肾、心及胰腺是否存在预存病变，并获得试验前动物基础值。

1)动物禁食10-12h，不禁水；

2)根据动物购入时体重，按15mg/kg肌肉注射氯氨酮(50mg/ml)；

3)待动物麻醉后，准确称量体重，并记录；

4)将恒河猴上下肢固定于手术台上，下肢小腿后侧备皮暴露大隐静脉，碘氟消毒；

5)20G留滞针穿刺大隐静脉，自动采血器采集全血6ml(分别做肝功能、肾功能、血常规、心肌酶谱、血糖和胰淀粉酶测定，并标记为0分钟数值)。

1.5.2恒河猴颅、胸腔、腹腔主要脏器影像学参数

通过CT、MRI及胸腹部超声，了解脑、心、肺、肝、肾、胰腺等主要脏器是否有预存病变，并获得试验前动物基础值。

1)动物麻醉同上。

2)腹部备皮。

3)分别采用PHILIPS BRILLIANCE 64排/16排CT、SIEMENS TRIO 3T和SIEMENS AVANTO 1.5T(增强磁共振采用MR对比剂为莫迪司Gd-BOPTA，multihance)磁共振进行全身扫描，获取全身主要脏器影像学参数。

4)采用PHILIPS BRILLIANCE IU22超声，获取心、肝、脾、肾、胰腺等主要脏器影像学参数(增强造影采用超声对比剂：声诺维SonoVue)。

5)图像采集完毕，待动物完全苏醒，送回笼内。

1.5.3恒河猴肝脏穿刺活检

1)动物麻醉同上。

2)上腹部以艾力克纱布对以进针点为中心向周围至少15em皮肤无遗漏地涂擦。待艾力克涂液自然干燥后，再用70％酒精棉球将艾力克擦去。铺巾。

3)于剑突下偏右侧肋缘进针1.5cm，扳动扳机，获取肝组织两条。

4)妥善处理创口。

5)分别对获取的肝组织进行冰冻切片及石蜡包埋切片。冰冻切片用于油红O染色，观察肝脂肪变情况。石蜡包埋切片用于HE染色，获取组织学参数。

6)活检完毕，待动物完全苏醒，送回笼内。

1.5.4鹅膏蕈碱及内毒素脂多糖注入恒河猴

1)动物麻醉同上。

2)中上腹部以艾力克纱布对以进针点为中心向周围至少15cm皮肤无遗漏地涂擦。待艾力克涂液自然干燥后，再用70％酒精棉球将艾力克擦去。

3)将输液针头插入腹腔，将鹅膏蕈碱及脂多糖混合液50ml滴注到腹腔内。滴注过程中多次晃动腹部，使药物均匀分布于腹腔。

4)滴注完毕，拔出针头，妥善处理创口。

5)待动物完全苏醒，送回笼内。给予正常饮食饮水。

6)密切观察动物生命体征。

1.5.5恒河猴FHF过程的动态观测

1)采用上述方法，分别于给药后每12h进行静脉采血，检测肝功能、肾功能、心肌酶谱、血糖、胰淀粉酶指标。

2)采用上述方法，分别于给药后每24h进行影像学(CT、MRI、超声)检查。

3)采用上述方法，分别于给药后每24h进行肝穿刺活检，标本用于冰冻切片油红O染色和石蜡包埋切片用于HE染色。

4)观察恒河猴生命体征、行为异常表现。

1.5.6恒河猴尸检

1)采用颈胸腹联合切口，从下颌正中向下沿前正中线经脐的左侧作一直线切开，止于耻骨联合。依次切开皮肤、皮下组织、肌肉，谨慎切开腹膜，切断胸壁下缘的肌肉，暴露腹腔各脏器。再将胸壁的皮肤连皮下组织和胸大肌一起自胸部中线起剥离，以充分暴露肋骨，用软骨刀切开肋骨与肋软骨交界处至胸锁关节处，用肋骨剪剪断第1肋骨，暴露胸腔。

2)检查腹腔各脏器：腹膜表面性状，色泽，有无渗出物附着，粘连等。腹腔内有否积液及气体，大网膜的位置与脏器有否粘连。各脏器的位置、大小是否正常。检查肠系膜同时注意其淋巴结是否肿大。

3)检查胸腔各脏器：检查心、肺的位置，大小，彼此间的关系，以及纵膈内淋巴结的外观，大小，硬度。胸膜的色泽，有无炎性渗出物附着及粘连，胸腔有无积液及气体。沿心脏底部在心包壁作“人”字形剪开，检查有无渗出物附着及粘连等。

4)将头部尽量向后仰，然后将软骨刀在下颌角内侧向上刺入，并沿骨之内缘逐渐向前割断口底组织一直绕至对侧该处，经下颌将舌牵出，沿脊柱前方将颈胸腹脏器联合取出。

5)依次取下各脏器，逐一详细检查，称量，测量体积，并检查脏器切面有无异常。

6)自一侧乳突经颅顶向另一侧乳突作一切线，切开皮肤后，剥离皮下软组织及骨膜。切开颞肌后，用细齿锯沿颅前后圆周切线锯断颅骨板全部及内板大部(但不要完全锯断，以免锯入脑内)。再用凿子、锤，轻轻击破内板之相连部分，用丁字凿掀起颅顶骨，将硬脑膜与骨分开。剪开上矢状窦检查其内有无血栓，再沿颅顶锯缘，将硬脑膜之四周剪断。于大脑纵裂深处，将大脑镰前端附着处割开，并拉大脑镰向后，露出两侧大脑半球全部表面，用左手托住脑顶部，右手指伸入脑额叶前端下方将之扶起，露出脑神经、垂体柄及小脑幕，逐一切断脑神经、垂体柄及小脑幕。最后将刀深入脊管内，割断颈髓及椎动脉，取出脑髓。然后用小刀将垂体周围组织分离，取出垂体。

7)观察有无脑出血、脑水肿等改变。

8)各脏器作适当切割后，即放于10％福尔马林液内固定。

2.实验结果

2.1鹅膏蕈碱联合脂多糖导致肝细胞大量坏死从而诱导FHF的发生

恒河猴腹腔滴注鹅膏蕈碱和内毒素脂多糖溶液后12h即出现肝脏转氨酶10倍以上的升高，肝脏活检见肝细胞发生脂肪变。至24h，转氨酶升高达50倍左右，胆红素水平上升，凝血酶原时间(PT)和APTT延长；影像学检查示肝细胞水肿，其余改变不明显。至给药后36h，转氨酶升高达到200-300倍，PT和APTT显著延长，胆红素水平显著上升，肝细胞出现中央静脉周围及肝小叶中央区大片状坏死，残余肝细胞脂肪变明显。至48h，转氨酶水平下降，胆红素持续升高，PT和APTT显著延长，影像学显示肝脏左内叶局部区域回声增强，呈低灌注，门静脉血流阻力升高。至60h，转氨酶水平继续下降，胆红素水平继续升高，PT和APTT显著延长，影像学显示肝脏密度不均，门静脉血流阻力升高。

2.2鹅膏蕈碱联合脂多糖对肝外器官损伤轻微

除肝脏出现显著病变外，血淀粉酶及心肌酶谱及相应的影像学指标显示肾脏、胰腺、心脏无明显损伤。肌酐水平在给药后48h显著升高，但尿酸和尿素水平并无明显改变。给药后36h起，血糖水平持续下降。

2.3鹅膏蕈碱联合脂多糖导致FHF可表现出严重的肝性脑病

给药后48h有脑水肿表现，恒河猴表现为行为减少、进食减少、嗜睡；给药后60h恒河猴出现昏睡至昏迷状态，CT及MRI可见双侧颞叶、额叶片带状异常信号区，提示脑急性缺血。

2.4鹅膏蕈碱联合脂多糖给药后恒河猴均发生死亡

3只恒河猴于给药后66h-96h内死亡。

2.5尸检及病理学显示鹅膏蕈碱联合脂多糖特异作用于肝细胞，导致肝细胞大量坏死，是最终引起动物死亡的主要原因

尸检显示：腹腔未见明显积液。肝脏呈急性黄色萎缩，边缘锐利，包膜皱缩。未见门静脉血栓形成。肺门、肾门、肠系膜、胃大弯侧淋巴结呈肿大，大小约绿豆至黄豆大，呈暗黑色。心、肺、肾、胰腺、胃、小肠、结肠、膀胱、输尿管、子宫等未见肉眼可见异常。轻度脑水肿，脑沟变浅，脑回增宽。颅底、硬脑膜外、硬脑膜下及蛛网膜下未见出血，脑实质未见出血，无脑疝形成。

各主要脏器进行石蜡包埋，切片，HE染色后镜下观察并照相。

肝：肝小叶结构紊乱，肝窦扩张充血，肝细胞广泛坏死，残留少量肝细胞未见再生现象。小叶内和汇管区可见淋巴细胞浸润。

肾：肾小球的毛细血管球扩张充血，肾小管上皮细胞水肿，管腔内可见蛋白管型，间质血管扩张充血。

肺：肺泡间隔增宽，肺泡壁毛细血管血管扩张充血。

淋巴结：肺门、胃大弯侧、肠系膜、肾门处淋巴结肿大，结内淋巴细胞大片减少伴出血，组织细胞增生，部分区域淋巴滤泡增生，增生的滤泡中央血管壁增厚玻变。

脑：脑膜下浅层脑组织疏松水肿。

结肠：灶性区域结肠粘膜上皮细胞坏死脱落。

心脏：心肌纤维波浪状改变。

按下表测定各指标，结果显示，本发明动物模型满足诊断指标要求，证明本发明造模成功。

表1.人与恒河猴爆发性肝衰模型比较

本发明制备的恒河猴爆发性肝功能衰竭模型具有制作简单、肝脏损伤的特异性、肝外毒性小、各项生化指标、影像学指标以及疾病过程和转归高度类似人爆发性肝功能衰竭的相应改变。从给药到动物死亡具有较长的治疗时间窗，可用于筛选促肝细胞再生药物，评估肝移植、组织工程肝、生物人工肝支持系统、肝细胞移植以及干细胞移植的治疗效果。

实施例2利用本发明恒河猴爆发性肝功能衰竭动物模型评价组织工程肝支持系统或肝细胞、干细胞移植效果并建立相关的评价体系

a、按实施例1的方法制备恒河猴爆发性肝功能衰竭模型，它是将鹅膏蕈碱联合脂多糖内毒素施用于灵长类动物，鹅膏蕈碱的施用剂量为：0.1mg/kg，脂多糖内毒素的施用剂量为1μg/kg；

b、采用细胞移植或器官移植于该动物模型；

c、观察移植后动物的肝功能的量化指标影响情况，评价组织工程肝支持系统或肝细胞、干细胞移植效果。

经过步骤c的评价，如果移植后的动物肝功能指标有明显改善的，则可以证明采用细胞移植或器官肝移植、组织工程肝、生物人工肝方式治疗爆发性肝功能衰竭的可行性。

综上所述，本发明制备的爆发性肝功能衰竭动物模型建模成功，可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药的评价和肝移植、组织工程肝、生物人工肝支持系统、肝细胞移植以及干细胞移植的治疗效果的评价。

Claims (2)

1.鹅膏蕈碱联合内毒素脂多糖在制备用于筛选治疗爆发性肝功能衰竭药物、评价组织工程肝支持系统或肝细胞、干细胞移植治疗效果的灵长类动物模型中的用途，其中鹅膏蕈碱的施用剂量为0.1mg/kg,内毒素脂多糖施用剂量为1μg/kg；

鹅膏蕈碱与内毒素脂多糖同时施用，施用方法为：单次腹腔滴注；

所述灵长类动物为恒河猴。

2.一种爆发性肝功能衰竭动物模型的制备方法，其特征在于：它是将鹅膏蕈碱与内毒素脂多糖施用于灵长类动物，鹅膏蕈碱的施用剂量为0.1mg/kg，内毒素脂多糖的施用剂量为1μg/kg；

所述灵长类动物为恒河猴；

所述的施用方法为：单次腹腔滴注。