CN102525689B - 取向纳米纤维仿生神经导管及其制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种取向纳米纤维仿生神经导管及其制作方法,通过同轴静电纺丝制备出取向度为≥75%的纳米纤维膜,然后卷曲制成神经导管,纤维中加入NGF使所述仿生神经导管结合了“纳米仿生”、“接触引导”和“药物缓释”等多种促进神经再生的因素,通过动物实验证明,本发明仿生神经导管能够有效促进神经再生。
Description
技术领域
本发明涉及一种神经修复导管及其制作方法,尤其涉及一种能够快速促进神经生长的神经导管及其制作方法。
背景技术
神经系统控制着人体的感官运动功能,神经一旦缺损,则意味着某些部位感觉、运动功能的丧失,给患者带来极大的痛苦,因此神经修复与再生成为人们关注的重点。自体神经移植是临床修复神经损伤最为经典的方法,但是该方法需要切取患者自述健康神经,不仅增加了手术部位,还可能造成该神经支配区功能障碍;而同种异体神经移植则需要联合应用免疫抑制剂,移植成功率较低。因此,长期以来临床对周围神经损伤的修复不甚理想,对粗大、长段神经缺损和多发性神经损伤更是无计可施。
美国专利US4963146公开了一种多层、半渗透导管以来,研究新的神经导管来桥接神经断端,以实现修复周围神经损伤一直是一个研究热点。神经导管通常是以生物或非生物材料制成合适的管状支架,桥接神经断断,在提供神经再生微环境的同时,通过神经趋化诱导、神经营养作用促进神经再生;利用神经导管修复受损神经具有以下优点:减轻缝合口的张力;引导神经元轴突轴向生长,避免外生和形成神经瘤;为神经再生提供一个相对隔绝的微环境,防止瘢痕组织侵入再生的神经纤维;固定并支持缺损神经的两端,提高神经束对合的精确度;同时可以在神经导管中植入神经营养因子以提高神经再生速度和质量。如专利CN1241656C公开的一种复合型聚乳酸缓释人工神经导管材料及制备方法,将聚乳酸、纳米羟基磷灰石和NGF(nerve growth factor,神经生长因子)混合,通过溶剂挥发制成具有微孔的复合导管;专利CN100539965C公开了一种可吸收神经导管及其制作方法,将壳聚糖和乳酸涂覆在模具棒上,干燥脱模制成神经导管;专利CN100479785C公开了一种双层人工神经导管的制备方法,将壳聚糖溶液和胶原蛋白溶液分别倒入模具中制得导管,然后将胶原蛋白导管插入壳聚糖导管中,并在两层导管之间填充纤维蛋白胶制成双层导管。
但是,神经导管除要求具有生物相容性外,还要能够在体内保持稳定状态,不易塌陷和断裂,Lundborg提出了“内在支架”的概念,将纤维细丝置入神经导管的管腔内形成内在支架,起到温度基质桥的作用。在此基础上,专利CN101366980A、公开了一种双层编织神经导管及其制备方法,将聚乙交酯-丙交酯纱线编织成内、外层管壁,然后用壳聚糖浆液浸渍外层,并将内层管壁穿入外层制成编织神经导管;专利CN101366981A则采用聚乙交酯-丙交酯平行纱层粘合制成内层,与聚乙交酯-丙交酯纱线编织成的外层一起组成编织神经导管;专利CN101366982A则采用甲壳素无纺布为内层,聚乙交酯-丙交酯纱线编织成外层制成编织神经导管。上述专利技术虽然能够提高神经导管的强度,但是应用效果并不好。
而且,上述专利技术中公开的神经导管,均采用的是横向取向的方式,神经再生效果不好。
发明内容
本发明提供了一种由取向纳米纤维组成的神经导管,通过拉伸制成高取向度的纳米纤维膜,然后卷成神经导管。所制成的神经导管在纤维取向方向具有较高的模量和强度,并能够引导细胞沿纤维取向方向(神经导管延伸方向)生长,神经再生速度加快,弥补了传统神经导管性能的不足。
本发明取向纳米纤维仿生神经导管为可生物降解材料制成的纳米纤维组成的中空管,其内径为0.5~5.0mm,外径为1.0~6.0mm;所述纳米纤维直径为150nm~1100nm,并且所纳米纤维朝所述神经导管延伸方向取向,取向度≥75%。
本发明取向度的测试中,以神经导管延伸方向为基准,与该方向倾斜角度在15°以内的纤维,均定义为朝神经导管延伸方向取向的纤维。
其中,所述可生物降解材料优选为乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。
其中,所述神经导管中纳米纤维取向度为50%~100%。
根据所述取向纳米纤维仿生神经导管的一种优选实施方式,其中,所述纳米纤维为中空纤维,空腔内填充有包括神经生长因子(NGF)的混合物。
优选地,所述混合物还包括聚乙二醇(PEG)。
其中,所述NGF与PEG用量比优选为10μg:100~400mg。
本发明还提供了一种所述仿生纳米神经导管的制作方法,其中:
以生物相容性聚合物溶液为壳层溶液,神经生长因子的缓冲溶液中加入聚乙二醇作为芯层溶液,分别通过不同注射容器使两种溶液在喷丝口汇合,其中壳层溶液在外层,芯层溶液在内层;
然后同轴共纺制成由具有壳、芯两层结构的纳米纤维组成的纳米纤维膜,其中,纺丝过程中进行拉伸,使纳米纤维单轴取向;
最后,以纳米纤维取向方向为轴向,将纳米纤维膜卷成所述仿生神经导管。
其中,优选为采用转速为4000转/分钟(4000rpm)的滚轴进行拉伸。
其中,优选为静电纺丝技术进行同轴共纺。
其中,所述缓冲溶液为PH值为7.0~7.5的缓冲溶液,并进一步优选为磷酸盐缓冲溶液。
本发明取向纳米纤维仿生神经导管,纤维取向度高,神经导管抗张强度和形状维持能力优异。同时纵向取向能够引导细胞沿纤维取向方向(即神经导管延伸方向)定向排列,从而更好的促进神经再生。
将纳米纤维制成壳、芯结构,壳层选用生物降解材料制成,芯层为神经生长因子,制成一种可控制、有活性的复合神经导管,可局部释放有活性的神经生长因子,模拟自体神经的结构和功能。
同时在芯层中加入PEG,可以提高纤维丝的均匀度,从而使制成的神经导管具有更为优异的性能。
采用同轴共纺技术时,电荷只富集在液滴外表面(壳层),可以为核心部分液体(芯层)提供一个天然、温和的环境,分散在芯层的活性物质可以免受电场力的影响,从而能够耐受电纺过程而不丧失活性。
附图说明
图1为同轴共纺静电纺丝过程示意图。
图2为本发明实施方式1仿生神经导管结构SEM照片;
图3为本发明实施方式1仿生神经导管纤维直径分布图;
图4为本发明实施方式2仿生神经导管纤维壳、芯结构TEM照片;
图5为本发明实施方式2仿生神经导管NGF缓释曲线;
图6为本发明实施方式2仿生神经导管动物实验电生理检查神经传导速度对比图;
图7为本发明实施方式2仿生神经导管动物实验电生理检查动作电位振幅对比图
图8为本发明实施方式2仿生神经导管动物实验腓肠肌湿重比对比图;
图9为本发明实施方式2仿生神经导管动物实验组织学检查对比图;
图10为本发明实施方式2仿生神经导管动物实验再生神经纤维数对比图;
图11为本发明实施方式2仿生神经导管动物实验神经组织百分比对比图;
图12为本发明实施方式2仿生神经导管动物实验再生神经髓鞘厚度TEM照片;
图13为本发明实施方式2仿生神经导管动物实验再生神经髓鞘厚度对比图;
图14为本发明实施方式3仿生神经导管纳米纤维丝SEM照片。
图15为本发明实施方式3仿生神经导管纤维直径分布图。
具体实施方式
周围神经损伤是临床常见疾患,其预后差,致残率非常高,给病人、家庭和社会带来巨大的经济损失和精神负担。因此,如何促进神经的再生、恢复靶器官的功能一直是关注的热点。临床上对于周围神经的离断伤,常采用显微外科技术进行端-端外膜缝合、束膜缝合或联合缝合,以恢复神经的连续性;对于周围神经缺损,自体神经移植仍是目前修复的主要选择。但存在再生速度慢、自体神经取材来源有限、供体与受体神经直径不匹配等缺点,同时切取自体神经时也将造成供区的损伤及一定的功能障碍。因此寻找自体神经的替代物以及促进神经再生的方法成为研究领域的热点。
近年来,组织工程学的兴起,为众多的组织缺损、器官功能衰竭病人的治疗带来了曙光。利用生物材料构建的神经再生支架,不仅可以为神经细胞获取营养、生长和代谢提供了一个有利的空间,还具有减轻缝合口的张力,引导神经纤维的生长,提高神经束对合的精确度,防止瘢痕组织侵入再生的神经纤维等优点。理想的神经再生支架应满足:1)仿生天然细胞外基质的结构和生物学功能,2)有良好的生物相容性使得细胞可以黏附和增殖,3)降解速率与组织再生的速率相匹配,5)适当的机械性能,支撑细胞生长,5)具有较好的显微结构,比如适合的孔尺寸、高孔隙率和相连的孔形态,6)特定的三维外形,7)高比表面积和合适的表面理化性质
在此基础上,本发明提供的取向纳米纤维仿生神经导管,是由直径为150nm~1100nm、并朝所述神经导管延伸方向取向的纳米纤维组成的中空管,取向度优选为50%~100%
下面通过具体实施例对本发明取向纳米纤维神经导管进行详细的介绍,以使更好了理解本发明,但下述实施例并不限制本发明范围。
实施方式1:
本发明取向纳米纤维仿生神经导管,有取向的可生物降解纳米纤维制成,所述神经导管内径为0.5~5.0mm,外径为1.0~6.0mm,内外径可根据需要进行调整;取向度≥75%。
我们以PLGA为例,采用纺丝技术制作所述神经导管,方法如下:
配制PLGA溶液,连接纺丝装置,调整溶液流速、电压、滚轴转速、接收距离等纺丝参数,通过滚轴拉伸制备出单轴取向的纳米纤维组成的纤维膜;以纳米纤维取向方向为轴向,将纤维膜卷曲制成神经纤维导管,卷成的神经导管可以采用缝合或者粘合等方式将结合部固定连接。
10kv加速电压下,扫描电子显微镜(SEM)观察纤维形态,参照图2,可见本发明取向纳米纤维仿生神经导管均朝神经导管延伸方向取向,并具有较高的取向度,经计算取向度为78.2%。
应用Image-J软件对SEM照片进行分析,随机计算100根纤维直径,评价纤维平均直径、直径范围和直径分布,参照图3,纳米纤维直径范围为150nm~550nm,平均直径为299±67nm。
由于本发明采用的是纤维沿神经导管纵向取向,取向的纤维素可以控制细胞取向,并在纵向增强细胞体与纤维间的相互作用,因此本发明取向纳米纤维神经导管能够引导细胞沿纤维取向方法(即神经导管延伸方向)定向排列,从而更好的促进神经再生。
实施方式2:
在实施方式1的基础上,组成本发明所述仿生神经导管的纳米纤维为中空纤维,空腔内填充有神经生长因子(NGF)等生物活性物质,如蛋白、药物等等,从而组成壳、芯结构。
参照图1,以同轴共纺静电纺丝技术为例,本发明取向纳米纤维仿生神经导管制作方法如下:
配制8%浓度的PLGA溶液作为壳层溶液6;取NGF冻干粉10μg溶解到PH值为7.0~7.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,搅拌均匀得到含NGF的芯层溶液5;取两支注射器1和2分别吸取壳层溶液和芯层溶液,连接同轴静电纺丝装置,将壳层溶液置于外层,芯层溶液置于内层,调整溶液流速、电压、接收距离、滚轴8的转速(以4000转/分钟为例)等静电纺丝参数,制成单轴取向纳米纤维7组成的纤维膜。参照实施方式1所述的方式制成神经导管。
其中,所述静电纺丝技术指的是聚合物喷射静电拉伸纺丝法,所用装置包括高压静电发生器3、带细小喷头的喷丝装置接收装置4。
175kv电子加速率下,透射电子显微镜(TEM)观察纤维结构,如图4所示,所制成的纤维具有明显的壳层12和芯层11。
1)NGF缓释研究
将载有NGF的纳米纤维膜放入含PBS的24孔培养皿中,定期取上清液用ELISA检测NGF含量。
图5为缓释1个月的NGF缓释曲线特点,从图中可以看出,NGF释放分为两个阶段,前3天为早期突释现象,NGF释放约为29%;之后则为缓慢的均匀释放。
2)动物实验研究
用所制作的负载NGF的取向纳米纤维仿生神经导管桥接修复大鼠13mm坐骨神经缺损,术后3个月进行肌电图检测、腓肠神经湿重比、组织学观察、电镜扫描以及图像分析和统计学分析等方法,综合分析评价载药神经导管临床应用的有效性和安全性。并将本发明组(PLGA/NGF)与自体神经移植组(Autograft)对比。
电生理检查神经传导速度(参照图6)和动作电位振幅(参照图7)结果显示,使用本发明仿生神经导管修复时,神经恢复速度与自体神经移植组无统计学差异。
腓肠肌湿重比(参照图8)显示,PLGA/NGF组腓肠肌恢复速度与自体神经移植组无统计学差异。
图9为再生神经中段甲苯胺髓鞘染色对比照片(A为PLGA/NGF组,B为自体神经移植组),图10、11分别为再生神经纤维数和神经组织对比图,从图9~11可以发现,组织学检查结果与上述功能检测结果相符。
TEM检查再生神经髓鞘厚度,结果显示PLGA/NGF组再生神经较为成熟(图12),髓鞘厚度与自体神经移植组无统计学差异(图13)。
实施方式3:
在实施方式2的基础上,组成本发明仿生神经导管的壳、芯结构纤维的芯层还包括聚乙二醇。
参照实施方式2所述的方法,本发明取向纳米纤维仿生神经导管制作方法如下:
配制8%浓度的PLGA溶液作为壳层溶液;取NGF冻干粉10μg溶解到PH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,配成NGF溶液,取400mgPEG加入NGF溶液中配成浓度为400mg/ml的NGF/PEG溶液作为芯层溶液。
取注射器分别吸取芯层溶液和壳层溶液,连接同轴静电纺丝装置,PLGA溶液(壳层溶液)置于外层,NGF/PEG溶液(芯层溶液)置于内层,调整静电纺丝参数,4000转/分钟转速拉伸,纺丝制得单轴取向纳米纤维膜。
将所制得的纳米纤维膜卷曲制成神经导管。
通过SEM和Image-J软件进行形态学检测,参照图14可以看出,加入聚乙二醇之后,纳米纤维丝得到了较高的均匀度。
参照图15,所制得的仿生神经导管直径范围为200~1100nm,平均直径为513±174nm。与图3相比,加入PEG之后纤维直径变化较小,也说明纤维均匀度得到了提高。
实施方式4:
在实施方式3的基础上,为了兼顾纤维均匀度、NGF含量和易于纺丝,PEG加入量可根据需要进行调整,如每10μgNGF加入100mg、200mg或300mgPEG等。
应当注意的是,本发明取向度的测试中,以神经导管延伸方向为基准,与该方向倾斜角度在15°以内的纤维,均定义为朝神经导管延伸方向取向的纤维。
综上所述,本发明利用同轴静电纺丝制备出取向纳米纤维组成的仿生神经导管,该神经导管结合了“纳米仿生”、“接触引导”以及“药物缓释”等多种促进神经再生的因素,通过大鼠13mm坐骨神经缺损模型研究证明,该仿生神经导管可以有效的促进神经再生,再生神经功能与形态接近自体神经移植组。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (6)
1.一种取向纳米纤维仿生神经导管,其特征在于,所述仿生神经导管是由直径为150nm~1100nm、并朝所述神经导管延伸方向取向的纳米纤维组成的中空管,所述仿生神经导管内径为0.5~5.0mm,外径为1.0~6.0mm;所述纳米纤维由可生物降解材料制成,取向度≥75%;所述可生物降解材料为乳酸-羟基乙酸共聚物;所述纳米纤维为中空纤维,空腔内填充有包括神经生长因子的混合物;所述混合物中还包括聚乙二醇;神经生长因子与聚乙二醇用量比为10μg:100~400mg。
2.一种如权利要求1所述的仿生神经导管的制作方法,其特征在于,
以生物相容性聚合物溶液为壳层溶液,神经生长因子的缓冲溶液中加入聚乙二醇作为芯层溶液,分别通过不同注射容器使两种溶液在喷丝口汇合,其中壳层溶液在外层,芯层溶液在内层;
然后同轴共纺制成由具有壳、芯两层结构的纳米纤维组成的纳米纤维膜,其中,纺丝过程中进行拉伸,使纳米纤维单轴取向,取向度≥75%;
最后,以纳米纤维取向方向为轴向,将纳米纤维膜卷成所述仿生神经导管。
3.根据权利要求2所述的制作方法,其特征在于,所述拉伸为采用转速为4000转/分钟的滚轴进行拉伸。
4.根据权利要求2所述的制作方法,其特征在于,所述缓冲溶液为PH值为7.0~7.5的缓冲溶液。
5.根据权利要求4所述的制作方法,其特征在于,所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
6.根据权利要求2所述的制作方法,其特征在于,所述同轴共纺采用静电纺丝技术。
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