CN102520188B - 一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于流式细胞术技术领域，具体涉及一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法。其是将100～120nm二氧化硅纳米粒子表面的氨基或羧基官能团与待测细胞胞内蛋白的抗体的氨基通过共价键连接，进而与经超声等方法得到的细胞胞内蛋白共同孵育，再加入另一种不同来源靶向同一待测细胞胞内蛋白的抗体进行孵育，然后用荧光素标记的二抗孵育，形成“二氧化硅纳米粒子-抗体-细胞胞内蛋白-抗体-荧光素标记的二抗”复合物，最后运用流式细胞术对该复合物进行定性检测。二氧化硅纳米粒子与待测细胞胞内蛋白的抗体结合后具有主动靶向性，能够靶向各种不同的细胞胞内蛋白。
Description
技术领域
本发明属于流式细胞术技术领域，具体涉及一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法。
背景技术
恶性肿瘤也称为癌症，是目前威胁人类生命和健康的主要疾病之一。癌症的发病率呈逐年上升趋势，尤其是70年代以后，癌症发病数以年均3％～5％的速度递增，不仅如此，癌症的发病年龄还趋于年轻化，已成为人类第二大死因。为此，医学界一直努力探寻对其进行有效的诊治。经过半个多世纪的发展和完善，外科手术、放疗、化疗等方法已经成为恶性肿瘤综合治疗的主要手段，但在临床应用时常常引起严重的毒副作用，其治疗效果并不是很好，治愈率通常较低。大量临床事实证明，癌变初期的治愈率是相当高的。因此，治疗癌症的关键在于有效的早期诊治。目前诊断恶性肿瘤最有效的手段是病理诊断，但准确性往往受限于操作医生的工作经验，早期病变容易漏诊、误诊。X线、B超、CT、NMRI是临床常用的检测诊断技术，但是也都存在分辨率不够高的缺点。寻找方便、快捷、准确的癌症早期诊断方法意义重大，所以研究更先进的手段或者仪器来实现准确、及时的癌症早期诊断一直是人们努力的方向，也是广大医药工作者研究的热门课题。
纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(0.1～100nm)或由它们作为基本单元构成的具有特殊性能的材料。纳米材料自从被发现和合成以来就一直是人们关注的热点。由于其自身具备一些特殊性质为生物医学的研究提供了良好的平台，因此在最新的研究中，纳米材料在生物医学领域中的应用备受瞩目。纳米技术是研究纳米材料性质和应用的一门技术。目前科研人员通过该技术制成了药物、基因、生物大分子等载体，称之为纳米载体。纳米载体是一种新型、高效、稳定、特异性强的靶向载体，主要应用于生物医药领域。纳米载体具有多种形态：纳米微球(纳米粒)、纳米管、纳米片以及纳米多边形等。其中，纳米微球(纳米粒)是一种应用较为广泛的纳米载体。由于肿瘤所特有的病理生理变化，在肿瘤的诊断治疗中，纳米技术能更好地检测疾病所导致的分子和细胞改变。近年来，研发的纳米载体多用于癌症的靶向治疗，如靶向药物的运载，而在早期诊断方面的研发甚少，这也是目前相关生物技术领域中的研究前沿。
流式细胞术是借助流式细胞仪通过抗原抗体反应和荧光标记法完成对细胞各种特性进行定性定量的一种分析技术。自1977年Horan首次利用流式细胞仪将纳米高分子微球应用于免疫学检测以来，以纳米微球作为载体的生物检测技术已经渗透到细胞生物学、分子生物学、免疫学、医学等各个领域。由于流式细胞仪具有可根据微球粒径及所带特征荧光信号对微球进行特异性识别的能力，因此可利用纳米微球结合流式细胞术建立特异分子的检测技术。
近年来，研究人员发现量子点纳米粒具有生物发光特性，可以此作为标记载体，应用流式细胞术检测肿瘤，但是该方法只能检测出细胞表面特异性分子。二氧化硅纳米粒是极其重要的高科技超微细无机新材料之一，因其粒径很小、微孔多、比表面积大、表面吸附力强、分散性能好、稳定性佳等方面具有特异的性能，在众多学科及领域内独具特性，是一种具有广泛应用前景的无机纳米粒子。为此，本发明选用二氧化硅纳米粒子结合流式细胞术建立肿瘤相关胞内蛋白的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，尤其是检测与肿瘤相关的胞内蛋白的方法，其包括如下步骤：
1.二氧化硅纳米粒的制备
(1)表面氨基化二氧化硅纳米粒的制备：
先采用
法制备粒径为100～120nm的二氧化硅纳米粒，然后用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷对二氧化硅纳米粒进行了表面修饰，得到表面氨基化的二氧化硅纳米粒；
(2)表面羧基化二氧化硅纳米粒的制备：
先采用法制备粒径为100～120nm的二氧化硅纳米粒，然后用硅烷偶联剂和丁二酸酐对二氧化硅纳米粒表面进行羧基化改性，得到表面羧基化的二氧化硅纳米粒；
2.具有结合胞内蛋白特异性二氧化硅纳米粒的制备：
(1)具有结合胞内蛋白特异性的表面氨基化二氧化硅纳米粒的制备：首先用质量分数为25％的戊二醛溶液活化步骤1中制备的100～120nm表面氨基化的二氧化硅纳米粒，再将活化后的纳米粒经磷酸盐缓冲液(PBS，NaCl 0.8g，KCl0.02g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.02g，H2O 100ml，pH 8.0)清洗后重悬于PBS(pH 8.0)中形成2.5mg/ml的纳米粒悬液；
然后将上述纳米粒悬液与抗某种胞内蛋白的特异性抗体溶液(购于SantaCruz Biotechnology，来源于小鼠，如β-actin、Akt2、p-Akt1/2/3等，抗体∶PBS体积比＝1∶200～1000)混合，在4℃轻轻搅拌过夜，真空冻干后得到具有结合蛋白特异性的表面氨基化二氧化硅纳米粒，其中纳米粒悬液与抗体溶液的体积比为2～5∶1；
(2)具有结合胞内蛋白特异性的表面羧基化二氧化硅纳米粒的制备：首先将步骤1制备的100～120nm表面羧基化的二氧化硅纳米粒用PBS重悬形成浓度为2.5mg/ml的悬液，之后用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对纳米粒进行活化；
然后再将活化后的纳米粒悬液与抗某种胞内蛋白的特异性抗体溶液(购于Santa Cruz Biotechnology，来源于小鼠，如β-actin、Akt2、p-Akt1/2/3等，抗体∶PBS体积比＝1∶200～1000)在4℃轻轻搅拌2h，真空冻干后得到具有结合胞内蛋白特异性的表面羧基化二氧化硅纳米粒，其中活化后的纳米粒悬液与抗体溶液的体积比为2～5∶1；
3.肿瘤细胞胞内总蛋白的提取：将体外培养的人肿瘤细胞(如肝癌细胞、乳腺癌细胞或宫颈癌细胞)通过超声破碎裂解法获得肿瘤细胞胞内总蛋白溶液，浓度为100～200μg/ml；
4.与肿瘤细胞胞内总蛋白的结合：将具有结合胞内蛋白特异性的二氧化硅纳米粒与获得的细胞胞内总蛋白溶液混合(1mg∶200～400μl)，4℃孵育30～60min，然后用PBS清洗2～3次，最后4℃、12000rpm离心5～10min得到与肿瘤细胞胞内总蛋白结合的纳米粒子；
5.在步骤4中加入与步骤2中等浓度和体积的另一不同来源的抗同一胞内蛋白的特异性抗体溶液(购于Santa Cruz Biotechnology，来源于兔，如β-actin、Akt2、p-Akt1/2/3等)，4℃孵育30～60min；然后用PBS(pH 8.0)清洗2～3次，最后用PBS(pH 8.0)重悬该反应后的纳米粒，使其浓度为5mg/ml；
6.在步骤5中加入荧光素标记的二抗(如FITC标记的小鼠抗兔IgG)，其中加入的荧光素标记的二抗溶液与步骤5中反应后纳米粒悬液的体积比为1∶200～500，4℃避光孵育30～60min；然后用PBS(pH 8.0)清洗2～3次，之后用PBS(pH 8.0)重悬该反应后的纳米粒，使其终浓度约为1×105个/ml，从而制备得到“二氧化硅纳米粒-抗体(鼠源)-肿瘤细胞胞内蛋白-抗体(兔源)-荧光素标记二抗(FITC标记的小鼠抗兔IgG)”的实验组复合物；
7.以1mg/ml牛血清白蛋白溶液替代步骤3中的肿瘤细胞胞内总蛋白，重复步骤2～6，从而制备“二氧化硅纳米粒子-抗体(鼠源)-牛血清白蛋白-抗体(兔源)-荧光素标记二抗(FITC标记的小鼠抗兔IgG)”作为对照组复合物；
8.利用流式细胞术对步骤6制备的“二氧化硅纳米粒-抗体(鼠源)-肿瘤细胞胞内蛋白-抗体(兔源)-荧光素标记二抗(FITC标记的小鼠抗兔IgG)”复合物及步骤7制备的对照组复合物进行检测，从而实现对肿瘤细胞特异性胞内蛋白的定性检测。
由于抗体与抗原的结合具有特异性，为此抗体可与实验组中的某种细胞胞内蛋白结合，而不与对照组中的牛血清白蛋白结合，表现为利用流式细胞术检测的结果是实验组复合物的荧光强度大于对照组复合物的荧光强度。因此，本发明中二氧化硅纳米粒子与待测细胞胞内蛋白的抗体结合后具有主动靶向性，根据与二氧化硅纳米粒子结合的抗体的种类不同，能够靶向各种不同的细胞胞内蛋白，尤其适用于靶向肿瘤细胞特异性胞内蛋白，从而实现对细胞胞内蛋白的定性检测。本发明能够快速有效地检测肿瘤细胞胞内蛋白样品，可用于胞内肿瘤标志物的快速检测，为肿瘤的早期发现、早期诊断提出了一种新型、有效的方法，为临床肿瘤诊断奠定了基础。
本发明的优势在于：
1.本发明所采用的二氧化硅纳米粒具有粒径小、微孔多、比表面积大、表面吸附力强、分散性能好、稳定性佳等优点，且成本低，制备相对简单。
2.本发明利用流式技术通过抗原抗体反应能够快速有效地检测出细胞内的相关蛋白，尤其是与肿瘤发生、发展相关的胞内蛋白，如蛋白激酶B(Akt)、人类白细胞抗原G(HLA-G)、人黑色素瘤相关抗原(MAGE)等。
3.为肿瘤的早期发现、早期诊断提出了一种新型、有效的方法，为临床肿瘤诊断奠定了基础。
附图说明：
图A和B为实施例1流式细胞术的检测结果：
A图为表面氨基化二氧化硅纳米粒-β-actin抗体(鼠源)-HepG2细胞胞内蛋白β-actin-β-actin抗体(兔源)-FITC标记的小鼠抗兔IgG(实验组)及其相应对照组复合物的流式细胞术分析图；其中，绿色曲线(曲线1)代表对照组复合物的流式细胞术检测结果，紫色曲线(曲线2)代表实验组复合物流式细胞术检测结果；FITC代表形成复合物中FITC标记的二抗荧光强度。
B图为表面羧基化二氧化硅纳米粒-β-actin抗体(鼠源)-HepG2细胞胞内蛋白β-actin-β-actin抗体(兔源)-FITC标记的小鼠抗兔IgG(实验组)及其相应对照组复合物的流式细胞术分析图；其中，绿色曲线(曲线3)代表对照组复合物的流式细胞术检测结果，黑色曲线(曲线4)代表实验组复合物流式细胞术检测结果；FITC代表形成复合物中FITC标记的二抗荧光强度。
从图中可以看出，无论是表面氨基化二氧化硅纳米粒还是表面羧基化二氧化硅纳米粒的实验组中FITC标记的二抗荧光强度均显著大于对照组，表明抗β-actin抗体与实验组肿瘤HepG2细胞胞内蛋白β-actin发生了特异性的结合，而未与对照组牛血清白蛋白发生特异性的结合。β-actin是一种重要的细胞骨架蛋白，广泛分布于细胞内，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。通过上述结果发现利用本发明的方法可定性检测出细胞胞内蛋白β-actin的表达，从而表明本发明方法对于检测细胞胞内蛋白是有效的。
图C和D为实施例2流式细胞术的检测结果：
C图为表面氨基化二氧化硅纳米粒-Akt2抗体(鼠源)-MCF7细胞胞内蛋白Akt2-Akt2抗体(兔源)-FITC标记的小鼠抗兔IgG(实验组)及其相应对照组复合物的流式细胞术分析图；其中，绿色曲线(曲线5)代表对照组复合物的流式细胞术检测结果，红色曲线(曲线6)代表实验组复合物流式细胞术检测结果；FITC代表形成复合物中FITC标记的二抗荧光强度。
D图为表面羧基化二氧化硅纳米粒-Akt2抗体(鼠源)-MCF7细胞胞内蛋白Akt2-Akt2抗体(兔源)-FITC标记的小鼠抗兔IgG(实验组)及其相应对照组复合物的流式细胞术分析图；其中，绿色曲线(曲线7)代表对照组复合物的流式细胞术检测结果，粉色曲线(曲线8)代表实验组复合物流式细胞术检测结果；FITC代表形成复合物中FITC标记的二抗荧光强度。
从图中可以看出，无论是表面氨基化二氧化硅纳米粒还是表面羧基化二氧化硅纳米粒的实验组中FITC标记的二抗荧光强度均显著大于对照组，表明抗Akt2抗体与实验组肿瘤MCF-7细胞胞内蛋白Akt2发生了特异性的结合，而未与对照组牛血清白蛋白发生特异性的结合。Akt2是肿瘤标志蛋白Akt中的一种，在肿瘤细胞中具有特异性表达。通过实例1与本实例可以看出，利用本发明的方法不仅能够定性检测出非肿瘤相关胞内蛋白的表达，还能够定性检测出肿瘤相关胞内蛋白的表达，从而表明本发明方法对于检测肿瘤相关胞内蛋白是有效的。
图E和F为实施例3流式细胞术的检测结果：
E图为表面氨基化二氧化硅纳米粒-p-Akt1/2/3抗体(鼠源)-Hela细胞胞内蛋白p-Akt1/2/3-p-Akt1/2/3抗体(兔源)-FITC标记的小鼠抗兔IgG(实验组)及其相应对照组复合物的流式细胞术分析图；其中，绿色曲线(曲线9)代表对照组复合物的流式细胞术检测结果，蓝色曲线(曲线10)代表实验组复合物流式细胞术检测结果；FITC代表形成复合物中FITC标记的二抗荧光强度。
F图为表面羧基化二氧化硅纳米粒-p-Akt1/2/3抗体(鼠源)-Hela细胞胞内蛋白p-Akt1/2/3-p-Akt1/2/3抗体(兔源)-FITC标记的小鼠抗兔IgG(实验组)及其相应对照组复合物的流式细胞术分析图；其中，绿色曲线(曲线11)代表对照组复合物的流式细胞术检测结果，黄色曲线(曲线12)代表实验组复合物流式细胞术检测结果；FITC代表形成复合物中FITC标记的二抗荧光强度。
从图中可以看出，无论是表面氨基化二氧化硅纳米粒还是表面羧基化二氧化硅纳米粒的实验组中FITC标记的二抗荧光强度均显著大于对照组，表明抗p-Akt1/2/3抗体与实验组肿瘤Hela细胞细胞胞内蛋白p-Akt1/2/3发生了特异性的结合，而未与对照组牛血清白蛋白发生特异性的结合。Akt是肿瘤标志蛋白，其磷酸化蛋白p-Akt在肿瘤中也具有特异性表达。通过实例1、2与本实例可以看出，利用本发明的方法不仅能够定性检测出非肿瘤相关胞内蛋白的表达，还能够定性检测出肿瘤相关胞内蛋白的表达，进一步表明本发明方法对于检测肿瘤相关胞内蛋白是有效的。
具体实施方式
实施例1：以肌动蛋白(β-actin)在人肝癌HepG2细胞系的表达为例加以说明。
1.二氧化硅纳米粒的制备
(1)表面氨基化二氧化硅纳米粒的制备：
先采用
法(
W，Fink A，Bohn E.J Colloid Interface Sci，1968，26～62.)制备100～120nm二氧化硅纳米粒；然后将约1g二氧化硅纳米粒加入到30ml无水甲苯中，室温搅拌均匀，然后缓慢滴加2.5mlγ-氨基丙基三乙氧基硅烷(ATES)，继续搅拌1h后，升温至95℃，回流10h，再用异丙醇超声洗涤3次，在60℃真空干燥10h，得约1g表面氨基化二氧化硅纳米粒；
(2)表面羧基化二氧化硅纳米粒的制备：
先采用
法(
W，Fink A，Bohn E.J Colloid Interface Sci，1968，26～62.)制备100～120nm二氧化硅纳米粒；然后将0.01M硅烷偶联剂(KH-550)和等摩尔的丁二酸酐均匀分散在约100ml的二甲基甲酰胺(DMF)中，120℃下磁力搅拌3h，再加入20ml二氧化硅DMF悬液，使整个反应体系中二氧化硅纳米粒子的浓度约为10mg/ml，同时加入2ml去离子水。在相同温度下继续磁力搅拌5h后，12000rpm离心10min分离出反应后的纳米粒，经5次乙醇洗涤离心分离后，90℃干燥，即得到约1.2g表面羧基化二氧化硅纳米粒；
2.具有结合胞内蛋白特异性的纳米粒的制备
(1)具有结合胞内蛋白特异性的表面氨基化二氧化硅纳米粒的制备：首先将100～120nm表面氨基化的二氧化硅纳米粒悬浮于质量分数为25％的戊二醛溶液中，使其终浓度为1mg/ml，室温搅拌过夜对粒子进行活化；第二天用3ml PBS(pH 8.0)清洗3次，除去过量的戊二醛溶液；然后重悬于PBS(pH 8.0)中形成2.5mg/ml的纳米粒子悬液；
取100μl的抗β-actin抗体溶液(购于Santa Cruz Biotechnology，来源于小鼠，抗体∶PBS体积比＝1∶1000)加入到上述400μl纳米粒子悬液中，4℃轻轻搅拌过夜；第二天用3ml PBS(pH 8.0)清洗3次，真空冻干得到约1mg具有结合胞内蛋白特异性的表面氨基化纳米粒；
(2)具有结合胞内蛋白特异性的表面羧基化二氧化硅纳米粒的制备：首先将100～120nm表面羧基化的二氧化硅纳米粒悬浮于400μl PBS(pH 8.0)中形成2.5mg/ml的悬液；加入4.5μg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺盐酸盐(EDC)和等质量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温轻轻搅拌混匀，再加入100μl抗β-actin抗体溶液(购于Santa Cruz Biotechnology，来源于小鼠，抗体∶PBS体积比＝1∶1000)，4℃轻轻搅拌2h，之后用3ml PBS(pH 8.0)清洗3次，真空冻干得到约1mg具有结合胞内蛋白特异性的表面羧基化纳米粒；
3.肿瘤细胞胞内总蛋白的提取：将体外培养的人肝癌HepG2细胞(含有10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO2条件下培养)用质量分数为0.25％的胰蛋白酶液消化制成单细胞悬液，用4℃预冷的PBS(pH 8.0)清洗2次，之后重悬于PBS(pH 8.0)中使细胞浓度为1×106个/ml；取1ml移入离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，估计细胞体积，向沉淀中加入约2倍细胞体积含有蛋白酶抑制剂(PMSF)的细胞裂解液(1M Tris-HCl pH 8.05ml，NaCl 150mM，体积分数1％NP-40，蒸馏水定容至100ml；细胞裂解液∶PMSF体积比＝870∶50)，混匀，冰浴超声破碎细胞(70W，超声3s，间隙5s，共15次)，4℃12000rpm离心10min，取上清液，上清液中肿瘤细胞胞内总蛋白的浓度约为150μg/ml；
4.与肿瘤细胞胞内蛋白β-actin的结合：将步骤2中具有结合胞内蛋白特异性的纳米粒1mg与步骤3中提取的300μl肿瘤胞内蛋白液混合，4℃孵育40min；然后用2ml PBS(pH 8.0)清洗3次，最后4℃12000rpm离心10min得约1mg结合后的纳米粒子；
5.在步骤4中加入100μl抗β-actin抗体溶液(购于Santa CruzBiotechnology，来源于兔，抗体∶PBS体积比＝1∶1000)，4℃孵育40min，随之用2ml PBS(pH 8.0)洗3次，最后将反应后的纳米粒重悬于200μl PBS(pH8.0)中；
6.接着在步骤5中加入0.5μl FITC标记的小鼠抗兔IgG，4℃避光孵育30min；然后用2ml PBS(pH 8.0)清洗3次，之后用PBS(pH 8.0)重悬该反应后的纳米粒，使其浓度约为1×105个/ml，得到“二氧化硅纳米粒-β-actin抗体(鼠源)-HepG2细胞胞内蛋白β-actin-β-actin抗体(兔源)-FITC标记的小鼠抗兔IgG”实验组复合物；
7.用BD-FACS Calibur流式细胞仪检测分析；
8.同时设定以1mg/ml牛血清白蛋白溶液替代步骤3中的人肝癌HepG2细胞总蛋白，得到“二氧化硅纳米粒-β-actin抗体(鼠源)-牛血清白蛋白-β-actin抗体(兔源)-FITC标记的小鼠抗兔IgG”对照组复合物。
实施例2：以蛋白激酶B(Akt2)在人乳腺癌MCF-7细胞系的表达为例加以说明。
1.二氧化硅纳米粒的制备(同实施例1)
2.具有结合胞内蛋白特异性的纳米粒的制备
(1)具有结合胞内蛋白特异性的表面氨基化二氧化硅纳米粒的制备：首先将100～120nm表面氨基化的二氧化硅纳米粒悬浮于质量分数为25％的戊二醛溶液中，使其终浓度为1mg/ml，室温搅拌过夜对粒子进行活化；第二天用3ml PBS(pH 8.0)清洗3次，除去过量的戊二醛溶液；然后重悬于PBS(pH 8.0)中形成2.5mg/ml的纳米粒子悬液；
取100μl的抗Akt2抗体溶液(购于Santa Cruz Biotechnology，来源于小鼠，抗体∶PBS体积比＝1∶800)加入到上述400μl纳米粒子悬液中，4℃轻轻搅拌过夜；第二天用3ml PBS(pH 8.0)清洗3次，真空冻干得到约1mg具有结合胞内蛋白特异性的表面氨基化纳米粒；
(2)具有结合胞内蛋白特异性的表面羧基化二氧化硅纳米粒的制备：首先将100～120nm表面羧基化的二氧化硅纳米粒悬浮于400μl PBS(pH 8.0)中形成2.5mg/ml的悬液；加入4.5μg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺盐酸盐(EDC)和等质量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温轻轻搅拌混匀，再加入100μl抗Akt2抗体溶液(购于Santa Cruz Biotechnology，来源于小鼠，抗体∶PBS体积比＝1∶800)，4℃轻轻搅拌2h，之后用3ml PBS(pH 8.0)清洗3次，真空冻干得到约1mg具有结合胞内蛋白特异性的表面羧基化纳米粒；
3.肿瘤细胞胞内总蛋白的提取：将体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞(含有10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO2条件下培养)用质量分数为0.25％的胰蛋白酶液消化制成单细胞悬液，用4℃预冷的PBS(pH 8.0)清洗2次，之后重悬于PBS(pH 8.0)中使细胞浓度为1×106个/ml；取1ml移入离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，估计细胞体积，向沉淀中加入约2倍细胞体积含有蛋白酶抑制剂(PMSF)的细胞裂解液(1M Tris-HCl pH 8.05ml，NaCl 150mM，体积分数1％NP-40，蒸馏水定容至100ml；细胞裂解液∶PMSF体积比＝870∶50)，混匀，冰浴超声破碎细胞(70W，超声3s，间隙5s，共15次)，4℃12000rpm离心10min，取上清液，上清液中肿瘤细胞胞内总蛋白的浓度约为150μg/ml；
4.与肿瘤细胞胞内蛋白Akt2的结合：将步骤2中具有结合胞内蛋白特异性的纳米粒1mg与步骤3中提取的300μl肿瘤胞内蛋白液混合，4℃孵育40min；然后用2ml PBS(pH 8.0)清洗3次，最后4℃12000rpm离心10min得约1mg结合后的纳米粒子；
5.在步骤4中加入100μl抗Akt2抗体溶液(购于Santa CruzBiotechnology，来源于兔，抗体∶PBS体积比＝1∶800)，4℃孵育40min，随之用2ml PBS(pH 8.0)洗3次，最后将反应后的纳米粒重悬于200μl PBS(pH8.0)中；
6.接着在步骤5中加入0.5μl FITC标记的小鼠抗兔IgG，4℃避光孵育30min；然后用2ml PBS(pH 8.0)清洗3次，之后用PBS(pH 8.0)重悬该反应后的纳米粒，使其浓度约为1×105个/ml，得到“二氧化硅纳米粒-Akt2抗体(鼠源)-MCF7细胞胞内蛋白Akt2-Akt2抗体(兔源)-FITC标记的小鼠抗兔IgG”实验组复合物；
7.用BD-FACS Calibur流式细胞仪检测分析；
8.同时设定以1mg/ml牛血清白蛋白溶液替代步骤3中的人乳腺癌MCF-7细胞总蛋白，得到“二氧化硅纳米粒-Akt2抗体(鼠源)牛血清白蛋白-Akt2抗体(兔源)-FITC标记的小鼠抗兔IgG”对照组复合物。
实施例3：以磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt1/2/3)在人宫颈癌Hela细胞系的表达为例加以说明。
1.二氧化硅纳米粒的制备(同实施例1)
2.具有结合胞内蛋白特异性的纳米粒的制备
(1)具有结合胞内蛋白特异性的表面氨基化二氧化硅纳米粒的制备：首先将100～120nm表面氨基化的二氧化硅纳米粒悬浮于质量分数为25％的戊二醛溶液中，使其终浓度为1mg/ml，室温搅拌过夜对粒子进行活化；第二天用3ml PBS(pH 8.0)清洗3次，除去过量的戊二醛溶液；然后重悬于PBS(pH 8.0)中形成2.5mg/ml的纳米粒子悬液；
取100μl的抗p-Akt1/2/3抗体溶液(购于Santa Cruz Biotechnology，来源于小鼠，抗体∶PBS体积比＝1∶600)加入到上述400μl纳米粒子悬液中，4℃轻轻搅拌过夜；第二天用3ml PBS(pH 8.0)清洗3次，真空冻干得到约1mg具有结合胞内蛋白特异性的表面氨基化纳米粒；
(2)具有结合胞内蛋白特异性的表面羧基化二氧化硅纳米粒的制备：首先将100～120nm表面羧基化的二氧化硅纳米粒悬浮于400μl PBS(pH 8.0)中形成2.5mg/ml的悬液；加入4.5μg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺盐酸盐(EDC)和等质量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温轻轻搅拌混匀，再加入100μl抗p-Akt1/2/3抗体溶液(购于Santa Cruz Biotechnology，来源于小鼠，抗体∶PBS体积比＝1∶600)，4℃轻轻搅拌2h，之后用3ml PBS(pH 8.0)清洗3次，真空冻干得到约1mg具有结合胞内蛋白特异性的表面羧基化纳米粒；
3.肿瘤细胞胞内总蛋白的提取：将体外培养的人宫颈癌Hela细胞(含有10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO2条件下培养)用质量分数为0.25％的胰蛋白酶液消化制成单细胞悬液，用4℃预冷的PBS(pH 8.0)清洗2次，之后重悬于PBS(pH 8.0)中使细胞浓度为1×106个/ml；取1ml移入离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，估计细胞体积，向沉淀中加入约2倍细胞体积含有蛋白酶抑制剂(PMSF)的细胞裂解液(1M Tris-HCl pH 8.05ml，NaCl 150mM，体积分数1％NP-40，蒸馏水定容至100ml；细胞裂解液∶PMSF体积比＝870∶50)，混匀，冰浴超声破碎细胞(70W，超声3s，间隙5s，共15次)，4℃12000rpm离心10min，取上清液，上清液中肿瘤细胞胞内总蛋白的浓度约为150μg/ml；
4.与肿瘤细胞胞内蛋白p-Akt1/2/3的结合：将步骤2中具有结合胞内蛋白特异性的纳米粒1mg与步骤3中提取的300μl肿瘤胞内蛋白液混合，4℃孵育40min；然后用2ml PBS(pH 8.0)清洗3次，最后4℃12000rpm离心10min得约1mg结合后的纳米粒子；
5.在步骤4中加入100μl抗p-Akt1/2/3抗体溶液(购于Santa CruzBiotechnology，来源于兔，抗体∶PBS体积比＝1∶600)，4℃孵育40min，随之用2ml PBS(pH 8.0)洗3次，最后将反应后的纳米粒重悬于200μl PBS(pH8.0)中；
6.接着在步骤5中加入0.5μl FITC标记的小鼠抗兔IgG，4℃避光孵育30min；然后用2ml PBS(pH 8.0)清洗3次，之后用PBS(pH 8.0)重悬该反应后的纳米粒，使其浓度约为1×105个/ml，得到“二氧化硅纳米粒-p-Akt1/2/3抗体(鼠源)-Hela细胞胞内蛋白p-Akt1/2/3-p-Akt1/2/3抗体(兔源)-FITC标记的小鼠抗兔IgG”实验组复合物；
7.用BD-FACS Calibur流式细胞仪检测分析；
8.同时设定以1mg/ml牛血清白蛋白溶液替代步骤3中的人宫颈癌Hela细胞总蛋白，得到“二氧化硅纳米粒-p-Akt1/2/3抗体(鼠源)牛血清白蛋白-p-Akt1/2/3抗体(兔源)-FITC标记的小鼠抗兔IgG”对照组复合物。
Claims (6)
1.一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，其步骤如下：
（1）采用
法制备粒径为100～120nm的二氧化硅纳米粒，然后用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷对二氧化硅纳米粒进行了表面修饰，得到表面氨基化的二氧化硅纳米粒；
（2）具有结合胞内蛋白特异性二氧化硅纳米粒的制备
(a)具有结合胞内蛋白特异性的表面氨基化二氧化硅纳米粒的制备：首先用质量分数为25%的戊二醛溶液活化步骤（1）中制备的100～120nm表面氨基化的二氧化硅纳米粒，再将活化后的纳米粒经磷酸盐缓冲液清洗后重悬于磷酸盐缓冲液中形成2.5mg/ml的纳米粒悬液；
然后将上述纳米粒悬液与来源于小鼠的抗胞内蛋白的特异性抗体溶液混合，再在4℃轻轻搅拌过夜，真空冻干后得到具有结合蛋白特异性的表面氨基化二氧化硅纳米粒，其中纳米粒悬液与抗体溶液的体积比为2～5：1；
(b)具有结合胞内蛋白特异性的表面羧基化二氧化硅纳米粒的制备：首先将步骤（1）制备的100～120nm表面羧基化的二氧化硅纳米粒用磷酸盐缓冲液重悬形成浓度为2.5mg/ml的悬液，之后用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺对纳米粒进行活化；
然后再将活化后的纳米粒悬液与来源于小鼠的抗胞内蛋白的特异性抗体溶液混合，再在4℃轻轻搅拌2h，真空冻干后得到具有结合胞内蛋白特异性的表面羧基化二氧化硅纳米粒，其中活化后的纳米粒悬液与抗体溶液的体积比为2～5：1；
（3）肿瘤细胞胞内总蛋白的提取：将体外培养的人肿瘤细胞通过超声破碎裂解法获得肿瘤细胞胞内总蛋白溶液，浓度为100～200μg/ml；
（4）与肿瘤细胞胞内总蛋白的结合：将具有结合胞内蛋白特异性的二氧化硅纳米粒与获得的细胞胞内总蛋白溶液混合，用量比例为1mg：200～400μl，4℃孵育30～60min，然后用磷酸盐缓冲液清洗2～3次，最后4℃、12000rpm离心5～10min得到与肿瘤细胞胞内总蛋白结合的纳米粒子；
（5）在步骤（4）中加入与步骤（2）中等浓度和体积的来源于兔的抗同一胞内蛋白的特异性抗体溶液混合，在4℃孵育30～60min；然后用磷酸盐缓冲液清洗2～3次，最后用磷酸盐缓冲液重悬该反应后的纳米粒，使其浓度为5mg/ml；
（6）在步骤（5）中加入荧光素标记的二抗溶液，其中加入的荧光素标记的二抗溶液与步骤（5）中反应后纳米粒悬液的体积比为1：200～500，4℃避光孵育30～60min；然后用磷酸盐缓冲液清洗2～3次，之后用磷酸盐缓冲液重悬该反应后的纳米粒，使其终浓度约为1×105个/ml，从而制备得到“二氧化硅纳米粒-鼠源抗体-肿瘤细胞胞内蛋白-兔源抗体-荧光素标记二抗”的实验组复合物；
（7）以1mg/ml牛血清白蛋白溶液替代步骤（3）中的肿瘤细胞胞内总蛋白，重复步骤（2）～（6），从而制备“二氧化硅纳米粒-鼠源抗体-肿瘤细胞胞内蛋白-兔源抗体-荧光素标记二抗”作为对照组复合物；
（8）利用流式细胞术对步骤（6）制备的“二氧化硅纳米粒-鼠源抗体-肿瘤细胞胞内蛋白-兔源抗体-荧光素标记二抗”复合物及步骤（7）制备的对照组复合物进行检测，从而实现对肿瘤细胞特异性胞内蛋白的定性检测。
2.如权利要求1所述的一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，其特征在于：表面羧基化二氧化硅纳米粒的制备是采用法制备粒径为100～120nm的二氧化硅纳米粒，然后用硅烷偶联剂和丁二酸酐对二氧化硅纳米粒表面进行羧基化改性，得到表面羧基化的二氧化硅纳米粒。
3.如权利要求1所述的一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，其特征在于：来源于小鼠的抗胞内蛋白的特异性抗体溶液为β-actin、Akt2或p-Akt1/2/3抗体的磷酸盐缓冲液溶液，抗体：磷酸盐缓冲液的体积比为1：200～1000。
4.如权利要求1所述的一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，其特征在于：来源于兔的抗胞内蛋白的特异性抗体溶液为β-actin、Akt2或p-Akt1/2/3抗体的磷酸盐缓冲液溶液，抗体：磷酸盐缓冲液的体积比为1：200～1000。
5.如权利要求1所述的一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，其特征在于：荧光素标记的二抗为FITC标记的小鼠抗兔。
6.如权利要求1所述的一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，其特征在于：人肿瘤细胞为肝癌细胞、乳腺癌细胞或宫颈癌细胞。
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