CN102517357A

CN102517357A - 纤维素酶水解纤维素的方法

Info

Publication number: CN102517357A
Application number: CN201110418723XA
Authority: CN
Inventors: 王万能
Original assignee: Chongqing University of Technology
Current assignee: Chongqing University of Technology
Priority date: 2011-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2012-06-27

Abstract

本发明公开了一种纤维素酶水解纤维素的方法，有以下步骤：1)将植物秸秆粉碎至60-80目；2)取粉碎的植物秸秆80-100克，加入到500-600mL的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液中；3)加热40-45℃，加入2.5-3.0g纤维素酶粉；4)再加入所用植物秸秆质量0.3％-0.8的激活剂，在45℃水浴中保温反应48小时后，即将纤维素进行酶解。本发明方法可以高效地降解纤维素，酶解率可达60-80％左右，为推动纤维素的大规模应用，缓解能源匮乏危机提供基础。

Description

纤维素酶水解纤维素的方法

技术领域

本发明涉及纤维酶解领域，特别涉及一种纤维素酶水解纤维素的方法。

背景技术

纤维素(cellulose)是由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，是植物细胞壁的主要成分。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50％以上。棉花的纤维素含量接近100％，为天然的最纯纤维素来源。一般木材中，纤维素占40～50％，还有10～30％的半纤维素和20～30％的木质素。

麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的丰富来源。纤维素是重要的造纸原料。此外，以纤维素为原料的产品也广泛用于塑料、炸药、电工及科研器材等方面。

纤维素是通过生命现象、光合作用等生物方式转化过来的物质，包括树木、草类、农作物秸秆等。在科研领域，纤维素被划归为新能源、环境友好新技术，它将对人类生活带来的深刻影响可能超出了多数人的想象。对解决当今世界所面临的环境污染、粮食短缺、资料资源紧张和能源危机等问题有着重大的意义。

纤维素大分子的基环是D-葡萄糖以β-1，4糖苷键组成的大分子多糖，分子量约50000～2500000，相当于300～15000个葡萄糖基脱水葡萄糖，其分子式为：(C6H10O5)n，其化学组成含碳44.44％、氢6.17％、氧49.39％。

由纤维素降解产生的纤维素酶可以用做饲料添加剂、用于纺织业、用于中草药可提高其有效成分的提取、用于提高酒和其他酿造产品的产率、用于蔬菜汁或果汁的生产以及工业生产等广泛的用途。因此，纤维素的降解一直是人们研究的热点。

纤维素大分子的降解的方式有酸水解降解、氧化降解、生物降解、热降解、机械降解、离子辐射降解等多种途径.其中酶法水解是一种较为可行的途径，目前采用生物资源酶解纤维素的方法有纤维素不易降解、纤维素转化效率不高等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种纤维素酶水解纤维素的方法，采用本发明方法可以高效地降解纤维素，酶解率可达60-80％左右，为推动纤维素的大规模应用，缓解能源匮乏危机提供基础。

本发明所述的纤维素的酶解方法，有以下步骤：

1)将植物秸杆粉碎至60-80目；

2)取粉碎的植物秸杆80-100克，加入到500-600mL磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液中；

3)加热40-45℃，加入2.5-3.0g纤维素酶粉；

4)再加入所用植物秸杆重量03.-0.8％的激活剂，在45℃水浴中保温反应48小时后，即将纤维素进行酶解。

所述激活剂为CaCl₂或ZnSO₄。

所述磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液的pH＝4-5。

所述植物秸杆含水量为10-30％，纤维素含量为73％。

本发明所述方法将纤维素原料充分粉碎，以克服秸秆中的木质素的障碍，降低天然纤维素的聚合度和结晶度，提高天然纤维素对纤维素酶解的敏感性。采用磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液，使得纤维素酶水解在pH＝4-5的弱酸性条件下进行(模拟福寿螺胃中pH值)，有利于纤维素晶体结构破坏，提高纤维素酶酶解活力，使纤维素酶水解充分，大大提高纤维素酶水解效率，酶解率可达60-80％左右。纤维素酶解后产物是低分子糖，更利于纤维素的大规模利用，如利用酶解后的产物葡萄糖产生酒精等。

本发明将化学、物理、仿生等多种技术方法有机地结合起来，探求其真正的酶解反应体系，形成物理化学、和仿生技术一体化酶解优化体系，对纤维素的大规模应用具有重要的现实和理论意义。

附图说明

图1为DNS法葡萄糖标准曲线。

图中，Y＝0.0003X X：葡萄糖含量(μg/mL)Y：吸光度值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不仅限于这些例子。

一.试剂和材料：

植物秸秆采用含水量为10-30％，纤维素含量为73％的麦秆、稻草、高粱杆、甘蔗渣等；

纤维素酶粉(活力大于10000U.g^-1)购自上海生化制品有限公司；

DNS试剂的配制：准确称取酒石酸钾钠36.4g，3，5-二硝基水杨酸1.26g，NaOH4.2g，苯酚1.0g，无水亚硫酸钠1.0g。将酒石酸钾钠溶于100ml蒸馏水中，加热(不超过50℃)，依次加3，5-二硝基水杨酸，NaOH，苯酚，无水亚硫酸钠于热溶液中，搅拌至溶解完全，冷却后定容至200ml，贮存于棕色瓶子中，在避光处保存。

磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液的配制：分别称取磷酸二氢钠2.84g，柠檬酸2.101g，分别定容至100mL。吸取88.74mL磷酸二氢钠溶液和91.26mL柠檬酸混合，调pH值为4.5-4.8(模拟福寿螺胃中pH值)。

其它试剂均采用市售的化学纯产品。

二.纤维素的酶解

1、将植物秸杆粉碎，60-80目待用，其中含水量为10-30％，纤维素含量为73％。

2、标准曲线的绘制测定纤维素的转化效率

DNS法原理

DNS法即3，5-二硝基水杨酸比色法的英文简称。其原理是3，5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物-3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈正比。

2.1、DNS法标准曲线的制作：

精确称取经105℃烘干至恒重的无水葡萄1.0000克，配成10mg/mL浓度的标准葡萄糖液。分别吸取10mg/mL标准葡萄糖液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于50mL容量瓶中，用蒸馏水制成每毫升分别含有葡萄糖200μg、400μg、600μg、800μg、1000μg、1200μg的标准液。各取不同浓度标准液0.5mL于试管中，加磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液1.5mL，DNS试剂3mL于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10mL混匀，冷却后，于紫外分光光度计550nm处比色，以所得的光密度OD值为纵坐标，以对应的葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线。见图1

空白的制作：以0.5mL蒸馏水代替0.5mL标准葡萄糖液，以下操作步骤同标准曲线制作。

Cx酶活力＝A(分光度值对应的葡萄糖含量)×2/30(u/mL)

2.2酶活定义及绘制标准曲线：

在40℃，pH4.8条件下，定义每分钟催化纤维素水解生成1μg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位U。

以葡萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，用Excel进行线性回归，绘制标准曲线。

2.3纤维素酶的酶活力的测定：

用pH＝4.8的醋酸缓冲溶液配制1％羧甲基纤维素钠溶液。称取0.5g羧甲基纤维素钠，加入50mlpH＝4.8的醋酸缓冲液，加热使其均匀溶解。准确称取1g酶粉，用蒸馏水定容至一定体积，配制成稀释酶溶液。在试管中加入1.5ml1％羧甲基纤维素钠溶液。再加入0.5ml稀释酶液。在40±1℃水浴中保温反应30min后，立即加入3ml DNS试剂。空白对照液用1.5ml1％羧甲基纤维素钠溶液加入3ml DNS试剂，再加入0.5ml稀释酶液。同时在沸水浴中反应7min，加入10ml蒸馏水。

以空白对照液调零点，在λmax＝550nm下，用分光光度计测量吸光度值。

Cx酶活力＝A(分光度值对应的葡萄糖含量μg)×2/30(u/ml)

3、在500mLpH＝4.8的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液中加入步骤1所述的粉碎植物秸杆100克，加热40-45℃使植物秸杆均匀。准确加入2.5g纤维素酶粉(活力大于10000U.g^-1)，加入植物秸杆重量的0.5％激活剂氯化钙或ZnSO₄，在45℃水浴中保温反应48小时，立即加入30mL DNS试剂，同时在沸水浴中反应7min，即完成对纤维素酶水解。

3.1激活剂氯化钙的纤维素酶水解后酶活测定

空白对照液用1.5ml 1％羧甲基纤维素钠溶液加入3ml DNS试剂，再加入0.5ml稀释酶液。同时在沸水浴中反应7min，加入10ml蒸馏水。

取步骤3得到的纤维素酶水解液做Ca²⁺离子(氯化钙溶液)的酶活测定，见表2。

表2添加Ca²⁺离子的酶活测定

3.2激活剂硫酸锌的纤维素酶水解后酶活测定

空白对照液用1.5ml1％羧甲基纤维素钠溶液加入3mlDNS试剂，再加入0.5ml稀释酶液。同时在沸水浴中反应7min，加入10ml蒸馏水。

取步骤3得到的纤维素酶水解液做Zn²⁺离子(ZnSO₄溶液)的酶活测定，见表3。

表3添加Zn²⁺离子的酶活测定

Ca²⁺、Zn²⁺两种离子有利于酶的水解，提高纤维素水解效率。激活剂氯化钙或ZnSO₄对纤维素酶的水解起着促进作用。

由实验可知，在纤维素酶降解纤维素的实际生产应用中选用一些金属离子，如：Zn²⁺、Ca²⁺等来作为促进剂是可行的，可以提高生产效率和纤维素的降解速度；同时也为纤维素酶的生产及在其它行业的应用提供了理论依据。

5.实验结果：

对照处理为：在水溶液中加入步骤1所述的粉碎植物秸杆100克，加热40-45℃使植物秸杆均匀。准确加入2.5g纤维素酶粉(活力大于10000U.g^-1)，在45℃水浴中保温反应48小时，立即加入30mL DNS试剂，同时在沸水浴中反应7min。

在λmax＝550nm下，用分光光度计测量吸光度值，利用标准曲线方程计算出总糖含量。

5.1标准曲线数据记录及计算

表4DNS法葡萄糖标注曲线

吸光度	对应葡萄糖含量Y(μg/mL)
		0.052	200
0.129	400
		0.209	600
0.280	800
		0.375	1000
0.411	1200

标准曲线图见图1。

5.2酶解体系的酶解效果分析

经过实验检测分析，处理中葡萄糖含量为123.333μg/ml，比对照处理的酶解方法提高了25.8％。

结论：纤维素酶水解纤维素的方法，采用激活剂氯化钙或ZnSO₄，在pH＝4.8～5.0，温度＝40℃条件下，纤维素酶的水解效果好。

Claims

1.一种纤维素酶水解纤维素的方法，其特征在于有以下步骤：

1)将植物秸杆粉碎至60-80目；

2)取粉碎的植物秸杆80-100克，加入到500-600mL的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液中；

3)加热40-45℃，加入2.5-3.0g纤维素酶粉；

4)再加入所用植物秸杆质量0.3％-0.8的激活剂，在45℃水浴中保温反应48小时后，即将纤维素酶水解。

2.根据权利要求1所述的纤维素酶水解纤维素的方法，其特征在于：所述激活剂为CaCl₂或ZnSO₄。

3.根据权利要求1所述的纤维素酶水解纤维素的方法，其特征在于：所述磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液的pH＝4-5。