CN102514135B - 一种塑形器及采用该塑形器构建三维细胞培养模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于构建三维细胞培养模型的塑形器，所述塑形器包括本体和平板，所述本体向上弧形凸起呈穹窿型，所述本体内部为空腔，所述平板与所述本体周边的下缘连接并延伸为方形，所述平板被所述本体内部空腔覆盖的地方设置通孔，所述本体的顶端设有灌注孔。本发明所述塑形器所构建的三维细胞培养模型均一性较好，而且使得构建三维细胞培养模型更加简单、易于实施。同时，本发明还公开了采用所述塑形器构建三维细胞培养模型的方法，采用所述方法构建的三维细胞培养模型稳定，不易变形，容易保存，有效节省了实验时间。

Description

一种塑形器及采用该塑形器构建三维细胞培养模型的方法

技术领域

本发明涉及一种用于构建三维细胞培养模型的塑形器，还涉及一种采用所述塑形器构建三维细胞培养模型的方法。

背景技术

体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境，该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。目前，关于肿瘤细胞培养的研究大多建立在二维细胞培养基础上，其特点是简便易操作，易于研究单细胞对化疗药物的影响。但是此类研究却难以从肿瘤组织的立体结构特点上模拟体内细胞的组织微环境，故而无法准确反映肿瘤细胞在三维空间组织中的化疗敏感性特点。

三维细胞培养技术，是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构建三维的细胞载体复合物。三维细胞培养作为有别于传统二维平板细胞培养的崭新的细胞培养模式，能在体外最大限度地反映体内细胞微环境的结构基础，主要体现在以下两个方面：（1）可较真实地反映肿瘤在体内的发生过程：细胞通过其表面的特异性受体特别是整合素家族受体实现细胞与细胞之间以及细胞与基质之间的病理联系及信号传导；（2）可再现肿瘤组织化疗过程中细胞内及细胞间的信号通路蛋白及关键生命分子表达的动态演变过程：三维空间中的外层富氧细胞遭遇“休克”式化疗打击，迅速发生凋亡或坏死，并释放相关信号分子，外层信号分子及化疗药物刺激对内核乏氧细胞产生选择压力，最终导致肿瘤细胞幸存或死亡。因而，三维细胞培养在研究肿瘤细胞转化、转移及放化疗敏感性的分子机制方面具有独特的优势。

常规的三维细胞培养过程为：（1）将基质胶培养基从-20℃中取出后置于冰上，半小时后基质胶将由固态转为液态：（2）在如附图1所示的三维细胞培养小室中将基质胶铺就呈穹窿型，所述穹窿型为外表面向上弧形凸起呈半球形或近似半球形的多面曲面体型；（3）室温放置半小时至一小时，基质胶将由液态恢复固态，加入细胞培养基并接种肿瘤细胞后，置于细胞培养箱中培养一至两周后，检测。

三维细胞培养模型首先需要构建犹如穹窿状的基质胶团块，现有技术中构建三维细胞培养模型常采用手工方法，常规手工方法塑形时，易发生基质胶与培养小室接触的情况，而基质胶一旦与培养小室接触，由于液体张力原因，基质胶迅速流向培养小室的四壁，形成四周高中间低的“碗状”构型，导致塑形失败，此种情况在手工塑形过程中极易发生；而且采用常规手工方法构建三维细胞培养模型，与操作者的熟料程度密切相关，由于人为因素，常造成三维培养模型的不均一性，主要表现为由偏心、塌陷造成的外形不均一，以及由于塑形凝固过程中基质胶的流动造成的三维模型内部不均一。同时，也很难准确根据基质胶的状态选择合适的模型制作时机，因为基质胶在由-80℃固态转变为液态的过程中，如果部分基质胶未完全融解，即便是存在毫米级未融解的基质胶，将导致穹窿型三维细胞培养模型塑形的困难，甚至出现空泡；仿佛冻融更将增加以上情况发生的可能，而且反复冻融使基质胶粘合度下降，降低了基质胶的可塑性。因此，基质胶反复冻融后难以形成穹窿状，即便是首次使用的崭新的基质胶，其穹窿状塑形亦需非常娴熟的技巧，而一旦穹窿状塑形不佳，如出现偏心或塌陷，将直接导致后续检测过程难度的加大，甚至无法检测；如出现三维基质胶培养模型与培养小室的四壁接触，则会直接导致模型构建失败而无法进行后续试验。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种方便构建三维细胞培养模型的塑形器，采用所述塑形器构建的三维细胞培养模型的均一性较好；同时，本发明还提供一种采用所述塑形器构建三维细胞培养模型的方法。

为提供一种方便构建三维细胞培养模型、且所构建的三维细胞培养模型均一性较好的塑形器，本发明采取的技术方案为：一种塑形器，用于构建三维细胞培养模型，所述塑形器包括本体和平板，所述本体向上弧形凸起呈穹窿型，所述本体内部为空腔，所述平板与所述本体周边的下缘连接并延伸为方形，所述平板被所述本体内部空腔覆盖的地方设置通孔，所述本体的顶端设有灌注孔。

所述塑形器的本体呈穹窿型，所述穹窿型为外表面向上弧形凸起呈半球形或近似半球形的多面曲面体。

所述塑形器的本体设计为内部为空腔的穹窿型，内部空腔用于构建犹如穹窿状的基质胶团块；所述平板与所述塑形器本体周边的下缘连接并延伸为方形，使得所述塑形器的边缘与培养小室的四壁吻合严密；所述塑形器本体的顶端设置有灌注孔，所述灌注孔用于基质胶的灌注。使用时，将所述塑形器放置于培养小室中，所述塑形器平板的底部与培养小室的底部紧密贴合，所述塑形器的边缘与培养小室的四壁吻合严密；然后用吸头吸取融解为液态的基质胶，通过塑形器本体顶端的灌注孔注入到所述塑形器本体的空腔中，至所述基质胶填满所述塑形器本体内部的空腔后，停止注入；室温下放置，待所述塑形器本体内部空腔中的基质胶固化后，取出所述塑形器，即得犹如穹窿状的基质胶团块。由于所述平板被所述本体内部空腔覆盖的地方设置通孔，当所述塑形器取出时，在塑形器本体内部空腔中形成的基质胶固化块留在所述三维细胞培养小室中。所述塑形器使得构建三维细胞培养模型变得简单易操作，避免了手工构建穹窿型基质胶团块时，基质胶与培养小室四壁接触、外形偏心、塌陷及内部不均一等问题，而且降低了三维细胞培养模型构建与操作者熟练程度的相关性。采用上述所述塑形器构建的三维细胞培养模型，快速高效，所构建的穹窿状的基质胶团块外形及内部均一性较好。

作为本发明所述塑形器的优选实施方式，所述塑形器的本体和平板均采用聚四氟乙烯材料制备而成。聚四氟乙烯材料具有不粘及自润滑的特点，采用此种材料时，使得采用所述塑形器构建成穹窿状的基质胶团块后，塑形器不易与基质胶粘黏在一起，方便塑形器的取出。

作为本发明所述塑形器的优选实施方式，所述塑形器的平板底部为磨砂面。将所述塑形器的平板底部设计为磨砂面，同时将培养小室的底边也设计为磨砂面，使用时，将所述塑形器放置于所述培养小室中后，所述塑形器平板的磨砂面底部与所述培养小室的磨砂面底部接触，可减少基质胶灌注后的渗透现象，从而更好的保障基质胶塑形成功后，所得穹窿状基质胶团块的均一性。

作为本发明所述塑形器的优选实施方式，所述塑形器本体顶端的灌注孔为圆孔，所述灌注孔的直径为1mm。所述灌注孔设计为圆孔时，可与吸头的形状相配合，方便吸头通过所述灌注孔将基质胶注入所述塑形器本体内部的空腔中；所述灌注孔的直径大小可根据实际情况或吸头的大小设计，可设计的更大或更小。

作为本发明所述塑形器的优选实施方式，所述塑形器本体和平板的厚度为1mm。所述塑形器本体和平板的厚度可根据需要设计得更小或更大，一般情况下，厚度太小，其强度和刚度较小，容易破损；厚度太大，一方面浪费材料，另一方面相同大小外形的塑形器的内部空腔体积减小，所构建的基质胶团块的体积减小；当塑形器本体和平板的厚度为1mm时，性能较优。

作为本发明所述塑形器的优选实施方式，所述塑形器本体内部的空腔容量为45-50μL，所述塑形器本体的中轴高度为3.5-4.5mm，底部直径为8.5-9.5mm。所述塑形器本体的空腔容量、中轴高度及底部直径可根据需要构建的穹窿型的基质胶团块的体积大小设计，可设计的更小或更大；当所述塑形器本体内部的空腔容量为45-50μL、中轴高度为3.5-4.5mm、底部直径为8.5-9.5mm时，所构建的穹窿型基质胶团块的性能更优。

作为本发明所述塑形器的优选实施方式，所述塑形器的平板长度为11mm，宽度为9.5mm。所述塑形器平板的尺寸与培养小室的底边尺寸相适配，可使得塑形器底部与培养小室底边紧密贴合，塑形器平板的尺寸可根据培养小室的底边尺寸设计的更小或更大。

作为本发明所述塑形器的优选实施方式，所述塑形器的本体上设有手柄。在所述塑形器的本体上设置手柄，当灌注到塑形器本体内部空腔中的基质胶固化后，可方便通过塑形器本体上的手柄将塑形器取出。所述手柄的数量可以为一个、两个或多个，所述手柄在所述塑形器本体上的位置不限，所述手柄的形状多种多样，只要方便通过手柄将所述塑形器取出即可。

作为本发明所述塑形器的优选实施方式，所述塑形器本体顶端的灌注孔上连接有空心圆锥形固定部，所述固定部的底部与所述灌注孔连通。在所述灌注孔上连接空心圆锥形固定部，一方面，当向所述塑形器本体内部的空腔中灌注基质胶时，将吸头插入所述空心圆锥形固定部中，使得吸头不能上下左右晃动，所述固定部对所述吸头起到一定的固定作用，使得通过吸头向所述塑形器本体内部的空腔中灌注基质胶时，更加方便容易；另一方面，向所述塑形器本体内部的空腔中灌注好基质胶后，待基质胶固化后，将塑形器取出时，可通过手持所述空心圆锥形固定部将所述塑形器取出，因此所述固定部还起到手柄的作用，方便塑形器的取出。

 本发明还提供一种采用如上所述塑形器构建三维细胞培养模型的方法，包括以下步骤：

（1）将塑形器放置于培养小室中，使所述塑形器的平板底部与培养小室的底边紧密贴合；

（2）将基质胶自-80℃取出后置于冰上自然融解为液态，该过程保证无空气混入；

（3）用吸头吸取步骤（2）中融解后的基质胶，通过所述塑形器顶端的灌注孔注入所述塑形器本体的空腔中，至基质胶填满所述塑形器本体内部的空腔，停止注入；

（4）室温放置，待注入到所述塑形器本体内部空腔中的基质胶固化后，取出所述塑形器，即得三维细胞培养模型。

上述采用塑形器构建三维细胞培养模型的方法中，所述步骤（2）中将基质胶自-80℃取出后置于冰上自然融解为液态的时间为30-60分钟，该过程保证无空气混入，因为气泡将极大的干扰塑形的均一性；所述步骤（4）中室温放置30-60分钟，基质胶即可固化。整个灌胶过程需缓慢匀速，从而保证所得三维细胞培养模型内部均质稳定。

本发明所述塑形器，结构简单，使用方便，可快速高效的用于构建穹窿状的基质胶团块，而且所构建的基质胶团块外形及内部均一性较好。本发明所述采用塑形器构建三维细胞培养模型的方法，操作简捷，可快速高效的构建均一性较好的三维细胞培养模型。

附图说明

图1为常用三维细胞培养小室的结构示意图。

图2为本发明所述塑形器的一种实施例的结构示意图。

图3为图2所示塑形器的另一视向的结构示意图。

图4为本发明所述塑形器的另一种实施例的结构示意图。

图5为本发明所述塑形器的又一种实施例的结构示意图。

具体实施方式

    为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

如附图2和3所示，本发明所述塑形器的一种实施例的结构图，所述塑形器包括本体10和平板20，所述本体10向上弧形凸起呈穹窿型，所述本体10内部为空腔，所述平板20与所述本体10周边的下缘连接并延伸为方形，所述平板20被所述本体10内部空腔覆盖的地方设置通孔22，所述本体10的顶端设有灌注孔12。

如附图1所示的三维细胞培养小室共分为8个格，每个格中可构建一个三维细胞培养模型。

所述空腔的穹窿型塑形器本体10，用于构建犹如穹窿状的基质胶团块，所述塑形器本体10顶端设置的灌注孔12，用于将基质胶灌注到所述塑形器本体10内部的空腔中；所述平板20与所述塑形器本体10周边的下缘连接并延伸为方形，使得所述塑形器的边缘与附图1所示的三维细胞培养小室一个格的四壁吻合严密，以保证所构建的穹窿型基质胶团块的均一性。

使用时，将附图2所示的塑形器放置于附图1所示三维细胞培养小室的一个格中，所述塑形器平板20的底部与所述三维细胞培养小室一个格的底部紧密贴合，所述塑形器的边缘与所述三维细胞培养小室一个格的四壁严密吻合；放置好后，用100μL的吸头吸取融解为液态的基质胶，通过塑形器本体10顶端的灌注孔12将吸取的基质胶注入到所述塑形器本体10内部的空腔中，直至所述塑形器本体10内部的空腔中填满基质胶，停止注入。注满基质胶的塑形器在室温下放置，待所述塑形器本体10内部空腔中的基质胶固化后，将塑形器取出，塑形器与固化后的基质胶分离，即得到穹窿型的基质胶团块。

基质胶的外观犹如果冻状可流动浓稠液体，采用传统的手工方法构建三维细胞培养模型时，操作者直接在三维细胞培养小室中灌注基质胶并将基质胶铺就呈穹窿型，灌注到三维细胞培养小室中的基质胶很容易与培养小室的四壁接触，一旦基质胶与培养小室的四壁接触，由于液体张力原因，基质胶迅速流向三维细胞培养小室的四壁，形成四周高中间低的“碗状”构型，直接导致模型构建失败而无法进行后续试验，特别对于操作不熟练的研究者而言，更易出现此种情况；而且即便操作者能够成功构建三维细胞培养模型，由于人为因素常造成所构建的三维细胞培养模型的外形偏心、塌陷以及内部不均质等问题，一旦穹窿状的基质胶团块塑形不佳，将直接导致后续检测过程难度的加大。本发明所述的塑形器，通过设计空心穹窿型的塑形器本体10及与三维细胞培养小室紧密贴合的平板20，将基质胶通过塑形器本体10上端的灌注孔12注入到所述塑形器本体10的空腔中，从而构建出外形及内部均一的穹窿型基质胶团块，同时避免了所构建的三维基质胶培养模型与培养小室四壁接触的现象，使得三维细胞培养模型的构建简单快速，而且所构建的三维细胞培养模型的均一性和稳定性得到显著提高。

较佳地，所述塑形器的本体10和平板20均采用聚四氟乙烯材料制备而成。聚四氟乙烯材料具有不粘及自润滑的特点，当所述塑形器的本体10和平板20均采用此种材料时，采用所述塑形器构建呈穹窿型的基质胶团块后，塑形器不易与基质胶粘黏一起，塑形器和所构建的穹窿型基质胶团块容易分离，方便塑形器的取出。

较佳地，所述塑形器的平板20底部为磨砂面。将所述塑形器的平板20底部设计为磨砂面，同时将三维细胞培养小室的底边也设计为磨砂面，使用时，将所述塑形器放置于所述培养小室中后，所述塑形器平板20的磨砂面底部与所述培养小室的磨砂面底部接触，与采用光滑面相比，此种设计可减少基质胶灌注后的渗透现象，从而更好的保障基质胶塑形成功后，所得穹窿状基质胶团块的均一性。

较佳地，如附图2所示，所述塑形器本体10顶端的灌注孔12为圆孔，所述灌注孔12的直径为1mm。所述灌注孔12设计为圆形时，可与吸头的形状相配合，方便吸头通过所述灌注孔12将基质胶注入所述塑形器本体10内部的空腔中；所述灌注孔12的直径大小可根据实际情况或吸头的大小设计，可设计的更大或更小。

较佳地，所述塑形器本体10和平板20的厚度为1mm。所述塑形器本体10和平板20的厚度可根据需要设计得更大或更小，一般情况下，厚度太小，其强度和刚度较小，容易破损；厚度太大，一方面浪费材料，另一方面相同大小外形的塑形器的内部空腔体积减小，所构建的基质胶团块的体积减小；当塑形器本体10和平板20的厚度为1mm时，性能较优。

较佳地，所述塑形器本体10内部的空腔容量为45-50μL，所述塑形器本体10的中轴高度为3.5-4.5mm，底部直径为8.5-9.5mm。所述塑形器本体10的空腔容量、中轴高度及底部直径可根据需要构建的穹窿型基质胶团块的体积大小设计，可设计的更小或更大；当所述塑形器本体10内部的空腔容量为45-50μL、中轴高度为3.5-4.5mm、底部直径为8.5-9.5mm时，所构建的穹窿型基质胶团块的性能更优。使用时，常使用容积为100μL的吸头吸取液态的基质胶灌注到所述塑形器本体10内部的空腔中。

较佳地，所述塑形器的平板20长度为11mm，宽度为9.5mm。所述塑形器平板20的尺寸与培养小室的底边尺寸相适配，可使得塑形器底部与培养小室底边紧密贴合，塑形器平板20的尺寸可根据培养小室的底边尺寸设计的更小或更大。

较佳地，如附图3所示，所述塑形器的本体10上设有手柄14。在所述塑形器本体10上设置手柄14，当灌注到塑形器本体10内部空腔中得基质胶固化后，通过所述手柄14可方便的将塑形器与固化的穹窿型基质胶团块分离，方便构建好三维细胞培养模型后塑形器的取出。所述手柄14的形状可多种多样，数量可设置一个、两个或多个，可根据个人喜好及需要设在所述塑形器本体10的不同位置，只要实现方便通过手柄14将所述塑形器从三维细胞培养小室中取出即可。

更佳地，如附图4所示，所述塑形器本体10顶端的灌注孔12上连接有空心圆锥形固定部16，所述固定部16的底部与所述灌注孔12连通。在所述灌注孔12上连接空心圆锥形固定部16，一方面，当向所述塑形器本体10内部的空腔中灌注基质胶时，将吸头插入所述空心圆锥形固定部16中，使得吸头不能上下左右晃动，所述固定部16对所述吸头起到一定的固定作用，这样通过吸头向所述塑形器本体10内部的空腔中灌注基质胶时，更加方便容易；另一方面，向所述塑形器本体10内部的空腔中灌注好基质胶，待基质胶固化后，需要将塑形器与固化后的穹窿型基质胶团块分离，将塑形器从三维细胞培养小室中取出，此时可通过手持所述空心圆锥形固定部16将所述塑形器从三维细胞培养小室中取出，因此所述固定部16还可起到手柄的作用，方便塑形器的取出。

实施例1

鼻咽癌细胞在三维细胞培养模型培养中的化疗敏感性研究

三维细胞培养模型的构建：

（1）将塑形器放置于如附图1所示三维细胞培养小室的一个格中，并使所述塑形器的平板底部与培养小室的底边紧密贴合；

（2）将基质胶自-80℃取出后置于冰上自然融解为液态，融解时间为30-60分钟，该过程保证无空气混入，因为气泡将极大的干扰塑形的均一性；

（3）用100μL的吸头吸取步骤（2）中融解后的基质胶，通过所述塑形器顶端的灌注孔注入所述塑形器本体的空腔中，至基质胶填满所述塑形器本体内部的空腔，停止注入；

（4）室温放置30-60分钟，待注入到所述塑形器本体内部空腔中得基质胶固化后，取出所述塑形器，即得构建的三维细胞培养模型。

试验过程：在构建好穹窿型基质胶团块的三维细胞培养小室的格中加入细胞培养基，每个三维细胞培养小室的格中加入的培养基量为100-150μL，所加入的细胞培养基的组分及质量比为：马血清：霍乱霉素：DMEM=1:20:1000，所述霍乱霉素的浓度为1mg/ml。随后接种细胞，所述三维细胞培养小室的每个格中接种的细胞量为5000-10000个，加入一定浓度的化疗药物，置于二氧化碳培养箱中1-2周，而后三维免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜检测。

检测后发现，鼻咽癌细胞CNE-2在基质胶培养基中形成巨大畸形球状实体，当予以小分子抑制剂VX-680处理后，激光共聚焦荧光染色显示，CNE细胞团内P53表达上调并诱导CNE-2三维细胞团发生凋亡，随后细胞团松散，犹如体内化疗后肿瘤组织的消退过程。

实施例2

本发明所述塑形器的性能试验

发明人应用本发明所述塑形器构建的12个预实验三维细胞培养模型，在常规培养基中分别放置一周、两周，激光共聚焦显微镜及三维免疫荧光染色检测显示，未出现脱落、软化及碎裂等异常情况，一例出现轻度膨胀；而采用常规手工方法构建的三维细胞培养模型，在常规培养基中放置一至两周后，约有20-40%的比例出现脱落、软化及碎裂等异常情况，而膨胀变形则更易出现。

该试验证实，采用本发明所述塑形器所构建的三维细胞培养模型具有较可靠的一致性，具体表现为外形一致，不同批次模型之间所用基质胶的体积差别小于5μL，未出现偏心、塌陷等常规手工构建三维细胞培养模型中常见的技术问题。

本发明所述塑形器可使得构建的三维细胞培养模型均一性较高，而且使得构建三维细胞培养模型更加简单，易于实施。本发明所述采用塑形器构建三维细胞培养模型的方法，将现有手工构建三维细胞培养模型进行了较大程度的优化，由于采用穹窿型的塑形器，所构建的三维细胞培养模型稳定，不易变形，容易保存，构建方便，节省了实验时间，且易于操作。

以上所述仅是本发明的优选实施方式而非对本发明保护范围的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明技术方案进行修改或等同替换，这些修改或等同替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种构建三维细胞培养模型的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将塑形器放置于培养小室中，使所述塑形器的平板底部与培养小室的底边紧密贴合；

（2）将基质胶自-80℃取出后置于冰上自然融解为液态，该过程保证无空气混入；

（3）用吸头吸取步骤（2）中融解后的基质胶，通过所述塑形器顶端的灌注孔注入所述塑形器本体的空腔中，至基质胶填满所述塑形器本体内部的空腔，停止注入；

（4）室温放置，待注入到所述塑形器本体内部空腔中的基质胶固化后，取出所述塑形器，即得三维细胞培养模型；

所述塑形器包括本体和平板，所述本体向上弧形凸起呈穹窿型，所述本体内部为空腔，所述平板与所述本体周边的下缘连接并延伸为方形，所述平板被所述本体内部空腔覆盖的地方设置通孔，所述本体的顶端设有灌注孔。

2.如权利要求1所述的构建三维细胞培养模型的方法，其特征在于，所述塑形器的本体和平板均采用聚四氟乙烯材料制备而成。

3.如权利要求1所述的构建三维细胞培养模型的方法，其特征在于，所述塑形器的平板底部为磨砂面。

4.如权利要求1所述的构建三维细胞培养模型的方法，其特征在于，所述塑形器本体顶端的灌注孔为圆孔，所述灌注孔的直径为1mm。

5.如权利要求1所述的构建三维细胞培养模型的方法，其特征在于，所述塑形器本体和平板的厚度为1mm。

6.如权利要求1所述的构建三维细胞培养模型的方法，其特征在于，所述塑形器本体内部的空腔容量为45-50μL，所述塑形器本体的中轴高度为3.5-4.5mm，底部直径为8.5-9.5mm。

7.如权利要求1所述的构建三维细胞培养模型的方法，其特征在于，所述塑形器的平板长度为11mm，宽度为9.5mm。

8.如权利要求1-7任一所述的构建三维细胞培养模型的方法，其特征在于，所述塑形器的本体上设有手柄。

9.如权利要求1-7任一所述的构建三维细胞培养模型的方法，其特征在于，所述塑形器本体顶端的灌注孔上连接有空心圆锥形固定部，所述固定部的底部与所述灌注孔连通。

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