CN102507919A

CN102507919A - 一种标记3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物的方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN102507919A
Application number: CN2011103497099A
Authority: CN
Inventors: 周彬; 黄飚; 包建东; 俞惠新; 吴兴镛; 张艺; 王柯; 张珏
Original assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Current assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Priority date: 2011-11-08
Filing date: 2011-11-08
Publication date: 2012-06-20

Abstract

一种标记3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物（3,3’-T₂S）的方法及检测试剂盒，属于光激化学发光免疫分析技术领域。本发明首先采用3,3’-T₂S与发光微粒偶联，将发光微粒标记到3,3’-T₂S上。再由白色不透明微孔板，3,3’-T₂S标准品，包被有3,3’-T₂S的发光微粒，兔抗3,3’-T₂S抗体冻干品，生物素化羊抗兔抗体冻干品和包被有链霉亲和素的感光微粒组成检测试剂盒。发光微粒上的3,3’-T₂S与3,3’-T₂S竞争连接到3,3’-T₂S抗体，再与生物素化羊抗兔抗体及包被有链霉亲和素的感光微粒形成复合体，光激发下，通过单线态离子氧的产生和传递，将能量传递给发光微粒产生荧光，光信号强度与样品中3,3’-T₂S浓度成反比，对照标准曲线测得样品中3,3’-T₂S的含量。该3,3’-T₂S检测试剂盒结构简单，操作简便、检测时间短、灵敏度高。

Description

一种标记3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物的方法及检测试剂盒

技术领域

一种标记3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物（3,3’-T₂S）的方法及检测试剂盒，属于光激化学发光免疫分析（LICLIA）技术领域，用于对妊娠妇女血清中3,3’-T₂S含量的检测。

背景技术

先天性甲状腺功能减低症，简称先天性甲减，是由于胚胎期和出生前在某些病因的作用下引起的甲状腺轴的发生、发育和功能代谢出现异常，引起甲状腺功能减低，严重地影响到中枢神经系统和体格等的发育。

目前胎儿期的甲减筛查还是个世界性难题。对此，国内外一些学者对胎儿甲状腺功能的检测做了不少研究。

已有大量实验显示3,3’-T₂S与胎儿甲状腺激素代谢有密切关系，3,3’-T₂S是胎儿甲状腺激素的代谢物，经胎盘溢出到母体一侧，造成母体血中其浓度升高，因此，孕妇血清和尿中的3,3’-T₂S浓度可以反映胎儿甲状腺激素的水平，间接反映胎儿甲状腺功能状态。目前3,3’-T₂S的RIA检测方法十分繁琐、复杂和耗时，RIA进行标记时标记物为¹²⁵I，由于标记时会形成的T₂S、T₃S与T₄S，因此分离纯化的过程繁琐及复杂，且放射性碘的半衰期较短，标记物放置后因衰变使放射性降低，因而需要经常制备标记物，另外放射性核素对环境保护及工作人员健康都带来不利影响；RIA操作时，整个检测的反应时间达48小时，而且方法很难自动化，等等，这些限制了3,3’-T₂S检测的应用，从而限制了其在胎儿和新生儿甲状腺功能筛查中的价值。

光激化学发光免疫分析（LICLIA）是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学发光技术，该项技术将被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。LICLIA技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光（680 nm）照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小（约为200 nm）。如果发光微粒在200 nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光（520nm - 620nm）。相反，如果在200 nm直径范围内没有发光微粒，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是LICLIA均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距离，例如形成免疫夹心复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号。

发明内容

本发明的目的在于提供一种标记3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物（3,3’-T₂S）的方法及检测试剂盒，用于对妊娠妇女血清中3,3’-T₂S含量的检测。

本发明的技术方案：

发光微粒标记3,3’-T₂S的方法：在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5 μL 质量浓度1% Tween-20，0.05 mg 3,3’-T₂S，10μL的25mg/mL硼氢化氰钠溶液，用pH6.0、0.1M的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时，加入10μL pH 5.0、0.3M的羧甲氧基胺半盐酸盐溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时，离心纯化，洗去未反应的试剂后，分离得到包被有3,3’-T₂S抗原的发光微粒，即为用发光微粒标记的3,3’-T₂S，稀释后备用。

一种3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物（3,3’-T₂S）的检测试剂盒，由白色不透明微孔板1，3,3’-T₂S标准品2，包被有3,3’-T₂S的发光微粒3，兔抗3,3’-T₂S抗体冻干品4，生物素化羊抗兔抗体冻干品5，和包被有链霉亲和素的感光微粒6组成。

3,3’-T₂S标准品2的配制：3,3’-T₂S标准品浓度分别为：0 pg/mL，10 pg/mL，100 pg/mL，500 pg/mL，1000 pg/mL，5000 pg/mL，从3,3’-T₂S纯品中稀释得到，稀释液为30%乙醇溶液。

用所述的检测试剂盒检测3,3’-T₂S的方法，取包被有3,3’-T₂S的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入3,3’-T₂S标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后各孔顺序加入兔抗3,3’-T₂S抗体、生物素化羊抗兔抗体进行标记免疫反应；接着在避光处加入包被有链霉亲和素的感光微粒进行反应，反应后检测光信号，对照标准曲线计算被测样品中的3,3’-T₂S含量。

所述的检测3,3’-T₂S的方法，操作为：

取20μL包被有3,3’-T₂S的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的3,3’-T₂S标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL 兔抗3,3’-T₂S抗体；继续加入20μL生物素化羊抗兔抗体，37℃孵育15分钟；避光处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃暗处孵育15分钟，反应后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算被测样品中的3,3’-T₂S含量。

本发明的有益效果：该标记方法结构简单，操作简便、检测时间短、灵敏度高。

附图说明

图1：3,3’-T₂S检测试剂盒组成示意图。1、白色不透明微孔板，2、3,3’-T₂S标准品，3、包被有3,3’-T₂S抗原的发光微粒，4、兔抗3,3’-T₂S抗体冻干品，5、生物素化羊抗兔抗体冻干品，6、包被有链霉亲和素的感光微粒。

图2：3,3’-T₂S- LICLIA反应示意图。

图3：3,3’-T₂S- LICLIA标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：发光微粒标记到3,3’-T₂S并制备试剂盒及检测妊娠妇女血清样品

将发光微粒标记到3,3’-T₂S：

在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL 1% Tween-20，0.05mg 3,3’-T₂S，10μL的25mg/mL硼氢化氰钠溶液，用0.1M、pH6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时。加入10μL 0.3 M pH 5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐（CMO）溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，洗去未反应的试剂后，分离得到已连接3,3’-T₂S抗原的发光微粒，稀释后备用。

妊娠妇女血清的制备：取妊娠妇女血清加入2倍体积95%的乙醇，-20℃过夜后，4℃ 3000r/min 离心20min，取其上清备用。

试剂的配制：

标准3,3’-T₂S试剂的配制：标准3,3’-T₂S：0 pg/mL，10 pg/mL，100 pg/mL，500 pg/mL，1000 pg/mL，5000 pg/mL，从3,3’-T₂S纯品中稀释得到，稀释液为30%乙醇溶液。

试剂盒的组成：

(1)、白色不透明微孔板（12条×8孔，可以拆分为单孔）。

(2)、6×3,3’-T₂S标准液，1.0mL/瓶，3,3’-T₂S标准液浓度为：0 pg/mL，10 pg/mL，100 pg/mL，500 pg/mL，1000 pg/mL，5000 pg/mL。

(3)、1×包被有3,3’-T₂S的发光微粒：2mL。

(4)、1×兔抗3,3’-T₂S抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。

(5)、1×生物素化羊抗兔抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。

(6)、1×包被有链霉亲和素的感光微粒：20mL。

测定时注意事项

1、使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃)。

2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。

具体检测步骤如下：

取20μL包被有3,3’-T₂S的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的3,3’-T₂S标准或经处理后妊娠妇女血清到各自的微孔中；加20μL兔抗3,3’-T₂S抗体；继续加入20μL生物素化羊抗兔抗体，37℃孵育15分钟；避光处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃暗处孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的3,3’-T₂S含量。结果见表1，由标准曲线求得该例血样1所含3,3’-T₂S浓度为796pg/mL，血样2所含3,3’-T₂S浓度为1851pg/mL。

表1

Claims

1.发光微粒标记3,3’-T₂S的方法，3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物简称3,3’-T₂S，其特征在于：在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL质量浓度1% Tween-20，0.05mg 3,3’-T₂S，和10μL的25mg/mL硼氢化氰钠溶液，用pH6.0、0.1M的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时，加入10μL pH 5.0、0.3M的羧甲氧基胺半盐酸盐溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时，离心纯化，洗去未反应的试剂后，分离得到包被有3,3’-T₂S的发光微粒，即为用发光微粒标记的3,3’-T₂S，稀释后备用。

2.一种3,3’-T₂S的检测试剂盒，其特征在于应用了权利要求1所述方法制备的包被有3,3’-T₂S的发光微粒，该检测试剂盒由白色不透明微孔板（1），3,3’-T₂S标准品（2），包被有3,3’-T₂S的发光微粒（3），兔抗3,3’-T₂S抗体冻干品（4），生物素化羊抗兔抗体冻干品（5），和包被有链霉亲和素的感光微粒（6）组成。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于3,3’-T₂S标准品（2）的配制：3,3’-T₂S标准品浓度分别为：0 pg/mL，10 pg/mL，100 pg/mL，500 pg/mL，1000 pg/mL，5000 pg/mL，从3,3’-T₂S纯品中稀释得到，稀释液为30%乙醇溶液。

4.一种用权利要求2所述的检测试剂盒检测3,3’-T₂S的方法，其特征在于取包被有3,3’-T₂S的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入3,3’-T₂S标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后各孔顺序加入兔抗3,3’-T₂S抗体、生物素化羊抗兔抗体进行标记免疫反应；接着在避光处加入包被有链霉亲和素的感光微粒进行反应，反应后检测光信号，对照标准曲线计算被测样品中的3,3’-T₂S含量。

5.根据权利要求4所述的检测3,3’-T₂S的方法，其特征在于操作为：取20μL包被有3,3’-T₂S的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的3,3’-T₂S标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL兔抗3,3’-T₂S抗体；继续加入20μL生物素化羊抗兔抗体，37℃孵育15分钟；避光处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃暗处孵育15分钟，反应后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算被测样品中的3,3’-T₂S含量。