CN102504023A - 一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用，其技术方案是：以中蜂囊状幼虫为病毒增殖模型增值病毒，并用增值的病毒制备中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，用制备的灭活疫苗连续三次免疫产蛋鸡，用间接ELESA法测定抗体效价，效价达到2⁸以上收集鸡蛋，用水合法提纯卵黄抗体。用这种卵黄抗体对感染中蜂囊状幼虫病毒的蜂群进行治疗，治愈率96.25%达以上，并且使用方便、特异性强、起效快、不复发、无药物残留。

Description

一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用。

背景技术

中华蜜蜂已被列入国家畜禽遗传资源保护名录，也是辽宁省十大畜禽遗传资源保护品种之一，是我国宝贵的地方蜂种资源，饲养中蜂也已成为山区农民发家致富的有效途径。中蜂对保持我国植物生态系统具有不可替代的作用，研究表明一旦中蜂灭绝，我国将有30%的植物灭绝，目前因中蜂的减产，导致一些国家级二级保护植物濒临灭绝。近年来各地为加强中蜂业的发展，已经建立了中蜂保护区，然而，目前因中蜂囊状幼虫病的发生，已经给中蜂业造成了毁灭性的打击。1972年中蜂囊状幼虫病在广东大流行，不到半年蔓延至大半个中国，中蜂损失约百万群，严重制约了中蜂产业的发展。目前虽然有中药用于中蜂囊状幼虫病的治疗，但中药治疗主要是通过免疫调节作用，间接抗病毒，并不能直接杀死病毒，相对起效慢，尤其是对重病蜂群治愈效果较差，同时由于中药的药味会使蜜蜂不能很好的采食，甚至发生逃逸。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用，可用于治疗中蜂囊状幼虫病，且疗效显著。

本发明涉及的一种卵黄抗体的制备方法，其具体步骤如下：

1、中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗的制备

将中蜂囊状幼虫病毒用BCA法检测浓度，用PH=7.4~7.8的磷酸盐缓冲液将病毒浓度稀释至0.2~0.3毫克/毫升，按稀释后的囊状幼虫病毒溶液体积的0.3~0.4%加入甲醛灭活24~48小时后，按稀释后的囊状幼虫病毒溶液体积的4~8%的加入吐温-80，做水相；司本-80与10号白油按体积比1: 9~1: 19混合，灭菌，做油相；水相与油相体积比为1:3~2:3，先将油相在8000~10000rpm搅拌，再缓慢加入水相，10000~12000rpm搅拌4~6分钟，进行无菌检验后，制得中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，所制疫苗为油包水型；

2、卵黄抗体的制备

用制备的中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首次免疫肌肉注射0.5~1毫升，之后第14~15天，第28~30天免疫加强1次，剂量加大至首次注射剂量的2~4倍，经三次免疫后，用间接ELESA法测定抗体效价，当效价达到2⁸以上时，收集鸡蛋，储于 4~8℃，以后每隔30~35天免疫一次所述产蛋鸡，以保证有效抗体效价在2⁸以上；对收集到的鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY。

上述的卵黄抗体的制备方法，所述的中蜂囊状幼虫病毒通过以下步骤得到：

1、用RT-PCR检测阳性的患病幼虫与pH=7.4~7.8的磷酸盐缓冲液先混匀，每1g患病幼虫加磷酸盐缓冲液1~2ml，磨碎后的混合液加入氯仿，氯仿与所述混合液的体积比1:0.8~1:1.5，在37~40℃下匀浆8~10 min，然后800~1200 rpm离心8~10min，分别收集上清液和沉淀物；

2、取上清液，在上清液中加入与其体积比为1:0.8~1:1.5的氯仿，在37~40℃水浴中振摇8~10 min，然后800~1200 rpm离心8~10 min，分别收集上清液和沉淀物；

3、上清液继续用步骤2处理2~4次，分别收集上清液和沉淀物；

4、将所得沉淀物收集在一起，用pH=7.4~7.8的磷酸盐缓冲液溶解，每1g沉淀物加1~2ml磷酸盐缓冲液，然后800~1200 rpm离心8~10 min，取上清液，与之前经过多次处理的上清液混合，然后5000~8000 rpm离心25~30min，取上清液，10000~15000rpm离心25~30 min，再取上清液，35000~45000 rpm离心50~60 min，弃去上清液，将最后离心得到的沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，得到中蜂囊状幼虫病毒。

上述的卵黄抗体的制备方法，采用水合法提取卵黄抗体IgY时具体步骤为：

用蒸馏水将卵黄液稀释，其中卵黄抗体与蒸馏水的体积比为1:9~1:10，搅拌15~30min，用0.1mol／L的HCL调节PH= 5.0~5.2 后，放置 4~8℃冰箱 6~12 小时；然后以4~8℃，8000~10000 r／min离心25~30min, 用医用纱布过滤，取上清液，浓缩。

用上述方法制备得到的卵黄抗体。

上述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用。

上述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用，其具体步骤如下：

将效价调整到2⁵的卵黄抗体溶液，通过直接溶解糖或喷雾的方式给予蜜蜂，饲喂量为15~25毫升/天/框，隔天饲喂1次，连续饲喂三周。

用该方法制得的卵黄抗体在治疗中蜂囊状幼虫病的药物中，具有作用迅速、疗效确切、治愈率高、特异性强、起效快、不复发等优点，其直接针对相应抗原发生迅速的结合反应，因而使用后可产生立竿见影的效果，尤其用于周边已有疾病发生时的紧急预防，使用方便，见效快、安全。卵黄抗体除具有抗体共同优点外，更有许多独特优点， 表现在：原料易得，生产成本低，使用方便，无药物残留，不易失效，便于贮存等特点。

通过该方法制得的卵黄抗体，用于中蜂囊状幼虫病治疗，临床试验结果表明，对已经通过RT-PCR检测和临床确诊的80箱感染中蜂囊状幼虫病毒的蜂群进行治疗，发病较轻的蜂群6~8天，不再有幼虫拖出，2周左右开始出现新的封盖幼虫，而其他蜂群在13天左右陆续不再有幼虫拖出，并在21天左右出现新的封盖幼虫，一个月左右77箱蜜蜂全部治愈，治愈率96.25%以上。

具体实施方式

实施例1

一、中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗的制备

用RT-PCR检测阳性的患病幼虫与pH7.6的磷酸盐缓冲溶液先混匀，每1g患病幼虫加磷酸盐缓冲液1ml，磨碎后的混合液加入氯仿，与上述混合液的体积比1:0.8，在37℃下匀浆10 min，然后1000 rpm离心10min，分别收集上清液和沉淀物；取上清液，在上清液中加入与其体积比为1:0.8的氯仿，在37℃水浴中振摇10 min，然后1000 rpm离心10 min，分别收集上清液和沉淀物，上清液继续用此法处理两次，分别收集上清液和沉淀物；将所得沉淀物收集在一起，用pH7.6磷酸盐缓冲液溶解，每1g沉淀物加1ml磷酸盐缓冲液，然后1000 rpm离心10 min，取上清液，与之前经过多次处理的上清液混合，然后5000 rpm离心30 min，取上清液，15000 rpm离心25 min，再取上清液，35000 rpm离心60 min，弃去上清液，将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，用RT-PCR进行检测，检测阳性，证明得到中蜂囊状幼虫病毒。

将得到的病毒用BCA法检测浓度，用pH7.6磷酸盐缓冲液将病毒浓度稀释至0.25毫克/毫升，按稀释后的囊状幼虫病毒体积的0.3%加入甲醛灭活24小时后，按稀释后的囊状幼虫病毒体积的4%的加入吐温-80，做水相；司本-80与10号白油按体积比1:14混合，在121.3℃温度下灭菌，做油相；水相与油相体积比为2:3，先将油相在8000rpm搅拌，再缓慢加入水相，12000rpm搅拌4分钟，进行无菌检验后，制得中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，所制疫苗为油包水型。

二、卵黄抗体的制备

用制备的中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首次免疫肌肉注射0.5毫升，之后第14天，第28天免疫加强1次，剂量加大1倍，经三免后，用间接ELESA法测定抗体效价，效价达到2⁸以上，就可以收集鸡蛋，储于 4℃，以后每隔35天免疫一次上述产蛋鸡，以保证有效抗体效价在2⁸以上；对收集到的鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY，具体方法为：用蒸馏水将卵黄液稀释，其中卵黄抗体与蒸馏水的体积比为1：9，搅拌15min，用0.1mol／L的HCL调节PH至 5.0后放置 4℃冰箱 6 小时；然后以4℃，10000 r／min离心25min, 用医用纱布过滤，取上清液，用浓缩仪（millipoe 30kd）浓缩，即制得卵黄抗体。

三、上述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用

对已经通过RT-PCR检测和临床确诊的30箱感染中蜂囊状幼虫病毒的蜂群进行治疗，将效价调整到2⁵的卵黄抗体溶液作为药物通过直接溶解糖的方式给予蜜蜂，饲喂量为15毫升/天/框，隔天饲喂1次，连续饲喂21天。除了2箱因管理不善、失王、工蜂产卵外，未进行持续治疗外，其他剩下的28箱蜜蜂，在治疗后第13天不再有幼虫拖出，21天开始出现新的封盖幼虫，截止31天28箱蜜蜂全部治愈，治愈率96.25%。

实施例2

一、     中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗的制备

用RT-PCR检测阳性的患病幼虫与pH7.4的磷酸盐缓冲溶液先混匀，每1g患病幼虫加磷酸盐缓冲液1.5ml，磨碎后的混合液加入氯仿，与上述混合液的体积比1:1.2，在39℃下匀浆8 min，然后1200 rpm离心8min，分别收集上清液和沉淀物；取上清液，在上清液中加入与其体积比为1:1.2的氯仿，在39℃水浴中振摇8 min，然后1200 rpm离心8 min，分别收集上清液和沉淀物，上清液继续用此法处理三次，分别收集上清液和沉淀物；将所得沉淀物收集在一起，用pH7.4磷酸盐缓冲液溶解，每1g沉淀物加1.5ml磷酸盐缓冲液，然后1200 rpm离心8 min，取上清液，与之前经过多次处理的上清液混合，然后6000 rpm离心27 min，取上清液，12000 rpm离心27 min，再取上清液，40000 rpm离心55 min，弃去上清液，将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，用RT-PCR进行检测，检测阳性，证明得到中蜂囊状幼虫病毒。

将得到的病毒用BCA法检测浓度，用pH7.4磷酸盐缓冲液将病毒浓度稀释至0.2毫克/毫升，按稀释后的囊状幼虫病毒体积的0.35%加入甲醛灭活36小时后，按稀释后的囊状幼虫病毒体积的6%的加入吐温-80，做水相；司本-80与10号白油按体积比1: 19混合，在121.3℃温度下灭菌，做油相；水相与油相体积比为1:2，先将油相在9000rpm搅拌，再缓慢加入水相，10000rpm搅拌6分钟，进行无菌检验后，制得中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，所制疫苗为油包水型。

二、卵黄抗体的制备

用制备的中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首次免疫肌肉注射0.75毫升，之后第14天，第29天免疫加强1次，剂量加大1.5倍，经三免后，用间接ELESA法测定抗体效价，效价达到2⁸以上，就可以收集鸡蛋，储于 6℃，以后每隔32天免疫一次上述产蛋鸡，以保证有效抗体效价在2⁸以上；对收集到的鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY，具体方法为：用蒸馏水将卵黄液稀释，其中卵黄抗体与蒸馏水的体积比为1:10，搅拌20min，用0.1mol／L的HCL调节PH至 5.1 后放置6℃冰箱 9 小时；然后以6℃，9000r／min离心27min, 用医用纱布过滤，取上清液，用浓缩仪（millipoe 30kd）浓缩，即制得卵黄抗体。

三、上述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用

对已经通过RT-PCR检测和临床确诊的25箱感染中蜂囊状幼虫病毒的蜂群进行治疗，将效价调整到2⁵的卵黄抗体溶液作为药物通过直接溶解糖的方式给予蜜蜂，饲喂量为20毫升/天/框，隔天饲喂1次，连续饲喂21天。在治疗后第8天不在有幼虫拖出，18天开始出现新的封盖幼虫，截止35天，25箱蜜蜂全部治愈，治愈率100%。

实施例3

一、中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗的制备

用RT-PCR检测阳性的患病幼虫与pH7.8的磷酸盐缓冲溶液先混匀，每1g患病幼虫加磷酸盐缓冲液2ml，磨碎后的混合液加入氯仿，与上述混合液的体积比1:1.5，在40℃下匀浆9 min，然后800 rpm离心9min，分别收集上清液和沉淀物；取上清液，在上清液中加入与其体积比为1:1.5的氯仿，在40℃水浴中振摇9min，然后800 rpm离心9 min，分别收集上清液和沉淀物，上清液继续用此法处理四次，分别收集上清液和沉淀物；将所得沉淀物收集在一起，用pH7.8磷酸盐缓冲液溶解，每1g沉淀物加2ml磷酸盐缓冲液，然后800 rpm离心9 min，取上清液，与之前经过多次处理的上清液混和，然后8000 rpm离心25 min，取上清液，10000 rpm离心30 min，再取上清液，45000 rpm离心50 min，弃去上清液，将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，用RT-PCR进行检测，检测阳性，证明得到中蜂囊状幼虫病毒。

将得到的病毒用BCA法检测浓度，用pH7.8磷酸盐缓冲液将病毒浓度稀释至0.3毫克/毫升，按稀释后的囊状幼虫病毒体积的0.4%加入甲醛灭活48小时后，按稀释后的囊状幼虫病毒体积的8%的加入吐温-80，做水相；司本-80与10号白油按体积比1: 9混合，在121.3℃温度下灭菌，做油相；水相与油相体积比为1:3，先将油相在10000rpm搅拌，再缓慢加入水相，11000rpm搅拌5分钟，进行无菌检验后，制得中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，所制疫苗为油包水型。

二、卵黄抗体的制备

用制备的中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首次免疫肌肉注射1毫升，之后第15天，第30天免疫加强1次，剂量加大2倍，经三免后，用间接ELESA法测定抗体效价，效价达到2⁸以上，就可以收集鸡蛋，储于8℃，以后每隔30天免疫一次上述产蛋鸡，以保证有效抗体效价在2⁸以上；对收集到的鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY，具体方法为：用蒸馏水将卵黄液稀释，其中卵黄抗体与蒸馏水的体积比为1：9.5，搅拌30min，用0.1mol／L的HCL调节PH至5.2 后放置8℃冰箱 12 小时；然后以8℃，8000r／min离心30min, 用医用纱布过滤，取上清液，用浓缩仪（millipoe 30kd）浓缩，即制得卵黄抗体。

三、上述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用

对已经通过RT-PCR检测和临床确诊的25箱感染中蜂囊状幼虫病毒的蜂群进行治疗，将效价调整到2⁵的卵黄抗体溶液作为药物通过喷雾的方式给予蜜蜂，饲喂量为25毫升/天/框，隔天饲喂1次，连续饲喂21天。在治疗后第6天不再有幼虫拖出，17天开始出现新的封盖幼虫，在第23天因1箱蜜蜂失王与邻近箱合并，剩下的24箱蜜蜂全部治愈，治愈率98.76%。

Claims (6)

1.本发明涉及的一种卵黄抗体的制备方法，其特征在于：

1.1中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗的制备

将中蜂囊状幼虫病毒用BCA法检测浓度，用PH=7.4~7.8的磷酸盐缓冲液将病毒浓度稀释至0.2~0.3毫克/毫升，按稀释后的囊状幼虫病毒溶液体积的0.3~0.4%加入甲醛灭活24~48小时后，按稀释后的囊状幼虫病毒溶液体积的4~8%的加入吐温-80，做水相；司本-80与10号白油按体积比1: 9~1: 19混合，灭菌，做油相；水相与油相体积比为1:3~2:3，先将油相在8000~10000rpm搅拌，再缓慢加入水相，10000~12000rpm搅拌4~6分钟，进行无菌检验后，制得中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，所制疫苗为油包水型；

1.2卵黄抗体的制备

用制备的中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首次免疫肌肉注射0.5~1毫升，之后第14~15天，第28~30天免疫加强1次，剂量加大至首次注射剂量的2~4倍，经三次免疫后，用间接ELESA法测定抗体效价，当效价达到2⁸以上时，收集鸡蛋，储于 4~8℃，以后每隔30~35天免疫一次所述产蛋鸡，以保证有效抗体效价在2⁸以上；对收集到的鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY。

2.根据权利要求1所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的中蜂囊状幼虫病毒通过以下步骤得到：

2.1用RT-PCR检测阳性的患病幼虫与pH=7.4~7.8的磷酸盐缓冲液先混匀，每1g患病幼虫加磷酸盐缓冲液1~2ml，磨碎后的混合液加入氯仿，氯仿与所述混合液的体积比1:0.8~1:1.5，在37~40℃下匀浆8~10 min，然后800~1200 rpm离心8~10min，分别收集上清液和沉淀物；

2.2取上清液，在上清液中加入与其体积比为1:0.8~1:1.5的氯仿，在37~40℃水浴中振摇8~10 min，然后800~1200 rpm离心8~10 min，分别收集上清液和沉淀物；

2.3上清液继续用步骤2处理2~4次，分别收集上清液和沉淀物；

2.4将所得沉淀物收集在一起，用pH=7.4~7.8的磷酸盐缓冲液溶解，每1g沉淀物加1~2ml磷酸盐缓冲液，然后800~1200 rpm离心8~10 min，取上清液，与之前经过多次处理的上清液混合，然后5000~8000 rpm离心25~30min，取上清液，10000~15000rpm离心25~30 min，再取上清液，35000~45000 rpm离心50~60 min，弃去上清液，将最后离心得到的沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，得到中蜂囊状幼虫病毒。

3.根据权利要求1所述的卵黄抗体的制备方法，采用水合法提取卵黄抗体IgY时其特征在于：

用蒸馏水将卵黄液稀释，其中卵黄抗体与蒸馏水的体积比为1:9~1:10，搅拌15~30min，用0.1mol／L的HCL调节PH= 5.0~5.2 后，放置 4~8℃冰箱 6~12 小时；然后以4~8℃，8000~10000 r／min离心25~30min, 用医用纱布过滤，取上清液，浓缩。

4.如权利要求1或2或3所述方法制备得到的卵黄抗体。

5.按照权利要求4所述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用。

6.根据权利要求5所述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用，其特征在于：

将效价调整到2⁵的卵黄抗体溶液，通过直接溶解糖或喷雾的方式给予蜜蜂，饲喂量为15~25毫升/天/框，隔天饲喂1次，连续饲喂三周。