CN102495033B - 一种汞元素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于纳米技术和分析检测领域，提供了一种基于干扰银纳米颗粒形成的汞元素检测方法，该方法为：在PBS缓冲溶液中加入标记了的荧光素(FAM)的DNA，震荡混匀；向上述溶液中加入硝酸银溶液，震荡混匀，静置，使银离子与DNA充分作用，吸附到DNA上；向上述溶液中加入硼氢化钠，银离子在DNA被还原上形成银纳米颗粒，淬灭荧光素的荧光。该方法是在加入硼氢化钠前向溶液中通入汞离子作用一段时间，则银、汞离子在硼氢化钠的还原下生成游离的银汞合金从而保留荧光素的荧光，因此可用于检测汞离子，同时也可用于检测汞蒸气。所述方法用来检测汞元素(离子、蒸气)操作简便，经济实用，专一性高，灵敏度好，具有较大的创新性和对其它目标物的应用前景。

Description

一种汞元素的检测方法

技术领域

本发明属于纳米技术和分析检测领域，涉及纳米材料中的DNA为模板银纳米颗粒的制备方法及应用以DNA为模板的银纳米颗粒检测汞元素的方法。

背景技术

银纳米颗粒作为一种新兴的纳米材料，继金纳米颗粒之后，成为又一个研究热点。与金纳米颗粒类似，银纳米颗粒在390-420nm间具有特征的等离子共振吸收峰。此外，银纳米颗粒具有更高的消光系数，这使得它应用于比色检测灵敏度更好，基于银纳米颗粒的比色检测方法已被应用到DNA，金属离子，蛋白质等。同时银纳米颗粒具有拉曼增强的性质，作为拉曼信号物而被广泛的应用于设计以拉曼光谱为信号输出的探针。

最近，M.Dickson等提出了以DNA为模板合成银纳米团簇的方法，银纳米团簇是一些粒径较小(约几个纳米)的银纳米颗粒堆积在一起形成的特殊结构，而正因为粒径较小，产生纳米尺寸效应，具有离散的电子能级，电子容易被激发因而这一类团簇往往具有较强的荧光，该工作发表在JACS上(《DNA-Templated Ag Nanocluster Formation》，J.Am.Chem.Soc.2004，126，5207-5212)。接下来，该组继续研究发现银纳米簇的荧光是跟模板DNA链的序列密切相关的，通过改变序列，可以调控发射的波长达到近红外区域(《Oligonucleotide-Stablized Ag Nanocluster Fluorophores》，J.Am.Chem.Soc.2008，130，5038-5039)。此后，一系列利用具有荧光的银纳米簇进行分析检测的工作得到了发表，包括DNA，金属离子，以及单碱基多态性分析等。

当粒径增大时，利用DNA为模板将会形成不具有荧光的银纳米颗粒，它们对与DNA相连的荧光基团的荧光将会起到较大的猝灭作用。

汞是一种具有很强毒性的重金属，并且由于其分布广泛，容易形成各种形态的污染物。空气，土壤以及水遭受污染后均可引发汞中毒。在各种形态的汞之中，具有水溶性的二价汞离子是最常见的，同时又具有强烈的毒性。二价汞离子可导致严重的健康问题，包括肌肉震颤，视觉损害，听力损害，以及损伤大脑进而对神经系统造成危害等；于此同时二价汞离子也是一种环境污染物，广泛存在于工业废水中。基于以上原因，近年来针对如高灵敏，高选择性检测汞离子做了大量的研究。传统的一些检测方法主要依赖于各种仪器，如：原子吸收和发射光谱，电感耦合等离子质谱，冷蒸气原子荧光光谱等，这些方法虽然检测效果好，但需要昂贵复杂的仪器，且成本较高，难以实现实时监测。近年来关于汞离子检测的研究非常热门，出现了应用前沿技术的方法，基于电化学和光学传感器、有机小分子探针、共聚物、核酸、蛋白质和酶、无机纳米材料等一系列检测汞离子手段。

由于汞容易挥发，因而汞蒸气便成为了检测单质汞的最常见目标物，针对汞蒸气的检测，目前常用的方法是通过发生器产生汞蒸气然后与仪器联用进行测量，最常用的气体发生方法有冷蒸气发生法以及流动注射法，而检测器则可以使用原子吸收，原子荧光。另外色谱原子吸收联用技术，电感耦合等离子共振质谱也被用来进行汞蒸气的测定。

目前看来，通常银纳米颗粒多用于比色检测，而本发明应用它的淬灭效应来设计检测方法，且以DNA为模板的银纳米颗粒的淬灭特性进行分析检测的工作，目前基本上没有出现，是一个新的研究领域。

发明内容

本发明的目的在于，为了克服现有检测汞元素技术的不足，结合纳米材料的一些优势，提出了一种利用汞对以DNA为模板的银纳米颗粒形成的影响，来检测汞元素的新方法。本发明的汞元素的检测方法方便简单，无需昂贵仪器，花费低廉，且能得到优异的检测结果，具有实际应用前景并且可应用到其他目标物的检测。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种汞元素的检测方法，以标记有荧光素的DNA为模板的银纳米颗粒的合成过程为基础，在形成银纳米颗粒之前加入汞元素，汞离子和银离子在还原剂的作用下形成银汞合金而影响了银纳米颗粒的生成，荧光素的荧光得到保留，实现汞离子的检测。

具体为：在PBS缓冲溶液中加入标记了荧光素的DNA溶液，震荡混匀；然后加入硝酸银溶液，震荡混匀，静置，使银离子与DNA充分作用，吸附到DNA上；再加入汞离子或者通入汞蒸气，摇匀；最后加入硼氢化钠溶液，银、汞离子在硼氢化钠的还原下生成游离的银汞合金从而保留荧光素的荧光，测量荧光素在490nm-600nm的荧光，实现汞离子的检测。

所述PBS缓冲溶液的pH为7.2-7.4。

所述硝酸银溶液与标记了荧光素的DNA溶液加入的摩尔比例为1∶0.9-11。

所述标记了荧光素的DNA溶液的浓度为4.8μM/L-5.2μM/L，所述硝酸银溶液的浓度为0.8mM/L-1.2mM/L，所述硼氢化钠溶液的浓度为8mM/L-12mM/L，硼氢化钠溶液的加入量为1μL-5μL。

所述荧光素优选为FAM。

银纳米颗粒的合成为现有方法，本发明所述银纳米颗粒的合成过程优选为：

(1)将5μM/L标记了荧光素的DNA溶液与1mM/L硝酸银溶液按1∶0.9-1.1的摩尔比例混合摇匀，静置10分钟，得混合溶液；

(2)取pH＝7.410mM/L的PBS缓冲溶液480μL加入到容积为1mL的荧光池中；接着加入10μL上述混合溶液摇匀；

(3)加入10mM/L的硼氢化钠溶液2μL还原，摇晃后放置20分钟(可以看到溶液的颜色有变黄，说明生成了银纳米颗粒)，即可。

本发明所述的一种汞元素的检测方法，优选在上述银纳米颗粒的合成过程的步骤(3)之前加入硝酸汞溶液或者通入汞蒸气，摇匀，放置10分钟，此时再加入硼氢化钠溶液时，银、汞离子在硼氢化钠的还原下生成游离的银汞合金从而保留荧光素的荧光，实现汞离子的检测。

以下对本发明做进一步说明：

本发明的原理是：在PBS缓冲溶液中加入标记了的荧光素的DNA，向上述溶液中加入硝酸银溶液，震荡混匀，静置，使银离子与DNA充分作用；向上述溶液中加入硼氢化钠，银离子在DNA被还原上形成银纳米颗粒，荧光素的荧光被淬灭。若在加入硼氢化钠前向溶液中通入一定量的汞离子作用一段时间，则银、汞离子会在硼氢化钠的还原下生成游离的银汞合金从而保留荧光素的荧光，因此可用于检测汞离子，同时也可用于检测汞蒸气。

本发明进行汞离子检测所用到的PBS缓冲溶液为10mM/L，pH＝7.2-7.4的缓冲溶液，优选pH＝7.4，温度为常温；PBS缓冲液中Na₂HPO₄的浓度为4.3mmol/L，KH₂PO₄的浓度为1.4mmol/L。

本发明所述的标记了荧光素的DNA溶液可以是一段含有一定碱基数量的现有DNA或者合成DNA，优选含20-45个碱基的DNA，更优选含23个碱基的DNA，其中碱基中以C的含量较多的碱基为最好，本发明实施例中所用的DNA序列为：5′-FAM-CCCCTAACCCTAACCCTAACCCC-3′，其中FAM是标记的荧光素，此段序列是从生工生物工程(上海)有限公司购买得到。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

本发明为一种基于DNA为模板的银纳米颗粒来进行汞离子和汞蒸气的检测方法，它不再依赖于复杂昂贵的仪器，而且与新兴的纳米材料进行了较好的结合，发展出了一种有效的应用手段。同时从结果上看，本发明具有很好的灵敏度与选择性(见实施例2-6)，且操作方法简单。

附图说明

图1-1为实施例1中制得的以DNA为模板的银纳米颗粒透射电镜图；

图1-2为实施例1中制得的在Hg²⁺存在的情况下还原后的透射电镜图。

图2为实施例2中采用标记了荧光素的DNA为模板合成银纳米颗粒对荧光的淬灭以及在不同加入不同金属离子的情况下，对荧光影响的光谱；

图3-1为实施例3中合成银纳米颗粒的吸收图谱，以及在不同加入不同金属离子的情况下，对吸收图谱的影响的情况；

图3-2为实施例3中合成银纳米颗粒溶液的照片，以及在不同加入不同金属离子的情况下溶液的照片。

图4为实施例4中考察是否以DNA为模板合成的银纳米颗粒对荧光素的荧光的猝灭情况；

图5为实施例5中在不同浓度的汞离子存在下采用标记了荧光素的DNA为模板合成银纳米颗粒时对荧光素荧光的保留情况的光谱；

图6为实施例6中在不同浓度的汞蒸气存在下采用标记了荧光素的DNA为模板合成银纳米颗粒时对荧光素荧光的保留情况的光谱。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，旨在易于理解本发明的技术方案特征，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者是等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

实施例1制备以DNA为模板的银纳米颗粒：

配制制备银纳米颗粒所需的溶液：将含23个碱基的DNA原液加水稀释得5μM/L的溶液，配制1mM/L的硝酸银(AgNO3)溶液，配制10mM/L的硼氢化钠(NaBH₄)溶液，配制10mM/L的PBS缓冲液(pH＝7.4)待用；

向1.5mL的离心管内加入490μL的PBS缓冲溶液(10mM/L)；取配制好的5μM/L的DNA溶液5μL加入，摇匀；取配制好的1mM/L的硝酸银溶液5μL加入，摇匀，放置10分钟(使得银离子与DNA充分作用)；加入10mM/L的硼氢化钠溶液1μL还原，并剧烈震荡离心管。由于银离子与DNA上的碱基作用进而吸附到了DNA上，故形成了以DNA为模板的银纳米颗粒，另一份平行样中还原前再加入5μL 1mM/L的汞离子。

透射电镜图分析：从图1-1可以看出，没有汞离子存在时，形成了均一，分散，直径在5nm左右的银纳米颗粒，而汞离子存在的情况下，由图1-2，不再有分散的纳米颗粒，取而代之的是较大的银汞合金聚集体，说明汞离子的确能影响银纳米颗粒的形成。

实施例2本检测方法对各种金属离子的选择性荧光实验：

将含标记了荧光素的DNA溶液(5μM/L)与硝酸银溶液(1mM/L)按1∶1的比例混合摇匀，静置10分钟；取PBS缓冲溶液(10mM/L，pH＝7.4)480μL加入到容积为1mL的荧光池中；接着加入10μL上述混合溶液摇匀；加入10μL的不同金属离子溶液(1mM/L)，使得各种金属离子浓度为20μM摇匀，放置10分钟；最后加入2μL硼氢化钠溶液(10mM/L)还原，摇晃后放置20分钟，使得反应进行充分，测试并分别记录其荧光发射光谱，得到不同金属离子的加入对荧光素的荧光的影响。

荧光谱图分析：从图2的荧光谱图中可以看出，当未加入金属离子的情况下，荧光素的荧光会被银纳米颗粒淬灭(90％以上)，若加入金属离子，则加汞离子的情况下荧光会得到较大程度的保留，而其余金属离子则几乎与未加入时情况相差不大，由此可以说明本方法对汞离子具有特异性响应，这也是应用其进行汞离子检测的一个基础。

实施例3各种金属离子对以DNA为模板的银纳米形成的影响实验：

将含23个碱基(5′-FAM-CCCCTAACCCTAACCCTAACCCC-3′)的标记了荧光素的DNA溶液(5μM/L)与硝酸银溶液(1mM/L)按1∶1的比例混合摇匀，静置10分钟；取PBS缓冲溶液(10mM/L，pH＝7.4)480μL加入到容积为1mL的吸收池中；接着加入10μL上述混合溶液摇匀；加入10μL的不同金属离子溶液(1mM/L)，使得各种金属离子浓度为20μM摇匀，放置10分钟；最后加入2μL硼氢化钠溶液(10mM/L)还原，摇晃后放置20分钟，使得反应进行充分，测试并分别记录其吸收光谱，得到不同金属离子的加入对银纳米颗粒吸收光谱的影响。

吸收谱图分析：从图3-1的吸收谱图中可以看出，当未加入任何金属离子时，经过硼氢化钠还原后，在390nm处出现了一个明显的吸收峰(这个峰是属于银纳米颗粒的特征吸收峰)，说明形成了银纳米颗粒；而在汞离子存在的情况下进行还原后，390nm处的吸收强度明显降低，说明汞离子的存在会干扰银纳米颗粒的形成；但其他金属离子的加入吸收光谱并不会产生太大的变化，由此更进一步的证明了应用本方法检测汞离子的有效性。

照片图分析：图3-2的照片中可以看出银纳米颗粒溶液的颜色呈亮黄色，而在汞离子存在的情况下，溶液的颜色为蓝灰色，而其余的金属离子对溶液的颜色影响不大(图片中从左到右依次为空白，含有Hg²⁺，Cd²⁺，Ni²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，Ba²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺，Pb²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺)。

实施例4考察是否以DNA为模板形成的银纳米颗粒荧光淬灭能力实验：

(1)取PBS缓冲溶液(10mM/L，pH＝7.4)480μL加入到容积为1mL的荧光池中；将5μL含标记了荧光素的DNA溶液(5μM/L)加入荧光池中，摇匀，测试其荧光光谱；

(2)向(1)中的溶液加入5μL硝酸银溶液(1mM/L)后，摇匀静置10分钟，测试其荧光光谱；

(3)向(2)中的溶液加入1μL硼氢化钠溶液(10mM/L)进行还原，反应20分钟，测试其荧光光谱；

(4)取PBS缓冲溶液(10mM/L，pH＝7.4)480μL加入到容积为1mL的荧光池中；将5μL硝酸银溶液(1mM/L)加入荧光池中，摇匀，加入1μL硼氢化钠溶液(10mM/L)进行还原，形成银纳米颗粒

(5)向(4)中加入5μL含标记了荧光素的DNA溶液(5μM/L)，摇匀，等待20分钟，测试其荧光光谱；

荧光谱图分析：从图4的荧光谱图中可以看出，测量样品DNA，即(1)在516nm处的荧光强度约为900左右，加入了硝酸银之后下降到700(这是由于银离子对荧光素的荧光有一定的淬灭作用)，用硼氢化钠还原后，荧光急剧淬灭。而没有以DNA为模板的银纳米颗粒产生的荧光淬灭，即(5)的荧光强度基本等同于DNA加入硝酸银后，即(2)的情况，由此可以说明只有当银纳米颗粒以DNA为模板形成的时候，才能对荧光素的荧光产生较大的淬灭(由于这种情况下银纳米颗粒在DNA链上，与荧光素距离很近)。

实施例5本检测方法对Hg²⁺进行检测的响应实验：

将含标记了荧光素的DNA溶液(5μM/L)与硝酸银溶液(1mM/L)按1∶1的比例混合摇匀，静置10分钟；取PBS缓冲溶液(10mM/L，pH＝7.4)480μL加入到容积为1mL的荧光池中；接着加入10μL上述混合溶液摇匀；加入10μL的不同浓度的硝酸汞溶液，摇匀，放置10分钟；最后加入2μL硼氢化钠溶液(10mM/L)还原，摇晃后放置20分钟，使得反应进行充分，测试并分别记录其荧光光谱光谱，得到不同浓度汞离子的加入对荧光的保留情况。

荧光谱图分析：从图5的荧光谱图中可以看出，随着汞离子浓度的增大，516nm处荧光峰的强度逐渐增强，在汞离子浓度为100nM的时候，就有一定的响应，一直到6μM时，再升高浓度，荧光的保留程度不再上升。

实施例6本检测方法对汞蒸气进行检测的响应实验：

将含标记了荧光素的DNA溶液(5μM/L)与硝酸银溶液(1mM/L)按1∶1的比例混合摇匀，静置10分钟；取PBS缓冲溶液(10mM/L，pH＝7.4)5mL加入到容积为50mL的离心管中；接着加入100μL上述混合溶液摇匀；将硝酸汞溶液加入到汞蒸气的发生器中，启动发生器，将汞蒸气导入50mL的离心管中，通气约5分钟(使得汞蒸气吸收基本完全)；取下离心管，关闭发生装置，将导气管插入尾气吸收装置中；将离心管摇匀静置10分钟后，取500μL离心管中的液体加入到1mL的荧光池中，加入2μL硼氢化钠溶液(10mM/L)还原，摇晃后放置20分钟，使得反应进行充分，测试并记录其荧光光谱光谱，得到不同浓度汞蒸气的加入对荧光的保留情况。

荧光谱图分析：从图6的荧光谱图中可以看出，随着汞蒸气浓度的增大，516nm处荧光峰的强度逐渐增强，在汞离子浓度为250nM的时候，就有一定的响应，一直到10μM时，再升高浓度，荧光的保留程度不再上升。对比图5，图6发现，在同样的条件下，等浓度汞离子对荧光素荧光的保留程度比汞蒸气略高，且汞离子的最低响应浓度更小(由于蒸气发生程度与吸收过程并不能达到100％)，但两者都能对荧光素的荧光产生很好的保留效果。

Claims (8)

1.一种汞元素的检测方法，其特征是，以标记有荧光素的DNA为模板的银纳米颗粒的合成过程为基础，在形成银纳米颗粒之前加入汞元素，汞离子和银离子在还原剂的作用下形成银汞合金而影响了银纳米颗粒的生成，荧光素的荧光得到保留，实现汞离子的检测；在PBS缓冲溶液中加入标记了荧光素的DNA溶液，震荡混匀；然后加入硝酸银溶液，震荡混匀，静置，使银离子与DNA充分作用，吸附到DNA上；再加入汞离子或者通入汞蒸气，摇匀；最后加入硼氢化钠溶液，银、汞离子在硼氢化钠的还原下生成游离的银汞合金从而保留荧光素的荧光，测量荧光素在490nm-600nm的荧光，实现汞离子的检测。

2.根据权利要求1所述的一种汞元素的检测方法，其特征是，所述PBS缓冲溶液的pH为7.2-7.4。

3.根据权利要求1所述的一种汞元素的检测方法，其特征是，所述硝酸银溶液与标记了荧光素的DNA溶液加入的摩尔比例为1:0.9-1.1。

4.根据权利要求1所述的一种汞元素的检测方法，其特征是，所述标记了荧光素的DNA溶液的浓度为4.8μM/L-5.2μM/L，所述硝酸银溶液的浓度为0.8mM/L-1.2mM/L，所述硼氢化钠溶液的浓度为8mM/L-12mM/L，硼氢化钠溶液的加入量为1μL-5μL。

5.根据权利要求1所述的一种汞元素的检测方法，其特征是，所述银纳米颗粒的合成过程为：

（1）将5μM/L标记了荧光素的DNA溶液与1mM/L硝酸银溶液按1:0.9-1.1的摩尔比例混合摇匀，静置10分钟，得混合溶液；

（2）取pH=7.410mM/L的PBS缓冲溶液480μL加入到容积为1mL的荧光池中；接着加入10μL上述混合溶液摇匀；

（3）加入10mM/L的硼氢化钠溶液2μL还原，摇晃后放置20分钟，即可。

6.根据权利要求5所述的一种汞元素的检测方法，其特征是，在步骤（3）之前加入硝酸汞溶液或者通入汞蒸气，摇匀，放置10分钟。

7.根据权利要求1-6之一所述的一种汞元素的检测方法，其特征是，所述标记了荧光素的DNA溶液中的DNA为含20-45个碱基的DNA。

8.根据权利要求7所述的一种汞元素的检测方法，其特征是，所述标记了荧光素的DNA溶液中的DNA的碱基序列为5′-FAM-CCCCTAACCCTAACCCTAACCCC-3′。

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