CN102482497A - 再生丝心蛋白的加速凝胶化 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于加速再生丝心蛋白的凝胶时间的方法，所述方法使用凝胶剂，优选二氧化硅以建立多孔结构，并且是无微生物生长的。

Description

再生丝心蛋白的加速凝胶化
发明领域
本发明涉及用于加速再生丝心蛋白的凝胶化的方法。本发明还涉及使用试剂如二氧化硅建立再生丝心蛋白的多孔结构的方法。
发明背景
已知再生丝心蛋白(RSF)凝胶具有多孔微结构，这可以被转化为获得可控的机械性能。丝心蛋白凝胶的高强度，其孔隙度及其生物相容性使它成为潜在地令人感兴趣的可用于如组织工程学用3D多孔骨架的应用的生物材料。
RSF的凝胶时间依赖于溶液中丝心蛋白的pH和浓度。丝心蛋白凝胶的潜在重要性是在对于细胞生长适宜的pH为7.2-7.4的生物医学研究中。已经发现浓度在1至10g/L的范围内的RSF在pH 7可能花费多至30至60天用于凝胶化，而10至100g/L的范围内的更高蛋白质浓度的RSF在pH 7花费10至20天变成凝胶(参考图1)。由更高蛋白质浓度的溶液制备的RSF凝胶不具有用于细胞进入和生长的适当的孔隙度。因此，希望的是由较低蛋白质浓度的RSF在pH 7制造微孔凝胶。长时间暴露于较高温度范围导致蛋白质的沉淀以及微孔结构的丧失，这对于为RSF所构想的应用是不适宜的。用于这种溶液的凝胶化需要相当长的时间，如果未保持无菌环境，在该过程中在丝溶液/凝胶中观察到真菌生长。考虑到其在组织工程学中的潜在应用，需要能够避免抗真菌剂的使用以使得细胞系不经历有毒的环境。因此需要缩短RSF在pH 7和室温的凝胶时间。A.Lele等在2008年8月3-8日的国际流变学大会(International Congress onRheology)的墙报上以及在Phys.Chem.Chem.Phys.，2010，12，3834-3844中研究了再生丝心蛋白溶液的凝胶化机制。他们还研究了所形成的丝水凝胶的结构和特征。
可以参考Dr.David L.Kaplan的标题为“Silk Polymer Designs forImproved Expression and Processing”的文章，其公开了丝凝胶化的控制，其中丝心蛋白的凝胶化依赖于丝心蛋白浓度、温度和凝胶形成的pH以及蛋白质结构，所述蛋白质结构可以关联到丝心蛋白蛋白质的分子构造中的一级序列特异性特征。此外，所述文章还描述了丝-无机纳米复合材料-二氧化硅体系，其中研究了用于二氧化硅纳米复合材料的形成的丝-R5融合体的克隆、表达和功能。
可以参考Wong等2006年的标题为“Novel nanocomposites from spidersilk-silica fusion(chimeric)proteins)”的文章，其公开了新仿生纳米复合材料方法以使用融合(嵌合)蛋白质合成二氧化硅复合材料。已经发现融合蛋白质具有宽范围领域内的应用，如生物医学领域[包括免疫学、癌症研究和药物递送(17-20)]以及材料科学[自组装材料(例如，凝胶)，量子点生物结合物、传感器和无机材料合成(21-27)]。
可以参考文章“Composite Material Made of Regenerated Silk Fibroinand Silica Sol”，Cheng Cheng等，2008/10发表，其公开了将再生丝心蛋白溶液与二氧化硅溶胶混合以制备丝心蛋白/二氧化硅复合材料。为了探测在丝蛋白质与二氧化硅之间是否有相互作用，并且更进一步地，是否该相互作用可以改善复合材料的机械性能，通过动态力学分析(DMA)与扫描电子显微镜(SEM)和拉曼光谱一起研究了丝心蛋白/二氧化硅复合材料的结构和性质。SEM结果显示复合材料中丝心蛋白与二氧化硅之间良好的相容性。纳米尺寸的二氧化硅粒子均匀地分散在丝心蛋白的连续基体中。复合材料的拉曼光谱显示丝心蛋白以β折叠构象为主。与纯丝心蛋白材料比较，该复合材料显示出更好的动态机械性能。
可以参考专利申请WO 200512606，其中申请要求保护水性丝心蛋白溶液和用于制备其的方法、制备纤维的方法、丝泡沫体、膜和丝水凝胶。在所述PCT申请的第30页上，讨论了关于离子、pH、温度和PEO对丝心蛋白溶液的凝胶化的影响的研究。
现有技术调查表明没有文献教导凝胶化的加速从而缩短凝胶时间的方法。尤其是没有现有技术文献教导使用加速剂的丝心蛋白凝胶时间的加速方法。
发明目的
本发明的主要目的是缩短RSF凝胶的凝胶时间以填补本领域中的空白。
本发明的另一个目的是使用不引起凝胶介质中微生物生长的方法缩短RSF凝胶时间。
本发明的再另一个目的是通过对细胞系无毒的方法缩短凝胶时间。发明概述
因此，本发明提供一种加速具有多孔结构的再生丝心蛋白(RSF)的凝胶化的方法，所述方法包括以下步骤：
a)调节再生丝心蛋白溶液的pH至pH 5-7.5并且在0.1至40％的范围内调节其浓度；
b)加入所需浓度的凝胶剂并且保持温度条件，以及
c)通过管倒置法检查凝胶化以获得RSF凝胶。
在本发明的实施方案中，所述凝胶剂选自由以下各项组成的组：二氧化硅、TiO2、FeO2SiN3、羟基磷灰石(hydroxyapetite)，以及其他生物相容的无机化合物，优选二氧化硅。
在本发明的另一个实施方案中，所述凝胶化任选地在碱性条件下通过用蛋白质的β折叠，优选丝心蛋白蛋白质的β折叠自接种(self seeding)进行。
在本发明的再另一个实施方案中，所述方法在20-70℃的范围内的温度下进行。
在本发明的再另一个实施方案中，所述凝胶剂在1g/L至25g/L，优选1至5g/L的浓度范围内使用。
在本发明的再另一个实施方案中，所述凝胶剂的粒子大小在1nm-1μ，优选1nm至400nm的范围内。
在本发明的再另一个实施方案中，再生丝心蛋白凝胶具有多孔结构，所述凝胶的孔大小在1-10微米的范围内。
在本发明的再另一个实施方案中，再生丝心蛋白凝胶具有多孔结构，所述凝胶包含孔隙度在1至500nm的范围内的纳米多孔壁。
在本发明的再另一个实施方案中，再生丝心蛋白凝胶具有多孔结构，所述凝胶是没有微生物生长的。
附图简述
图1：在不同的pH下RSF的凝胶时间(D.Kaplan，JPC B，110，2006，21630-21638)
图2：对本发明的含有不同二氧化硅纳米粒子的RSF溶胶和RSF凝胶在pH 7和25℃的圆二色性法研究
图3：对本发明带有和不带有纳米粒子的RSF凝胶的压缩模量测量。
图4：在不同浓度的纳米粒子的存在下5g/L RSF凝胶的压缩模量和凝胶时间研究。
图5：浓度5g/L，pH 2和50℃的RSF凝胶的CSLM图像(图像的宽度表示160μm)，其中观察到蛋白质形成多孔结构。
图6：管倒置显示了凝胶的形成。第一管显示了RSF的溶胶。第二管显示了所形成的凝胶，通过管倒置法测试证实了凝胶的形成。
发明详述
本发明公开了一种缩短RSF的凝胶时间的方法。RSF和凝胶剂的组合物在pH 7-8下在2-24小时内凝胶，产生带有纳米多孔壁的微孔凝胶。该组合物是用于接种细胞和递送活性剂的粉末、膜、成形体、模制体等。
短语“再生丝心蛋白”和“再生蛋白质丝心蛋白”遍及本说明书可互换地使用并且本领域技术人员可以认识到这点。
短语“丝”和“蛋白质”遍及本说明书可互换地使用并且本领域技术人员可以认识到这点。
依照本发明的目的，尝试了不同的方法以缩短RSF凝胶的凝胶时间。依赖于蛋白质(丝)浓度，在室温下在pH 7.0下RSF凝胶在约两周至三个月内形成(参考图1)。为缩短凝胶时间，一个备选方案是减小pH，但是酸性pH不允许细胞的繁殖。在一个实验中，出乎意料地发现二氧化硅纳米粒子的加入将凝胶时间由数个月缩短为数天或数小时，凝胶时间随过程的温度、蛋白质的浓度和二氧化硅纳米粒子的粒子大小而变化。所得到的包含再生丝心蛋白凝胶、水和缩短凝胶时间的试剂的组合物建立再生丝心蛋白的多孔结构。
因此，本发明公开了加速具有多孔结构的再生丝心蛋白的凝胶化的方法，所述方法包括以下步骤：
a.调节再生丝心蛋白溶液的pH至pH 7并且调节它的浓度；
b.加入凝胶剂并保持温度条件；以及
c.通过管倒置法检查凝胶化。
如图6中所观察的，通过管倒置法检查凝胶形成。
凝胶剂不仅缩短用于凝胶化的时间，而且还克服了微生物生长的问题。不存在凝胶剂时，在pH 7-8对于5-70℃的范围内的温度，凝胶化花费大于三周，并且在该期间中观察到微生物生长。然而，在二氧化硅纳米粒子的存在下，在凝胶化之前观察不到微生物生长。
此外，这种试剂是生物相容的并且对将在RSF凝胶的这些微孔网络上生长的细胞系是无毒的。
在本发明中所使用的凝胶剂选自二氧化硅、TiO2、FeO2SiN3、羟基磷灰石和其他生物相容的无机化合物的纳米粒子。
凝胶时间随从1g/L变化至25g/L以上的凝胶剂浓度的上升而缩短。该试剂的粒子大小从1nm至400nm变化并且凝胶时间至少比没有该试剂时所花费的时间缩短一半。在一些情况下，凝胶时间缩短至少一个数量级。此外，加速凝胶化的过程在20℃至70℃的范围内的温度下进行。
采用不同的温度范围和凝胶剂浓度的多个试验的结果在下面的表1、2和3中以表格列出在这里。
表1：显示了二氧化硅粒子对RSF样品凝胶时间的影响的凝胶时间表
Figure BDA0000133286150000051
表2：显示了二氧化硅粒子对RSF样品凝胶时间的影响的凝胶时间表
Figure BDA0000133286150000061
在15天内形成沉淀并且保持这样超过30天。
表3：显示了增加二氧化硅粒子浓度对RSF样品凝胶时间的影响的凝胶时间表
Figure BDA0000133286150000062
从以上结果发现，当蛋白质浓度为1g/L时，对于400nm的二氧化硅粒子在25℃凝胶时间低至5天，并且当该过程在70℃和pH 5-7进行时缩短至10小时。在5g/L的更高的蛋白质浓度下，对于400nm的二氧化硅粒子大小以及70℃的温度和pH 7.2，凝胶时间为3小时。因此，通过增加凝胶剂的浓度但保持温度并使用稀盐酸保持pH，获得RSF的凝胶化过程的加速。
在本发明中，蛋白质浓度从0.1至40％变化。组合物形成具有纳米多孔壁的、孔大小在1-10微米的范围内的微孔凝胶网络，其中壁的孔隙度在1-500nm的范围内。
在本发明的另外一个方面中，用蛋白质的β折叠自接种导致凝胶时间的加速。
在一个优选的方面中，RSF的凝胶时间通过将RSF溶液用碱性条件下的凝胶自接种而加速。二氧化硅不存在于该RSF中。
表4
显示了RSF溶液用碱性条件下的凝胶自接种对RSF样品凝胶时间的影响的凝胶时间表
组合物是流延膜，是粉末或是成形体或模制体。该组合物包含有助于流延膜或模制为物体的添加剂。
如这里所示例的，该凝胶的特征在于它们的机械性能和3D多孔性。
这样的组合物可用于接种细胞、作为药物递送剂等。
实施例
以下实施例仅以示例的方式给出，并且因此不应被理解为限制本发明的范围。
实施例1
RSF组合物的制备
使用Nagarkar等(Ind.Eng.Chem.Res.2009，0-11)中描述的程序制备RSF溶液。通过在持续的搅拌下加入0.1N HCl将渗析过的RSF溶液的pH调节至7。使用pH 7的去离子水将蛋白质的浓度调节至1g/L。将已知重量的40nm的二氧化硅纳米粒子加入至RSF溶液。将这些溶液在恒温水浴中保持在25℃、50℃和70℃下并且每3小时之后监测样品的状态。使用小瓶倾倒法记录凝胶状态和凝胶时间。
实施例2
RSF组合物的制备
使用Nagarkar等(Ind.Eng.Chem.Res.2009，0-11)中描述的程序制备RSF溶液。通过在持续的搅拌下加入0.1N HCl将渗析过的RSF溶液的pH调节至7。使用pH 7的去离子水将蛋白质的浓度调节至1g/L。将已知重量的150nm的二氧化硅纳米粒子加入至RSF溶液。将这些溶液在恒温水浴中保持在25℃、50℃和70℃下并且每3小时之后监测样品的状态。使用小瓶倾倒法记录凝胶状态和凝胶时间。
实施例3
RSF组合物的制备
使用Nagarkar等(Ind.Eng.Chem.Res.2009，0-11)中描述的程序制备RSF溶液。通过在持续的搅拌下加入0.1N HCl将渗析过的RSF溶液的pH调节至7。使用pH 7的去离子水将蛋白质的浓度调节至1g/L。将已知重量的400nm的二氧化硅纳米粒子加入至RSF溶液。将这些溶液在恒温水浴中保持在25℃、50℃和70℃下并且每3小时之后监测样品的状态。使用小瓶倾倒法记录凝胶状态和凝胶时间。
实施例4
RSF组合物的制备
使用Nagarkar等(Ind.Eng.Chem.Res.2009，0-11)中描述的程序制备RSF溶液。通过在持续的搅拌下加入0.1N HCl将渗析过的RSF溶液的pH调节至7。使用pH 7的去离子水将蛋白质的浓度调节至5g/L。将已知重量的40nm的二氧化硅纳米粒子加入至RSF溶液。将这些溶液在恒温水浴中保持在25℃、50℃和70℃下并且每3小时之后监测样品的状态。使用小瓶倾倒法记录凝胶状态和凝胶时间。
实施例5
RSF组合物的制备
使用Nagarkar等(Ind.Eng.Chem.Res.2009，0-11)中描述的程序制备RSF溶液。通过在持续的搅拌下加入0.1N HCl将渗析过的RSF溶液的pH调节至7。使用pH 7的去离子水将蛋白质的浓度调节至5g/L。将已知重量的150nm的二氧化硅纳米粒子加入至RSF溶液。将这些溶液在恒温水浴中保持在25℃、50℃和70℃下并且每3小时之后监测样品的状态。使用小瓶倾倒法记录凝胶状态和凝胶时间。
实施例6
RSF组合物的制备
使用Nagarkar等(Ind.Eng.Chem.Res.2009，0-11)中描述的程序制备RSF溶液。通过在持续的搅拌下加入0.1N HCl将渗析过的RSF溶液的pH调节至7。使用pH 7的去离子水将蛋白质的浓度调节至5g/L。将已知重量的400nm的二氧化硅纳米粒子加入至RSF溶液。将这些溶液在恒温水浴中保持在25℃、50℃和70℃下并且每3小时之后监测样品的状态。使用小瓶倾倒法记录凝胶状态和凝胶时间。
对于不同浓度的二氧化硅和RSF溶液”实施例1-6所得到的RSF凝胶时间上的加速在上面的表1、2和3中以表格列出。
实施例7
机械性能
通过Rheometric Series RSA-III测试台(TA仪器-Waters LLC，NewCastle DE 1970)测量本发明的RSF凝胶的压缩模量(E′)。使用包括15mm直径的上盘，充当样品架的27mm内径乘以4mm高的圆筒，和下盘的自制附件测试样品。将在15ml培养瓶中形成的RSF凝胶放置在样品架中。在约半小时的等待期间之后，将硅油(SF-1000，GE Bayer Silicones，印度)涂布至样品的边缘以避免水从RSF凝胶丧失。在频率1Hz下在所有的样品上进行动态应变扫描测试，并且将应力由0.01％以0.01％的增量增加至3％。表5和6显示了所测得的带有和不带有纳米粒子的RSF凝胶的压缩模量。
表5：带有和不带有纳米粒子的RSF凝胶的压缩模量测量。
Figure BDA0000133286150000101
表6：在不同浓度的纳米粒子的存在下5g/L RSF凝胶的压缩模量测量。
Figure BDA0000133286150000102
实施例8
通过CLSM的孔隙度测量
通过共焦激光扫描显微镜(CLSM)定量计算RSF凝胶的孔隙度。使用卡尔蔡司共焦显微镜(Carl Zeiss Confocal Microscope)获得如图5中所示的RSF凝胶的显微图像。由已知的物镜放大率计算RSF凝胶的孔隙度。对于1g/L至5g/L的RSF浓度，RSF凝胶的孔隙度从100微米至10微米变化。图5显示了浓度5g/L，pH 2和50℃下的RSF凝胶的CSLM图像。
实施例9
作为接种时间函数的RSF凝胶化研究
通过使用以下方法制备RSF。将丝茧在0.5重量％的碳酸氢钠(NaHCO3)中煮沸一小时以移除丝胶蛋白。将煮沸过的丝心蛋白纤维用过量的水彻底洗涤以移除NaHCO3。之后将所获得的丝心蛋白溶解在9.3MLiBr溶液中以获得10重量％溶液。将该溶液向去离子水渗析(得自SigmaAldrich的乙酸纤维素渗析袋，MWC＝10,000)48小时。将第一批的去离子水在3小时之后更换，并且之后每9小时更换。将渗析过的RSF溶液在15000RPM下离心20分钟，在这之后使用UV可见光谱测定蛋白质的浓度，用11.8作为摩尔消光系数(Izuka等，1968)。通常将渗析过的溶液储藏在5-7℃下的冰箱中。测得渗析过的溶液的pH为8.7。
通过在持续搅拌下逐滴加入0.1M HCL溶液调节渗析过的溶液的一部分的pH。在pH调节过程中，一部分的蛋白质沉淀出来，并且将这些通过在15000RPM下离心20min移除。从而获得的上清液蛋白质溶液，在下文中称作“溶胶”，是澄清的并且在将其用于进一步研究之前通过UV可见光谱测定其浓度。准备各自含有5ml的溶胶的9个样品小瓶。将27μl的3M NaOH加至样品小瓶1以将其pH升高至8.7，这等于渗析过的RSF的pH。我们将该样品称为具有零“接种”时间的样品。将在其他八个小瓶中的溶胶样品在低pH下保持如表4中所提到的0至24h之间的不同的“接种”时间，在这之后将27μl的3M NaOH加入至它们的每一个。加入NaOH溶液时样品的状态和加入NaOH之后的凝胶时间显示在表4中。
本发明的益处
1.温度以及pH的环境条件加速凝胶化过程。
2.加速使得凝胶时间与数天比较缩短至数小时。
3.凝胶时间上的缩短使得凝胶可用于宽范围的多种应用。
4.凝胶对微生物生长不敏感。
5.获得具有宽范围的孔隙度的多孔网络。
6.自接种的备选方法也导致凝胶时间的加速。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于再生丝心蛋白(RSF)的凝胶化以获得具有多孔结构的凝胶的方法，所述方法包括以下步骤：
a)调节再生丝心蛋白溶液的pH至pH 5-7.5并且在0.1至40％的范围内调节其浓度；
b)加入选自由二氧化硅、TiO2、FeO2SiN3和羟基磷灰石组成的组，优选二氧化硅的凝胶剂并且将温度保持在20-70℃的范围内以获得RSF凝胶。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述凝胶化任选地在碱性条件下通过用蛋白质的β折叠，优选丝心蛋白蛋白质的β折叠自接种而进行。
3.如权利要求1所述的方法，其中用于再生丝心蛋白的凝胶化的时间期间在3小时至6天的范围内。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述凝胶剂在1g/L至25g/L，优选1至5g/L的浓度范围内使用。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述凝胶剂的粒子大小在1nm-1μ，优选1nm至400nm的范围内。
6.根据权利要求1获得的具有多孔结构的再生丝心蛋白凝胶，其中所述凝胶的孔大小在1-10微米的范围内。
7.根据权利要求1获得的具有多孔结构的再生丝心蛋白凝胶，其中所述凝胶包含孔隙度在1至500nm的范围内的纳米多孔壁。
8.根据权利要求1获得的具有多孔结构的再生丝心蛋白凝胶，其中所述凝胶是没有微生物生长的。
说明或声明(按照条约第19条的修改)
                根据第19(1)条的声明
根据国际检索机构(ISA/EP)的检索报告和书面意见，我们适当地修改了权利要求书以在本发明中确立新颖性和创造性。
·修改了权利要求1。
·删除了权利要求2、4和10。
·添加了新的权利要求3。
·权利要求中的任何增加内容已经用下划线指出，并且权利要求中的任何删除已经通过删除线指出。
所修改的权利要求未超出原始提交的国际申请的公开内容并且不影响原始提交的说明书和附图。

Claims (10)

1.一种加速具有多孔结构的再生丝心蛋白(RSF)的凝胶化的方法，所述方法包括以下步骤：
a)调节再生丝心蛋白溶液的pH至pH 5-7.5并且在0.1至40％的范围内调节其浓度；
b)加入所需浓度的凝胶剂并且保持温度条件，以及
c)通过管倒置法检查凝胶化以获得RSF凝胶。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述凝胶剂选自由以下各项组成的组：二氧化硅、TiO2、FeO2SiN3、羟基磷灰石，以及其他生物相容的无机化合物，优选二氧化硅。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述凝胶化任选地在碱性条件下通过用蛋白质的β折叠，优选丝心蛋白蛋白质的β折叠自接种而进行。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述方法在20-70℃的范围内的温度下进行。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述凝胶剂在1g/L至25g/L，优选1至5g/L的浓度范围内使用。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述凝胶剂的粒子大小在1nm-1μ，优选1nm至400nm的范围内。
7.根据权利要求1获得的具有多孔结构的再生丝心蛋白凝胶，其中所述凝胶的孔大小在1-10微米的范围内。
8.根据权利要求1获得的具有多孔结构的再生丝心蛋白凝胶，其中所述凝胶包含孔隙度在1至500nm的范围内的纳米多孔壁。
9.根据权利要求1获得的具有多孔结构的再生丝心蛋白凝胶，其中所述凝胶是没有微生物生长的。
10.一种加速具有多孔结构的再生丝心蛋白(RSF)的凝胶化的方法，所述方法在这里基本上根据实施例和说明书附图。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102007797B1 (ko) * 2012-11-30 2019-08-07 (주)아모레퍼시픽 실크 하이드로겔 조성물 및 실크 하이드로겔 마스크

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4233212A (en) * 1979-04-17 1980-11-11 Kanebo, Ltd. Process for producing a fine powder of silk fibroin
WO2003022909A1 (en) * 2001-09-11 2003-03-20 Consorzio Per Gli Studi Universitari Method for the preparation of silk fibroin hydrogels
CN1861666A (zh) * 2006-04-19 2006-11-15 东华大学 SF/SiO2纳米复合膜的制备方法
CN101235204A (zh) * 2008-02-26 2008-08-06 天津工业大学 一种纳米相羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料的制备方法
CN101474429A (zh) * 2009-01-22 2009-07-08 浙江理工大学 两步法制备羟基磷灰石-丝素蛋白复合支架材料的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2912430B2 (ja) * 1990-07-18 1999-06-28 鐘紡株式会社 油性体吸蔵再生蛋白質微粉末及びその製造方法
JP3738255B2 (ja) * 2003-02-21 2006-01-25 株式会社オードレマン 非結晶性絹フィブロインを含有する化粧料
CA2562415C (en) 2003-04-10 2015-10-27 Tufts University Concentrated aqueous silk fibroin solutions free of organic solvents and uses thereof
DK2211876T3 (en) * 2007-05-29 2015-01-12 Tufts College PROCESS FOR silk fibroin-GELATION USING sonication
JP5637424B2 (ja) * 2008-05-26 2014-12-10 国立大学法人群馬大学 複合体及びその製造方法並びに化粧品材料

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4233212A (en) * 1979-04-17 1980-11-11 Kanebo, Ltd. Process for producing a fine powder of silk fibroin
WO2003022909A1 (en) * 2001-09-11 2003-03-20 Consorzio Per Gli Studi Universitari Method for the preparation of silk fibroin hydrogels
CN1861666A (zh) * 2006-04-19 2006-11-15 东华大学 SF/SiO2纳米复合膜的制备方法
CN101235204A (zh) * 2008-02-26 2008-08-06 天津工业大学 一种纳米相羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料的制备方法
CN101474429A (zh) * 2009-01-22 2009-07-08 浙江理工大学 两步法制备羟基磷灰石-丝素蛋白复合支架材料的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
UNG-JIN KIM, ET AL.: "Structure and properties of Silk Hydrogels", 《BIOMACROMOLECULES》 *
郑桂芬等: "纳米TiO2对丝素蛋白膜构象转变的影响", 《功能高分子学报》 *

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