CN102472753B - 基于组蛋白macroH2A同工型预测癌症复发风险的诊断方法 - Google Patents

基于组蛋白macroH2A同工型预测癌症复发风险的诊断方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于诊断哺乳动物患者中癌症复发风险的方法，所述方法包括检测获自所述患者的生物学样品中macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达，其中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的低表达或降低表达是所述患者中癌症复发风险提高的指征。基于所述诊断方法，本发明还涉及用于治疗癌症，特别是乳癌和/或肺癌的改进方法。

Description

基于组蛋白macroH2A同工型预测癌症复发风险的诊断方法
发明领域
本发明涉及用于诊断哺乳动物患者中癌症复发风险的方法，所述方法包括检测获自所述患者的生物学样品中macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达，其中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的低表达或降低表达是所述患者中癌症复发风险提高的指征。基于所述诊断方法，本发明还涉及用于治疗癌症，特别是乳癌和/或肺癌的改进方法。
发明背景
癌症中，就新病例而言，肺癌是第二大最普遍的癌症(在美国占所有癌症的15％)(Jemal等，2007)，并且是全世界范围内癌症死亡的首要原因(在美国占男性的31％和女性的26％)。五分之四的肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)，约三分之一的NSCLC患者诊断具有早期疾病。对于这些患者来说，手术是最佳治疗选择，但是患者复发比例高，并且大多数死于其疾病。处于相同癌症阶段的患者往往显示不同的复发率(Zhu等，2006)；因此，存在对分子标志物的关注，所述分子标志物能够鉴别出在手术后更易于复发的患者(D’Amico，2008)。已经测试了NSCLC的转移性复发的数个潜在标志物，但是所述标志物都没有证明它们足够有用(Zhu等，2006)。
通常认为组蛋白以类似水平存在于不同细胞类型中。在数个分子和细胞特征方面，异染色质组蛋白变体macroH2A是独特的。在结构水平，其具有大的C-末端延伸，即大结构域(macro domain)，这是约25kDa的球形构件(globular module)，对于dmacroH2A1.1，其以高特异性结合ADP-核糖(Kustatscher等，2005)。此外，对于macro-H2A，在所有脊椎动物中都存在保守的2个基因，以及称为macroH2A1.2的macroH2A1的第二剪切变体，其不能结合小分子。
MacroH2A参与称为衰老的永久性生长终止(Pehrson和Fried，1992；Zhang等，2005)。此现象已在体外针对原代细胞培养物进行了描述(Hayflick，1965)，该现象是对于例如端粒酶缩短、DNA损伤累积和某些致癌基因过度表达等压力的反应(Serrano等，1991)。
此外还令人感兴趣关注的是，诱导致癌基因衰老已成为体内有效的抗肿瘤机制(Braig等，2005；Chen等，2005；Collado等，2005；Michaloglou等，2005)。
Holdenrieder等(在：Holdenrieder S，Stieber P，Bodenmüller H，Busch M，Fertig G，Fürst H，Schalhorn A，Schmeller N，Untch M，Seidel D.Nucleosomes in serum of patients with benign and malignant diseases.Int JCancer 2001 Mar 20；95(2)：114-20.中)观察了进行化疗的20位患者和进行放疗的16位患者的血清样品中的核小体和核小体浓度动力学。相比健康人和患有良性疾病的患者的血清，患有恶性肿瘤的患者的血清中含有的核小体浓度显著更高。他们提出，血清中核小体的浓度可成为用于监测抗肿瘤治疗过程中生化反应的有用工具，尤其是用于治疗效力的早期估测的有用工具。
Kurdistani(在：Kurdistani SK.Histone modifications as markers ofcancer prognosis：a cellular view.Br J Cancer.2007 Jul 2；97(1)：1-5.Epub2007 Jun 26.中)描述了组蛋白修饰的改变与在癌症发展和进程中具有重要作用的许多基因的失控表达有关。一直以来，都是从启动子特异性的角度对这些改变的作用进行理解，集中于在组蛋白修饰形式中的基因与基因之间的差异。此外，提出了癌症组织还在特异性组蛋白修饰的总量方面显示出细胞与细胞之间的差异。这种新的细胞表观遗传异质性(epigenetic heterogeneity)与癌症患者的临床结果有关，且可以用作预后的重要标志物。
Barlési等(在：Barlési F，Giaccone G，Gallegos-Ruiz MI，Loundou A，Span SW，Lefesvre P，Kruyt FA，Rodriguez JA.Global histone modificationspredict prognosis of resected non small-cell lung cancer.J Clin Oncol.2007Oct 1；25(28)：4358-64.中)描述了考察表观遗传修饰是否会促进癌症的发展和进程的研究。考察了涉及多个组蛋白的表观遗传改变对于非小细胞肺癌(NSCLC)患者的预后的影响。考察了138位NSCLC患者切除的肿瘤样品中组蛋白3赖氨酸4二甲基化(H3K4diMe)，以及组蛋白2A赖氨酸5(H2AK5Ac)、组蛋白2B赖氨酸12、组蛋白3赖氨酸9(H3K9Ac)和组蛋白4赖氨酸8的乙酰化。I期患者所在的组(低于第一淋巴结)显示出存活的显著差异(中值，具有H3K9Ac的腺癌患者存活10个月占68％，而具有H3K4diMe的非腺癌患者存活147个月占85％)。据说所公开的数据提供了采用标准化疗和与组蛋白修饰相互作用的药物相联合的原理，所述药物例如组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
Deligezer等(在：Deligezer U，Akisik EE，Erten N，Dalay N.Sequence-specific histone methylation is detectable on circulatingnucleosomes in plasma.Clin Chem.2008Jul；54(7)：1125-31.Epub 2008 May16.中)描述了DNA甲基化和组蛋白修饰的改变参与致癌作用，并研究了是否可在血浆中检测到作为组蛋白修饰模型的组蛋白甲基化。因此，通过染色质免疫沉淀反应在血浆中分析了单甲基化的H3K9(H3K9me1)。还需要进一步验证以证实循环系统中组蛋白修饰的癌症特异性改变。
最后，Seligson等(在：Seligson DB，Horvath S，McBrian MA，Mah V，YuH，Tze S，Wang Q，Chia D，Goodglick L，Kurdistani SK.Global Levels ofHistone Modifications Predict Prognosis in Different Cancers.Am J Pathol.2009 Apr 6.中)公开了在各个基因的组蛋白修饰形式和各个细胞中单个核酸整体水平方面，癌细胞显示出改变。公开了组蛋白H3赖氨酸4二甲基化(H3K4me2)和H3K18乙酰化(ac)的较低整体/细胞水平会预测前列腺癌复发的较高风险，并且还显示了H3K4me2和H3K18ac的细胞水平同样预测了肺癌和肾癌患者的临床结果，具有在两个癌症组中都预示显著更差存活概率的较低水平。其还显示，H3K9me2(与基因活性和抑制相关的修饰)的更低细胞水平也是具有前列腺癌或肾癌的个体的较差结果的预兆。这些组蛋白修饰的预测能力与增殖标志物Ki-67无关。染色质免疫沉淀反应实验表明，在侵袭性更高的癌细胞系中，组蛋白修饰的较低水平与DNA复制元件修饰的较低水平相关，但与整个基因组的基因启动子无关。该结果表明，组蛋白修饰的较低整体水平预示侵袭性更高的癌症表型，揭示了不同组织来源的腺癌的预后表观遗传形式中令人吃惊的普遍性。
发明概述
肺癌是癌症死亡的主要原因。尽管具有最佳诊断和早期治疗，一些患者仍死于复发疾病。不存在足够有用的生物标志物来预测癌症(特别是实体癌，例如肺癌)的肿瘤复发风险。因此，本发明的目的是提供用于此类复发癌症的新的诊断分析，以及用于进行所述分析的适合的工具。对于技术人员来说，在阅读了本发明下述更详细的说明之后，其它目的和优点将是显而易见的。
在本发明优选的第一方面，本发明涉及用于诊断哺乳动物患者中癌症复发风险的方法，所述方法包括检测获自所述患者的生物学样品中macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达，其中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的低表达或降低表达是所述患者中癌症复发风险提高的指征。优选地，根据本发明的方法还包括基于所述诊断预测所述癌症复发，进一步优选预测转移性复发。
在本发明优选的第二方面，本发明涉及用于诊断上述哺乳动物患者中癌症复发风险的方法，其还包括基于macroH2A1.1的表达，诊断肿瘤中的衰老细胞，特别是癌细胞。
在本发明优选的第三方面，本发明涉及macroH2A1.1或macroH2A2特异性试剂的筛选方法，所述方法包括使macroH2A1.1或macroH2A与macroH2A1.1或macroH2A2潜在特异的试剂相接触，并且测定所述试剂是否特异性地结合macroH2A 1.1或macroH2A。
在本发明优选的第四方面，本发明涉及诊断试剂和/或治疗试剂，根据本发明，其根据用于macroH2A1.1或macroH2A2特异性试剂的筛选方法进行筛选。
在本发明优选的第五方面，本发明涉及用于产生macroH2A1.1或macroH2A2特异性抗体或者其macroH2A1.1或macroH2A2特异性片段的方法，所述方法包括：a)使用结合至色谱柱的macroH2A1.1或macroH2A2结构域亲和纯化含有抗体的血清或细胞培养物上清液，或b)使用macroH2A1.1或macroH2A2结构域筛选sc-Fv噬菌体展示库。
在本发明优选的第六方面，本发明涉及用于进行根据本发明的上述方法的诊断试剂盒，其包括根据本发明的诊断试剂，和/或根据本发明的macroH2A1.1或macroH2A2特异性抗体或者其macroH2A1.1或macroH2A2特异性片段，以及任选地其它助剂。
在本发明优选的第七方面，本发明涉及治疗哺乳动物患者中癌症的方法，所述方法包括根据本发明的上述方法，以及治疗和/或预防患者中所述癌症的复发，优选转移性复发，所述患者是鉴定为所述患者中具有癌症复发风险提高的患者。
在本发明优选的第八方面，本发明涉及根据本发明的方法筛选的试剂、和/或根据本发明的macroH2A1.1或macroH2A2特异性抗体或者其macroH2A1.1或macroH2A2特异性片段、或者根据本发明的试剂盒在预防、治疗和/或诊断癌症，特别是预防、治疗和/或诊断癌症复发，优选其转移性复发中的用途。
本发明大体上基于发现组蛋白macroH2A1.1和macroH2A2的表达预测肺癌复发，将这些组蛋白变体鉴定为癌症患者的改进的风险分级的新工具。MacroH2A同工型在经历衰老的细胞中上调并且高度表达，所述衰老已知是一种抗肿瘤机制，表明macro-H2A1.1是肿瘤中衰老细胞的有用标志物。MacroH2A1.1在具有更好预后的肿瘤中表达更高。
此外，在本发明的上下文中可见，macroH2A1.1表达的预后相关性优于通常用于评估癌症患者预后的增殖标志物Ki-67。本发明人观察到macroH2A1.1和macroH2A2表达与肿瘤增殖速率之间有强的负相关性。缓慢增殖的肿瘤倾向于显示高表达macroH2A1.1和macroH2A2，而具有高增殖指数的肿瘤(通常在临床上侵袭性更高)具有较低的表达或降低表达，或甚至不表达。
因此，在其第一方面，本发明涉及用于诊断哺乳动物患者中癌症复发风险的方法，所述方法包括检测获自所述患者的生物学样品中macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达，其中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的低表达或降低表达是所述患者中癌症复发风险提高的指征。优选地，该表达分析的结果可以显示在适合的装置上。在本发明的上下文中，macroH2A1.1和/或macroH2A2的“低”表达或“降低”表达应当意味着相比来自疾病复发之前的同一患者或者不具有复发风险的不同患者或者健康患者或患者组的样品，macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达降低。确定低表达或降低表达的另一种策略是在优选使用macroH2A1.1和/或macroH2A2-特异性抗体的组织切片上没有染色，如下文进一步所述。又一种策略是比较样品中macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达与macroH2A1.2的表达，并且在根据本发明方法的优选实施方案中，所述表达标准化为在所述样品和/或对照样品中macroH2A1.2的表达。此外，所述对照样品可以是来自复发之前的同一患者或者不具有复发风险的不同患者或者健康患者或患者组的样品。
在其优选实施方案中，本发明涉及诊断哺乳动物患者中癌症复发风险的方法，所述方法包括检测获自所述患者的生物学样品中macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达，并且将所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达与对照样品相比较，其中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的低表达或降低表达是所述患者中肺癌复发的风险提高的指征。优选地，所述表达分析和/或比较的结果可以显示在或者放在适合的装置上，例如诊断计算机。
根据本发明方法的另一个优选实施方案，macroH2A1.1或macroH2A2的表达与无病存活之间的相关性具有P＜0.05、优选P＜0.01、更优选P＜0.006的显著性。
根据本发明方法的另一个优选实施方案，还包括检测诸如Ki-67的其它癌症标志物的表达。优选地，所述生物学样品中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达与Ki-67的表达负相关。
根据本发明方法的又一个优选实施方案，还包括基于根据本发明所述诊断预测所述癌症复发的步骤。本文使用的“复发”是指在患者无病存活时间后临床显现癌症参数，例如优选地，出现肿瘤组织和转移。所述预测(或可能性)还可以包括其它参数，例如，如患者或患者组的临床参数、肿瘤类型等。预测的结果可以优选显示在适合的装置上。
根据本发明的方法可用于诊断任何类型的实体癌。因此，优选根据本发明的方法，其中所述癌症选自实体癌、肺癌、乳癌、肾癌、肝癌、头颈部癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、甲状腺癌、食管癌和脑癌。更优选用于诊断乳癌或肺癌的方法。
任何生物学样品都可用于根据本发明的方法，只要其允许直接或间接检测根据本发明的标志物的表达。因此，所述生物学样品可以选自来自肺肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、头颈部肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤、胃肿瘤、结肠肿瘤、甲状腺肿瘤、食管肿瘤和脑肿瘤的细胞、全血、血清、血浆、尿液、淋巴液、脑液、组织样品和制备的组织样品例如组织切片。优选根据本发明的方法，其中所述样品在手术期间取自患者或者为血清样品。
根据本发明方法的另一个优选方面则涉及基于macroH2A1.1的表达，诊断或进一步诊断肿瘤中的衰老细胞，特别是癌细胞。已知具有大量衰老细胞的啮齿类动物肺腺瘤中富含macroH2A1.1，但是macroH2A1.1在已克服衰老并显示出增殖失控的肺腺癌中下调或者缺乏，这一发现同样与这些结论一致，强调了衰老是抗肿瘤机制的观点。因此，在根据本发明方法的此优选方面，基于标志物macroH2A1.1的表达，所述表达可以用于大体上监测肿瘤中的衰老细胞的量或比率，特别是癌细胞的量或比率。作为肿瘤细胞生长的指示物，可使用衰老细胞的量或比率来监测抗肿瘤治疗(例如化疗或放疗)的成效或作用，或者用于观察癌细胞的数量是否正在增加，以作为患者疾病复发的指征。还可以测量其它衰老标志物，并且用于测量或监测所述标志物的方法是技术人员已知的和如本文针对标志物macroH2A1.1和/或macroH2A2所述。
在根据本发明方法的上下文中，可以使用允许测量标志物表达的技术人员已知的任何方法。方法的选择将取决于表达是在核酸水平上和/或在蛋白水平上测量，以及取决于待分析的样品。优选根据本发明的方法，其中所述检测表达包括聚合酶链式反应(PCR)，即核酸扩增，特别是rtPCR，或免疫组化染色(即在蛋白水平上)，特别是使用macroH2A1.1-特异性抗体或macroH2A2-特异性抗体，如本文所述，和/或mRNA分析。
本发明的另一个优选方面则涉及用于macroH2A1.1或macroH2A2特异性试剂的筛选方法，所述方法包括使macroH2A1.1或macroH2A与macroH2A1.1或macroH2A2潜在特异的试剂相接触，并且测定所述试剂是否特异性地结合macroH2A1.1或macroH2A。某些筛选方法是本领域已知的，并在例如In vitro Methods in Pharmaceutical Research，AcademicPress，1997和美国专利号5,030,015中有所讨论。优选根据本发明的筛选方法，其中所述macroH2A1.1或macroH2A2潜在特异的试剂存在于化合物库、噬菌体展示库(特别是sc-Fv噬菌体展示库)或抗体库中。
进一步优选根据本发明的筛选方法，其中所述macroH2A1.1或macroH2A2潜在特异的试剂为诊断试剂和/或治疗试剂。即，所述试剂可以用于上述诊断方法中，例如，如用于诊断哺乳动物患者中癌症复发风险或者监测衰老细胞的量或比率，或者治疗试剂可以用于例如增加肿瘤细胞的衰老。
本发明的另一方面则涉及根据本发明的方法筛选的诊断试剂和/或治疗试剂。根据本发明，该试剂可以以制备药物组合物的方法配制成药物组合物，所述方法包括上述筛选方法，并将所述试剂与药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂一起配制。优选的试剂是根据本发明的macroH2A1.1或macroH2A2特异性抗体，其选自任选地包含标记的单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化的抗体和/或重组抗体或者其功能片段。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂采用的剂量和浓度对受体是无毒的，并且包括：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如，氯化十八烷基二甲基苄基铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯烷基酯，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
并且，本发明的另一方面涉及上述制备的药物组合物或制剂，其含有根据本发明的上述方法筛选的诊断试剂和/或治疗试剂。
此外，本发明的另一方面涉及用于产生macroH2A1.1或macroH2A2特异性抗体或者其macroH2A1.1或macroH2A2特异性片段的方法，所述方法包括下述步骤：a)使用结合至色谱柱的macroH2A1.1或macroH2A2结构域亲和纯化含有抗体的血清，或b)使用macroH2A1.1或macroH2A2结构域筛选sc-Fv噬菌体展示库。这些方法各自的细节是技术人员已知的，并且如本文所述，例如对于a)，使用含抗macroH2A1.1或macroH2A2结构域的特异性抗体的兔血清；对于b)，使用重组macroH2A1.1或macroH2A2结构域。
因此，本发明的另一方面涉及根据本发明的方法产生的macroH2A1.1或macroH2A2特异性抗体或者其macroH2A1.1或macroH2A2特异性片段(例如sc-Fv片段)。优选地，根据本发明的所述macroH2A1.1或macroH2A2特异性抗体选自任选地包含标记的单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化的抗体和/或重组抗体。在本发明的上下文中，“macroH2A1.1或macroH2A2特异性”应当意味着抗体特异性地结合macro H2A1.1或macroH2A2的大结构域上的表位，并且显示与待分析样品中的其它抗原无交叉反应性或基本上无交叉反应性。
本发明的又一方面则涉及用于进行根据本发明的方法的诊断试剂盒，其包括根据本发明的诊断试剂，和/或根据本发明的macroH2A1.1或macroH2A2特异性抗体或者其macroH2A1.1或macroH2A2特异性片段，以及任选地其它助剂。优选地，所述试剂盒含有进行根据本发明的方法所需的化学物质、染料、缓冲剂等。所述试剂盒还可以含有用于分析的DNA或蛋白芯片或微阵列，以及为显示和解读诊断结果的手册和软件以及设备。
本发明的又一方面则涉及治疗哺乳动物患者中癌症的方法，所述方法包括根据本发明的方法，以及治疗和/或预防患者中所述癌症的复发，所述患者是鉴定为所述患者中具有癌症复发风险提高的患者。本文使用的“治疗”是指治疗性治疗和避免性或预防性方法，其中的目的是预防或减缓(减轻)靶向的病理症状或病症，特别是癌症复发。有治疗需要的那些包括已经患有所述病症的那些以及倾向于患有所述病症的那些或者所述病症已经得到预防的那些。所述治疗还可以包括辅助治疗和治疗原发患者的一线治疗，并且可以与其它抗癌策略例如化疗和/或放疗相联合。
优选根据本发明治疗哺乳动物患者中癌症的方法，其中所述治疗包括向有此需要的所述患者给予根据本发明的上述方法筛选的试剂，优选以上述药物组合物的形式。优选的试剂是小化学分子或者上述抗体或其片段。
进一步优选根据本发明治疗哺乳动物患者中癌症的方法，其还包括基于macroH2A1.1的表达，监测响应于所述治疗的肿瘤中衰老细胞的量和/或比例，特别是癌细胞的量和/或比例。已知具有大量衰老细胞的啮齿类动物肺腺瘤中富含macroH2A1.1，但是macroH2A1.1在已克服衰老并显示出增殖失控的肺腺癌中下调或者缺乏，这一发现同样与这些结论一致，强调了衰老是抗肿瘤机制的观点。因此，在根据本发明方法的此优选方面，基于标志物macroH2A1.1的表达，所述表达可以用于大体上监测肿瘤中衰老细胞的量或比率，特别是癌细胞的量或比率。作为肿瘤细胞生长的指示物，可使用衰老细胞的量或比率来监测抗肿瘤治疗(例如化疗或放疗)的成效或作用，或者用于观察癌细胞的数量是否正在增加，以作为患者疾病复发的指征。还可以测量其它衰老标志物，并且用于测量或检测所述标志物的方法是技术人员已知的和如本文针对标志物macroH2A1.1和/或macroH2A2所述。
根据本发明的待治疗的癌症可以选自实体癌、肺癌、乳癌、肾癌、肝癌、头颈部癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、甲状腺癌、骨癌、食管癌和脑癌，优选乳癌和/或肺癌。所表明的癌症还包括其转移形式。
本发明的又一方面则涉及根据本发明的方法筛选的试剂和/或根据本发明的macroH2A1.1或macroH2A2特异性抗体或者其macroH2A1.1或macroH2A2特异性片段或根据本发明的试剂盒在预防、治疗和/或诊断癌症，特别是在预防、治疗和/或诊断癌症复发(特别是乳癌和/或肺癌复发)中的用途，或者涉及根据本发明的方法筛选的试剂和/或根据本发明的macroH2A1.1或macroH2A2特异性抗体或者其macroH2A1.1或macroH2A2特异性片段或根据本发明的试剂盒在制备预防、治疗和/或诊断癌症，特别是制备预防、治疗和/或诊断癌症复发(特别是乳癌和/或肺癌复发)的药物中的用途。
优选根据本发明的用途，其中所述癌症选自实体癌、肺癌、乳癌、肾癌、肝癌、头颈部癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、甲状腺癌、骨癌、食管癌和脑癌，优选乳癌和/或肺癌。所表明的癌症还包括其转移形式。
通常认为组蛋白以相似水平存在于不同细胞类型中。在数个分子和细胞特征方面，异染色质组蛋白变体macroH2A是独特的。在结构水平，其具有大的C-末端延伸，即大结构域，这是约25kDa的球形构件，在macroH2A1.1的情况中，其以高特异性结合ADP-核糖(Kustatscher等，2005)。此外，对于macro-H2A，在所有脊椎动物中都存在保守的2个基因，以及称为macroH2A1.2的macroH2A1的第二剪切变体，其不能结合小分子。本文中，本发明人已开发了抗所有macroH2A同工型(macroH2A1.1、macroH2A1.2和macroH2A2)的多克隆和单克隆抗体，并采用这些抗体研究了macroH2A组蛋白在培养细胞中和体内的细胞定位和丰度。本发明人发现macroH2A在已经历复制衰老的原代成纤维细胞中上调。此外，在人类癌症中，macroH2A1.1和Ki-67的表达之间存在强的负相关性。经历快速细胞分裂(以增殖标志物Ki-67的高表达为标志)的肿瘤表达低水平的macroH2A1.1，而具有低有丝分裂指数的肿瘤则富含组蛋白。这两个发现都说明macroH2A1.1与细胞分化程度相关，并标志已退出细胞周期的细胞。
已知具有大量衰老细胞的啮齿类动物肺腺瘤中富含macroH2A1.1，但是macroH2A1.1在已克服衰老并显示出增殖失控的肺腺癌中下调或者缺乏，这一发现同样与这些结论一致，强调了衰老是抗肿瘤机制的观点。显著地，本发明人发现macroH2A1.1水平是肺癌的肿瘤复发风险的良好预测物。在发明人可以分析的有限数量的患者中，证明了其在统计学上优于与常用增殖标志物Ki-67的相关性(对于macroH2A1.1，P＝0.0058；而对于Ki-67，P＝0.07983)。
对于乳癌组织阵列的目前可获得的患者信息不足以评估macroH2A1.1水平和临床结果之间的相关性。在来自肺肿瘤的数据基础上，macroH2A1.1似乎也是乳癌的有用预后生物标志物。其它测试将表明其在其它癌症中的用途。
支持macroH2A1.1基因产物在细胞衰老期间上调以及其在致癌中作用的机制还有待阐明。初步证据表明，衰老期间mRNA水平并不会改变，说明转录后加工可能造成macroH2A1.1上调。
关于具有无病存活的macroH2A1.1表达的以统计方式记录的观察结果为癌症且特别是肺癌患者的复发风险评分的改进带来了希望，并且应当用更大的患者群进行重复。进一步的研究将针对macroH2A1.1上调是否是人类肿瘤中衰老细胞的普遍特征和macroH2A1.1高染色是否大体上反映肿瘤细胞中细胞分化程度而提供甚至更为深入的了解。本发明的新工具将改进对高风险癌症，特别是乳癌或肺癌患者的鉴别，从而允许更好地靶向预后困难的癌症的治疗策略。
附图简要说明
将在下述实施例中参考附图进一步描述本发明，然而本发明并不限于此。为了本发明的目的，本文引用的所有参考文献都通过全文引用的方式并入本文。附图中：
图1示出了与增殖相关的macroH2A同工型的表达。(a)通过免疫组化测定一组260份乳癌样品中的增殖指数和组蛋白变体的水平，所述免疫组化采用抗增殖标志物Ki-67、macroH1A1.1、macroH2A1.2和macroH2A2的抗体。Ki-67以核心内所有肿瘤细胞中阳性染色的肿瘤细胞的百分比进行评分。以半定量方式测定macroH2A1.1的表达水平(评分：0-1，阴性/弱染色；1-2，中度染色；2-3，强的细胞核阳性)。(b)箱线图示出了随着增殖指数提高，macroH2A1.1的表达降低(P＜0.001)。(c)对macroH2A2观察到了相同的相关性。在这些样品中普遍以高水平表达MacroH2A1.2。
图2示出了macroH2A1.1表达预测癌症，优选肺癌的复发。(a)通过免疫组化测定肺肿瘤的增殖指数，所述免疫组化采用抗Ki-67的抗体。(b)随着增殖指数提高，macroH2A1.1的表达水平降低(P＜0.001)。(c)在肺肿瘤样品中，表达水平显示与无病存活显著相关(P＝0.0058)。
图3示出了macroH2A同工型在衰老期间上调。(a)macroH2A1同工型在K-Ras+/LSLC12Vgeo敲进(knock-in)小鼠的肺部的表达。在含有低级别腺瘤(L)和高级别腺癌(H)的石蜡包埋的肺组织的连续切片中分析了macroH2A1.1(上图)和macroH2A1.2水平(下图)的免疫组化检测。在低级别腺瘤中衰老期间富含MacroH2A1.1表达。(b)增殖(小核)和衰老(大核)的W138原代成纤维细胞的免疫染色。MacroH2A1.1和macroH2A1.2定位于衰老相关的异染色质位点(heterochromatic foci，SAHF)，并且在衰老细胞中以更高水平表达。相反地，衰老不改变常规组蛋白。(e)在衰老期间macroH2A1上调的蛋白质印迹。ITM细胞是原代成纤维细胞，将其改造以经添加它莫西芬(tamoxifen)类似物4OHT而进行致癌基因同时诱导的衰老(Collado等，2005)。本发明人连续观察到macroH2A1在衰老细胞中的水平升高。常规组蛋白H2A和H3的蛋白水平在衰老细胞中略微降低。
图4示出的蛋白质印迹显示了亲和纯化的抗体对三种macroH2A同工型的特异性。HA标记的macroH2A同工型在HEK293细胞中表达，并且将全细胞提取物上样用于蛋白质印迹分析。
图5示出了macroH2A同工型在一组260份乳癌样品中的表达。(a)通过免疫组化测定增殖指数和组蛋白变体的水平，所述免疫组化采用抗Ki-67、macroH1A1.1、macroH2A1.2、macroH2A2的抗体。(b)箱线图示出了随着增殖指数提高，macroH2A1.1的表达水平降低(P＜0.001)。(c)对macroH2A2同工型观察到了相同的相关性。值得注意的是，在这些样品中普遍以高水平表达MacroH2A1.2。
图6示出了mH2A2在肺癌中的表达水平。(a)通过免疫组化检测Ki-67和macroH2A2来测定增殖指数和组蛋白变体的表达水平。(b)随着增殖提高，macroH2A2的表达水平降低(P＜0.001)。(c)macroH2A2的表达水平与肿瘤复发相关(P＝0.04146)。
图7示出了macroH2A1.2在大部分肺肿瘤中以高水平表达。通过免疫组化检测Ki-67、macroH2A1.2和H3来测定增殖指数、组蛋白变体和核心组蛋白的表达。在mH2A1.2和Ki-67表达之间不存在相关性，组蛋白H3在所有细胞中都表达强烈。
SEQ ID No.1至SEQ ID No.8示出了在下文的实施例中使用的寡核苷酸的序列。
实施例
材料和方法
组蛋白和mRNA提取、蛋白质印迹和实时PCR
之前已描述了表达开关MEK1-ER融合蛋白的ITM细胞的生成。在用或不用40HT孵育后，收获细胞并分成等分试样。将一个细胞等分试样重悬于0.4M HCl中，孵育4h以提取组蛋白，离心并以水透析。使用RNeasy Mini Prep试剂盒(Qiagen)提取RNA。用丙酮从RNAeasy旋转柱的流过液中沉淀蛋白。在上样之前通过考马斯亮蓝(Bradford)法将蛋白提取物标准化。使用同工型-特异性macroH2A抗体以及抗H2A(Abcam，ab15653；1∶3000)和H3(Abcam；ab1791；1∶30000)的商业抗体进行蛋白质印迹。使用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)进行第一链cDNA合成。然后通过实时PCR(Applied Biosystems)使用下述引物分析cDNA：
mH2A1.1AAGTTGTACAGGCTGACATTGC(SEQ ID No.1)；
GTTCTTTTTCCGGAGTTCCA(SEQ ID No.2)，
mH2A1.2CTTTGAGGTGGAGGCCATAA(SEQ ID No.3)；
CACAAACTCCTTGCCACCTT(SEQ ID No.4)，
mH2A2GGACGTCCAAAAAGTCCAAA(SEQ ID No.5)；
GCTTCTGTCCCAGAACAAGG(SEQ ID No.6)，
和GAPDH TGGGTGTGAACCATGAGAAGTA(SEQ ID No.7)；
CCTTCCACGATACCAAAGTTGT(SEQ ID No.8)。
将样品标准化为GAPDH，所述GAPDH之前由本发明人鉴定为对于这些实验测试运行中的可靠对照。
抗体的生成
表达MacroH2A 1.1(氨基酸198-226)和macroH2A1.2(氨基酸198-228)并纯化为GST-融合蛋白。将macroH2A2的大结构域(氨基酸162-372)纯化为(His)6-标记的融合蛋白。将抗原注射到兔(Eurogentec)中。使用HiTrap蛋白-G HP柱(GE Healthcare Life Sciences)根据制造商的说明从兔血清中回收抗体。将macroH2A的3个同工型重组的(His)6-标记的大结构域结合到HiTrap NHS-活化的HP(GE Healthcare)上。之后将这些柱子用于亲和纯化同工型-特异性抗体。
乳癌组织微阵列
乳癌TMA由德国国家肿瘤疾病中心(National Center of TumorDiseases(NCT)，海德堡，德国)提供。它们含有260位患者的福尔马林固定和石蜡包埋的样品，其中每个玻片上有每位患者的2份样品，并分布于不同的块。所有的乳癌患者均为女性，中值年龄为58岁(范围：30-88岁)。与这些患者相关的临床数据还不足以进行进一步分析。
肺癌患者和肺组织微阵列
肺癌TMA由德国海德堡胸科诊所(Thoraxklinik)和NCT提供。玻片上含有41位患有可切除NSCLC的患者的样品，且患者在2004年3月至12月接受过手术(23位患有腺瘤，18位患有鳞状细胞癌)。
在手术期间收集这些患者的样品，并经福尔马林固定和石蜡包埋，然后用于构建TMA，所述TMA还包括对照样品。出于质量原因，2位患者的样品无法分析，因此在分析中包括39位患者的样品。研究群体的临床特征参见表1。人体材料的收集和使用经地方伦理委员会批准(伦理表决#270/2001，2005年更新)。患者知情同意。
表1：非小细胞肺癌研究群体的特征
在R2-切除的患者中，1位复发(远处转移)，1位存活且未复发；在R1-切除的患者中，3位复发(2位局部复发，1位远处转移)，2位存活且未复发；在R0-切除的患者中，15位复发，17位存活且未复发。
免疫组化
使用连续的TMA玻片，进行macroH2A1.1、macroH2A1.2、macroH2A2、Ki-67(DakoCytomation，单克隆小鼠抗-人Ki-67，克隆MIB-1，1∶100)和组蛋白H(Abcam；ab1791；1∶1000稀释)的免疫组化染色。于海德堡大学病理学系(Department of Pathology，Heidelberg University)使用Aperio Scanscope系统和ImageScope软件扫描玻片。
以半定量方式评估macroH2A的表达水平，其中使用下述评分：0-1，阴性/弱染色；1-2，中度染色；2-3，强的细胞核阳性。使用抗增殖标志物Ki-67的抗体测定增殖指数，并以阳性染色的肿瘤与核心内所有肿瘤细胞相比的百分比进行评分。评估所有玻片，且盲评打分并重复2次。
为了分析小鼠肿瘤中的macroH2A同工型，从激活的7-9月龄K-RasP/G12Vgeo小鼠(Guerra等，2003)切下肺部，在10％-缓冲的福尔马林(Sigma)中固定并在石蜡中包埋。用苏木精和伊红对连续的3mm至5mm厚的切片进行染色，并经处理用于使用macroH2A1.1和macroH2A1.2抗体(1∶75稀释)的免疫组化染色。由专业病理学家根据最新的用于小鼠肺癌的形态学认可标准(Jackson等，2005)进行肺损伤的定级。级别1-3的瘤分类为腺瘤(良性损伤)，级别4-5为腺癌(恶性损伤)。
统计分析
使用通过阵列分级的条件线性相关性检验(Hothorn等，2006)评估Ki-67和mH2A1.1之间的关系。通过条件log-rank检验，同时通过阵列分级(Hothorn等，2006)建立无病存活的相关性。
二个人macroH2A基因存在3个基因产物，这些产物都含有N-末端H2A样折叠和C-末端大结构域。MacroH2A1.1和macroH2A1.2通过H2AFY基因产物的选择性剪切产生，而macroH2A2由第二基因H2AFY2编码。体外，macroH2A1.1(而非其它同工型)的大结构域结合ADP-核糖和相关NAD代谢物(Kustatscher等，2005)。本发明人生成特异性抗体来检测和区分不同的macroH2A同工型(图4)。
已提出macroH2A1.1表达可受限于分化的非增殖的组织(Pehrson等，1997)。为了分析macroH2A1.1蛋白表达和细胞增殖之间的任何相关性，本发明人对含有260位患者的乳癌样品的组织微阵列(TMA)进行了免疫组化染色(图1)。本发明人评估了在核心内所有肿瘤细胞中的macroH2A和增殖标志物Ki-67的表达水平。组蛋白H3染色用作阳性对照，并在核心内每个细胞中都显示出强的细胞核染色(图5)。本发明人使用由通过阵列分级的条件线性相关性检验评估Ki-67和macroH2A1.1表达之间的关系。本发明人发现，macroH2A1.1表达与Ki-67水平高度相关(P＜0.001)，显示随着Ki-67阳性癌细胞增加，macroH2A1.1降低。对于mH2A2观察到类似的关系(P＜0.001)，而在这些肿瘤中普遍表达macroH2A1.2(图1)。后者可能部分是由于抗macroH2A1.2的抗体的更高亲和性，这可能使得难以比较表达水平的微小变化。然而，明显存在本发明人从中可见并且可以区分macroH2A1.2的高度可变表达水平的组织(例如骨骼肌)。
这些测定表明剪切变体macroH2A1.1的表达限于显示较低增殖指数的肿瘤中。
为了在一组具有完整临床参数的人肿瘤中测试细胞增殖与macroH2A1.1水平如何相关，本发明人对来自39位可切除且接受过手术的NSCLC患者的样品进行了评分(22位患有腺癌，17位患有鳞状细胞癌；表1)。在手术后1年内，18位患者肿瘤复发，而21位患者保持无复发。类似于本发明人在乳癌和其他癌症测定中所观察到的，肺肿瘤阵列的统计分析表明，macroH2A1.1表达与Ki-67水平显著相关(P＜0.001)，并且随着Ki-67阳性癌细胞的增加而降低(图2a和b)。这证实了macroH2A1.1是退出细胞周期的细胞的标志物的这一证据。
为了进一步测试这一看法，本发明人分析了来自K-RasGI2V诱导的肿瘤衰老小鼠模型(Guerra等，2003)的免疫组化切片。染色表明，与相应的恶性腺癌(图3a)相比，在癌变前腺瘤损伤(其标志为衰老细胞丰富(Braig等，2005；Chen等，2005；Collado等，2005))中的macroH2A1.1表达更高。相反地，剪切变体macroH2A1.2以类似水平在腺瘤和腺癌中表达。该表达形式将macroH2A1.1确定为致癌基因诱导的衰老标志物。
为了鉴别是否存在无病存活(复发)与macroH2A1.1表达的相关性，本发明人进行了通过阵列分层的条件log-rank检验(Hothorn等，2006)。
令人感兴趣的是，所述检验表明在macroH2A1.1表达和无病存活之间具有显著相关性(P＝0.0058)。在肺肿瘤样品中具有低macroH2A1.1水平的患者比具有强的细胞核macroH2A1.1染色(图2c)的那些患者更有可能复发。对于macroH2A2的表达同样观察到类似但更弱的相关性(P＝0.04146；图6)。相反地，广泛表达的macroH2A1.2(图7)显示与肿瘤复发无预后相关性。注意到，常用增殖标志物Ki-67的表达不显示与无病存活的显著相关性(P＝0.07983)。因此，本发明人的免疫染色和临床数据将组蛋白macroH2A1.1鉴定为新的、优良的且有应用潜力的肺癌复发的生物标志物。
为了进一步表征衰老期间的异染色质组蛋白macroH2A，本发明人进行了原代成纤维细胞的免疫荧光染色，并观察到macroH2A1同工型在复制衰老期间上调。MacroH2A1.1以更高水平在衰老前和衰老细胞中表达，以及定位于衰老细胞中的衰老-相关异染色质位点(SAHF)(图3b)。类似地，与对照蛋白例如常规组蛋白H2A相反，macroH2A1.2同样上调。进一步地，macroH2A在SAHF中的富集并不仅是由于SAHF染色质的浓缩性质，因为细胞macroH2A富集和SAHF加入比形成DAPI-富集的异染色质结构所遵循的动力学更慢，从而证实了之前的报告(Zhang等，2005)。这一发现通过在表达hTERT和MEK:ER的人正常的二倍体成纤维细胞IMR90(ITM细胞；Collado等，2005)上进行的蛋白质印迹得到支持。此体系允许对MEK激酶的可开关的激活，所述MEK激酶为Ras-诱导的衰老的下游效应物。结果显示macroH2A1.1和macroH2A1.I组蛋白在衰老细胞中上调(图3c)。相反地，经诱导衰老，常规组蛋白H2A似乎略微下调。
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Claims (50)

1.检测生物样品中macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达的试剂在制备用于诊断哺乳动物患者中增殖性或恶性癌症的试剂盒中的用途，
其中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的低表达或降低表达是所述患者中增殖性或恶性癌症的指征。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂盒进一步包括手册，所述手册记载了将所述表达标准化为所述样品和/或对照样品中macroH2A1.2的表达的指示。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述癌症选自实体癌、肺癌、乳癌、肾癌、肝癌、头颈部癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、甲状腺癌、食管癌和脑癌。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述癌症是乳癌或肺癌。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述试剂盒还包括检测其它癌症标志物的表达的试剂。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述其它癌症标志物是Ki-67。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述样品中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的所述表达与Ki-67的表达负相关。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其还包括基于macroH2A1.1的表达，诊断肿瘤中癌细胞的衰老细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其中所述检测表达包括PCR；免疫组化染色；和/或mRNA分析。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述PCR是rtPCR。
11.根据权利要求9所述的用途，其中所述免疫组化染色使用macroH2A1.1-特异性抗体。
12.检测生物样品中macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达的试剂在制备用于诊断哺乳动物患者中缓慢增殖、癌变前或良性肿瘤的试剂盒中的用途，
其中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的高表达或增加表达是所述患者中癌症缓慢增殖、癌变前或良性肿瘤的指征。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述试剂盒进一步包括手册，所述手册记载了将所述表达标准化为所述样品和/或对照样品中macroH2A1.2的表达的指示。
14.根据权利要求12或13所述的用途，其中所述癌症选自实体癌、肺癌、乳癌、肾癌、肝癌、头颈部癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、甲状腺癌、食管癌和脑癌。
15.根据权利要求12或13所述的用途，其中所述癌症是乳癌或肺癌。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的用途，其中所述试剂盒还包括检测其它癌症标志物的表达的试剂。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述其它癌症标志物是Ki-67。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述样品中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的所述表达与Ki-67的表达负相关。
19.根据权利要求12至18中任一项所述的用途，其还包括基于macroH2A1.1的表达，诊断肿瘤中癌细胞的衰老细胞。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的用途，其中所述检测表达包括PCR；免疫组化染色；和/或mRNA分析。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述PCR是rtPCR。
22.根据权利要求20所述的用途，其中所述免疫组化染色使用macroH2A1.1-特异性抗体。
23.用于诊断哺乳动物患者中包括衰老癌细胞的衰老细胞的方法，所述方法包括检测获自所述患者的生物学样品中macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达，
其中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的高表达或增加表达是所述患者中衰老细胞的指征。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述生物学样品是血液、血清或血浆样品。
25.根据权利要求23所述的方法，其还包括将所述表达标准化为所述样品和/或对照样品中macroH2A1.2的表达。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述癌症选自实体癌、肺癌、乳癌、肾癌、肝癌、头颈部癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、甲状腺癌、食管癌和脑癌。
27.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述癌症是乳癌或肺癌。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的方法，其还包括检测其它癌症标志物的表达。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述其它癌症标志物是Ki-67。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述样品中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的所述表达与Ki-67的表达负相关。
31.根据权利要求23至30中任一项所述的方法，其还包括基于macroH2A1.1的表达，诊断肿瘤中癌细胞的衰老细胞。
32.根据权利要求23至31中任一项所述的方法，其中所述检测表达包括PCR；免疫组化染色；和/或mRNA分析。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述PCR是rtPCR。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述免疫组化染色使用macroH2A1.1-特异性抗体。
35.检测生物样品中macroH2A1.1和/或macroH2A2的表达的试剂在制备用于诊断哺乳动物患者中癌症复发风险的试剂盒中的用途，
其中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的低表达或降低表达是所述患者中癌症复发风险提高的指征。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述试剂盒进一步包括手册，所述手册记载了将所述表达标准化为所述样品和/或对照样品中macroH2A1.2的表达的指示。
37.根据权利要求35或36所述的用途，其中所述癌症选自实体癌、肺癌、乳癌、肾癌、肝癌、头颈部癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、甲状腺癌、食管癌和脑癌。
38.根据权利要求35或36所述的用途，其中所述癌症是乳癌或肺癌。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的用途，其中所述试剂盒还包括检测其它癌症标志物的表达的试剂。
40.根据权利要求39所述的用途，其中所述其它癌症标志物是Ki-67。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述样品中所述macroH2A1.1和/或macroH2A2的所述表达与Ki-67的表达负相关。
42.根据权利要求35-41中任一项所述的用途，其还包括基于macroH2A1.1的表达，诊断肿瘤中癌细胞的衰老细胞。
43.根据权利要求35-42中任一项所述的用途，其中所述检测表达包括PCR；免疫组化染色；和/或mRNA分析。
44.根据权利要求43所述的用途，其中所述PCR是rtPCR。
45.根据权利要求43所述的用途，其中所述免疫组化染色使用macroH2A1.1-特异性抗体。
46.对macroH2A1.1或macroH2A2特异性的试剂，或macroH2A1.1或macroH2A2特异性抗体或者其macroH2A1.1或macroH2A2特异性片段在制备用于诊断癌症的试剂盒，或者用于预防和/或治疗癌症的药物中的用途。
47.根据权利要求46所述的用途，其中所示试剂盒是用于诊断癌症复发的试剂盒。
48.根据权利要求46所述的用途，其中所述药物是用于预防和/或治疗癌症复发的药物。
49.根据权利要求46-48中任一项所述的用途，其中所述癌症选自实体癌、肺癌、头颈部癌、前列腺癌、胰腺癌、骨癌或肺癌、胃癌、结肠癌、甲状腺癌、食管癌和脑癌。
50.根据权利要求46-48中任一项所述的用途，其中所述癌症是乳癌或肺癌。
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