CN102459584A - 用于治疗神经退行性病症的磷脂酶d的调节 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗神经退行性疾病的方法，包括：给需求该治疗的受试者施用一种或更多种抑制或减小磷脂酶D家族的酶，诸如磷脂酶D1和/或磷脂酶D2的作用，包括催化性活性的制剂。本发明也涉及基于细胞的测定，其可用于鉴定抑制或减小磷脂酶D家族的酶的活性及可用于治疗神经退行性疾病的制剂。

Description

用于治疗神经退行性病症的磷脂酶D的调节
【资金信息】
本发明在National Institutes of Health颁发的NIH RO1NS056049的政府支持下进行。政府具有本发明的某些权利。
【优先权要求】
本申请要求2009年7月31日提交的美国临时申请系列No.61/230,447和2009年5月29日提交的美国临时申请系列No.61/182,609的优先权，两个申请的内容通过引用整体并入本文。
【引言】
本发明涉及治疗神经退行性疾病的方法，包括：给需求该治疗的受试者施用一种或更多种抑制或减小磷脂酶D家族的酶，诸如磷脂酶D1和/或磷脂酶D2的作用，包括催化性活性的制剂。本发明也涉及基于细胞的测定，其可用于鉴定抑制或减小磷脂酶D家族的酶的活性及可用于治疗神经退行性疾病的制剂的方法。
【背景技术】
神经退行性疾病包括各种病症，其特征在于与认知和功能能力的进行性降低关联的突触功能障碍，常常导致死亡。阿尔茨海默病(AD)是最常见的年龄-关联的削弱性神经退行性病症，影响约4百万美国人和约2～3千万世界人。AD的典型神经病理学特征包括海马，杏仁核，及颞，额和顶叶的皮质联合区中的老年(含有β-淀粉样蛋白的)斑及神经纤维缠结的存在。更精细变化包括内嗅皮质和基底前脑中反应性星形细胞变化，以及神经元和突触的损失。
阿尔茨海默病的发病机制未完全明了，但是已知疾病和膜蛋白，淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的切割产物之间有关联。γ-分泌酶介导APP的淀粉样蛋白-β(Aβ)结构域的C-端切割，由此从通过由α-(ADAM10和TACE)或β-分泌酶(BACE1)的胞外域脱落产生的膜结合APP C-端片段释放Aβ/p3。γ-分泌酶切割产生2种主要Aβ亚型-Aβ40和Aβ42。良好记载着早老素基因PS1和PS2的全部突变导致γ-分泌酶活性的调节，导致高度淀粉样蛋白生成性及神经毒性Aβ42种的产生的升高，可能消费更多良性Aβ40肽。
膦酸肌醇(“PI”)作为多种细胞通路的信号转导分子(Williams，1999，Biochim.Biophys.Acta 1441：255-267；Rhee and Bai，1997，J.Biol.Chem.272(24)：15045-15048；Katan，1998.Biochim.Biophys.Acta 1436：5-17)，且某些细胞类型中PI的异常调节显示促进各种人疾病状态(Pendaries et al.，2003，FEBS Lett.546(1)：25-31)。PI信号转导通过许多激酶，磷酸酶和磷脂酶严格调控。磷脂酰肌醇4，5-重磷酸酯(PIP2)由磷脂酶C(PLC)的水解是调节各种细胞功能中的早期和关键事件。已发现，Aβ42导致PIP2水平的降低(见国际专利申请No.PCT/US2007/085274，WO 2008/064244，通过引用并入本文)。
磷脂酶D(PLD)催化磷脂酰胆碱的水解而形成磷脂酸(见国际专利申请No.PCT/US2007/085274，WO 2008/064244，通过引用并入本文；Sweeney et al.，2002，J.Biol.Chem.277：3030-3039；Exton et al.，2002，FEBS Lett 531：58-61；Schields and Arvan，1999，Curr.Opin.Cell Biol.11：489-494)。PLD已报道调控各种膜运输步骤，例如，分泌囊泡的释放，胞吞及胞吐(Chen et al.，1997，J Cell Biol.138：495-504；Shen et al.，2001，Mol.Cell.Biol.21：595-602；Humeau etal.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.98：15300-`5305；Cockcroft，2001，Cell.Nol.Life Sci.58：1674-1687)。PLD1和PLD2是此酶的2种不同亚型(Hammond et al.，1995，J.Biol.Chem.270：29640；Colley et al.，1997，Curr.Biol.7：191；Steed et al.，1998，FASEB J.12：1309；see FIGURE1A-B)，且被报道具有不同细胞功能(Choi et al.，2002，J.Immunol.168：5682-5689)。Cai et al.，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.报道PLD1调控βAPP的细胞内运输，且其伴随论文(Cai et al.，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103：1941-1946)报道，通过独立机理，PLD1缓和抑制β-淀粉样蛋白形成的γ分泌酶复合物的完整性。Cai等人提示，PLD代谢中的缺陷可贡献于阿尔茨海默病发病机制。
【发明概述】
本发明涉及治疗神经退行性疾病的方法，包括：给需求该治疗的受试者施用一种或更多种抑制或减小磷脂酶D家族的酶，诸如磷脂酶D1和/或磷脂酶D2的作用，包括催化性活性的制剂。本发明也涉及基于细胞的测定，其可用于鉴定抑制或减小磷脂酶D家族的酶的活性的制剂。
在进一步实施方式中，本发明提供治疗涉及神经节苷脂的增加的水平的病症，基于PLD抑制剂，优选PLD2抑制剂，降低神经节苷脂水平的发现。
本文中使用的术语“治疗”指改善或减小或降低疾病的症状或迹象的进展的速度或降低发展疾病或病症的风险，包括但不限于，损伤的记忆(短或长期)和/或痴呆。可根据本发明治疗的神经退行性疾病的非限制性例包括阿尔茨海默病，轻度认知障碍，帕金森病，亨廷顿舞蹈症，老年痴呆和Creuzfeld-Jacob病。本发明可也用于抑制进行性记忆损伤。可根据本发明治疗的具有神经节苷脂的增加的水平的病症的非限制性例包括：GM1神经节苷脂贮积病，莫尔基奥B病，泰-萨克斯病，桑德霍夫病，AB变体和C型尼曼-皮克病。
【附图说明】
图1A～B.(A)PLD1/PLD2的结构域结构。(B)由PLD酶介导的转磷脂酰基化反应，其在乙醇和1-丁醇的存在下分别导致磷脂酰乙醇(PEtOH)或磷脂酰丁醇(PButOH)的合成。
图2A～D(A)用200nM合成oAβ42处理的初生皮层神经元中二磷酸甘油酯(“DPG”)，PEtOH，磷脂酰肌醇4磷酸酯(“PtdIns4P”)和PIP2(也写作“PtdIns(4，5)P2)的水平(n＝9)。(B)PLD活性，如经转磷脂酰基化反应，在1-丁醇的存在下，在oAβ42或2μM Ca++离子载体离子霉素的存在或缺失下，在培养的初生皮层神经元中，通过[3H]-磷脂酰丁醇的合成测量的。(C)PLD活性，如在培养的N2a细胞中，在oAβ42的存在或缺失下，通过[3H]磷脂酰丁醇的合成测量的。(D)PLD活性，如在培养的N2a细胞或表达swAPP突变体的培养的N2a细胞中，通过[3H]磷脂酰丁醇的合成测量的。(E)PLD2活性，如响应oAβ42，在由是野生型(+/+)或PLD2的杂合(+/-)或纯合(-/-)突变体的小鼠制备的初生神经元皮质培养物中，通过[3H]磷脂酰丁醇产生测量的。值表示平均值±SEM.ns-非显著.＊p＜0.05；＊＊p＜0.01；＊＊＊p＜0.001
图3A～D.PC12细胞中GFP-PLD2的Aβ-诱导的再定位。(A)质膜/细胞质比的计算；(B)200nM合成寡聚体Aβ42的效应的定量。对照(n＝31细胞)；5min(n＝29)；30min(n＝32)和120min(n＝30)。(C)GFPPLD2的再定位是Ca2+-依赖性的。对照(n＝12)；200nMAβ42(n＝13)；200nM逆转的肽Aβ42-1(n＝12)；2μM离子霉素(n＝13)；2mM EGTA(n＝14)；2mM EGTA和200nM oAβ42(n＝13)。全部治疗是30min长。D.PLD2-GFP构建体。
图4A～B.(A)在由Pld2KO小鼠制备的成年脑提取物(核后上清液)中缺乏PLD2免疫反应性。使用ECL用针对指示的蛋白的抗体进行蛋白印迹分析。(B)Pld2KO脑中的分泌的总PLD活性，如通过向小鼠I.P.注射乙醇后的磷脂酰乙醇(PEtOH)产生测量的。PEtOH通过LC-MS测量。磷脂酰丝氨酸的水平显示为对照。N＝4。
图5A～B.Pld2KO皮质神经元中分泌的Aβ的降低的水平。在第14天用swAPP-慢病毒感染培养物，和在第16天收集培养基用于Aβ40和Aβ42的ELISA测量。(A)Aβ水平标准化于总蛋白及表示为非-感染的Pld2WT培养物的％。(B)标准化的Aβ40和Aβ42水平(％WT)。N＝3。
图6.自PLD2KO小鼠的海马在oAβ42的存在下显示正常LTP。在媒质的存在下，在PLD2WT片(n＝10)和PLD2KO片(n＝9)之间，在LTP中无差异(F1，17＝0.00，p＝0.947)。尽管PLD2WT片显示在200nM oAβ42的浴应用后LTP的减小(n＝8)(F1，16＝5.19，p＝0.038，相对于媒质)，PLD2KO片显示在肽存在下无LTP差异(n＝8)(F1，14＝0.01，p＝0.919，相对于媒质)。fEPSP，CA1场兴奋性突触后电位。条代表oAβ42的浴应用的时间。3个箭标代表用于诱导增强的爆式刺激。动物是约3月龄。
图7.PLD2消除改善SwAPP小鼠中的学习及记忆。将SwAPP小鼠(Tg2576)与Pld2敲除小鼠杂交，及使得到的后代[Pld2+/+/无tg(n＝14)；Pld2+/-/无tg(n＝14)；Pld2-/-/无tg(n＝11)；Pld2+/+/SwAPP(n＝10)；Pld2+/-/SwAPP (n＝12)；Pld2-/-/SwAPP(n＝11)]经历情景恐惧记忆的训练，其在足休克之后24h，使用5～6月龄动物评定。＊，p＜0.05，在Student氏单尾t检验中。
图8.PLD2消除改善SwAPP小鼠中的学习及记忆。使12月龄小鼠经历旋臂水迷宫(RAWM)测试。在测试的最后3天对误差评分。对于全部基因型n值是8，除了Pld2-/-/SwAPP(n＝7)和Pld2+/+/SwAPP(n＝6)之外。＊＊，p＜0.01。值表示平均值±SEM。
图9A～E.(A)FIPI部分拯救PIP2水平的oAβ42诱导的降低。将2周龄初生皮层神经元培养物用媒质急处理(“1”)，用200nM oAβ42急处理2小时(“2”)，用750nM FIPI急处理3小时(“3”)或用750nMFIPI预处理1小时然后是用200nM oAβ42处理2小时(“4”)。n＝3。(B)野生型或PLD2，±SwAPP的纯合突变小鼠中的PLD1和PLD2水平。(C)突变小鼠中PA种的相对量，如对比对照表示的。值表示平均值±SEM(n＝6-8)。＊p＜0.05；＊＊p＜0.01；＊＊＊p＜0.001。(D)野生型或PLD2，±SwAPP的纯合突变小鼠中的GM3水平(彩色版本)；(E)野生型或PLD2，±SwAPP的纯合突变小鼠中的GM3水平(图9D的黑白简化；画剖面线而显示色彩：///＝绿，\\\＝红，未显示色彩的渐变)。
图10A～B.Aβ的FIPI诱导的降低产生。给达到汇合之后的表达swAPP的N2a细胞，更换新培养基，及用媒质(黑)或FIPI(灰)处理6小时。收集培养基及通过ELISA测量Aβ40(A)和Aβ42(B)。n＝6。
图11A～M.PLD抑制剂。
【发明详述】
本发明涉及通过抑制或减小磷脂酶D家族的酶，诸如磷脂酶D1(PLD1)和/或磷脂酶D2(PLD2)的作用，包括催化性活性来减少淀粉样蛋白β产生和/或抑制淀粉样蛋白β的毒性效应的制剂的用途，包括该制剂用于治疗神经退行性疾病的用途。本发明也涉及可用于鉴定抑制或减小磷脂酶D家族的酶的作用和/或活性的制剂及可用于本文所述的治疗方法的检定系统。
为了清楚，且不旨在限制，将本发明的详述分为以下部分：
(i)PLD抑制剂；
(ii)检定系统；以及
(iii)治疗方法。
【1.PLD抑制剂】
可根据本发明使用PLD活性的抑制剂，包括PLD1和PLD2抑制剂。PLD抑制剂降低存在于施用其的受试者中的PLD活性的量，且可通过任何机理这样，包括酶活性的直接抑制以及PLD的量或利用度的减小。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供抑制PLD(其可为PLD1和/或PLD2，尽管优选抑制PLD2)的酶活性的制剂的用途。
在一个非限制性实施方式中，抑制PLD(包括PLD2)的制剂是5-氟-2-吲哚基去-氯卤培米特(“FIPI”)。
可根据本发明使用的其他PLD抑制剂包括，但不限于：二乙基己烯雌酚，白藜芦醇，和厚朴酚，SCH420789，前角鲨烯二磷酸酯，雷洛昔芬，卤培米特，4-羟基他莫昔芬，图11A～C中所示的化合物(Scottet al.，2009，Nat Chem Biol 5(2)：108-117and its supplementalinformation online at Nature Chemical Biology10.1038/nchembio.140)；卤培米特衍生物，尤其包含2-吲哚基部分的卤培米特衍生物，包括图11D中所示的化合物(Monovich et al.，2007，Bioorg.Med.Chem.Lett.17：2310-2311)；显示于图11E～J的化合物，包括但不限于包含卤化的哌啶基苯并咪唑酮部分和S-甲基部分的卤培米特衍生物(Lewis et al.，2009，Bioorg.Med.Chem.Letts.19：1916-1920)；图11E的化合物5的衍生物，包括包含1，3，8-三氮杂螺[4，5]癸-4-酮结构的化合物，包括图11K～L中所示的化合物(Lavieriet al.，2009，Bioorg.Med.Chem.Lett.19：2240-2243)；及图11M中所示的化合物(Lavieri et al.，2009，Bioorg.Med.Chem.Lett.19：2240-2243)。
在尤其优选的非限制性实施方式中，PLD抑制剂是PLD2选择性抑制剂，诸如但不限于4-OH他莫昔芬；图11B的化合物72和82(Scottet al.，2009，Nat Chem Biol 5(2)：108-117)；图11D的化合物4j和4k(Monovich et al.，2007，Bioorg.Med.Chem.Lett.17：2310-2311)；图11E的化合物5(Lewis et al.，2009，Bioorg.Med.Chem.Letts.19：1916-1920)；及图11E的化合物5的衍生物，包括包含1，3，8-三氮杂螺[4，5]癸-4-酮结构的化合物，包括图11K～L中所示的化合物(Lavieri et al.，2009，Bioorg.Med.Chem.Lett.19：2240-2243)。各上述参考文献和任何与其关联的以公共渠道提供的补充性信息，及该文提供的任何化合物和/或合成方案通过引用整体并入本文。
在本发明的另一优选的，非限制性实施方式中，PLD抑制剂是图11C的化合物56(其也是图11E的双PLD1/2抑制剂2和图11F的化合物2)，也称为N-(2-(4-(2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-1-基)哌啶-1-基)乙基)-2-萘甲酰胺，其具有81nM的PLD1IC50，240nM的PLD2IC50，380nM的293-PLD2IC50，及21nM的Calu-1IC50(Scott et al.，2009，Nature Chemical Biology 5：108-117)。
在本发明的另一优选的，非限制性实施方式中，PLD抑制剂是图11J的化合物13r，也称为(1R，2R)-N-((S)-1-(4-(5-溴-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-1-基)哌啶-1-基)丙烷-2-基)-2-苯基环丙烷羧酰胺，其具有15nM的PLD1IC50，1100nM的PLD2IC50，6400nM的293-PLD2IC50，及3.7nM的Calu-1IC50(Lewis et al.，2009，Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters 19：1916-1920)；此化合物是PLD1选择性的。
在本发明的另一优选的，非限制性实施方式中，PLD抑制剂是图11K的化合物9b，也称为N-(2-(4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂螺[4，5]癸-8-基)乙基)喹啉-3-羧酰胺，其具有20,000nM的PLD1IC50，500nM的PLD2IC50，90nM的293-PLD2IC50，及1900nM的Calu-1IC50(Lavieri et al.，2009，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters19：2240-2243)；此化合物是PLD2选择性的。额外的PLD抑制剂可通过本领域知道的方法鉴定，包括但不限于以下文献中提供的测定：Scott et al.，2009，Nat Chem Biol.Feb；5(2)：108-17；Monovich et al.，2007，Bioorg.Med.Chem.Lett.17：2310-2311；Lewis et al.，2009，Bioorg.Med.Chem.Letts.19：1916-1920；或Lavieri et al.，2009，Bioorg.Med.Chem.Lett.19：2240-2243。
或者，PLD抑制剂可为降低PLD，及尤其PLD2的表达的分子，例如包含互补于PLD1和/或PLD2基因的部分的小干扰RNA或反义RNA。
【2.测定系统】
在某些非限制性实施方式中，本发明提供用于鉴定抑制PLD，例如PLD2的制剂的检定系统，其中检定系统具有图3A～C中所示的特征。例如，可测试测试剂调节细胞(例如，PC12细胞，在Ca++离子的存在下)中PLD2，例如可检测标记的PLD2(例如，用绿色荧光蛋白标记的)的转位的能力，其中测试剂抑制Aβ42-诱导的将PLD2自细胞膜转位到细胞质的能力表明其为本发明的潜在治疗剂，且其治疗性活性可任选地在体内测试中确认，例如但不限于，在Tg2576小鼠中(见图8)。
在非限制性实施方式中，本发明还提供利用经加工以表达荧光形式的PLD，优选PLD2或其可自膜转位的部分的细胞，优选神经元细胞，或细胞系(优选神经元细胞系)的检定系统。荧光蛋白可为，例如但不限于绿色荧光蛋白，增强的绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，红色荧光蛋白，或本领域知道的任何其他荧光蛋白。PLD可为来自人，大鼠或小鼠的PLD蛋白，或其可转位的片段(见，例如但不限于，GenBank登录号：AAH15033，AAH56871，NP002654，EHW90405，EHW90406，AA021120，AAD04197，AAB96656，AAB96655，NP002653，NP001123553，AAH68976，CAB76564，NP150641，AAM48521，BAA24078，U87557，NP032902，NP032901，AAH68144或NC000077.5)。例如，在该检定系统中，可使用神经元细胞系诸如但不限于PC12细胞或N2a细胞。或者，可使用非-神经元细胞系，诸如但不限于CHO，NIH 3t3，HEK293或HeLa(72)。
在特定的，非限制性实施方式中，在用Aβ寡聚体处理后，可将嗜铬细胞瘤细胞系PC12用编码包含连接到PLD，优选PLD2或经历转位到细胞质的部分该序列的整个编码序列的荧光蛋白的融合蛋白的构建体转染。在16～24小时之后，可将落射荧光显微镜检用于可视化荧光PLD2相比在细胞质而在质膜的分布。在对照细胞中，荧光应呈现为与细胞接壤的边缘，及由此在质膜浓缩。细胞用oAβ42的处理，其中oAβ42指寡聚体Aβ或Aβ42的任何其他衍生物或其他Aβ物种，包括Aβ40，应诱导，在数分钟之内，探针自质膜的显著消失及细胞质中荧光水平的对应增加，其应呈现为更扩散。此效应可通过用离子霉素处理来模拟。在PLD2-转染的细胞中，在oAβ42的缺失下，测试剂增加PLD2在细胞表面的定位的能力可检测为在质膜的荧光强度与胞质溶胶的平均荧光强度的比的增加。
因此，本发明提供用于鉴定增加细胞表面-关联的PLD(优选PLD2)的制剂的方法，包括：(i)提供含有荧光PLD(优选PLD2)传感器的宿主细胞；(ii)将测试剂施用于宿主细胞；及(iii)测量在质膜的荧光与胞质溶胶的平均荧光的比，其中比的增加指示宿主细胞表面的PLD(优选PLD2)水平的增加。
在替代性的实施方式中，本发明提供用于鉴定抑制oAβ42的毒性效应的制剂的方法，包括：(i)提供含有荧光PLD(优选PLD2)传感器的宿主细胞；(ii)使宿主细胞暴露于毒性浓度的oAβ42；(iii)将测试剂施用于宿主细胞；及(iv)测量在质膜和胞质溶胶中的荧光，其中在质膜对比胞质溶胶中荧光的比的增加表明测试剂抑制oAβ42的毒性效应。
在再一，非限制性实施方式中，本发明提供用于鉴定是PLD和优选PLD2的抑制剂和/或AD的治疗剂的制剂的方法，包括：(i)提供宿主细胞；(ii)将测试剂施用于宿主细胞；及(iii)测定测试剂的施用是否降低宿主细胞中PA 34：2，PA 34：0和/或GM3的水平，其中PA 34：2，PA 34：0和/或GM3的水平的降低表明测试剂是PLD(例如PLD2)的抑制剂和可用于治疗AD。见，例如，图9C～D。例如，可将暴露于测试剂的宿主细胞中PA 34：2，PA 34：0和/或GM3的水平与适当的对照细胞中PA 34：2，PA 34：0和/或GM3的水平相比较。磷脂脂肪酸(PA)组合物的名称被表示为总链长度：不饱和的键数。在这些实施方式中，宿主细胞可为，无限制地，神经元细胞或细胞系或组织外植体(例如皮质组织)或宿主细胞可为，在非-人测试动物中，诸如小鼠，例如但不限于携带SwAPP突变的小鼠。在一个特定非限制性实施方式中，宿主细胞可为嗜铬细胞瘤细胞，例如PC12细胞。
【3.治疗方法】
在某些非限制性实施方式中，本发明提供通过给需求该治疗的受试者施用有效量的PLD的抑制剂，例如PLD1和/或PLD2的抑制剂来抑制与淀粉样蛋白生成性肽关联的突触功能障碍，记忆损伤和/或神经变性的方法。
需求该治疗的受试者可为人或具有PLD酶的非-人受试者。所述受试者可由于，例如但不限于，龄，家族历史，或暴露于毒性剂而患有突触功能障碍，记忆损伤和/或神经变性或可处于发展一种或更多种这些病情的风险。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供通过阻断或部分阻断磷脂酶D酶，诸如磷脂酶D1和/或磷脂酶D2的作用来减少淀粉样化(即，毒性Aβ种，诸如Aβ40和Aβ42的产生)的方法。在某些相关的非-限制的实施方式中，本发明提供保护免于Aβ42肽对神经细胞的毒性效应的方法，包括：使所述细胞暴露于有效量的磷脂酶D抑制剂。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供治疗(例如减小症状和/或减缓进展和/或减小发病风险)神经退行性疾病或病症诸如但不限于阿尔茨海默病，轻度认知障碍，帕金森病，亨廷顿舞蹈症，老年痴呆和/或现有-相关的疾病，诸如Creuzfeld-Jacob病的方法。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供抑制受试者的记忆损伤的进展的方法，包括：给受试者施用有效量的磷脂酶D抑制剂。在某些非限制性实施方式中，本发明提供减小记忆损伤和/或痴呆发生的风险的方法，包括：给受试者(例如至少约40岁或至少约50岁或至少约60岁的人受试者)施用有效量的PLD抑制剂。
在还非限制性实施方式中，本发明提供治疗与增加的神经节苷脂水平关联的病症的方法，包括：给需求该治疗的受试者施用有效量的PLD抑制剂，优选PLD2抑制剂，从而改善受试者的临床状况和/或降低神经节苷脂水平。与增加的神经节苷脂水平关联的病症的非限制性例是GM1神经节苷脂贮积病，莫尔基奥B病，泰-萨克斯病，桑德霍夫病，AB变体，及C型尼曼-皮克病。
可用于此部分中讨论的方法的PLD抑制剂在以上部分1中提供。
PLD抑制剂可由本领域知道的任何适合的途径施用，包括但不限于通过口腔，皮下，肌内，静脉内，鞘内，吸入或直肠施用。
在尤其是非限制性实施方式中，PLD抑制剂是FIPI，施用以在脑脊液中达到约50和2500nM之间，或约250和2000nM之间，或约250和1000nM之间的浓度。当PLD抑制剂不是FIPI时，(非-FIPI)PLD抑制剂的剂量范围可通过使上述FIPI的剂量范围乘以所述PLD抑制剂的EC50与FIPI的EC50的比来测定，例如但不限于如通过本文所述的测定测量，诸如制剂抑制oAβ42-诱导的PLD自质膜转位到细胞质，或抑制培养的初生皮层神经元中oAβ42-诱导的PIP2的降低，或降低培养的表达swAPP的神经元中Aβ42产生，或改善AD动物模型(诸如Tg2576小鼠)中的行为性能的能力。
在一个特定，非限制性实施方式中，其中PLD抑制剂是图11C的化合物56(其也是图11E的双PLD1/2抑制剂2和图11F的化合物2)，也称为N-(2-(4-(2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-1-基)哌啶-1-基)乙基)-2-萘甲酰胺，其具有81nM的PLD1IC50，240nM的PLD2IC50，380nM的293-PLD2IC50，及21nM的Calu-1IC50，所述PLD抑制剂可施用以在脑脊液中达到约10和2000nM之间，或约10和1000nM之间，或约10和500nM之间，或约200和1000nM之间，或约200和500nM之间的浓度。
在另一特定，非限制性实施方式中，其中PLD抑制剂是图11J的化合物13r，也称为(1R，2R)-N-((S)-1-(4-(5-溴-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-1-基)哌啶-1-基)丙烷-2-基)-2-苯基环丙烷羧酰胺，其具有15nM的PLD1IC50，1100nM的PLD2IC50，6400nM的293-PLD2IC50，及3.7nM的Calu-1IC50，所述PLD抑制剂可施用以在脑脊液中达到约2和10,000nM之间，或约2和200nM之间，或约2和100nM之间，或约2和50nM之间，或约500和8000nM之间，或约500和2000nM之间的浓度。
在另一特定，非限制性实施方式中，其中PLD抑制剂是图11K的PLD2选择性抑制剂化合物9b，也称为N-(2-(4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂螺[4，5]癸-8-基)乙基)喹啉-3-羧酰胺，其具有20,000nM的PLD1IC50，500nM的PLD2IC50，90nM的293-PLD2IC50，及1900nM的Calu-1IC50，所述PLD抑制剂可施用以在脑脊液中达到约30和1500nM之间，或约50和1000nM之间，或50和800nM之间，或50和600nM之间的浓度。
在尤其是，非限制性实施方式中，PLD抑制剂可以每天一次或更多次，每周一次或更多次，或每月一次或更多次施用。治疗时期可为连续或非连续的。
【实施例】
【实施例1】
PLD1/PLD2的结构域结构显示于图1A。区I-IV是催化性结构域的关键决定子，和HKD签名基序(II和IV)表示共有序列HxK(x)4D(x)6GSxN。PLD1含有涉及催化性活性的调节的额外的区(活化环，L)。由PLD酶介导的转磷脂酰基化反应，其在乙醇和1-丁醇的存在下分别导致磷脂酰乙醇(PEtOH)或磷脂酰丁醇(PButOH)的合成，显示于图1B。
当培养的初生皮层神经元用200nM合成寡聚体化的Aβ42(“oAβ42”)处理时，观察到磷脂酸(PtdOH)的水平增加(图2A)。而且，oAβ42的急性细胞外应用(以200nM)发现刺激在源自新生儿小鼠的初生皮层神经元(图2B)和成神经细胞瘤细胞系Neuro2A(N2A)(图2C)中的磷脂酶D(PLD)的酶促活性。在成神经细胞瘤细胞系N2A中淀粉样蛋白前体蛋白(swAPP)的瑞典突变体的过表达，其已显示导致Aβ的增加的产生和分泌，也发现刺激PLD的酶促活性(图2D)。
如显示于图2E，培养的缺少PLD2的神经元不响应用Aβ42寡聚体的处理。在第12天将初生神经元皮质培养物用[3H]肉豆蔻酸标记，在第15天进行处理，随后提取脂质，及将[3H]磷脂酰丁醇计数/总和计数的比用作PLD活性的测量。在Pld2+/+(对于媒质和oAβ42处理，分别n＝19和12)，Pld2+/-(n＝7)，及Pld2-/-(分别n＝5和7)中PLD活性测量之前，用媒质或oAβ42200nM进行4小时处理。
为了监控PLD2的细胞定位，制备GFP-标记的PLD2构建体(图3D)。在制备构建体中，可使用XbaI和SmaI位点(有内部BamHI和BglII位点)切下mPLD2，尽管在典型细菌株中，甲基化干扰在XbaI和BclI位点的切割。pEGFP是约4.7kb长，及mPLD2cDNA是约3kb长。将pEGFP(Clontech)用作其编码对于哺乳动物细胞优化的GFP的红移的变体。PLD2(鼠)的Genbank登录号是U87557。将GFP-PLD2编码构建体通过阳离子脂质体2000导入PC12细胞(seeHammond et al.，1995，J.Biol.Chem.270：29640-29643；Colley et al.，1997，Current Biology 7：191-201；Sung et al.，1997，EMBO J.16：4519-4530；Sung et al.，1999，J.Biol.Chem.274：3659-3666；andSung et al.，1999，J.Biol.Chem.274：494-502)。oAβ42的急性细胞外应用(以200nM)导致GFP-标记的磷脂酶D2(PLD2)以Ca2+-依赖性样式(即，如果通过隔绝细胞外Ca2+的制剂，诸如EGTA阻断的效应)自嗜铬细胞瘤细胞系PC12的细胞表面转位到细胞质(图3A～C)。
为了提供用于研究神经系统中PLD2的作用的体内模型系统，使用Cre-LoxP技术制备PLD2“敲除”小鼠(“PLD2KO小鼠”)。显示在这些小鼠的脑提取物中缺乏对PLD2的免疫反应性，表明PLD2不在敲除动物中表达(图4A)。而且，在Pld敲除小鼠的脑中的总PLD活性显示降低大致一半(图4B)。PLD2敲除小鼠有活力及至今未观察到呈现明显的异常。
在测试PLD2KO动物中Aβ42的效应的第1系列的实验中，收获WT和KO小鼠的初生皮层神经元，在培养物中建立，然后用swAPP-慢病毒感染。神经元中全长swAPP的表达一般导致大量的分泌的Aβ40和Aβ42。观察到得到到Pld2KO神经元相比野生型培养物分泌降低量的Aβ40和Aβ42(图5A～B)。
接下来，在由KO动物制出的海马脑片中测试PLD2KO对长期增强(“LTP”)的效应。LTP是使用电生理学技术测量及在许多实例中与学习及记忆关联的现象。几组已之前显示Aβ(及尤其是Aβ寡聚体)分裂LTP，潜在地提供与轻度认知障碍和阿尔茨海默病关联的认知缺陷的基础。如显示于图6，然而暴露于oAβ42的自PLD2野生型小鼠的海马显示LTP的减小，自PLD2KO小鼠的海马在oAβ42的存在下显示正常LTP。
为了测试在Aβ42过表达的情景中PLD2KO的体内效应，将PLD2KO小鼠与swAPP小鼠杂交。产生对于PLD2消除纯合及杂合的后代，然后在2个行为测试中与对照动物(包括具有野生型PLD2的swAPP突变动物)比较性能。将情景恐惧条件反射(FC)范例中的测试结果显示于图7，及将旋臂水迷宫(RAWM)范例中的测试结果显示于图8。在这两种测试范例中，在过表达swAPP的小鼠(品系Tg2576)中1个或2个拷贝的Pld2的遗传灭活改善是Tg2576(swAPP-表达)小鼠的特征的学习缺陷。
已在上述实验中展示，PD2的遗传消除的Aβ42-保护性益处，进行实验异评定该酶的化学抑制的效应。如显示于图9A，PLD(包括PLD2)的药理学抑制剂，5-氟-2-吲哚基去-氯卤培米特(“FIPI”)，发现在oAβ42的急性细胞外应用(以200nM)后部分拯救初生皮层神经元中的PIP2缺乏。FIPI是卤培米特的类似物，其最初在Monovich，L.et al.Optimization of halopemide for phospholipase D2inhibition.Bioorg Med Chem Lett 17，2310-2311(2007)中表征，而由MichaelFrohman的组进一步表征(Su，W.et al.5-Fluoro-2-indolyldes-chlorohalopemide(FIPI)，a phospholipase D pharmacologicalinhibitor that alters cell spreading and inhibits chemotaxis.MolPharmacol 75，437-446(2009))。
接下来，进行实验以研究SwAPP过表达和Pld2基因型对PA和神经节苷脂GM3水平的效应。如显示于图9B，通过PLD2，PLD1，APP和微管蛋白的蛋白印迹分析评价蛋白水平(显示代表性的印迹)。从有和无SwAPP转基因的Pld2+/+和Pld2-/-小鼠提取前脑脂质及使经历LC-MS分析，及在突变小鼠中测量PA种的相对量及与对照小鼠(Pld2+/+，无SwAPP)比较；结果显示于图9C。PA种34：2和34：0(箭标)是阿尔茨海默病的候选生物标记，和它们在Pld2敲除(KO)中的减小表明这些生物标记可用于监控PLD2抑制剂的作用。磷脂脂肪酸组合物的名称被表示为总链长度：不饱和的键数。如显示于图9D，鞘糖脂(神经节苷脂)GM3在阿尔茨海默病小鼠突变体中升高(红色)和可用作此疾病的生物标记。GM3的水平在Pld2KO中下降(绿色)。在SwAPP突变体中，PLD2的消除恢复正常GM3水平(黑)。
此外，当用FIPI处理时，发现表达swAPP的N2A细胞分泌降低量的Aβ42(图10)。注意，因为FIPI阻断PLD1和PLD2二者，不清楚是否药物的保护性效应涉及PLD1，PLD2或二者。
结果，PLD2独自(部分和总和)的遗传消除不呈现以有机体水平对敲除小鼠具有实质性效应，及由于在各种阿尔茨海默病实验模型的环境中PLD2的遗传消除赋予保护，PLD2被提示为药理学抑制的合理的靶。类似地，未观察到PLD1的消除导致任何明显的异常，提示，依赖于PLD1抑制的治疗剂也可携带治疗性益处。
【实施例2】
越来越多的证据表明阿尔茨海默病(AD)相关于脂质代谢中的深刻的变化，且表明这些变化可负责扰动成为突触功能障碍和认知降低的基础的分子通路。在此研究中，我们研究了淀粉样蛋白β(Abeta)和磷脂酸(PtdOH)之间的接头，控制多细胞过程的关键信号转导磷脂。我们之前已报道，培养的神经元用可溶性Abeta 1-42寡聚体的处理增加PtdOH水平。因为磷脂酶D(PLD)通路是生物活性组的PtdOH的主要来源，我们聚焦于脂质酶的此家族。因此，培养的神经元和成神经细胞瘤细胞用Abeta 1-42寡聚体的处理以及APP(swAPP)的瑞典突变体的表达导致PLD活性的显著增加。我们也显示，Abeta 1-42寡聚体处理促进PLD2自质膜转位到细胞质，还提示，PLD2位于Abeta信号转导通路。为了遗传测试AD中PLD通路的关联，我们产生了带有Pld2基因的条件性缺失的小鼠。我们的结果表明，Pld2消除，其不导致任何明显的表型，抑制海马片中Abeta对长期增强(LTP)的突触-损伤作用，提示，其赋予保护免于细胞毒性肽。醒目地，我们的行为分析显示情景学习在缺乏1个(swAPP/Pld2+/-)或2拷贝(swAPP/Pld2-/-)的Pld2的AD(swAPP)的转基因小鼠模型中改善。总之，这些发现提示，PLD2通路介导Abeta寡聚体的一些细胞毒性效应，及提示阻断此通路可改善AD-关联的突触功能障碍和认知降低。
本文引用各出版物，它们的内容通过引用整体并入本文。

Claims (29)

1.治疗神经退行性疾病的方法，包括：给需求该治疗的受试者施用有效量的磷脂酶D抑制剂。
2.减小神经退行性疾病发生的风险的方法，包括：给需求该治疗的受试者施用有效量的磷脂酶D抑制剂。
3.抑制受试者的记忆损伤的进展的方法，包括：给受试者施用有效量的磷脂酶D抑制剂。
4.保护免于Aβ42肽对神经细胞的毒性效应的方法，包括：使所述细胞暴露于有效量的磷脂酶D抑制剂。
5.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述磷脂酶D抑制剂是磷脂酶D2抑制剂。
6.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述磷脂酶D抑制剂是卤培米特衍生物。
7.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述磷脂酶D抑制剂选自：图11A～M中所示的磷脂酶D抑制剂。
8.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述磷脂酶D抑制剂是5-氟-2-吲哚基去-氯卤培米特(“FIPI”)。
9.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述磷脂酶D抑制剂是N-(2-(4-(2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-1-基)哌啶-1-基)乙基)-2-萘甲酰胺。
10.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述磷脂酶D抑制剂是(1R，2R)-N-((S)-1-(4-(5-溴-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-1-基)哌啶-1-基)丙烷-2-基)-2-苯基环丙烷羧酰胺。
11.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述磷脂酶D抑制剂是N-(2-(4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂螺[4，5]癸-8-基)乙基)喹啉-3-羧酰胺。
12.权利要求1或2的方法，其中神经退行性疾病选自：阿尔茨海默病，轻度认知障碍，帕金森病，亨廷顿舞蹈症，老年痴呆和朊病毒-相关的疾病。
13.磷脂酶D抑制剂，其用于治疗神经退行性病症。
14.磷脂酶D抑制剂，其用于减小神经退行性疾病的风险。
15.磷脂酶D抑制剂，其用于抑制记忆损伤的进展。
16.磷脂酶D抑制剂，其用于保护免于Aβ42肽对神经细胞的毒性效应。
17.权利要求13，14，15或16的磷脂酶D抑制剂，其为磷脂酶D2抑制剂。
18.权利要求13，14，15或16的磷脂酶D抑制剂，其为卤培米特衍生物。
19.权利要求13，14，15或16的磷脂酶D抑制剂，其选自：图11A～M中所示的磷脂酶D抑制剂。
20.权利要求13，14，15或16的磷脂酶D抑制剂，其为5-氟-2-吲哚基去-氯卤培米特(“FIPI”)。
21.权利要求13，14，15或16的磷脂酶D抑制剂，其为N-(2-(4-(2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-1-基)哌啶-1-基)乙基)-2-萘甲酰胺。
22.权利要求13，14，15或16的磷脂酶D抑制剂，其为(1R，2R)-N-((S)-1-(4-(5-溴-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-1-基)哌啶-1-基)丙烷-2-基)-2-苯基环丙烷羧酰胺。
23.权利要求13，14，15或16的磷脂酶D抑制剂，其为N-(2-(4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂螺[4，5]癸-8-基)乙基)喹啉-3-羧酰胺。
24.权利要求13或14的磷脂酶D抑制剂，其中所述神经退行性疾病选自：阿尔茨海默病，轻度认知障碍，帕金森病，亨廷顿舞蹈症，老年痴呆和朊病毒-相关的疾病。
25.鉴定某种剂是PLD2的抑制剂的方法，包括：
(i)提供宿主细胞；
(ii)将测试剂施用于宿主细胞；及
(iii)测定测试剂的施用是否降低宿主细胞中PA 34：2，PA 34：0和/或GM3的水平，
其中PA 34：2，PA 34：0和/或GM3的水平的降低表明测试剂是PLD2的抑制剂。
26.鉴定某种剂是用于阿尔茨海默病的治疗剂的方法，包括：
(i)提供宿主细胞；
(ii)将测试剂施用于宿主细胞；及
(iii)测定测试剂的施用是否降低宿主细胞中PA 34：2，PA 34：0和/或GM3的水平，
其中PA 34：2，PA 34：0和/或GM3的水平的降低表明测试剂可用于治疗AD。
27.治疗与增加的神经节苷脂水平关联的病症的方法，包括：给需求该治疗的受试者施用有效量的磷脂酶D抑制剂。
28.权利要求27的方法，其中所述磷脂酶D抑制剂是磷脂酶D2抑制剂。
29.权利要求27或28的方法，其中所述病症选自：GM1神经节苷脂贮积病，莫尔基奥B病，泰-萨克斯病，桑德霍夫病，AB变体，及C型尼曼-皮克病。
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PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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