CN102448931A - 蛋氨酸的放射标记的氟衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了化合物，该化合物是18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸或其衍生物。该化合物具有至少约90％的对映体纯度。18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸的制备可以通过将取代的S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯在碱的存在下使用络合的18F-盐进行处理，从而形成保护的产物，并且随后将所述保护的产物脱保护，从而形成18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸。在此方法中，N-保护的酯在S-丙基上具有离去基团，并且具有至少约90％的对映体纯度。所述的碱应该是不导致保护的产物消旋的那种。

Description

蛋氨酸的放射标记的氟衍生物
技术领域
本发明涉及放射标记的氟化合物以及制备它们的方法。
发明背景
[18F]氟-2-脱氧-D-葡萄糖(FDG)是最广泛地用于使用正电子发射断层扫描(PET)来诊断肿瘤的放射性示踪剂。然而，临床研究已证明，在一些情况下，难以将赘生物与炎症组织区分开。已经将放射标记的氨基酸，尤其含有PET放射核碳-11和氟-18的那些用于克服FDG的一些缺点。
出于这种目的，在动物和人类的PET肿瘤成像中，广泛地采用了放射标记的氨基酸，具体地采用了S-(2-[11C]甲基)-L-蛋氨酸([11C]MET)，然而碳-11的短半衰期(t1/2＝20分钟)限制了这些示踪剂的广泛应用。这促进了18F-标记的氨基酸(t1/2＝110分钟)如4-[18F]氟-L-苯丙氨酸和2-[18F]氟-L-酪氨酸。这些氨基酸证实具有适合的成像性质，但是这些化合物的放射合成困难、漫长并且放射化学收率低。
O-(2-[18F]氟代乙基)-L-酪氨酸([18F]FET)据证实在大脑中区分赘生物和炎症组织时具有好的成像性质，并成为18F-标记的氨基酸的开发中领先的候选者。然而，它在身体的末梢区域成像赘生物时并不太成功，主要地其缺少特异性，并且靶与非靶的比率差。因此，开发在肿瘤中显示出高的摄取并在周围的组织中背景低的其他氨基酸是有临床意义的。最近公开了使用碳-11和氟-18放射标记的其他氨基酸，并研究了它们在体内的生物学性质，包括氨基酸蛋氨酸(MET)的新的氟代衍生物S-(2-[18F]氟代乙基)-L-高半胱氨酸([18F]FEHCys)。然而，[18F]FEHCys是通过两步合成来制备的，并且在含水的系统中显示出相当大的不稳定性，这致使其在临床医学中的潜在应用变得不可能。
因此，需要[18F]FEHCys的新的，在含水的系统中具有改进的稳定性的类似物，以及在常规的临床或放射药物环境下制备该类似物的方法。
发明目的
本发明的目的在于基本上克服，或者改善前述至少一种或多种的缺点。
发明概述
本发明的第一个方面，提供了化合物，该化合物是18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸或其衍生物。该化合物可以具有至少约90％的对映体纯度。
可以将以下的选择单个地，或者以任意适合的组合与第一个方面结合使用。
所述的化合物可以是在S-丙基基团上被18F-放射标记。其可以是S-(3-[18F]氟代丙基)高半胱氨酸。其可以是N-保护的S-(3-[18F]氟代丙基)高半胱氨酸，例如作为N-叔丁氧羰基化合物来进行保护的。其可以是C-保护成为酯的，如叔丁酯。其可以是同时N-保护及C-保护的。其可以是，例如N-叔丁氧羰基-S-(3-[18F]氟代丙基)高半胱氨酸叔丁酯。
所述的化合物可以是D-对映体(即至少约90％为D-对映体)。其可以是S-(3-[18F]氟代丙基)-D-高半胱氨酸。其可以是N-叔丁氧羰基-S-(3-[18F]氟代丙基)-D-高半胱氨酸叔丁酯。
所述的化合物可以具有至少约90％的放射化学纯度。
在本发明的第二个方面，提供了制备18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸的方法，所述方法包括：
将在S-丙基基团上具有离去基团的取代S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯在碱的存在下使用络合的18F-盐进行处理，从而形成保护的产物，所述的酯具有至少约90％的对映体纯度，并且所述碱不导致所述保护的产物的消旋；和
将所述保护的产物脱保护，从而形成18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸。
可以将以下的选择单个地，或者以任意适合的组合与第二个方面结合使用。
所述的N-保护的酯可以是N-叔丁氧羰基(Boc)保护的酯。其可以是叔丁酯。
所述的离去基团可以位于所述的S-丙基基团的3位上。
所述的取代的丙基高半胱氨酸的N-保护的酯可以是在所述方法的条件下，能够产生18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸的D-对映体的对映体。
所述的离去基团可以是氯化物、溴化物、甲磺酸酯或者甲苯磺酸酯。
所述的碱可以是弱碱。其可以是比碳酸盐更弱的碱。其可以是足够弱的碱，从而其在所述反应的条件下，不造成S-丙基高半胱氨酸的α-氢原子或者N-保护的酯的去除。所述碱可以是四正丁基碳酸氢铵。所述碱可以是草酸盐。其可以是草酸钾。所述方法可以在不存在碱的情况下进行，所述碱能使取代的S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯消旋或者能使所述的保护的产物在该方法所使用的条件下消旋到显著程度。所述方法可以在不存在碳酸盐的情况下进行。
所述脱保护的步骤可以包括将所述的保护的产物使用强酸处理，所述的强酸如氢氯酸。
所述络合的18F-盐可以是穴状配体(cryptand)-络合的18F-盐。所述络合的18F-盐可以是4，7，13，16，21，24-六氧-1，10-二氮双环[8.8.8]-二十六烷-络合的18F-盐。所述络合的18F-盐可以是得自四正丁基铵盐的盐，如四正丁基碳酸氢铵、和四正丁基铵的[18F]氟化物。所述的四正丁基铵盐可能是不能将所述取代的S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯消旋化的。所述络合的18F-盐可以是足够弱的碱，从而其在所述反应的条件下，不造成S-丙基高半胱氨酸的α-氢原子或者N-保护的酯的去除。所述的络合的18F-的盐可以是四正丁基铵的[18F]氟化物。所述的络合的18F-的盐可以是原位形成的，或者其可以是预先形成的。
所述的脱保护的步骤可以在不分离所述保护的产物的情况下进行。
所述方法可以包括制备所述的取代S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯，所述的取代S-丙基高半胱氨酸具有在丙基上的离去基团。该步骤中可以包括将高半胱氨酸的N-保护的酯与取代的1-溴代丙烷进行反应。在上下文中，应当理解的是所述的1-溴代丙烷具有不是1-溴取代基的取代基。
在一些实施方案中有：
所述的1-溴代丙烷上的取代基是离去基团，或者
所述的1-溴代丙烷上的取代基是OH基团，在该情况下，制备在丙基上具有离去基团的取代丙基高半胱氨酸的N-保护的酯的步骤可以额外地包括将所述的OH基团进行甲苯磺酸化(即将OH基团转化为对甲苯磺酸酯基团或者甲基磺酸酯基团)。
所述方法可以包括从高半胱氨酸制备N-保护的高半胱氨酸。
所述方法可以额外地包括将所述的18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸纯化。
所述方法可以产生对映体纯度为至少约90％的18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸。所述方法可以产生放射化学纯度为至少约90％的18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸。
在一个实施方案中，提供了用于制备S-(3-[18F]氟代丙基)-D-高半胱氨酸的方法，所述方法包括：
将N-叔丁氧基-S-(3-甲苯磺酰基丙基)-D-高半胱氨酸叔丁酯在草酸盐的存在下，用穴状配体络合的18F-盐处理，形成保护的产物；并且
将所述保护的产物用氢氯酸处理，形成S-(3-[18F]氟代丙基)-D-高半胱氨酸。
在另一个实施方案中，提供了制备S-(3-[18F]氟代丙基)-D-高半胱氨酸的方法，所述方法包括：
将N-叔丁氧基-D-高半胱氨酸叔丁酯与3-溴-1-丙醇反应，以形成N-叔丁氧基-S-(3-羟基丙基)-高半胱氨酸叔丁酯；
将所述N-叔丁氧基-S-(3-羟基丙基)-D-高半胱氨酸叔丁酯进行甲苯磺酸化，以形成N-叔丁氧基-S-(3-甲苯磺酸氧丙基)-D-高半胱氨酸叔丁酯；
将所述N-叔丁氧基-S-(3-甲苯磺酸氧丙基)-D-高半胱氨酸叔丁酯在草酸盐的存在下，用穴状配体络合的18F-盐处理，形成保护的产物；和
将所述保护的产物用氢氯酸脱保护，形成S-(3-[18F]氟代丙基)-D-高半胱氨酸。
在本发明的第三个方面，提供了第一个方面的化合物或者由第二个方面制备的化合物作为肿瘤诊断的放射示踪剂的用途。
在本发明的第四个方面，提供了第一个方面的化合物或者由第二个方面制备的化合物在制备用于正电子成像术的组合物中的用途。
在本发明的第五个方面，提供了组合物，所述组合物包含第一个方面的化合物，或者由第二个方面制备的化合物，以及临床上可接受的载体。所述载体可以是含水载体。所述载体可以是缓冲的含水载体。
附图的简要说明
现在将以仅通过实施例，并通过参考所附的附图的方法来描述本发明优选的实施方案：
图1是前体1-3的合成的示意图—试剂和条件：(a)Boc2O、二氧杂环乙烷、Na2CO3(aq)，RT；(b)叔丁基-2，2，2-三氯乙酰亚胺酯、CH2Cl2，RT；(c)三丁基膦、DMF，RT；(d)1-溴-3-卤代丙烷或者3-溴丙醇、K2CO3、DMF，RT；(e)对甲苯磺酰氯、N，N，N’，N’-四甲基-1，6-己二胺、乙腈，RT；
图2是[18F]FPHCys的放射合成的示意图；
图3是显示了在含有K222(10mg)和K2CO3(2mg)的乙腈(1mL)中，甲苯磺酰基、溴代和氯代前体1-3(5mg)的放射标记作为温度和时间的函数的图；
图4是显示了在含有K222(10mg)、K2C2O4(2.55mg)和K2CO3(50μg)的乙腈(1mL)，甲苯磺酰基、溴代和氯代前体1-3的放射标记作为温度和时间的函数的图；
图5显示了使用γ和UV检测[18F]FPHCys的一般的色谱图；
图6显示了在手性柱上[18F]-L-FPHCys的色谱图(γ检测)，所述的[18F]-L-FPHCys是使用碳酸盐作为碱制备的；
图7显示了在手性柱上[18F]-L-FPHCys的色谱图(γ检测)，所述的[18F]-L-FPHCys是使用草酸盐作为碱制备的；
图8显示了在手性柱上[18F]-L-FPHCys的色谱图(UV检测)，所述的[18F]-L-FPHCys是使用碳酸盐作为碱制备的；
图9显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys的色谱图(UV检测)，所述的[18F]-D-FPHCys是使用草酸盐作为碱制备的；
图10显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys的色谱图(UV检测)，所述的[18F]-D-FPHCys是使用草酸盐作为碱制备的；
图11显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝0时、乙醇/缓冲液中的色谱图(γ检测)；
图12显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝0时、乙醇/缓冲液中的色谱图(UV检测)；
图13显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝4h时、乙醇/缓冲液中的色谱图(γ检测)；
图14显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝4h时、乙醇/缓冲液中的色谱图(UV检测)；
图15显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝0时、盐水中的色谱图(γ检测)；
图16显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝0时、盐水中的色谱图(UV检测)；
图17显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝4h时、盐水中的色谱图(γ检测)；
图18显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝4h时、盐水中的色谱图(UV检测)；
图19显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝0时、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中的色谱图(γ检测)；
图20显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝0时、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中的色谱图(UV检测)；
图21显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝4h时、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中的色谱图(γ检测)；
图22显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝4h时、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中的色谱图(UV检测)；
图23显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝0时、PBS中的色谱图(γ检测)；
图24显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝0时、PBS中的色谱图(UV检测)；
图25显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝4h时、PBS中的色谱图(γ检测)；
图26显示了在手性柱上[18F]-D-FPHCys在t＝4h时、PBS中的色谱图(UV检测)；
图27显示了不同类型的肿瘤细胞对18F-氟-L-丙基蛋氨酸的摄取；
图28显示了不同类型的肿瘤细胞对18F-氟-D-丙基蛋氨酸的摄取；
图29显示了已知的抑制剂对18F-氟-L-丙基蛋氨酸的运输的抑制；
图30显示了已知的抑制剂对18F-氟-D-丙基蛋氨酸的运输的抑制；
图31显示了在A431引发肿瘤(A431 tumoured)的小鼠中对D-[18F]FPM的摄取：示踪剂显示出1.96％的注射剂量百分比(ID％)，而肿瘤对背景的比值为7.86；
图32显示了在HT29引发肿瘤(HT29 tumoured)的小鼠中对D-[18F]FPM的摄取：示踪剂显示出0.75％的注射剂量百分比(ID％)，而肿瘤对背景的比值为2.10；
图33显示了在A431引发肿瘤的小鼠中对L-[18F]FPM的摄取：示踪剂显示出2.12％的注射剂量百分比(ID％)，而肿瘤对背景的比值为5.39；
图34显示了在HT29引发肿瘤的小鼠中对L-[18F]FPM的摄取：示踪剂显示出2.13％的注射剂量百分比(ID％)，而肿瘤对背景的比值为2.45；
图35是在A431引发肿瘤的小鼠中的FDG摄取：示踪剂显示出5.84％的注射剂量百分比(ID％)，而肿瘤对背景的比值为3.33；
图36是在A431引发肿瘤的小鼠中的FDG摄取：示踪剂显示出2.37％的注射剂量百分比(ID％)，而肿瘤对背景的比值为2.11；并且
图37显示了L-FPM的肿瘤放射自显影研究(上)和影像图(下)。
优选实施方案的详述
本发明涉及18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸及其衍生物。在本说明书中，使用D/L的术语表示不同的化合物的立体化学。与丙基或者取代的丙基基团连接使用的前缀S-用于表示该具体基团连接到硫原子，而与立体化学是无关的。
本发明的化合物可以具有至少约90％的对映体纯度，或者至少约91、92、93、94、95、96、97、98或者99％。它们可以用于肿瘤成像剂，然而，该化合物的特定前体也被包含在本发明中。具体地，在高半胱氨酸的N(NH2)或者C(COOH)上具有保护基的化合物也是被包含的。因此，例如根据本发明的化合物可以是N-叔丁氧羰基衍生物，或者叔丁酯，或者N-叔丁氧羰基衍生物和叔丁酯。本发明的其他实施方案包括未保护的18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸，其中的NH2基团和COOH基团没有取代基。应当理解的是，取决于周围环境的pH，NH2基团和COOH基团的中的一者或者两者可以是离子化的，即所述NH2基团可以以NH3 +存在，而所述COOH基团可以以COO-存在。因此，所述化合物可以以铵盐或者羧酸盐，或者两性离子存在。
所述化合物可以在S-丙基基团上被18F-放射标记。所述化合物可以在每个分子中，特别是在每个S-丙基基团上具有单个18F。所述18F可以是末端的18F。所述18F可以位于S-丙基基团的3-位上。
所述化合物可以是D-对映体。其可以为至少约90％，或者至少约91、92、93、94、95、96、97、98或者99％的D-对映体。
所述化合物可以具有至少约90％，或者至少约91、92、93、94、95、96、97、98或者99％的放射化学纯度。其可以具有至少约90％，或者至少约91、92、93、94、95、96、97、98或者99％的放射化学纯度和对映体纯度。
18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸可以通过将在S-丙基基团上具有离去基团的取代S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯在碱的存在下使用络合的18F-盐进行处理，从而形成保护的产物。随后可以将所述保护的产物脱保护，形成18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸。这些步骤可以以“单罐”法来进行，即在不分离或纯化保护的产物的情况下。
酯基团可以代表羧基基团，其具有连接至其上的保护基团。所述的N-保护的酯可以是N-叔丁氧羰基(Boc)保护的酯。其可以是叔丁酯。
所述的离去基团可以在S-丙基基团的3位上。所述的离去基团可以位于一些其他位置，如1位或者2位。一般在S-丙基基团上只有一个离去基团。
所述的取代S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯可以是能够在所述方法的条件下，产生所述的D-对映体的那种对映体。
所述的离去基团可以是卤素。其可以是，例如氯或者溴或者碘。所述的离去基团可以是甲苯磺酸酯。所述的离去基团可以是甲磺酸酯(甲磺酸酯(methanesulfonate))。所述的离去基团可以是三氟甲磺酸酯(三氟甲磺酸酯(trifluromethanesulfonate))。所述的离去基团可以是氮化物。所述的离去基团可以是硫氰酸酯。
所述的碱可以是草酸盐。所述草酸盐可以是钾盐。所述草酸盐可以是钠盐。所述的碱可以是弱碱，可以是草酸钾。所述的碱可以是不导致S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯或者保护的产物消旋的碱。应当理解短语“不导致消旋”的范围内，允许少量的消旋，并且这一短语应表示保护的产物在本方法中使用的条件下不消旋到显著的程度。所述的碱不能将所述的N-保护的酯消旋到大于约5％或者4、3、2或者1％的程度。本发明人出人意料地发现，草酸盐作为碱使用导致了非常低水平的消旋。因此可以得到具有高水平的对映体纯度的产物。与L-对映体相比，在患者的身体中，D-对映体显示出在肿瘤外代谢的程度更低。因此，认为其在到达肿瘤方法更为有效，并且认为其是更为有效的标记过程。
脱保护的步骤可以包括将保护的产物用强酸进行处理。所述的酸可以是矿物酸。其可以是强的有机酸。例如，可以为一定浓度的三氟乙酸、氢氯酸、硫酸、氢溴酸或者一些其他的适合的酸，这些酸在该浓度下在不分解产物的情况下有效且及时地将保护基去除。其可以具有至少约5N、或者约5至10或者5至7N，例如5、6、7、8、9或者10N的浓度。
所述的络合的18F-的盐可以是穴状配体-络合的18F-盐。所述的络合的18F-的盐可以是4，7，13，16，21，24-六氧-1，10-二氮双环[8.8.8]-二十六烷-络合的18F-盐。所述的络合的18F-的盐可以是四正丁基碳酸氢铵的18F-盐。所述的18F可以为约500至约1000mCi，或者约500至800，700至1000，500至600，900至1000或者600至800mCi，例如约500、600、700、800、900或者1000。在一些情况下，其可以小于500mCi或者大于1000mCi。其可以使用Cyclotron或者其他适合的源来产生。
脱保护的步骤可以在不分离保护的产物的情况下完成，即18F的引入和脱保护可以由单罐法来进行。
合成的放射化学收率可以是至少约10％，或者至少约15、20、25或者30％，或者为约10至约100％，或者约10至50、10至30、30至50、50至100或者25至35％，例如约10、15、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或者100％。
在方法的一个实施方案中，活化的络合18F是在最初制备的。这可以通过使用活化的吸附装置(例如，用草酸盐活化)来进行。因此，18F-可以吸附到所述的活化的吸附装置上，并且随后使用草酸盐或者碳酸盐或者两者的混合物与络合剂(例如，所述的穴状配体)一起进行吸附。所得到的溶液含有想要的活化的络合18F-，并且可以将其干燥(例如在干燥的气流中或者在高温下或者两者，同时地或者相继地)。适合的气体包括氮、氦、氩等等。所述的干燥可以在部分真空下进行。一般地可以在溶剂中将所得到的干燥的活化的络合18F-用于处理取代的S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯。所述的酯可以以约0.1至约1％w/v，或者约0.1至0.5，0.1至0.3，0.2至1，0.5至1或者0.2至0.5％，例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或者1％存在于溶剂中。所述的溶剂可以是极性溶剂。所述的溶剂可以是质子惰性的。所述的溶剂可以是例如乙腈、乙醚、碳酸二乙酯、四氢呋喃、二噁烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、二乙基乙酰胺或者一些其他适合的溶剂如有位阻的醇：叔丁醇或者新戊醇。该反应可以在密封的容器中进行。该反应可以在高温下、在密封的容器中进行，使得该反应是在高(即大气压以上)压下进行的。该反应可以在约50至约150℃，或者约50至100，100至150，80至120，80至100，100至120或者90至110℃，例如约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或者150℃下进行。该反应可以进行适当的时间，从而达到想要的转化率。所述的时间可以依赖于温度。例如，所述的时间其可以为约5至到约30分钟，或者约5至到约20分钟，5到至10，10到至30，20到至30或者5到至15分钟，例如约5、10、15、20、25或者30分钟。然后可以将所述所述的酸可以直接地加到反应混合物中。其可以过量加入，例如至少过量约10摩尔过量。可以将所得到的混合物反应约1至到约10分钟，或者约1至5，5至10或者3至8分钟，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10分钟。可以在更早的反应进行的同样温度下，或者在同样范围内的不同的温度下使该反应进行。将所产生的混合物中和，或者大致地中和。其可以使用碱进行处理从而将该混合物大致地中和，所述的碱如氢氧化物。可以使用缓冲液，例如磷酸盐缓冲液来得到想要的pH。想要的pH可以是例如为约5至约8，或者约5至7，5至6，6至8，7至8或者6至7，例如约5、5.5、6、6.5、7、7.5或者8。对产生的反应混合物进行任意适合的分离技术，从而将产物分离。可以例如使用HPLC柱，并且将含有想要的产物的馏分分离。该馏分可以被干燥并且随后可以将该产物配制到适合的缓冲液中用于进一步的用途。可选地，可以将从HPLC柱分离的想要的产物进一步用水稀释，并且吸附到固相提取柱上，使用适合的溶剂洗涤且随后重新配制到适合的缓冲液中。所述的适合的缓冲液的pH可以是例如为约5至约8，或者约5至7，5至6，6至8，7至8或者6至7，例如约5、5.5、6、6.5、7、7.5或者8。
可以使用标准的有机合成方法来制备在丙基上有离去基团的取代的S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯。适合的方法概括于下文，然而应该容易地认识的是，可以使用其他的方案以及其他的条件设定来得到所述产物。
因此在适合的合成中，将高半胱氨酸(3，3’-氨基-3，3’-二羧基二丙基二硫化物)使用Boc2O和弱碱进行N-保护。随后，将所产生的N，N’-保护的高半胱氨酸使用叔丁基-2，2，2-三氯乙酰亚胺酯或者其他适合的叔丁基化剂进行酯化。产物的还原，如使用三丁基膦的还原导致二硫键的切割以产生游离的N-保护的和羧基保护的硫醇。随后，将该硫醇使用3-溴-1-卤代丙烷或者使用3-溴-1-丙醇中的一种进行处理，并使用如碳酸盐的弱碱进行催化。该步骤应该在不导致消旋的条件(碱、温度)下进行。在使用3-溴-1-卤代丙烷的情况下，这直接地产生在丙基上具有离去基团的取代的S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯。在在使用3-溴-1-丙醇的情况下，将所得到的醇进行甲苯磺酰基化，例如使用甲苯磺酰氯和碱，这直接地产生在丙基上具有离去基团的取代的S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯。
该方法可以额外地包括将所述18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸进行纯化。适合地，所述纯化可以使用色谱如HPLC。由于产物是放射性标记的，因此在HPLC上使用对放射活性敏感的检测器是方便的。
本发明的化合物(即所述的18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸)可以用于肿瘤成像中。可以将本发明的化合物用于制备用于肿瘤成像的组合物。在该应用中，一般有必要将所述化合物暴露于含水的环境。本发明人已出人意料地发现，所述的18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸在该环境下比相对应的S-乙基同系物相比，大体上更为稳定。这使得该S-丙基类似物比此前已经研究用于该应用的S-乙基类似物更适合用于该应用。
本文描述了[18F]FEHCys的新类似物的开发和评估；S-(3-[18F]氟代丙基)高半胱氨酸([18F]FPHCys)。其化学鉴定、表征、性质包括稳定性和对映体纯度此前均无记载。因此，FPHCys或者[18F]FPHCys的单个的D和L对映体的生物性质无记载。
发明人开发了用于合成[18F]FPHCys的单罐两步的的放射标记方法。在此方法中，在密封的小管中，将活化的络合18F与取代的S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯进行加热，随后加入试剂减少水解，并随后将该反应混合物转移到HPLC进行纯化和配制。当所使用的放射性的剂量低时(一般地少于500MBq)，该方法可以按照人工的方法来进行。本发明人已开发并优化了[18F]FPHCys在自动化的合成模件单元上的制备，所述的自动化的合成单元模件不限于GE Tracerlab FXFN合成模件，从而导致明显更大量的放射性(也即超过500MBq的18F-量，一般地37GBq，但是可以承担到高达400GBq)。一般地，自动化的合成元件，如GE Tracerlab FXFN合成模件允许简单的步骤，如将[18F]氟化物、试剂(如草酸钾或者其他的碱、KryptofixTM2.2.2、氢氯酸、溶剂)及其它的材料通过阀反应容器系统转移到反应管和传送线的系统来转移中。与使用两锅双罐法合成的情况相比，所述单罐两步合成通过使得该方法以更容易更有效的方式进行的机械设备来完成。以此种方式，在本工作中所描述的方法更易修改成为自动化的放射合成，并因此与此前的方法相比，其确保了更广泛的使用和应用。除此之外，为了潜在的生物上和临床上的应用，保证并提高了该示踪剂的对映体稳定性。合成了合适地保护的S-(3-苯甲磺酰氧基丙基)高半胱氨酸1、S-(3-溴代丙基)高半胱氨酸2和S-(3-氯代丙基)高半胱氨酸3作为前体，并通过经典典型的氟-18亲核取代进行标记。因此，通过单罐两步合成，使用GE Tracerlab FXFN合成模件，通过保护的S-(3-苯甲磺酰氧基丙基)高半胱氨酸1、S-(3-溴代丙基)高半胱氨酸2和S-(3-氯代丙基)高半胱氨酸3前体制备了S-(3-[18F]氟代丙基)-L-高半胱氨酸([18F]FPHCys)的D和L异构体。该放射标记涉及进行经典的氟-18亲核取代(在不同的温度下(50-100℃)在乙腈中，使用KryptofixTM 222(也称作K222或者4，7，13，16，21，24-六氧-1，10-二氮双环[8.8.8]-二十六烷)和碳酸钾或者草酸钾)，随后进行酸水解(使用氢氯酸在100℃下进行5分钟)。然而，当此放射标记在碳酸钾的存在下进行时，观察到了([18F]FPHCys)的消旋。出于此原因，使用草酸钾替代碳酸钾。最后，通过苯甲磺酸酯前体1合成了[18F]-L-FPHCys和[18F]-L-FPHCys，在100℃下持续10分钟，随后为在100℃下酸水解5分钟。在这些条件下，分离出的[18F]FPHCys具有衰变校正后30±5％(非衰变矫正20±5％)的总体放射化学收率，其开始自而不限于18-37GBq(500-1000mCi)的[18F]氟化物的量，在包括HPLC纯化和配制的65分钟合成时间之后，具有＞98％的放射化学和对映体纯度。
本工作的根本性的目的在于化学上稳定及光学纯的[18F]PHFCys的有效的单罐合成，其可以采用自动化的合成方法，该方法使用但不限于使用自动化的合成元件，GE Tracerlab FXFN合成模件。简化的化学方法，稳定性及其对于自动化的合成的适应性确保了产物[18F]-L-FPHCys和[18F]-D-FPHCys可以大量地制备，这对于医疗机构的分配和使用是适合的。所需要的前体的合成使用经典的化学方法，在四或五步内实现(图1)，所述的前体为保护的S-(3-苯甲磺酰氧基丙基)高半胱氨酸1，S-(3-溴代丙基)高半胱氨酸2和S-(3-氯代丙基)高半胱氨酸3。L-高半胱氨酸或者D-高半胱氨酸进行保护(P.Serafinowski，E.Dorland，K.R.Harrap，J.Balzarini，E.De Clercq，J.Med.Chem.1992，35，4576-4583；J.Zhu，X.Hu，E.Dizin，D.Pei，J.am.Chem.Soc.2003，125，13379-13381)，随后将化合物4与叔丁基-2，2，2-三氯乙酰亚胺酯在二氯甲烷中，室温下反应定量地产生化合物5(J.McConathy，L.Martarello，E.J.Malveaux，V.M.Camp，N.E.Simpson，C.P.Simpson，G.D.Bowers，J.J.Olson，M.M.Goodman，j.Med.Chem.2002，45，2240-2249；J.McConathy，L.Martarello，E.J.Malveaux，V.M.Camp，N.E.Simpson，C.P.Simpson，G.D.Bowers，Z.Zhang，J.J.Olson，M.M.Goodman，Nucl.Med.Biol.2003，30，477-490)。切割二硫键，产生保护的L-高半胱氨酸6使用三丁基膦，在DMF中实现90％的收率(J.Zhu，X.Hu，E.Dizin，D.Pei，J.am.Chem.Soc.2003，125，13379-13381；K.Yoshiizumi，F.Nakajima，R.Dobashi，N.Nishimura，S.Ikeda，Bioorg.Med.Chem.2002，10，2445-2460；C.Lherbet，J.W.Keillor，Org.Biomol.Chem.2004，2，238-245)。在碳酸钾的存在下，通过将1-溴-3-卤代丙烷或者3-溴代丙醇与硫醇6在DMF中在室温下反应，以77-96％的收率制备了前体2-3和化合物7-8(K.Yoshiizumi，F.Nakajima，R.Dobashi，N.Nishimura，S.Ikeda，Bioorg.Med.Chem.2002，10，2445-2460；C.Lherbet，J.W.Keillor，Org.Biomol.Chem.2004，2，238-245)。在乙腈中的N，N，N’，N’-四甲基-1，6-己二胺的存在下，将醇8用对苯甲磺酰氯的保护以实现77％的收率(Y.Yoshida，K.Shimonishi，Y.Sakakura，S.Okada，N.Aso，Y.Tanabe，Synthesis 1999，9，1633-1636)。所述的苯甲磺酸酯化、溴化及氯化的前体1-3四或五步的总收率对于对映体L和D而言均分别为66％、69％和83％。
从1-3(对映体L)放射合成[18F]-L-FPHCys在单罐两步反应中，通过经典的氟-18亲核取代，随后酸水解保护基团来完成(图2)。该反应的条件的优化涉及[18F]-氟化物(370-555MBq(10-15mCi))在不同的温度下(50-100℃)与5mg量的前体1-3(10-14μmol)，在含有10mg K222(KryptofixTM 222)和2mg的碳酸钾的乙腈中的反应(图3)。在50℃下，甲苯磺酸酯前体1(30分钟时67％)比溴化的和氯化的类似物2和3(分别为55％和5％)显示出更强的反应性。然而，这三种前体的放射化学收率在100℃时明显地上升。在此温度下，氯化的前体3在30分钟的反应中提供连续上升的收率，直到达到最大值为48％的放射化学收率。与直到100℃时在高温下还稳定的氯化的前体2不同的是，甲苯磺酸酯前体1在100℃下15分钟反应之后，显示出明显的分解。在相同的温度下，溴化的前体2的放射化学收率相对地稳定，其为从5分钟的67％到30分钟的65％。然而，在80℃下，溴化的前体2显示出比100℃下更高的反应性(15分钟时77％的收率)。在此温度下，甲苯磺酸酯前体1显示出与100℃下相似的特征，但是在反应的15分钟之后无分解。
随后，通过酸水解去除保护基团，完成[18F]-L-FPHCys的放射合成。保护的[18F]-L-FPHCys(在100℃下经过10分钟(77％收率)由1产生)的水解使用6N的HCl在100℃下进行5分钟。该反应随后使用6N NaOH终止，并且在1.5M，pH为6的磷酸盐缓冲液中稀释。所得到的溶液使用HPLC进行纯化，这验证了完全的水解，以及[18F]-L-FPHCys的形成，所述的[18F]-L-FPHCys具有衰变校正后47±5％的总放射化学收率，以及＞98％的放射化学纯度。然而，由于此标记的碱性条件采用了碳酸钾，观察到了[18F]-L-FPHCys的消旋([18F]-L-FPHCys/[18F]-D-FPHCys，75/25)。
随后，使用2.55mg的草酸钾替代碳酸钾以及在不同的温度下(50-100℃)含有在乙腈中5mg的量的前体1-3(10-14μmol)的10mgK222来完成[18F]-L-FPHCys的放射合成(图4)。与碳酸钾相比，使用草酸钾的氟化对于前体1-3而言，在50、80和100℃下显示出连续上升的收率，以及在100℃下有更高的反应性。然而，当使用草酸钾进行氟化时，观察到所有放射化学收率均较低。前体1观察到的最高的标记效率为使用草酸钾在100℃下30分钟后62％的收率，而使用碳酸钾则为15分钟后82％的收率。
随后，通过在100℃下将保护的[18F]-L-FPHCys的酸水解(6N HCl)5分钟，完成[18F]-L-FPHCys的放射合成。该反应随后使用6N NaOH终止，并且使用1.5M，pH为6的磷酸盐缓冲液稀释。得到的[18F]-L-FPHCys具有衰变校正后38±5％的总放射化学收率，以及＞98％的放射化学纯度。在这些条件下，所得到的[18F]-L-FPHCys具有超过98％的对映体纯度。[18F]-D-FPHCys从1-3(对映体)的放射合成使用与[18F]-L-FPHCys相同的条件完成，其得到相似的化学和放射化学纯度。
总之，[18F]-L-FPHCys和[18F]-D-FPHCys通过单罐两步的合成进行制备，所述制备在GE Tracerlab FXFN合成模件上充分自动化，并使用在乙腈中的甲苯磺酸酯前体1(5mg、10μmol)，在2.55g的草酸钾和10mg的K222的存在下，于100℃下进行10分钟，随后使用6N HCl在100℃下将保护的[18F]FPHCys酸水解5分钟。一般地，分离出的4.1-7.8GBq(110-210mCi)[18F]FPHCys具有衰变校正后30±5％(非衰变矫正20±5％)的总体放射化学收率，其开始自而不限于18-37GBq(500-1000mCi)的[18F]氟化物的量，在包括HPLC纯化和配制的65分钟合成时间之内进行，具有＞98％的放射化学和对映体纯度。
实施例
试验
总则。在本制备中所使用的试剂和溶剂购自Lancaster、Fluka或者Sigma-Aldrich。全部的化合物和溶剂在不进一步纯化的情况下使用。
所有的熔点都是在开口毛细管中，使用SRS Optimet自动熔点系统MPA100进行测定的并未经校准。1H和13C NMR谱在Brucker DPX 400上，在400MHz(1H)和100MHz(13C)下，于合适的氘代溶剂(CDCl3、CD3OD、D2O)中进行测量。化学位移按照相对于四甲基硅烷(TMS，0.00ppm)的百万分的份数(δ)进行表示，所述的四甲基硅烷用作内标。偶合常数以Hz给出，并且偶合常数缩写为：s(单峰)、d(双峰)、q(四重峰)、qu(八重峰)、m(多重峰)以及dt(成对的三重峰)。低分辨率质谱(LRMS)在Waters Micromass ZE四极杆质谱仪上进行，而高分辨质谱(HRMS)在Micromass Qtof Ultima或者AutoSpec TOF上进行。TLC在预先包被了硅胶60F254(Merck)的铝板上进行，并且Rf使用254nm的UV灯来建立。柱色谱在Merck 60硅胶(40-63μm)的柱上进行。
[18F]HF通过18O(p，n)18F在Cyclotron上进行。放射性标记是在GETracerlab FXFN合成模件上进行的。使用HPLC、Waters 510泵、与Berthholdβ+-flow检测器串联的线性UVIS检测器(λ＝210nm)分析标记了氟-18的中间产物，所述中间产物在Phenomenex Bondclone C18柱(300×7.8mm，10μm)上，以2mL/分钟，以CH3CN/H2O(75∶25、v/v)作为流动相进行。氟-18标记的最终产物使用HPLC进行纯化，所述HPLC由Sykam S-1021泵、与Berthhold β+-flow检测器串联的Knauer K-2001UV检测器(λ＝220nm)组成，所述氟-18标记的最终产物的纯化在Waters AtlantisC18柱(250×10mm，5μm)上，以3mL/分钟，以pH为6、0.15M(5∶95，v/v)的EtOH/磷酸盐缓冲液作为流动相进行。水解的放射性配体的质量控制分析在Varian 9002泵、与Ortec ACE Mateβ+-flow检测器串联的线性UVIS检测器(λ＝226nm)上进行，即在Phenomenex Gemini C18柱(150×4.6mm，5μm)上，以1mL/分钟，以pH为11.5、0.05M的磷酸盐缓冲液作为用于化学和放射化学纯度流动相进行以及在Phenomenex Chirex D Penicilamine柱(150×4.6mm，5μm)上，以1mL/分钟，以2nM(1∶9，v/v)的异丙醇/CuSO4缓冲液作为对映体纯度流动相进行。标记的化合物的一致性通过将可靠的化合物共同注射到HPLC进行确定。在Capintec R15C剂量检测器上测量放射活性。
化学和放射化学
N，N’-二(叔丁氧羰基)高半胱氨酸(4)。按照公开的步骤(J.Zhu，X.Hu，E.Dizin，D.Pei，J.am.Chem.Soc.2003，125，13379-13381)进行制备。得到了以下的附加分析数据：mp 158-159℃；13C NMR(CD3OD)δ175.68、158.16、80.69、53.72、35.80、32.54、28.82；LRMS：ES(+ve)m.z 469(M+1)；HRMS：ES(+ve)C18H32N2O8S2(M+1)计算为469.1703，理论值469.1678。
二(叔丁基)N，N’-双(叔丁氧羰基)高半胱氨酸(5)。将叔丁基-2，2，2-三氯乙酰亚胺酯(11.0g，47.77mmol)在氮下加入到4(4.47g，9.55mmol)的二氯甲烷(39mL)溶液中。在室温下搅拌过夜后，将溶剂在减压下去除，并且通过硅胶色谱(庚烷/乙酸乙酯80∶20)纯化粗提残留物以产生白色固体的5(5.50g，99％)。mp 66-68℃；1H NMR和13C NMR与公开的数据一致(J.Zhu，X.Hu，E.Dizin，D.Pei，J.am.Chem.Soc.2003，125，13379-13381)；LRMS：ES(+ve)m/z 581(M+1)；HRMS：ES(+ve)C26H48N2O8S2(M+1)计算为581.2938，理论值581.2930。
叔丁基-N-(叔丁氧羰基)高半胱氨酸(6)。向5(3.2g，5.51mmol)的DMF(45mL)溶液中加入水(4mL)和三丁基膦(1.26g，6.06mmol)并且将该混合物在氮中在室温下搅拌过夜。将该反应混合物用水(500mL)骤冷，并且将水相用乙酸乙酯(3×240mL)进行彻底萃取。将合并的有机层用盐水(2×150mL)洗涤，干燥(MgSO4)，并且将溶剂蒸发。粗提残留物使用硅胶色谱进行纯化(庚烷/乙酸乙酯90∶10)，以产生无色油状的6(2.90g，90％)。1H NMR和13C NMR与公开的数据一致(J.Zhu，X.Hu，E.Dizin，D.Pei，J.am.Chem.Soc.2003，125，13379-13381)LRMS：ES(+ve)m/z 292(M+1)；HRMS：ES(+ve)C13H25NO4S(M+1)计算为292.1579，理论值292.1583。
叔丁基-N-(叔丁氧羰基)-S-(3-氟代丙基)高半胱氨酸(7)。在6(445mg，1.53mmol)DMF(6.7mL)的溶液中加入1-溴3-氟代丙烷(326mg，2.29mmol)，随后加入碳酸钾(422mg，3.05mmol)并且将所产生的白色溶液在室温下在氮中搅拌24小时。将该反应混合物使用水(90mL)稀释并且用乙酸乙酯(3×45mL)进行萃取。将合并的有机层用水(90mL)洗涤，干燥(MgSO4)，并且将溶剂蒸发。将粗提残留物使用硅胶色谱法进行纯化(庚烷/乙酸乙酯90∶10)，以产生黄色油状的7(504mg，95％)。1HNMR(CDCl3)δ5.15-5.05(m，IH)、4.53(dt，J＝All Hz，J＝5.8Hz，2H)、4.35-4.20(m，IH)、2.64(t，J＝7.3Hz，2H)、2.60-2.50(m，2H)、2.15-2.03(m，IH)、2.03-1.80(m，3H)、1.47(s，9H)、1.44(s，9H)；13C NMR(CDCl3)δ171.45、155.48、82.44(J＝165.6Hz)、82.35、79.95、53.55、33.28、30.54(J＝20.7Hz)、28.45、28.15、28.08、27.90(J＝5.4Hz)；LRMS：ES(+ve)m/z 374(M+Na)；HRMS：ES(+ve)C16H30NO4SF(M+1)计算为352.1958，理论值352.1970。
叔丁基-N-(叔丁氧羰基)-S-(3-羟丙基)高半胱氨酸(8)。该化合物由6(6g，20.61mmol)和3-溴丙醇(4.43mg，30.92mmol)按照7所描述地进行合成。将粗提残留物使用硅胶色谱法进行纯化(庚烷/乙酸乙酯70∶30)，以产生黄色油状的8(6.91mg，96％)。1H NMR(CDCl3)δ5.12-5.05(m，IH)、4.35-4.20(m，IH)、3.80-3.70(m，2H)、2.64(t，J＝6.7Hz，2H)、2.60-2.50(m，2H)、2.15-2.05(m，IH)、1.95-1.80(m，2H)、1.83(qu，J＝6.1Hz，2H)、1.47(s，9H)、1.44(s，9H)；13C NMR(CDCl3)δ172.56、156.56、82.35、81.06、61.62、54.51、33.18、31.98、28.80、28.47、28.16、28.02；LRMS：ES(+ve)m/z 372(M+Na)；HRMS：ES(+ve)C16H31NO5S(M+1)计算为350.2001，理论值350.2017。
叔丁基-S-(3-溴代丙基)-N-(叔丁氧羰基)-高半胱氨酸(2)。该化合物由6(200mg，0.68mmol)和1，3-二溴丙烷(420mg，2.06mmol)按照7所描述地进行合成。将粗提残留物使用硅胶色谱法进行纯化(庚烷/乙酸乙酯90∶10)，以产生黄色油状的2(215mg，77％)。1H NMR(CDCl3)δ5.15-5.05(m，IH)、4.35-4.20(m，IH)、3.51(t，J＝6.7Hz，2H)、2.67(t，J＝6.7Hz，2H)、2.60-2.50(m，2H)、2.15-2.05(m，IH)、2.10-2.05(qu，J＝6.7Hz，2H)、1.95-1.80(m，IH)、1.47(s，9H)、1.44(s，9H)；13C NMR(CDCl3)δ171.43、155.47、82.37、79.98、53.53、33.34、32.31、32.21、30.36、28.47、28.16、28.02；LRMS：ES(+ve)m/z 412(M[Br79]+1)，414(M[Br81]+1)；HRMS：ES(+ve)C15H28NO4SBr(M[Br79])计算为412.1157，理论值412.1165。
叔丁基-N-(叔丁氧羰基)-S-(3-氯代丙基)高半胱氨酸(3)。该化合物由6(200mg，0.68mmol)和1-溴-3-氯乙烷(327mg，2.06mmol)按照7所描述地进行合成。将粗提残留物使用硅胶色谱法进行纯化(庚烷/乙酸乙酯90∶10)，以产生黄色油状的3(236mg，94％)。1H NMR(CDCl3)δ5.15-5.05(m，1H)、4.35-4.20(m，1H)、3.64(t，J＝6.7Hz，2H)、2.67(t，J＝6.7Hz，2H)、2.60-2.50(m，2H)、2.15-2.05(m，1H)、2.02(qu，J＝6.7Hz，2H)、1.95-1.80(m，1H)、1.47(s，9H)、1.44(s，9H)；13C NMR(CDCl3)δ171.43、155.48、82.36、79.97、53.53、43.54、33.32、32.25、29.16、28.46、28.16、28.03；LRMS：ES(+ve)m/z 368(M[Cl35]+1)，370(M[Cl37]+1)；HRMS：ES(+ve)C16H30NO4SCl(M[Cl35]+1)计算为368.1662，理论值368.1677。
叔丁基-N-(叔丁氧羰基)-S-(3-甲苯磺酰氧丙基)高半胱氨酸(1)。向8(2.85g，8.20mmol)的乙腈(115mL)溶液中，加入N，N，N’，N’-四甲基-1，6-己二胺(2.84g，16.14mmol)随后加入对甲苯磺酰氯(2.39g，12.30mmol)并且将该反应混合物在氮中于室温下搅拌4小时。将该反应混合物用水(340mL)稀释，并且使用乙酸乙酯(3×340mL)萃取。将合并的有机层用盐水(340mL)洗涤，干燥(MgSO4)，并且蒸发溶剂。将粗提残留物使用硅胶色谱法进行纯化(庚烷/乙酸乙酯80∶20)，以产生黄色油状的1(3.19g，77％)。1H NMR(CDCl3)δ7.78(d，J＝8.2Hz，2H)、7.34(d，J＝8.2Hz，2H)、5.15-5.05(m，IH)54.30-4.15(m，IH)、4.12(t，J＝6.7Hz，2H)、2.53(t，J＝6.7Hz，2H)、2.50-2.40(m，2H)、2.45(s，3H)、2.10-1.95(m，1H)、1.90(qu，J＝6.7Hz52H)、1.90-1.75(m，2H)、1.46(s，9H)、1.43(s，9H)；13C NMR(CDCl3)δ171.37、155.47、144.97、133.15、130.03、128.05、82.37、79.97、68.88、53.51、33.19、29.82、28.45、28.14、27.99、27.97、21.78；LRMS：ES(+ve)m/z 526(M+Na)；HRMS：ES(+ve)C23H37NO7S2(M+1)计算为504.2090，理论值504.2105。
S-(3-氟代丙基)高半胱氨酸的盐酸盐(FPHCys)。在保护的氨基酸7(63mg)的THF(530μL)溶液中加入6N的氢氯酸(1.07mL)，并且将该反应混合物在室温下搅拌3小时。将溶剂在减压下去除，并且将所得的固体使用乙酸乙酯进行洗涤(3×7mL)，在真空中干燥，得到白色固体的FPHCys(38mg，91％)。1H NMR(D2O)δ4.64(dt，J＝47.1Hz，J＝5.8Hz，2H)、4.17(t，J＝6.2Hz，IH)、2.77(t，J＝7.3Hz，2H)、2.75(t，J＝7.0Hz，2H)、2.35-2.15(m，2H)、2.10-1.95(m，2H)；13C NMR(D2O)δ173.52、84.88(d，J＝158.7Hz)、53.52、30.81、30.69(d，J＝19.9Hz)、27.84(d，J＝5.4Hz)、27.64；LRMS：ES(+ve)m/z 196(M+1)；HRMS：ES(+ve)C7H14NO2SF(M+1)计算为196.0808，理论值196.0814。
S-(3-[18F]氟丙基)高半胱氨酸([18F]FPHCys)的放射合成。在GETracerlab FXFN合成模件上，将含水的[18F]氟化物溶液(18-37GBq(500-1000mCi))加载到QMA筒上，首先使用草酸钾进行活化(10mL，0.11M)。将浓缩的[18F]氟化物使用K2C2O4/K2CO3溶液(2.55mg/50μg，200μL，位于水中)和K222(10mg，800μL，位于CH3CN中)在反应器中洗脱。将溶剂在氦气流中于70℃下真空中蒸发7分钟，而后在120℃下仅5分钟。在活化的K222/钾[18F]氟化物中加入乙腈(2mL)中的甲苯磺酸酯前体1(5mg，10μmol)，并将该混合物在100℃下加热10分钟，之后加入6N HCl(500μL)。在100℃下5分钟后，加入6N NaOH(500μL)和pH为6的磷酸盐缓冲液(1mL，1.5M)，并将所得的溶液直接在半制备的HPLC柱(AtlantisC18柱，250×10mm，5μm)上进行纯化；流动相为乙醇/磷酸盐缓冲液，pH 6、0.15M(5∶95，v/v)；流速为3mL/分钟，λ＝220nm)。收集15至16分钟之间含有标记产物[18F]FPHCys的馏分，并且将其配制成pH无菌的缓冲液用于细胞研究，并且配制成盐水用于动物研究。惯常地，[18F]FPHCys在约65分钟内备用于注射。一般地，从18-37GBq(500-1000mCi)的量的[18F]氟化物开始，分离出4.1-7.8GBq(110-210mCi)的[18F]FPHCys，其总共的放射化学收率为衰变校正后30±5％(未经衰变校正时为20±5％)，并且放射化学纯度及对映体纯度＞98％。
结论
发明人已开发了[18F]FPHCys的单罐两步合成，该合成通过保护的S-(3-甲苯磺酰氧丙基)高半胱氨酸1、S-(3-溴丙基)高半胱氨酸2和S-(3-氯丙基)高半胱氨酸3前体来进行。甲苯磺酸酯的衍生物1在100℃下得到更高的放射化学收率。然而，当碳酸钾的存在下进行该放射性标记时，观察到了([18F]FPHCys)的消旋。出于此原因，使用草酸钾替代碳酸钾。最终，通过甲苯磺酸酯的前体1，在100℃下进行10分钟，随后再在100℃下进行酸水解10分钟，合成了[18F]-L-FPHCys和[18F]-D-FPHCys。在此条件下，分离得到的[18F]FPHCys的放射化学收率为衰变校正后30±5％(未经衰变校正时为20±5％)，并且在合成的65分钟时间内，放射化学纯度及对映体纯度＞98％，所述的合成时间包括HPLC纯化以及配制。因此，该单罐两步合成为使用自动化的合成制备具有高对映体纯度的氨基酸[18F]FPHCys带来了可能性，并且提供了这些对映体在临床上的成熟用途范围。
[18F]-L-FPHCys和[18F]-D-FPHCys的稳定性和对映体纯度
Figure BDA0000111432320000201
1)放射合成
[18F]-L-FPHCys和[18F]-D-FPHCys是使用GETracerlab FxFN模件，按照上述的方案合成的。所述的合成描述于前文。
在QC分析之前，[18F]-L-FPHCys和[18F]-D-FPHCys的HPLC纯化
[18F]-L-FPHCys和[18F]-D-FPHCys的纯化是在GETracerlab上进行的，使用Atlantis 250×10mm、5μm，并且使用pH为6的0.15M 5％EtOH/95％磷酸盐缓冲液以2.5mL/分钟进行洗脱，λ＝220nm。一般的色谱图显示于图5中。在15和16分钟之间收集含有标记产物[18F]FPHCys的馏分。所分离的[18F]FPHCys在碳酸钾的存在下，具有经衰变校正的47±5％的总体放射化学收率，而在草酸钾的存在下，具有经衰变矫正的30±5％的总体放射化学收率。
2)QC分析
2.1)对映体的分析
对映体分析在Chirex D Penicilamine 150×4.6mm上进行，其使用1mL/分钟的10％异丙醇/90％CuSO4aq进行洗脱，λ＝226nm。
2.1.1)[18F]-L-FPHCys
用碳酸钾(K2CO3)
首先，[18F]-L-FPHCys的放射合成在碳酸钾的存在下完成。F18的色谱图显示于图6中，并且数据显示于下表中。
在碳酸钾的存在下，观察到了[18F]-L-FPHCys的消旋。发现鉴于此标记方法中的碱性条件，([18F]-L-FPHCys/[18F]-D-FPHCys为75/25).
为了减少[18F]-L-FPHCys的消旋，使用更弱的碱草酸钾替代碳酸钾完成[18F]-L-FPHCys的放射合成。
用草酸钾(K2C2O4)
所得产物的F18的色谱图显示于图7中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000212
该产物的UV色谱图(226nm)显示于图8中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000221
在这些条件下，得到了对映体纯度超过99％的[18F]-L-FPHCys。对于[18F]-D-FPHCys的合成，使用了相同的条件。
2.1.2)[18F]-D-FPHCys
用草酸钾(K2C2O4)
所得产物的F18的色谱图显示于图9中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000222
该产物的UV色谱图(226nm)显示于图10中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000231
使用草酸钾得到的[18F]-D-FPHCys的对映体纯度为＞98％。[18F]-D-FPHCys的对映体纯度低于[18F]-L-FPHCys，是因为前体的对映体纯度。该前体是以对映体纯度＞98％的D-高半胱氨酸为起始材料合成的。
2.2)放射化学纯度和稳定性
配制剂在以下各个溶液中的[18F]-D-FPHCys和[18F]-L-FPHCys的稳定性：
1)5％EtOH/95％磷酸盐缓冲液，pH 6，0.15M(HPLC溶剂)
2)盐水
3)Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，pH 7
4)磷酸盐缓冲液，pH 7。
通过HPLC使用Gemini 150×4.6mm，5μm进行分析，以1mL/分钟，pH为11.5的0.05M 100％的磷酸盐进行洗脱，λ＝226nm。
5％Et0H/95％磷酸盐缓冲液，pH 6，0.15M
(HPLC溶液)：t＝0
产物的F18的色谱图显示于图11中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000241
产物的UV色谱图(226nm)显示于图12中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000242
5％EtOH/95％磷酸盐缓冲液，pH 6，0.15M
(HPLC溶液)：t＝4h
产物的F18的色谱图显示于图13中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000251
产物的UV色谱图(226nm)显示于图14中，并且数据显示于下表中。
QC分析显示，在各个制剂中，两种对映体均稳定，其放射化学纯度在5％EtOH/95％磷酸盐缓冲液，pH 6，0.15M(HPLC溶液)中4小时后为99.7％至99.0％。
盐水：t＝0
产物的F18的色谱图显示于图15中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000261
产物的UV色谱图(226nm)显示于图16中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000262
盐水：t＝4h
产物的F18的色谱图显示于图17中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000271
产物的UV色谱图(226nm)显示于图18中，并且数据显示于下表中。
QC分析显示，在各个制剂中，两种对映体均稳定，其放射化学纯度在盐水中4小时后为99.3％至95.2％。
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，pH＝7：t＝0
产物的F18的色谱图显示于图19中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000281
产物的UV色谱图(226nm)显示于图20中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000282
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，pH＝7：t＝4h
产物的F18的色谱图显示于图21中，并且数据显示于下表中。
产物的UV色谱图(226nm)显示于图22中，并且数据显示于下表中。
QC分析显示，在各个制剂中，两种对映体均稳定，其放射化学纯度在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，pH＝7中4小时后为99.0％至96.2％。
PBS：t＝0
产物的F18的色谱图显示于图23中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000301
产物的UV色谱图(226nm)显示于图24中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000302
PBS：t＝4h
产物的F18的色谱图显示于图25中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000311
产物的UV色谱图(226nm)显示于图26中，并且数据显示于下表中。
Figure BDA0000111432320000312
QC分析显示，在各个制剂中，两种对映体均稳定，其放射化学纯度在PBS中4小时后为98.4％至96.5％。
3)结论
在碳酸钾的存在下，合成了具有＞98％的放射纯度以及＞98％的对映体纯度的[18F]-D-FPHCys和[18F]-L-FPHCys。QC分析显示，[18F]-D-FPHCys和[18F]-L-FPHCys在不同的含水溶液中，在4h的时间内相对稳定，具有95％以上的放射化学纯度。
活性研究
方法：
细胞培养
在补加了10％胎牛血清(FBS)和2mM的L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中培养人类的A375(恶性黑色素瘤)、A431(鳞状细胞癌)、HT29(结肠直肠癌)、MCF-7(乳腺癌)、MDA-MB-231(乳腺癌)、PC-3(前列腺癌)肿瘤细胞。在补加了10％胎牛血清(FBS)、1mM的L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的RPMI-1640培养基中培养人类HS460(巨细胞肺癌)细胞系。在补加了10％FBS、2.5％马血清蛋白、1mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养MiaPaCa2人类胰腺肿瘤细胞系。在补加了10％FBS、2mM的L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的最低必须培养基中培养人类U87MG成胶质细胞瘤细胞系。将细胞置于175cm2烧瓶中并保持在5％CO2，37℃的湿润的培养箱中。将细胞常规地每7天进行传代，并且每两周更换培养基。
在研究之前一天，将细胞培养物使用不含有Ca2+和Mg2+，并含有0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液进行胰蛋白酶水解。将细胞点样于24孔培养盘中，并过夜使其附着。对于MCF-7细胞而言，点样3×105细胞，对于其他的细胞系而言，点样2.5×105个细胞。
细胞摄取研究
在研究的当天，将各个细胞系的细胞进行计数并评估存活性三次。在与放射标记的FPM进行温育之前，将细胞使用含有Ca2+和Mg2+的PBS洗涤一次，从而除去全部培养基的残余。将放射标记的FPM在含有Ca2+和Mg2+的PBS中进行配制。将500μL(～10μCi)等份的新制备的FPM加入，并且将细胞以三组在37℃下培养2、15、30、60、120、180和240分钟。使用1mL冰冷却的PBS停止示踪剂摄取之后，将细胞用500μL的0.2NNaOH溶解，并且使用γ计数器测量其活性，将结果表示为每1×105个细胞所施加剂量的百分比。
竞争性抑制试验
为了研究FPM在肿瘤细胞中的摄取的传送机制，进行了抑制剂的研究。使用了以下的氨基酸传送抑制剂：2-氨基-双环[2.2.1]-庚烷-2-羧酸(BCH)和N-甲基-α-氨基异丙酸，其分别地用于钠依赖的L类型传送系统，以及A类型氨基酸传送系统。
在研究的当天，将各个细胞系的细胞进行计数并评估存活性三次。在与放射标记的FPM进行温育之前，将细胞使用含有Ca2+和Mg2+的PBS洗涤一次，从而除去全部培养基的残余。在加入放射标记的FPM之前，在细胞中加入等份的400μL抑制剂(12.5mmol/L，在具有Ca2+和Mg2+的PBS中)或者PBS(用作对照)。加入等分的100μL(约10μCi)新制的FPM，并且将细胞三组在37℃下温育30分钟。使用1mL冰冷却的PBS停止示踪剂摄取之后，将细胞用500μL的0.2N NaOH溶解，并且使用γ计数器测量其活性，将结果表示为每1×105个细胞所施加剂量的百分比。测定了在治疗组中与对照组相比的摄取百分比。
结果：
图27和28显示了18F-氟代丙基蛋氨酸(分别地为L和D)在不同类型的肿瘤细胞中的摄取。D和L-FPM的摄取在MCF-7胸腺肿瘤细胞系中均为最高。在此细胞系中的摄取在120分钟中上升，并维持于相同水平的摄取。在所有其他的细胞系中的摄取均明显地更低。在胰腺MiaCaPa2肿瘤细胞系中的摄取在两种示踪剂的情况下，在30时达到峰值，而后下降。对于两种示踪剂而言，HT29结肠细胞系显示出最低的摄取。L-FPM的摄取在全部的细胞系中均比D-FPM为高。
图29和30显示了已知的抑制剂对18F-氟代丙基蛋氨酸(分别地为L和D)传送的抑制。在全部的细胞系中，两种示踪剂的摄取均在BCH的存在下，显著地受到抑制。在MiaPaCa2、HT29和H460细胞系中，在MeAIB的存在下，观察到了L-FPM的轻微下降(分别为对照摄取的79％、84％和70％)。在H460细胞中，D-FPM的摄取也降低到在MeAIB存在下的对照的76％。这些结果说明，D和L-FPM主要是通过钠依赖的L型传送系统进行摄取的。
活体成像
活体成像的研究在Philips AllegroTM小动物成像系统上，在小鼠中进行，所述的小鼠为左腿上植入了A431鳞状细胞癌和HT-29结肠癌异种抑制物的Balb/c裸鼠。将约100μL盐水中的400μCi的D和L18FPM经静脉注射，并在示踪剂注射后的90分钟时进行PET成像。还进行了其与FDG(氟代脱氧蔗糖)的摄取的比较。
结论
D-和L-FPM显示出高度摄取到肿瘤细胞中，尤其地在MCF-7(胸腺)、U87MG(神经胶质瘤)、MiaPaCa2(结肠)和A375(黑色素瘤)细胞系中。此外，这种高度摄取的活性可以由氨基酸传送基质BCH和MeAIB来竞争性地抑制。

Claims (30)

1.一种化合物，所述化合物是18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸或其衍生物，所述化合物具有至少约90％的对映体纯度。
2.权利要求1所述的化合物，所述化合物是在S-丙基基团上进行18F-放射标记的。
3.权利要求2所述的化合物，所述化合物是S-(3-[18F]氟代丙基)高半胱氨酸。
4.权利要求2所述的化合物，所述化合物是N-保护的S-(3-[18F]氟代丙基)高半胱氨酸。
5.权利要求2或4所述的化合物，所述化合物是C-保护成酯的。
6.权利要求1至5中任一项所述的化合物，所述化合物是D-对映体。
7.权利要求1至6中任一项所述的化合物，所述化合物具有至少约90％的放射化学纯度。
8.一种制备18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸的方法，所述方法包括：
将在S-丙基基团上具有离去基团的取代S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯在碱的存在下使用络合的18F-盐进行处理，从而形成保护的产物，所述的酯具有至少约90％的对映体纯度，并且所述碱不导致所述保护的产物的消旋；和
将所述保护的产物脱保护，从而形成18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸。
9.权利要求8所述的方法，其中所述的N-保护的酯是N-叔丁氧羰基(Boc)保护的酯。
10.权利要求8或9所述的方法，其中所述的N-保护的酯是叔丁酯。
11.权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述的离去基团位于所述的S-丙基基团的3位上。
12.权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述的取代的S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯是在所述方法的条件下，能够产生18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸的D-对映体的对映体。
13.权利要求8至12中任一项所述的方法，其中所述的离去基团是氯化物、溴化物或者甲苯磺酸酯。
14.权利要求8至13中任一项所述的方法，其中所述的碱是草酸盐。
15.权利要求14所述的方法，其中所述的碱是草酸钾。
16.权利要求8至15中任一项所述的方法，其中所述的脱保护的步骤包括将所述的保护的产物使用强酸来处理。
17.权利要求8至16中任一项所述的方法，其中所述的络合的18F-盐是穴状配体-络合的18F-盐。
18.权利要求17所述的方法，其中所述的穴状配体-络合的18F-盐是4，7，13，16，21，24-六氧-1，10-二氮双环[8.8.8]-二十六烷-络合的18F-盐。
19.权利要求8至18中任一项所述的方法，其中所述的脱保护的步骤在不分离所述的保护的产物下进行。
20.权利要求8至19中任一项所述的方法，所述方法还包括制备所述的取代S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯的步骤，所述的取代S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯在S-丙基上具有离去基团；所述步骤包括将高半胱氨酸的N-保护的酯与其上具有取代基的1-溴代丙烷进行反应。
21.权利要求20所述的方法，其中：
所述的1-溴代丙烷上的取代基是离去基团，或者
所述的1-溴代丙烷上的取代基是OH基团，并且制备在S-丙基上具有离去基团的取代S-丙基高半胱氨酸的N-保护的酯的步骤额外地包括将所述的OH进行甲苯磺酰化。
22.权利要求20或21所述的方法，所述方法包括从高半胱氨酸制备高半胱氨酸的N-保护的酯。
23.权利要求8至22中任一项所述的方法，所述方法额外地包括将所述的18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸纯化。
24.权利要求8至23中任一项所述的方法，所述方法产生对映体纯度为至少约90％的18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸。
25.权利要求8至24中任一项所述的方法，所述方法产生放射化学纯度为至少约90％的18F-放射标记的S-丙基高半胱氨酸。
26.权利要求8至25中任一项所述的方法，所述方法使用自动化合成仪来进行。
27.权利要求1至7任一项所述的化合物作为肿瘤诊断的放射示踪剂的用途。
28.权利要求1至7任一项所述的化合物在制备用于正电子成像术的组合物中的用途。
29.一种用于正电子成像术的组合物，所述组合物包含权利要求1至7任一项所述的化合物和临床上可接受的载体。
30.权利要求29所述的组合物，其中所述载体是含水的。
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