CN102439160A - 产生甲烷的改进方法 - Google Patents

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CN102439160A CN2010800204140A CN201080020414A CN102439160A CN 102439160 A CN102439160 A CN 102439160A CN 2010800204140 A CN2010800204140 A CN 2010800204140A CN 201080020414 A CN201080020414 A CN 201080020414A CN 102439160 A CN102439160 A CN 102439160A
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D.莱因
A.P.简森
S.波尔-古德
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Abstract

披露了含木质纤维素纤维的材料的处理方法。更具体地，所述处理可增加后续微生物或生物方法对于木质纤维素纤维的利用能力。

Description

产生甲烷的改进方法
生物材料保藏的引用
本申请包含对生物材料保藏的引用，所述保藏物通过提述并入本文。完整信息请见本文末页。
发明领域
本发明涉及包含木质纤维素纤维的材料的处理方法，所述处理可增加木质纤维素纤维的可降解能力。具体地，本发明涉及由肥料(manure)，优选来自牲畜的肥料产生甲烷，其中与未处理的肥料相比，使用本发明的处理方法可增加甲烷的生产。
发明背景
大多数基于天然植物的材料都包含大量的木质纤维素纤维，其在很多生物系统中不可消化或者只能缓慢消化。这导致对于很多转化基于植物的材料的生物过程而言，在处理过程中，大部分经处理的材料不可消化或者只能进行低水平的消化。
例如在常用的沼气(biogas)生产中，在厌氧条件下发酵植物肥料，形成沼气和废料，所述废料在很大程度上由木质纤维素纤维组成，其在厌氧沼气过程的条件下几乎不消化。
在集中的动物生产的地区，肥料经常引起环境问题。这些包括臭味形成，水道污染和产生贫瘠土地。随着世界范围动物生产持续增加，其对环境的影响也越来越大。同时，肥料是主要的未开采的可再生能源，具体为沼气如甲烷的生产。
由肥料产生沼气是项古老的技术，现在的生产设备从简单的带盖水塘到具有可控过程参数的复杂工业工厂。由于原始肥料(尿和粪的组合)的低能量强度，以及建立沼气工厂需要的相对较大的资本支出，现在的基于工业肥料的工厂具有低的投资回报率(ROI)。这种技术的用途通常较为有限，除非沼气或电力生产是得到补贴的(例如在德国)。由于肥料中存在的木质纤维素的低转化率(目前对于奶牛肥料，实现多至约50％的理论甲烷生产潜力)，通常加入高能材料来获得更多的沼气。这种材料包括高能玉米或食品加工废料。然而，据估计高能废料的有限利用度和成本会将沼气提取的应用限制到仅为可用肥料的5％。
有益的是提供增强由包含木质纤维素纤维的材料(如来自奶牛或其它牲畜的肥料)生产甲烷的方法。此技术能促进肥料管理实践的全球转变，并将环境问题转变成可获利并且对环境有益的解决方案。
发明简述
在第一个方面，本发明涉及包含木质纤维素纤维的材料的处理方法，所述方法包括步骤：
a.提供包含木质纤维素纤维的材料；
b.用一种或多种微生物接种来自步骤a的材料；
c.在需氧条件下培育所述材料。
根据这个方面的方法可增加木质纤维素纤维的可降解能力，使其更容易进行后续的微生物或生物过程，如沼气生产过程，导致比本来有可能但未进行本发明处理时更高的得率(yield)。
在一个优选实施方案中，本发明涉及从包含木质纤维素纤维的材料(优选肥料)产生甲烷的方法，所述方法进一步包括：
a.提供包含木质纤维素纤维的材料；
1.对来自步骤a的材料进行第一厌氧发酵，产生第一量的甲烷；
2.在步骤1之后，任选地分离包含纤维的级分；
b.用一种或多种微生物接种步骤1或2的材料；
c.在需氧条件下培育来自步骤b的接种的材料；和
d.对步骤c中获得的材料进行第二厌氧发酵，产生第二量的甲烷。
与通常仅包含第一厌氧发酵步骤的传统沼气方法相比，根据这个实施方案的方法提供更高的甲烷得率。因此，根据本发明，基于相同量的起始材料可以产生显著更高量的沼气。
在第二个方面，本发明涉及选择能消化木质纤维素纤维级分的微生物或两种或多种所述微生物的混合物的方法，所述方法包括步骤：
i)提供包含木质纤维素纤维的材料；
ii)在需氧条件下，用候选微生物或两种或多种微生物的混合物接种步骤i中提供的包含木质纤维素纤维的材料；
iii)分析步骤ii中获得的纤维级分，以确定是否有部分木质纤维素纤维可以进行处理(have been made accessible by the treatment)。
在这个方面，包含木质纤维素纤维的材料优选来自肥料，所述肥料已通过提供包含木质纤维素的级分的分级方法进行厌氧发酵用于产生沼气。
在第三个方面，本发明提供选择适合于本发明的方法的微生物的便利方法。
在第四个方面，本发明提供微生物或微生物的混合物，其特别适合于根据本发明的方法。
在第五个方面，本发明涉及根据所述方法中第四方面的微生物或两种或多种微生物的用途。
附图简述
图1.甲烷校准曲线，浓度为1x10-7至3.8x10-6mol CH4，其包括括号中的由样本获得的甲烷浓度的标准物(includes standards bracketing the methaneconcentrations obtained in the samples)。
图2.处理3天(图2a)、7天(图2b)和14天(图2c)的纤维的甲烷产生曲线(实施例1)。包括来自仅用水处理的纤维的甲烷水平作为参照。
图3.处理9天(图3a)和15天(图3b)的纤维的甲烷产生曲线(实施例2)。包括来自仅用水处理15天的纤维的甲烷水平作为参照。
图4.甲烷产生曲线，显示在纤维需氧处理28天的过程中加入的微生物产物的剂量对于甲烷生产的影响(实施例3)。包括来自仅用水处理的纤维的甲烷水平作为参照。
发明详述
描述：
根据本发明，术语“沼气”意指使用肥料在传统厌氧发酵罐中获得的气体。沼气的主要成分是甲烷，并且在本申请中术语“沼气”和“甲烷”可互换使用。
在本申请中，术语“初级消化器”意指发生第一厌氧发酵的容器。
在本申请中，术语“二级消化器”意指发生第二厌氧发酵的容器。根据沼气设施的具体配置，初级消化器也可用作二级消化器。
在根据本发明的第一个方面的处理方法中，通常在容器中提供所述材料，然而本发明的处理可以无容器进行，例如在堆中(in a pile)进行。
包含木质纤维素纤维的材料可以是任何已处理或未处理的植物材料以及包含这种植物材料的任何组合物。
可以处理或不处理植物材料。在本申请中，已处理植物材料意指植物材料的任何适当处理，例如可以使用适当技术如剁碎(mince)、截砍(chop)或切割(cut)而破碎植物材料；或者使用例如蒸汽处理或煮沸等进行加热。
根据本发明的包含木质纤维素纤维的材料可以是任何包含木质纤维素纤维的材料。这种材料的实例包括，但不限于，木材，稻草，干草，草，青贮，如谷类青贮、玉米青贮、草青贮；甘蔗渣和肥料，如来自牲畜例如家畜或牛(cattle)、牛或奶牛(cow)、家禽、猪、羊和马的肥料。优选的包含木质纤维素纤维的材料是肥料，优选来自家畜的肥料，最优选来自奶牛的肥料。
干草和稻草包含近90％w/w的木质纤维素。在家畜肥料中，木质纤维素纤维(粗纤维)占总固体的40-50％。木质纤维素纤维由碳水化合物的核心组成，特别是纤维素和半纤维素，其占纤维结构的63-78％。纤维素和半纤维素由木质素包裹并支撑，所述木质素占木质纤维素结构的15-38％。比较各种产奶家畜/奶牛和猪肥料的组成的研究显示，平均来说家畜/牛肥料包含：VFA(挥发性脂肪酸)(36g/kg VS)，蛋白质(150g/kg VS)，脂肪(69g/kg VS)，可降解碳水化合物(434g/kg VS)，不可降解碳水化合物(191g/kg VS)，木质素(121g/kgVS)，和粗纤维(270g/kg VS)。猪肥料平均包含：VFA(30g/kg VS)，蛋白质(202g/kg VS)，脂肪(163g/kg VS)，可降解碳水化合物(390g/kg VS)，不可降解碳水化合物(148g/kg VS)，木质素(68g/kg VS)，和粗纤维(171g/kg VS)。
在本申请中，术语木质纤维素纤维意指以任何形式、数量和比例包含木质纤维素、木质素和/或纤维素的任何植物材料。木质纤维素纤维可以进一步包含其它植物来源的组分如淀粉，葡聚糖，阿拉伯聚糖，半乳聚糖，果胶，甘露聚糖，半乳甘露聚糖和半纤维素如木聚糖。
根据本发明的微生物可以选自细菌，酵母或真菌，或者它们的混合物。根据本发明的微生物或两种或多种微生物的混合物具有在根据本发明的第一方面的第二厌氧发酵步骤中提供高甲烷产生量的益处。因此，在根据本发明的方法中使用根据本发明的微生物提供了令人惊讶的高甲烷产生。根据本发明的微生物的优选实例包括如下属菌株：芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)和曲霉属(Aspergillus)，如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、溶解肠杆菌(Enterobacter dissolvens)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、南极假单胞菌(Pseudomonas Antarctica)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)，或者其两种或更多种的任意组合。
特别优选的菌株包括：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136)，蒙氏假单胞菌(NRRLB-50256)，溶解肠杆菌(NRRL B-50257)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50258)，变形假单胞菌(ATCC 31483)，恶臭假单胞菌(NRRL B-50247)，变形假单胞菌(NRRLB-50248)，嗜吡啶红球菌(NRRL 50249)，恶臭假单胞菌(ATCC 49451)，门多萨假单胞菌(ATCC 53757)，鲍曼不动杆菌(NRRL B-50254)，短小芽孢杆菌(NRRLB-50255)，地衣芽孢杆菌(NRRL B-50141)，解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50151)，解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50019)，门多萨假单胞菌(ATCC 53757)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50250)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50251)，蒙氏假单胞菌(NRRLB-50252)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50253)，南极假单胞菌(NRRL B-50259)，解淀粉芽孢杆菌(ATCC 55405)，黑曲霉(NRRL 50245)，和米曲霉(NRRL 50246)。
技术人员理解在根据本发明的用途中如何使用公知技术确定这些优选菌株的合适的量。在优选的实施方案中，以1.0x106至5.0x109CFU/g的量加入菌株。
作为特别优选的微生物或两种或多种微生物的混合物的实例可提及：
-混合物，其包含：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136；1.1x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50256；0.6x109CFU/g)，溶解肠杆菌(NRRL B-50257；0.6x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50258；0.8x109CFU/g)，荧光假单胞菌(ATCC31483；0.8x109CFU/g)，恶臭假单胞菌(NRRL B-50247；0.4x109CFU/g)，变形假单胞菌(NRRL B-50248；0.4x109CFU/g)，嗜吡啶红球菌(NRRL 50249；0.8x109CFU/g)，恶臭假单胞菌(ATCC 49451；0.4x109CFU/g)，门多萨假单胞菌(ATCC53757；0.8x109CFU/g)，和鲍曼不动杆菌(NRRL B-50254；0.2x109CFU/g)；
-混合物，其包含：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136；1.6x109CFU/g)，短小芽孢杆菌(NRRL B-50255；0.2x109CFU/g)，解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50141；0.2x109CFU/g)，解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50151；0.2x109CFU/g)，解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50019；0.2x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50256；0.2x109CFU/g)，溶解肠杆菌(NRRL B-50257；0.3x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRLB-50258；0.8x109CFU/g)，变形假单胞菌(ATCC 31483；0.7x109CFU/g)，恶臭假单胞菌(NRRL B-50247；0.2x109CFU/g)，变形假单胞菌(NRRL B-50248；0.2x109CFU/g)，嗜吡啶红球菌(NRRL 50249；0.3x109CFU/g)，恶臭假单胞菌(ATCC 49451；0.2x109CFU/g)，门多萨假单胞菌(ATCC 53757；0.3x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50250；0.1x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50251；0.1x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50252；0.1x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50253；0.1x109CFU/g)，和南极假单胞菌(NRRL B-50259；0.2x109CFU/g)；和
-混合物，其包含：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136；3.5x109CFU/g)，解淀粉芽孢杆菌(ATCC 55405；1.0x109CFU/g)，南极假单胞菌(NRRL B-50259；0.2x109CFU/g)，黑曲霉(NRRL 50245；0.8x109CFU/g)，和米曲霉(NRRL 50246；0.8x109CFU/g)。
此外，根据下述商品名由Novozymes Biological Inc.商业上可得到的微生物或两种或多种微生物的混合物也根据本发明的第三方面适用：BI-CHEMABR-Hydrocarbon，BI-CHEM DC 1008 CB和Manure Degrader。
需氧条件下的培育可以以分批过程、补料分批过程或连续过程进行。在分批过程中，装入容器，加入微生物的适当接种物并进行所需时间的所述过程。在补料分批过程中，向容器中加入初始体积的包含木质纤维素纤维的材料，通常为容器总操作体积的25-75％，加入微生物的适当接种物并进行过程直至达到一定的转化率/细胞密度，此时以适当速率加入包含木质纤维素纤维的材料形式的额外补料，并继续进行过程直至容器已满并任选地，在不加入额外补料的情况下继续进行一段时间。在连续过程中，通过向容器中加入包含木质纤维素纤维的材料而开始所述过程，并加入微生物的适当接种物，当达到所需的细胞密度时，去除容器中的组合物液体并同时向容器中加入包含木质纤维素的材料液体，使体积保持基本恒定并且该过程原则上尽可能长时间地继续进行。甚至可能使用这些技术的组合。这些技术在本领域已知，并且技术人员了解如何根据容器的具体维度和性质为具体过程找到合适的参数。
通气的手段在本领域中公知，并且技术人员能够为本发明选择合适的通气手段。通常通过向将空气吹过组合物而进行通气，通常通过位于容器下部的一个或多个管路或管道进行，所述一个或多个管路或管道上设有规则间隔的洞，以提供空气在组合物中均匀分布。根据本发明也可以使用其它通气手段。
选择需氧发酵步骤中的通气速率，为微生物提供便利的生长速率。可以以体积空气每体积发酵每分钟(v/v/m)测量通气速率，并且通常在0.01v/v/m至10v/v/m范围中的通气是适当的，优选0.05v/v/m至5v/v/m，更优选0.1v/v/m至2v/v/m，更优选0.15v/v/m至1.5v/v/m并且最优选0.2v/v/m至1v/v/m。
在考虑下述情况时可决定这个步骤的持续时间：在一方面，需氧条件下的培育应该持续足够长的时间，从而使相当部分的木质纤维素溶解，可以进行后续的微生物或生物过程；在另一方面，需氧步骤不应进行太长时间而消耗(combust)了大部分纤维级分。通常地，需氧步骤持续5至30天，优选7至25天，更优选10至20天，并且最优选约15天。已经发现，使用这样的培育时间可将适当高部分的木质纤维素纤维转化成可在后续微生物或生物过程中转化的形式。
应在考虑根据本发明实验的微生物或两种或多种微生物的混合物的具体要求的情况下选择这个步骤中的温度。通常地，在10℃至60℃的范围内，优选在15℃至50℃的范围内，更优选在20℃至45℃的范围内，甚至更优选在25℃至40℃的范围内选择所述温度，并且最优选约35℃。
根据本发明的方法可增加木质纤维素纤维的可降解能力，使其更容易进行后续的微生物或生物过程，如沼气生产过程，导致比未使用本发明的方法时可能获得的更高的得率。
需氧条件下的培育持续至木质纤维素纤维的可降解能力已经增加到令人满意的程度，从而相当部分的木质纤维素纤维容易进行后续的微生物或生物过程。
当根据本发明，木质纤维素纤维容易处理时，可处理的纤维或其部分将可以进行后续的微生物或生物过程，表示可处理的纤维或其部分可以在后续的微生物或生物过程中转化。因此，通过下述可以确定木质纤维素的可处理能力(accessibility)是否通过本发明的方法来增加：对根据本发明处理的材料进行后续的微生物或生物过程，并比较所述后续微生物或生物过程的得率与使用包含木质纤维素纤维相同的材料但未使用本发明方法的相应后续微生物或生物过程的得率。
以沼气形成作为后续微生物或生物过程的实例，可以确定根据本发明的处理方法是否增加了包含木质纤维素纤维的材料的可处理能力，包含木质纤维素纤维的材料可以使用本发明的方法处理，然后进行通常的厌氧沼气形成过程，确定根据本发明处理的包含木质纤维素纤维的材料的沼气得率，并与相同的沼气形成过程但未使用本发明方法的得率相比较。如果使用本发明的方法时沼气得率较高，根据本发明，木质纤维素纤维的可处理能力提高。
另一个确定木质纤维素纤维的可处理能力是否增加的方法是在进行本发明的方法后确定可溶碳水化合物的量，例如，如实验方法部分1-3中所示。技术人员了解使用不同的后续微生物或生物方法能够用不同的方法确定根据本发明所增加的可处理能力。
根据本发明的方法可以与任何后续微生物或生物过程联合使用，在所述过程中理想地可实现包含木质纤维素纤维的更高程度的利用(increasedutilisation)。本发明可以用于但不限于下述微生物或生物过程：沼气形成和牲畜饲料。
在一个实施方案中，本发明的方法涉及甲烷的生产。在这个实施方案中，甲烷的生产可以以两步骤过程进行，所述过程包含根据本发明的方法，之后进行沼气生产过程，其原则上可以是本领域已知的任何用于沼气形成的过程。
在另一个实施方案中，甲烷的生产可以以下述过程进行，所述过程包括第一沼气形成过程，之后是根据本发明的方法，然后是第二沼气形成过程。
在另一个实施方案中，包含木质纤维素纤维的材料优选为肥料如任何牲畜产生的肥料。典型地，肥料来自家畜/牛、猪、马、绵羊、鸡或山羊，其中优选来自家畜/牛的肥料，特别是来自产奶家畜/奶牛的肥料。
参照肥料进一步解释这个实施方案，然而，应理解的是，其不限于肥料。
方法中的第一厌氧发酵对应于生产沼气的肥料传统发酵。因此这个步骤原则上可以实验本领域已知的用于发酵肥料产生沼气的技术进行。第一厌氧发酵步骤如本领域已知在适当的容器中发生。
在这个步骤中使用已知技术进行发酵直至沼气产生减慢到不可接受的较慢速率。技术人员能够选择所述发酵的合适终止点。
也可以使用本领域已知的用于分离具有流变性质的组合物的技术进行包含纤维的级分的分离，所述组合物与沼气发酵过程留下的已发酵的肥料相似。这些分离技术在本领域中已知，并且为分离过程选择适当参数在普通技术人员的技术范围内。
需氧发酵后，使用原则上与第一厌氧发酵相同的过程将已发酵肥料进行厌氧发酵，并且在这个步骤中产生更多的沼气。
这第二厌氧发酵原则上在与需氧发酵发生的相同容器中发生，通过简单的停止通气和加入适当量接种物而进行发酵。
可替换地，具体对于连续过程，需氧发酵后的肥料转移至另一个容器中进行第二厌氧发酵。这个容器可以是发生第一厌氧发酵的相同的容器，或者可以是单独的容器。
过程获得的甲烷的量依赖于肥料的组成，所述肥料的组成又依赖于肥料来源的动物，所述动物的饲料等；但是典型地，在第一厌氧发酵中可获得约225ml CH4/g VS的甲烷量。第二厌氧发酵罐通常提供第一厌氧发酵中获得的沼气量的至少10％，优选至少25％，更优选至少30％，更优选至少35％，更优选至少40％，更优选至少45％，甚至更优选至少50％，最优选至少55％和在一个特别优选的实施方案中为至少60％。
在本发明的第二方面提供选择适于增强第一厌氧发酵中纤维级分的甲烷产生潜力的微生物或两种或多种微生物的混合物的方法。
用于本发明这个方面的纤维级分原则上可以以与根据本发明第一方面的方法中提供的纤维级分相似的方法制备。然而，本发明的第一方面涉及大规模(生产规模)进行的方法，通常为几个m3，而本发明的第二方面通常以小得多的规模进行，比如通常在实验室实验的规模，比如几g或kg的数量级。
当提供纤维级分时，将候选微生物或两种或多种微生物的混合物与纤维级分的等分试样一起温育，通常为几克，然而用于此步骤的实际量对于本发明不是重要的。此外，可以加入营养物、盐、维生素和支持候选微生物或两种或多种微生物的混合物生长的其他生长因子。
候选微生物或两种或多种微生物的混合物与纤维级分的温育通常进行5至30天，优选7至25天，更优选10至20天，并且最优选约15天。
实施例
实验方法
1.来自初级消化器的纤维的需氧处理
在400-ml烧杯中，将50g纤维与70ml去离子水和5ml微生物聚生体(consortium)组合至终浓度为～5x105cfu/ml。在纤维中将水和微生物聚生体彻底混合。每个烧杯上覆盖蒸汽纸以允许气体交换，并将它们在每次实验开始时称重。加盖的烧杯在30℃温育长达2周。定期地，重新称重烧杯，并将蒸发损失的水加回。
2.厌氧甲烷生产能力
在需氧处理后，将每种条件下的4g处理后的纤维转移至单独的500ml棕色瓶(amber bottle)中。对于每个棕色瓶，加入200ml厌氧消化接种物，并且用N2气注满顶部空间。使用前，将新鲜的厌氧可消化接种物在52℃温育至少2周，去除残余的甲烷生产潜力并降低背景甲烷产生。给瓶子加塞并密封，防止气体损失并保持厌氧状态。每个处理的两个瓶子和相关对照在52℃温育28天。定期使用锁定的1-ml气体密封注射器从顶部空间取样，转移至气封GC小瓶中，并使用气相色谱分析甲烷含量。
3.气相色谱(GC)方法
使用配有火焰离子化检测器(GC-FID)和SupeIQPLOT 30m x 0.53m柱(Supelco)的Shimadzu GC-2010气相色谱测量甲烷。使用流速为30ml/min的He载气，而且进样口、炉和检测器温度分别为100℃、35℃和235℃，甲烷峰的保留时间为2.7±0.2分钟。通过注射从49％甲烷标准品制备的不同浓度甲烷产生校准曲线。
4.微生物聚生体简述
聚生体1包含：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136；1.1x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50256；0.6x109CFU/g)，溶解肠杆菌(NRRL B-50257；0.6x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50258；0.8x109CFU/g)，变形假单胞菌(ATCC31483；0.8x109CFU/g)，恶臭假单胞菌(NRRL B-50247；0.4x109CFU/g)，变形假单胞菌(NRRL B-50248；0.4x109CFU/g)，嗜吡啶红球菌(NRRL 50249；0.8x109CFU/g)，恶臭假单胞菌(ATCC 49451；0.4x109CFU/g)，门多萨假单胞菌(ATCC53757；0.8x109CFU/g)，和鲍曼不动杆菌(NRRL B-50254；0.2x109CFU/g)。
聚生体2包含：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136；1.6x109CFU/g)，短小芽孢杆菌(NRRL B-50255；0.2x109CFU/g)，地衣芽孢杆菌(NRRL B-50141；0.2x109CFU/g)，解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50151；0.2x109CFU/g)，解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50019；0.2x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50256；0.2x109CFU/g)，溶解肠杆菌(NRRL B-50257；0.3x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50258；0.8x109CFU/g)，变形假单胞菌(ATCC 31483；0.7x109CFU/g)，恶臭假单胞菌(NRRL B-50247；0.2x109CFU/g)，变形假单胞菌(NRRL B-50248；0.2x109CFU/g)，嗜吡啶红球菌(NRRL 50249；0.3x109CFU/g)，恶臭假单胞菌(ATCC 49451；0.2x109CFU/g)，门多萨假单胞菌(ATCC 53757；0.3x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50250；0.1x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50251；0.1x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50252；0.1x109CFU/g)，蒙氏假单胞菌(NRRL B-50253；0.1x109CFU/g)，和南极假单胞菌(NRRL B-50259；0.2x109CFU/g)。
聚生体3包含：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136；3.5x109CFU/g)，解淀粉芽孢杆菌(ATCC 55405；1.0x109CFU/g)，南极假单胞菌(NRRL B-50259；0.2x109CFU/g)，黑曲霉(NRRL 50245；0.8x109CFU/g)，和米曲霉(NRRL 50246；0.8x109CFU/g)。
实施例1.
通过测量分批类型厌氧消化器中在需氧微生物处理后获得的额外甲烷的量，可以评价来自初始厌氧处理中残余纤维的成功的微生物转化。用选出的微生物菌株进行纤维的这种需氧处理称作“需氧处理”或“处理”。
首先，产生标准校准曲线，其使用从1x10-7至3.8x10-6mol CH4的甲烷浓度，其在括号中表示典型样品中获得的甲烷浓度(图1)。获得的直线的R2值为0.9983。
在这第一个实施方案中，用一种上述微生物聚生体(1、2或3)将来自厌氧消化过程的残余纤维在30℃处理3、7或14天。向所述厌氧消化瓶加入来自所有处理样品的纤维。在指定时间将来自微生物处理样品和对照的甲烷产生定量，如上所述。将这一结果与仅用水处理的纤维产生的甲烷相比较。水的加入并未显著增加甲烷生产。
用三种不同微生物聚生体(1、2和3)处理的纤维导致在28天厌氧温育期过程中产生的甲烷增加(图2)。在用微生物产物处理3天时，观察到15-16.2mlCH4/g VS的甲烷产生。对于每种纤维处理，评价三个单独的需氧瓶以提供给出的标准偏差。使用更长的温育时间获得甲烷产生量的持续增加，在后处理2周的纤维中观察到获得的最大甲烷产生量。
用三种微生物聚生体(1、2和3)处理的纤维中的总体甲烷产生量在需氧后处理14天后比水处理的纤维对照高80至100ml额外CH4/g VS。
实施例2.
完成第二个研究以确认微生物聚生体的活性，现在评价9天和15天需氧处理的效果。结果(图3)确认了聚生体1、2和3从已处理纤维增强甲烷回收率的能力。使用的所有方法如实施例1中所述。在需氧堆肥15天后实现实施例2中最大的甲烷产生量。
实施例3.
在这个实验中研究了在纤维需氧处理过程中加入的微生物产物的剂量对于甲烷生产的影响。如上所述在30℃进行两周的纤维需氧处理，但是以5*104，5*105和5*106cfu/ml的剂量加入如上所述的聚生体1，聚生体2和聚生体3的微生物产物。需氧处理后，对4g微生物处理的纤维分析其厌氧甲烷产生潜力。在52℃温育1、2、3和4周后测量甲烷产生量。在阴性对照(未加入微生物的实验)中，甲烷产生量小于5ml/g VS。
这个实验的结果如图4所示。曲线显示四周过程中获得的最高甲烷生产量。结果显示随着微生物的剂量在104至106CFU/ml范围内增加，甲烷产生潜力增加。
实施例4.
在这个实验中在两个独立实验室进行微生物处理。在实验室之间交换处理后的纤维。在30℃进行两周的纤维需氧处理，加入5*105cfu/ml如上所述的聚生体1的三种不同微生物产物变体。在两个实验室中测试相同的微生物产物，并且测试的纤维相同。
需氧处理后，对4g纤维分析其厌氧甲烷产生潜力。在52℃温育1、2、3和4周后测量甲烷产生量。两个独立的实验室在开始测定厌氧甲烷产生潜力之前使用在52℃预培养2-3周的厌氧接种物。厌氧接种物来自两个不同并且完全独立的沼气装置。实验室1使用的接种物来自位于美国的工厂，实验室2的接种物来自丹麦沼气工厂。还包括了用于测量来自每个厌氧沼渣(digestate)源的内在背景甲烷产生潜力(inherent background methane potential)的阴性对照。
表1显示这个实验的结果。这些结果显示在两个实验室进行的所有微生物需氧处理都显著增加甲烷的生产。然而，仅在实验室1中进行的厌氧甲烷产生潜力研究中观察到了高于阴性对照的显著的CH4增强。在实验室2中使用的厌氧沼渣源中测试的所有样品(包括阴性对照)中都产生更高量的甲烷，这显示来自沼渣的内在背景甲烷产生潜力显著高于实验室1中使用的厌氧沼渣的相关潜力。这些结果显示依赖于厌氧系统的效率、底物源、加入厌氧消化器之前底物的处理和其它另外的加工，需氧微生物处理可能具有限制。
表1.两个独立实验室进行的实验中的甲烷产生量每克挥发性固体(VS)。对于实验室1/实验室1列的结果，需氧处理和厌氧甲烷产生潜力均在实验室1进行。对于实验室2/实验室1列的结果，需氧处理在实验室2进行，而厌氧甲烷产生潜力在实验室1评价。对于实验室2/实验室2，全部实验在实验室2进行。对于实验室1/实验室2，需氧处理在实验室1进行，而厌氧甲烷产生潜力在实验室2确定。
Figure BDA0000106881920000131
实施例5.
在这个实验中，评价微生物处理对于由不同来源获得的厌氧沼渣的效果。两个样品来自在嗜温条件(37℃)下运行的厌氧消化器，另外两个来自嗜热(52℃)厌氧消化器，但是所有厌氧系统用于在美国消化奶牛肥料。在30℃用两个聚生体(初始(接种)率为5*105cfu/ml)需氧微生物处理2周后，分析4g处理后纤维在四个不同厌氧沼渣样品中各自的甲烷产生潜力。从嗜温条件获得的样品在37℃温育6周，并且来自嗜热厌氧消化器的样品在52℃温育4周。
表2中所示数据显示与嗜热厌氧沼渣样品中的阴性对照相比，两种微生物聚生体获得相似的甲烷增强(嗜热1和2)。在一个嗜温样品(嗜温1)中还观察到比阴性对照高出更多的甲烷增强，但是在另一个嗜温样品(嗜温2)中没有观察到显著增强。本研究显示这种需氧微生物处理能在两种类型的厌氧消化系统(嗜温和嗜热)中起作用。基于一个嗜温沼渣样品中没有观察到增强，底物中的差异可能限制微生物处理，即使所有底物都来自产奶家畜/奶牛肥料。
表2.用来自两个嗜热和两个嗜温系统消化产奶家畜/奶牛肥料的厌氧沼渣进行的实验中的甲烷产生每克挥发性固体(VS)。结果表示为由厌氧温育的微生物处理纤维产生的总ml CH4每g VS。嗜热样品在52℃温育4周，而嗜温样品在37℃温育6周。
生物材料的保藏
下述生物材料已经按照布达佩斯条约的规定保藏于Agricultural ResearchService Patent Culture Collection(NRRL)，Northern Regional Research Center，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，USA，并给出下述登录号：
Figure BDA0000106881920000151
所述菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，依据该外国专利法律的授权的人能够获得所述培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律可以获得所述保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。

Claims (14)

1.包含木质纤维素纤维的材料的处理方法，所述方法包括步骤：
a.提供包含木质纤维素纤维的材料；
b.用一种或多种微生物接种来自步骤a的材料；和
c.在需氧条件下培育所述材料。
2.根据权利要求1的方法，其中所述包含木质纤维素纤维的材料选自下组：玉米青贮、草青贮、甘蔗渣和肥料。
3.根据权利要求2的方法，其中所述肥料选自牛、家禽、猪或其它牲畜的肥料。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述一种或多种微生物选自下组：芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)和曲霉属(Aspergillus)，如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、溶解肠杆菌(Enterobacter dissolvens)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)、南极假单胞菌(Pseudomonas Antarctica)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)，或者其两种或更多种的任意组合。
5.根据权利要求4的方法，其中每种菌株以1.0x106-5.0x109CFU/g的量加入。
6.根据权利要求1的方法，其进一步包括在步骤c后进行的厌氧发酵用于产生沼气。
7.根据权利要求6的方法，其进一步包含在步骤b前进行的厌氧发酵用于产生沼气。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中步骤c中在需氧条件下的培育进行预定的时间或者直到实现包含木质纤维素纤维的材料的所需程度的降解。
9.用于由包含木质纤维素纤维的材料产生甲烷的方法，所述方法包括：
(a)提供包含木质纤维素纤维的材料；
(1)对来自步骤a的材料进行第一厌氧发酵，产生第一量的甲烷；
(2)在步骤1之后，任选地分离包含纤维的级分；
(b)用一种或多种微生物接种步骤1或2的材料；
(c)在需氧条件下培育来自步骤b的接种的材料；和
(d)对步骤c中获得的材料进行第二厌氧发酵，产生第二量的甲烷。
10.根据权利要求9的方法，其中所述包含木质纤维素纤维的材料来自已进行过沼气生产方法的肥料，所述方法包括提供包含木质纤维素纤维的级分的分级方法。
11.能增强木质纤维素纤维级分产甲烷能力的微生物或者两种或多种微生物的混合物，所述微生物选自下组：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136)、蒙氏假单胞菌(NRRL B-50256)、溶解肠杆菌(NRRL B-50257)、蒙氏假单胞菌(NRRLB-50258)、变形假单胞菌(ATCC 31483)、恶臭假单胞菌(NRRL B-50247)、变形假单胞菌(NRRL B-50248)、嗜吡啶红球菌(NRRL 50249)、恶臭假单胞菌(ATCC 49451)、蒙氏假单胞菌(ATCC 53757)、鲍曼不动杆菌(NRRL B-50254)、短小芽孢杆菌(NRRL B-50255)、地衣芽孢杆菌(NRRL B-50141)、解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50151)、解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50019)、门多萨假单胞菌(ATCC 53757)、蒙氏假单胞菌(NRRL B-50250)、蒙氏假单胞菌(NRRLB-50251)、蒙氏假单胞菌(NRRL B-50252)、蒙氏假单胞菌(NRRL B-50253)、南极假单胞菌(NRRL B-50259)、解淀粉芽孢杆菌(ATCC 55405)、黑曲霉(NRRL50245)，和米曲霉(NRRL 50246)，或者它们的任意组合。
12.根据权利要求11的微生物或微生物的混合物，其中每种微生物以1.0x106-5.0x109CFU/g的量存在。
13.根据权利要求12的微生物的混合物，其中所述混合物为：
(a)微生物混合物，其包含枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136；1.1x109CFU/g)、蒙氏假单胞菌(NRRL B-50256；0.6x109CFU/g)、溶解肠杆菌(NRRL B-50257；0.6x109CFU/g)、蒙氏假单胞菌(NRRL B-50258；0.8x109CFU/g)、荧光假单胞菌(ATCC 31483；0.8x109CFU/g)、恶臭假单胞菌(NRRL B-50247；0.4x109CFU/g)、变形假单胞菌(NRRL B-50248；0.4x109CFU/g)、嗜吡啶红球菌(NRRL50249；0.8x109CFU/g)、恶臭假单胞菌(ATCC 49451；0.4x109CFU/g)、门多萨假单胞菌(ATCC 53757；0.8x109CFU/g)，和鲍曼不动杆菌(NRRL B-50254；0.2x109CFU/g)；
(b)微生物混合物，其包含：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136；1.6x109CFU/g)、短小芽孢杆菌(NRRL B-50255；0.2x109CFU/g)、地衣芽孢杆菌(NRRLB-50017；0.2x109CFU/g)、解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50151；0.2x109CFU/g)、解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50019；0.2x109CFU/g)、蒙氏假单胞菌(NRRLB-50256；0.2x109CFU/g)、溶解肠杆菌(NRRL B-50257；0.3x109CFU/g)、蒙氏假单胞菌(NRRL B-50258；0.8x109CFU/g)、变形假单胞菌(ATCC 31483；0.7x109CFU/g)、恶臭假单胞菌(NRRL B-50247；0.2x109CFU/g)、变形假单胞菌(NRRL B-50248；0.2x109CFU/g)、嗜吡啶红球菌(NRRL 50249；0.3x109CFU/g)、恶臭假单胞菌(ATCC 49451；0.2x109CFU/g)、门多萨假单胞菌(ATCC53757；0.3x109CFU/g)、蒙氏假单胞菌(NRRL B-50250；0.1x109CFU/g)、蒙氏假单胞菌(NRRL B-50251；0.1x109CFU/g)、蒙氏假单胞菌(NRRL B-50252；0.1x109CFU/g)、蒙氏假单胞菌(NRRL B-50253；0.1x109CFU/g)和南极假单胞菌(NRRL B-50259；0.2x109CFU/g)；
(c)微生物混合物，其包含：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136；3.5x109CFU/g)、解淀粉芽孢杆菌(ATCC 55405；1.0x109CFU/g)、南极假单胞菌(NRRLB-50259；0.2x109CFU/g)、黑曲霉(NRRL 50245；0.8x109CFU/g)和米曲霉(NRRL 50246；0.8x109CFU/g)；或
(d)以下述商品名销售的商业上可得到的产品中的微生物混合物：BI-CHEM ABR-Hydrocarbon，BI-CHEM DC 1008CB和Manure Degrader。
14.根据权利要求1-10中的微生物或两种或多种微生物的混合物的用途。
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