CN102439155A - 营养缺陷型重组体巴斯德bcg菌株及其在抗寄生虫导致的人体感染中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组体BCG牛结核杆菌的疫苗菌株,该菌株表达曼氏血吸虫Sm14蛋白(巴斯德BCGΔleuD/pΔK410-hsp60*-Sm14)。本发明的疫苗菌株是用来控制由寄生虫,特别是曼氏血吸虫所引起的感染。所述疫苗菌株是一种来源于巴斯德BCG亚-菌株在遗传转化后补充到亮氨酸的营养缺陷型菌株到亮氨酸的氨基酸其构造为pΔK410-hsp60*-Sm14。本发明显示了巴斯德BCGΔleuD/pΔK410-hsp60*-Sm14菌株在体内重组体Sm14抗原的基础上控制曼氏血吸虫感染的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达曼氏血吸虫Sm14抗原的卡介苗(BCG)牛结核杆菌的重组体疫苗菌株。本发明的疫苗菌株是用来控制由寄生虫,特别是曼氏血吸虫所引起的感染。该疫苗的疫苗菌株是一种由巴斯德BCG亚-菌株的遗传修饰获得的亮氨酸补体致活的营养缺陷型菌株。
背景技术
估计至少200百万人受到影响人类五类血吸虫之一的感染。 此外,有另外600百万处于受到这种寄生虫影响的危险之中。
采用抗-驱虫药吡喹酮的化学治疗是主要的防治方法,然而,这种再-感染率很高[Al-Sherbiny M, Osman A, Barakat R, El Morshedy H, Bergquist R & Olds R (2003). 在体外试验中对曼氏血吸虫疫苗试验抗原的细胞和体液反应,Acta Trop. 88: 117-130; 和 Capron A, Riveau GJ, Bartley PB & McManus DP (2002). 血吸虫疫苗的前景。Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord. 2: 281-290]。
因此,开发与适当的化学治疗联合使用的有效疫苗能够代表一种有效的长期控制策略 [Pearce EJ (2003) 用于血吸虫病的疫苗方面的进展,Acta Trop. 86: 309-313; 和 Bergquist NR (2002) 血吸虫病:从危险性评估到控制,寄生虫学趋势. 18: 309-314.]。
世界卫生组织(WHO)从S.血吸虫 (Sh 28-GST)选择出曼氏血吸虫脂肪酸-结合蛋白14(Sm 14)和28-kDa谷胱甘肽S-转移酶,作为用于人体临床试验即用于抗-血吸虫疫苗应试者的主要靶分子[Bergquist, 2004,2,http://who.int/tdr/publication/tdrnews/news71/schisto.html);BergquistR, Al-Sherbiny M, Barakat R & Olds R. (2002) 用于血吸虫病疫苗开发的蓝图,Acta Trop. 82: 183-192; 和Bergquist NR (1998) 血吸虫病疫苗开发:进展和前景,Mem Inst Oswaldo Cruz. 93 Suppl 1: 95-101.]。所述Sm14抗原的选择基于大肠杆菌中的观察,诱导针对曼氏血吸虫(35到60%)和肝片吸虫保护性免疫的重组体Sm14蛋白的试验,通过在啮齿类模型刺激的蠕虫负荷减少所确定[Vilar, M. M.; Barrientos, F; Almeida, M; Garrat, R; Tendler, M,一种与r-Sm14肽对抗血吸虫病和肝片吸虫病的试验性二价肽疫苗,Vaccine, v. 22, p. 137-144, 2003和 Tendler M, Brito CA, Vilar MM, Serra-Freire N, Diogo CM, Almeida MS, 等(1996)曼氏血吸虫脂肪酸-结合蛋白Sm14,是一种双重目标抗-寄生虫疫苗的潜在基础,Proc Natl Acad Sci USA. 93: 269-273.] 以及在羊身上使用曼氏血吸虫定义的重组体抗原Sm 14接种对抗肝片吸虫传染[Almeida MS, Torloni H, Lee-Ho P, Vilar MM, Thaumaturgo N, Simpson AJ & Tendler M (2003),寄生虫免疫. 25: 135-137]。此外,所述Sm14的保护性致免疫效力已经在一种DNA疫苗的上下文指引下对这种蛋白进行编码基因时Nascimento E, Le?o IC, Pereira VR, Gomes YM, Chikhlikar P, August T 等 (2002) 单和多-抗原DNA疫苗对抗血吸虫病的保护性免疫。Mem Inst Oswaldo Cruz. 97 Suppl 1: 105-109] 或者经由活的-减毒的重组细菌(如沙门氏菌)变种时被证实[鼠伤寒 (Pacheco LG, Zucconi E, Mati VL, Garcia RM, Miyoshi A, Oliveira SC, 等, (2005) 口服表达14-kDa曼氏血吸虫脂肪酸-结合蛋白的活Aro减毒沙门氏菌疫苗株诱导部分对抗试验性血吸虫病的保护,Acta Trop. 95: 132-142.] 或者如从全世界使用的一种对抗肺结核疫苗-牛结核杆菌(Bacille Calmette Guérin)的BCG菌株转化获得的BCG重组体 [Varaldo PB, Leite LC, Dias WO, Miyaji EN, Torres FI, Gebara VC, 等 (2004) 重组体牛结核杆菌BCG表达曼氏血吸虫的Sm14抗原保护小鼠来自摇尾幼虫的刺激。 Infect Immun. 72: 3336-3343 和 Varaldo, P.B., Leite, L.c.c., Dias, W.O., Miyaj, E.N., Arm?a, G.R.G., Campos, A.S., Vilar, M.M., McFadden, J., Almeida, M.S., Tendler, M 和 McIntosh, D. (2006)的结核分枝杆菌密码子优化在牛结核杆菌Bacille Calmette -Guérin中曼氏血吸虫重组体的Sm14基因的基因编码来增强蛋白表达而不是保护小鼠对抗摇尾幼虫的刺激,FEMS医学微生物学和免疫学, 48, 132-139.]。
很多优点与利用rBCG作为异源性抗原呈递系统相关 [Ohara N 和 Yamada T (2001) 重组BCG疫苗.疫苗.19: 4089-4098.]。在这篇文章中,Varaldo 等 (2004) 已经在先报道了用单剂量的arBCG菌株表达Sm14在与偶发分枝杆菌(rBCG/PL73-Sm14)的β-内酰胺酶融合的免疫与对抗曼氏血吸虫尾蚴的刺激保护比较相当于获得使用三个剂量的 rSm14 (Varaldo 等, 2004)。与使用同样的或相似的表达载体的其它抗原的记录相比,从这种结构获得的全部Sm14表达水平是比较低的(Mederle I, Bourguin I, Ensergueix D, Badell E, Moniz-Pereira J, Gicquel B & Winter N ( 2002) Plasmidic对抗牛结核杆菌BCG中异源基因的插入克隆:影响在体内抗原的持久性和免疫反应。Infect Immun. 70: 303-314.]。然而,应该指出的是,还没有关于rBCG菌株引起保护性免疫所需要的抗原生产的最低水平达到共识,但是低水平抗原表达一直被认为是代表一种潜在的限制因素 (Kanekiyo M, Matsuo K, Hamatake M, Hamano T, Ohsu T, Matsumoto S, 等, (2005) 结核分枝杆菌密码子优化增强了重组体牛结核杆菌卡介苗表达类型1Gag人类免疫缺陷性病毒中的抗原表达和病毒-特异性免疫应答。J Virol. 79: 8716-8723; 和Kawahara M, Matsuo K, Nakasone T, Hiroi T, Kiyono H, Matsumoto S, 等 (2002) 结合直肠内/真皮内接种重组体牛结核杆菌卡介苗(BCG)诱导对抗插入HIV -1V3抗原免疫的反应增强,Vaccine. 21: 158-166]。
为了解决这个问题,有人提出两个新的能提高所述目标抗原表达水平的rBCG结构[硕士论文题为构建M.牛卡介苗重组Sm14r及其在小鼠模型中评估对抗血吸虫病能力, A.P.C. Argondizzo in 2005, in Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brasil)。这些结构提供了二个质粒载体,pUS 977和pAU 5。
所述pAU 5媒介物是在一篇硕士论文中提出的,该论文题为牛分枝杆菌卡介苗中的结构和功能的重组双功能质粒载体(大肠杆菌-分枝杆菌)的稳定性评价,J.P.S Santos in 2002, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, oriented by Dr. Douglas McIntosh, visiting researcher of FIOCRUZ 和 Prof. Walter Martim R. Oelemann, teacher at Universidade Federal de Rio de Janeiro。所述pAU 5媒介物是一种在所述质粒pUS 973上的变异 [Medeiros, M., Dellagostin, O.A., Armoa, G.R.G, Degrave, W.M., Mendon?a-Lima, L., Lopes, M.Q., Costa, J.F., McFadden, J. G.M.B., 和 McIntosh, D. (2002) 牝牛分枝杆菌作为用于结核分枝杆菌因子研究中克隆宿主的代用品的对比评估。Microbiology 148, 1999-2009]。其中首创这种质粒(pAU5)与pUS973相比表现出增强的稳定性。所述增强的稳定性归功于启动子区域的上游在与失去第一个碱基对的hsp60启动子序列结合四个碱基对的一种立刻缺失。
两个独立的实验中证实了这些rBCG结构给予Swiss小鼠对抗曼氏血吸虫的摇尾幼虫的刺激保护的能力 [硕士学位论文 A.P.C. Argondizzo in 2005]。在这项研究中,有人观察到Sm14表达水平的提高(与由PL73-Sm14在rBCG结构转化伴随着pAU5媒介物的情况下得到的相比约大于32倍),当与rBCG/PL73-Sm14结构的那些记录相比没有导致保护水平的提高。此外,重要的是要注意到按照重组体Sm14蛋白的亚-细胞的位置,rBCG/pAU5-Sm14和rBCGr/pUS977-Sm14菌株也与rBCG/PL73-Sm14菌株不同。具体地,对于rBCG-/pAU5-Sm14的情况中蛋白是在所述细菌的细胞质内产生而不是像rBCG-/PL73-Sm14的情况那样是以膜相关融合附加物的形式。
总的来看,这些数据支持这一假设:rBCGr细胞质中产生的重组体Sm14,其表达由存在于pAU5-Sm14结构中被修饰的hsp60启动子驱动,具有作为预防对抗血吸虫病手段的潜力(rBCG/pAU5-Sm14)。
所有质粒结构发展至此是基于核外染色体,环状质粒DNA分子所包含对氨基糖苷抗菌素卡那霉素的基因编码抗性。 存在于这些结构内的卡那霉素基因提供了一种积极的手段:在质粒进入BCG的引入之后选择转化的细菌(转化体)。 该基因的一个次要功能是细菌在包含卡那霉素的液体培养生长过程中保证质粒的稳定性,用于生产试验性的疫苗。
然而,在体内抗生素的抗药性编码基因的存在并不提供对于质粒稳定性的选择。此外,将重组体BCG携带含有对菌素抵抗的编码序列的质粒用于人类接种疫苗带来了安全问题关注 (Burlein JE, Stover CK, Offcut S & Hanson, M.S. (1994) 分枝杆菌中外源基因的表达,Washington DC: ASM Press.].
显然,开发更稳定的用于在不携带抗生素抗性标志的BCG中异源性抗原表达的质粒载体是所期望的。
发明内容
本发明涉及一种表达曼氏血吸虫Sm14抗原的BCG牛结核杆菌的重组体疫苗菌株。本发明的疫苗菌株是用来控制由寄生虫,特别是曼氏血吸虫所引起的感染。该疫苗的疫苗菌株是一种由巴斯德BCG亚-菌株的遗传修饰获得的亮氨酸补体致活的营养缺陷型菌株。
附图说明
图1是一个互补载体pUP410的发展的示意图;
图2显示了利用pAU5-Sm14结构作为DNA模板扩增的表达盒hsp60*-Sm14的PCR结果。
具体实施方式
本发明涉及使用BCGΔleuD菌株和互补的媒介物pUP410获得一种用于控制曼氏血吸虫和相关寄生虫引起的感染的疫苗菌株,其基于曼氏血吸虫的Sm14在体内的表达。
本发明的主要的目的可以通过这种Sm14抗原在BCG利用营养缺陷型互补作为选择性标记的表达系统的结构完成。本发明中使用的表达系统是由Johnjoe Mcfadden博士,生物科学学院,Surrey大学,UK和Odir Dellagostin 博士,生物科技中心,Pelotas联合大学,巴西构成的群体,对题为用于拉丁美洲反刍动物的主要寄生和流行性病的重组体BCG多疫苗和互补诊断的发展的研究项目中开发的。
该使用营养缺陷型互补的BCG体系的组成和特点是一种营养缺陷型巴斯德BCG 菌株,所述营养缺陷型是有关氨基酸亮氨酸(BCG(leuD)和一种质粒载体家族编码的leuD序列的产物,这些leuD序列同样地能够补充所述BCG的营养缺陷型到亮氨酸。这种营养缺陷型BCG菌株不能生长在缺乏亮氨酸的媒介中,其通过所述LeuD序列的基因置换获得,存在于巴斯德BCG基因组内,使用这种方法的报道者是Parish, T. & and Stoker, N.G. (2000) [使用一种柔性盒的方法经过基因置换产生一种双无标记结核分枝杆菌tlyA plcABC 突变株,微生物学. 146: 1969-1975]。所述互补媒介物源自于媒介物pUS77 [Medeiros, M., Dellagostin, O.A., Armoa, G.R.G., Degrave, W.M, Mendon?a-Lima, L., Lopes, M.Q., Costa, J.F., McFadden, J. G.M.B., 和 McIntosh, D. (2002) 牝牛分枝杆菌作为用于结核分枝杆菌因子研究中克隆宿主的代用品的对比评估,微生物学 148, 1999-2009] 并且包含作为营养缺乏(营养缺陷型)和作为选择性标记的互补的LeuD基因,由pAN启动子驱动其表达。 此外,这些媒介物具有独特的限制性核酸内切酶中心,允许抗原表达盒进入媒介物的克隆以及具有一种卡那霉素抗性基因,这是在大肠杆菌选定区域必需的,其可以通过限制性内切酶消化在BCG转化前的重新-连接后更进一步地除去。亮氨酸的缺少无论在体外生长培养基(Middlebrooke生长培养基7H9液体培养基或7H10琼脂)还是在体内都提供了恒定的选择压力,这种压力迫使rBCG保持这种互补质粒。用于生产这种BCGΔleuD 菌株和一系列互补媒介物的具体方法描述于Borsuk,S.,等,营养缺陷型互补作为选择性标记用于牛结核杆菌BCG,结核病中外原抗原的稳定的表达,Vol. 87, 期刊 6, pp 474-480, 在线发表于 2007年九月 24日。这种源自互补媒介物家族的互补媒介物pUP410形成过程中的步骤显示于图1。
如图1所示,获得所述pUP410媒介物的步骤如下:
-利用引物leuDI通过PCR获得leuD基因编码序列 (5′-AAT CTA GAA CAG CTA GGG GAT C-3′ - SEQ ID NO:1)、 leuDII (5′TCC TGCA GTT CTA CGC CTC A-3′ - SEQ ID NO:2) 和牛结核杆菌BCG P3(Isogen)DNA 作为模板;
-采用酶XbaI和PstI消化扩增片段 (617bp);以及
-随后克隆源自称为pUP400的载体的pUS977质粒(Medeiros 等,2002)。
通过用KpnI酶消化从PGOAL19媒介物中获得hyg R基因(1575bp) [Parish, T & Stoker, N.G (2000),使用柔性盒经过基因置换产生一种双无标记结核分枝杆菌tlyA plcABC 突变株的方法,微生物学,146: 1969-1975] 并且与用同样的酶消化pU400媒介物相连。这个过程在pU401媒介物中产生结果。 通过用HindIII消化移去卡那霉素抗性基因后重新-连接,一个携带HindIII位点的适配器结束同时合成PacI。1微克的Adap F (5′GAT ATC AAG CTT AAG ACG CGT TAA3′) 和 Adap R (5′TAA CGC GTC TTA AGC TTG ATA TCT A 3′) 序列通过1min的煮沸使其杂交并在室温下孵化3h。然后,500毫微克(ng)的寡核苷酸用于PacI消化200ngpUP401媒介物的连接反应。连接的产物在70℃加热10min,立刻提交1%琼脂糖凝胶电泳并从凝胶中切除和洗脱。加入一种杂交缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.5;100mM NaCl;1mM EDTA)来洗脱DNA,并在80℃加热5min。 然后让所述DNA冷却到室温3小时,并且5微升用于所述大肠杆菌TOP 10菌株的转化。通过HindIII消化和通过DNA序列测定确定重组克隆。得到的结构命名为pUP402。hygR基因随后采用Kpn1消除在媒介物pUP410中产生结果。本发明将通过参照实施例的方式来进行描述,不应将这些例子认为是用于限制本发明。
补体致活的营养缺陷型巴斯德rBCG 到亮氨酸的结构(巴斯德 BCGrΔleuD/pΔKan-hsp60*-Sm14)
设计所述引物 PSm14F (TAT ATA TAT ATA TAG GCG CCA CCA CAA CGA CGC GC-SEQ ID NO:3) e PSm14R (CGC GGG CGC CTT AGG ATG ATC GTT TAT A-SEQ ID NO:4) 用于使得修饰后的hsp60*启动子和使用载体pAU5-Sm14作为模板的Sm14表达盒的PCR扩增。采用Nar1酶消化通过PCR获得的816bp扩增结果(图2),然后进入用同样酶消化的媒介物pUP410中克隆。 脱氧核糖核酸顺序分析证实所述表达盒插入了预定位置。图2中泳道 1 = 标记 fX174RF/HaeIII, 以及泳道 2 = hsp60*-Sm14 扩增。
在代替克隆宿主(牝牛分枝杆菌)中对所述结构的pUP410-hsp60*-Sm14到所述Sm14抗原的驱动表达能力进行评估。因而,在包含卡那霉素的板上被选定的五个独立转化体用于生产液体培养物,那些液体培养物被处理过用来通过免疫印迹法表达分析如同Medeiros等描述的,(2002)。所述抗原表达是利用一种小鼠多克隆抗-Sm14抗血清与共轭到碱性磷酸酶的抗-小鼠IgG作为二级抗体进行检测。发现所有五个克隆都表达Sm14,相当于用pAU5-Sm14转化母牛分枝杆菌(表达阳性对照)中见到的水平。
然后,通过采用限制性核酸内切酶HindIII消化从pUP410-hsp60*-Sm14中除去卡那霉素抗性基因,并且所述媒介物通过T4联接酶进行再-循环引起结构p?K410-hsp60*-Sm14,其用于转变BCG (BCG ?leuD)的营养缺陷型巴斯德菌株。在Middlebrook 7H10 琼脂的板上挑选获得的转化体并检测其在卡那霉素存在下的生长能力。其后,具有表达三个(tree)独立的对卡那霉素敏感的转化体Sm14蛋白的能力方面的体外稳定性,其评价是在米德尔布鲁克7H9液体培养基(不含亮氨酸)中60代以上并10天之内利用早先的报道的方法(Varaldo 等,2002)感染人和鼠科动物单核细胞。
为了达到这个目的,在体外采用所述结构p?K410-hsp60*-Sm14转化的二个稳定的BCG克隆感染鼠科动物或人单核细胞。 先在24孔板中培养好巨噬细胞(5x105每孔),用补充有HEPES 10mM;L-谷氨酰胺2mM;和1%的胎牛血清的RPMI 1640培养。然后单细胞层暴露在相当于每个BCG重组体的水平下,以获得约10细菌细胞/巨噬细胞的多重感染(MOI :“多重感染”)。
制备结核分枝杆菌接种体是在对数期培养稀释直到所需要的浓度,通过光学显微镜直接计数。收集巨噬细胞对BCG重组体暴露后4h、24h、5天和10天的样品(六孔/培养)。收集用0.1%的Tween溶于蒸馏水(200μL/孔)溶解后的单层细胞,其后连续稀释细胞溶解,随后接种于琼脂7H10板或以同样的手段并补充卡那霉素。
结核分枝杆菌生长的水平,是从曝光后的4小时收集的样品分析观测,用于计算相对的感染能力。 从其它点的菌落单位计数而获得的值用于计算细胞内持续的水平。所述功能稳定性(所述抗原Sm14的表达)是通过根据早先描述的方案(Medeiros 2002)的免疫印迹法进行分析。
在所有的例子中,人们已经注意到所述转化体表达蛋白Sm14的水平相当于那些在采用pAU5-Sm14(表达阳性对照)转化的牛分枝杆菌BCG中所看到的。 所述表达系统稳定性,因此,在非-细胞方式和鼠科动物和人细胞的培养中都被证实。
巴斯德B. BCGr ΔleuD/pΔKan-hsp60*-Sm14保护小鼠对抗曼氏血吸虫摇尾幼虫的刺激。
在两个独立的实验中评估了巴斯德rBCG ΔleuD/pΔKan-hsp60*-Sm14保护小鼠对抗活曼氏血吸虫尾蚴的能力。每个实验有6个实验组(表1),每个组包含10只4周龄的成年雌性Swiss小鼠。所述疫苗接种的效果用只有一个剂量的rBCG-(p?K21-Sm14)滴鼻给药(1x106cfu =标准剂量;或1x102cfu = 小剂量)与通过在爪给予相似单一剂量的rBCG-(pAU5-Sm14)或3倍剂量的rSm14蛋白(10μg在氢氧化铝中)完成的相比,如同早先Varaldo 等,(2004)描述的。在同样的日子给予最后的重组蛋白质部分作为基于BCGr的单剂量疫苗。对于保护试验,首次免疫后的30天(实验1)或在60天(实验2),所述小鼠皮下(sc)用100曼氏血吸虫尾蚴肌注进行刺激,并在刺激45天后灌注。 计算不同的刺激组中的寄生负担和保护水平根据的是Tendler等1996年早先所描述。通过Student t检验评估其统计学的重要性。
表1- 评价巴斯德rBCG ΔleuD/pΔK410-hsp60*-Sm14 保护对抗曼氏血吸虫尾蚴刺激的能力使用的免疫方案
实验组 | 免疫 (day 0) | BCG的菌落-形成-单位 |
A | 盐 | ---------- |
B | rBCG ?LeuD/p?K410-hsp60*-Sm14)a | 1 x 106 |
C | rBCG ?LeuD/p?K410-hsp60*-Sm14)b | 1 x 102 |
D | rBCG/pAU5-Sm14a | 1 x 106 |
E | rBCG/pAU5-Sm14b | 1 x 102 |
F | Sm14r (10 μg) 在矾土中c (3个独立和连续的剂量间隔一周) | ---------- |
a = 标准剂量;b = 小剂量;c = 氢氧化铝,如早先报道的 (Varaldo 等, 2004)。
刺激结果显示在表2。可以注意到所有接种组与对照动物(盐组)相比显示了寄生负担的显著减少。这个结果在继接种之后的30天和60天都很明显。 通常,这些数据清楚地表明,巴斯德rBCG ΔleuD/pΔKan-hsp60*-Sm14能够在30天诱导一种保护性的免疫反应,并且这种反应在免疫后60天持续有效。 此外,根据早先文章所描述的,所述的新疫苗菌株的保护性如BCGr/pAU5-Sm14菌株一样。最后,用一个单剂量的巴斯德BCGr ΔleuD/pΔKan-hsp60*-Sm14滴鼻给药(1 x 106 cfu = 标准剂量 和 1 x 102 cfu = 小剂量都是)获得的保护水平能够提供一个相当于如3倍剂量的用氢氧化铝作为佐剂配制的重组体Sm14蛋白获得的保护水平。
表2-依据与PBS(盐)控制的30和30天接种后的免疫Swiss小鼠相比蠕虫负担的减少检测评估保护作用
免疫使用 | 蠕虫负担的减少 %(30 天 ) | 蠕虫负担的减少%(60 天 ) |
盐 | 0 | 0 |
rBCG (p?K410-hsp60*-Sm14)a | 46 | 63 |
rBCG (p?K410-hsp60*-Sm14)b | 57.4 | 57.4 |
rBCG (pAU5-Sm14)a | 43.8 | 61.2 |
rBCG (pAU5-Sm14)b | 39.6 | 66.4 |
rSm14 (10 μg) 在矾土中c(3个独立和连续的剂量间隔一周) | 54.9 | 57.6 |
a =标准剂量;b =小剂量;c =如早先报道的 (Varaldo 等., 2004)。
继上述报道和例证之后,申请人确认所述巴斯德BCG ΔleuD菌株和其互补的媒介物pΔK410-hsp60*-Sm14to 获得的疫苗菌株的效果,该效果是用于控制曼氏血吸虫及其基于本土Sm14抗原表达的有关寄生虫引起的感染。
这里描述的本发明和提到的方面应该理解为可能的实施例子。 然而应该指出本发明不局限于那些实施例, 本领域技术人员应注意到这里介绍的任何特征,必须仅理解为使本发明更容易理解的描述。
Claims (5)
1.一种补充到亮氨酸并表达曼氏血吸虫Sm14蛋白(巴斯德rBCG ΔleuD/pΔK410-hsp60*-Sm14)的重组体营养缺陷型巴斯德BCG菌株,其根据以下步骤获得:
(a) 通过PCR扩增的包含 Sm14表达盒的片段,所述Sm14表达盒包含修饰后的hsp 60*启动子,使用pAU5-Sm14媒介物作为模板以及引物PSm14F (TAT ATA TAT ATA TAG GCG CCA CCA CAA CGA CGC GC – SEQ ID NO:3) e PSm14R (CGC GGG CGC CTT AGG ATG ATC GTT TAT A – SEQ ID NO:4);
(b) 消化通过PCR和Nar1酶所获得的816 bp的hsp60*-Sm14扩增子;
(c) Hsp60*-Sm14扩增子的克隆在 pUP410媒介物中使用Nar1酶消化并产生构造pUP410-hsp60*-Sm14;
(d) 评价构造pUP410-hsp60*-Sm14在牝牛分枝杆菌中表达Sm14蛋白的能力;
(e) 通过限制性核酸内切酶HindIII的消化从pUP410-hsp60*-Sm14移除耐卡那霉素基因;
(f) 再-环化没有卡那霉素编纂基因的pUP410-hsp60*-Sm14构造以产生一种pUP410-hsp60*-Sm14构造,用于转变巴斯德 BCG营养缺陷型菌株(BCG ΔleuD),以及产生一种重组体营养缺陷型巴斯德BCG菌株补充到表达曼氏血吸虫Sm14蛋白(巴斯德BCG ΔleuD/pΔK410-hsp60*-Sm14)的亮氨酸中。
2.如权利要求1中所定义的巴斯德BCG ΔleuD/pΔK410-hsp60*-Sm14菌株在控制由寄生虫,尤其是曼氏血吸虫所引起的人感染中的应用。
3.如权利要求1中所定义的巴斯德BCG ΔleuD/pΔK410-hsp60*-Sm14 菌株在控制由肝片吸虫所引起的动物感染的应用。
4.如权利要求1中所定义的巴斯德BCG ΔleuD/pΔK410-hsp60*-Sm14 菌株在控制由结核分枝杆菌的感染中的应用。
5.如权利要求1中定义的巴斯德BCG ΔleuD/pΔK410-hsp60*-Sm14菌株在控制肿瘤形成中的应用。
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