CN102438996A

CN102438996A - 点击化学合成的具有分支结构的组蛋白去乙酰酶抑制剂

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Publication number: CN102438996A
Application number: CN2010800306093A
Authority: CN
Inventors: 王鹏; 沈杰; 尹正; 侯静丽; 李中华; 冯丛然; 方清洪; 古国贤; 曹雪峰; 王辉辉; 张鹏飞
Original assignee: Accendatech Co Ltd
Current assignee: Suntech Erdos Acon Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2012-05-02
Anticipated expiration: 2030-07-09
Also published as: CN101941948A; CN102438996B; WO2011003365A1

Abstract

一种利用点击化学合成的具有“分支”结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，其结构通式如M1所示，式中，A是一个C1-C6的烷基链，R1和R2是烷基，环烷基，杂烷基，杂环烷基，链烯基，环烯基，杂烯基，杂环烯基，链炔基，环炔基，杂炔基，环杂炔基，芳基，或杂芳基，R1和R2可以相同也可以不同。本发明还包括通过对上述抑制剂的A、R1/或R2进行取代衍生化或桥接衍生化而得到的化合物。此外，组蛋白去乙酰化酶抑制剂也可作为制备治疗心血管疾病，免疫类疾病和神经退行性疾病药物的应用。

Description

点击化学合成的具有分支结构的组蛋白去乙酰酶抑制剂技术领域：本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种点击化学合成的具有"分支" 结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，该类抑制剂可作为制备治疗心血管疾病，免疫类疾病和神经退行性疾病药物的应用。

背景技术：赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化是一对可逆的蛋白质转录后修饰过程。催化该可逆过程的两个酶分别是 HDAC(组蛋白去乙酰化酶， histone deacetylase)和 HAT(组蛋白乙酰基转移酶， histone acetyltransferase)。 HAT和 HDAC通过协同作用，共同决定底物蛋白的乙酰化程度，进而调控细胞内众多的理化过程 (如蛋白的结合和转运,信号传导和基因表达等；)。已知的 HDAC/HAT的底物蛋白包括：组蛋白，微管蛋白， Hsp90和转录因子 (如 p53， F- B, Ku70和 Stat3)等。其中，组蛋白是研究的最早和最多的底物蛋白， HDAC和 HAT的命名也由此而来。 HDAC和 HAT对组蛋白的乙酰化修饰是表观遗传学中调控基因表达的一种重要方式。

现有的临床研究和药理研究表明， HDAC是治疗许多疾病的 (潜在)靶点，这些疾病包括: 癌症，心血管疾病，免疫类疾病和神经退行性疾病等。临床前研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂可选择性地杀死癌细胞,并且和许多的抗癌药物有很好的增效作用。 2006年十月，由美国默克公司研发的辛二酰苯胺异羟肟酸成为了第一个获准的 HDAC靶向药物。

我们曾发表过用点击化学合成具有 "非分支"结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂的方法 (Journal of Medicinal Chemistry, 2008， 7417-7427)。其相关的七个化合物的结构如下：

总体而言，这类"非分支"的组蛋白去乙酰化酶抑制剂分子的生物活性相对较差。

发明内容：本发明所要解决的技术问题是提供一种新的点击化学合成的具有"分支"结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，所公开的内容包括：化合物的结构，制备方法和应用。本发明的创新在于： 1 ) 通过引入"分支"结构来增强组蛋白去乙酰化酶抑制剂的生物活性； 2) 通过使用手性氨基酸来方便地合成具有手性"分支"结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

本发明提供的利用点击化学合成的具有"分支"结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂（即母体药物分子），该抑制剂是具有如下结构通式的化合物：

其中， A是一个 d-C₆的烷基链， Ri和 R₂是被取代基取代或未被取代的烷基，环烷基，杂烷基，杂环烷基，链烯基，环烯基，杂烯基，杂环烯基，链炔基，环炔基，杂炔基，环杂炔基，芳基，或杂芳基，其中和可以相同或不同；

其中，取代基选自烷基，环烷基，杂烷基，杂环烷基，链烯基，环烯基，杂烯基，杂环烯基，链炔基，环炔基，杂炔基，环杂炔基，芳基，杂芳基，卤素， -CF₃， -OCF3, 羧基 ( -COOH), 磺酸基 (-S0₃H)，氰基 (-CN), 羟基（-OH), 氨基 (- H₂)，或硝基（-N0₂); 优选地，在、或中的至少一个单键中间可以插入桥接基团，桥接基团选自硫醚基（-S-) , 醚基（-0-)，亚氨基（-HN -)，羰基（-(CO) -)，磺酰基（-(S0₂)-)，或亚磺酰基 ( -(SO)-);

优选地，结构通式 Mi的化合物是具有如下结构通式 M₂的化合物：

其中， Xi、 X₂、 X₃和 X₄是 N或 CR_{3 ;} 可以是 NR₃， S或 O; Q₂可以是 N或 CR₃。其中 R₃选自 H，烷基，环烷基，杂烷基，杂环烷基，链烯基，环烯基，杂烯基，杂环烯基，链炔基，环炔基，杂炔基，环杂炔基，芳基，杂芳基，卤素， -CF₃， -OCF3,羧基（-COOH), 磺酸基 (-S0₃H)，氰基 (-CN), 羟基（-OH), 氨基 (- H₂)，或硝基（-N0₂); 优选 R₃是 H 其中， CR₃和 NR₃中的 C、 N与 R₃之间插入桥接基团，或 R₃不为 H的取代基时，该取代基的至少某一个单键中间插入桥接基团，桥接基团选自硫醚基（-S-) , 醚基（-0-)，亚氨基（-HN -)，取代亚氨基（-NR-) , 羰基（-(CO) -)，磺酰基（-(S0₂)-)，或亚磺酰基（-(SO)-); 本发明中所涉及术语的含义如下：

垸基:是指直链或带有支链的脂肪烃基团；优先选择为 d-C₁₄的烷基;更优先的选择为 ₁₍₎ 的烷基；最优先的选择为 d-C₆。实施例包括但不局限于：甲基，乙基，正丙基， 2—丙基，正丁基，异丁基，特丁基，己基等。

环烷基: 是指饱和或部分饱和的单环、稠环或螺环之碳环。以 3-9个碳原子组成的环为优先选择。实例包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。

杂垸基: 是指直链或含有支链烷基的基团，并且在主链中，至少含有一个或多个选自 S， 0 和 N的杂原子。优先选择含有 2-14个原子的链。杂烷基包括但不限于：醚类、硫醚类、烷基酯类，第二或第三烷基胺类、烷基亚磺酸等。

杂环垸基: 是指至少含有一个选自 N， S， 0的杂原子的环烷基。优选含有 1-3个杂原子。优选的环为 3-14员环，更优先选择的环为 4-7员环。杂环烷基包括，但不限于：吡咯烷基、二氢吡咯基、四氢吡咯基、二氢吡唑基、哌啶基、吗啉四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、四氢吡喃基等。

链烯基: 作为一基团的一部分时是指至少含有一个碳-碳双键的脂肪烃基团，可以作为直链也可以带有支链。优先选择具有 C₂-C₁₄的烯基。 ₁₂则更好；最为优先选择的是 C₂-C₆的烯基。该基团可在其主链中含有多个双键且其构象可各自为 £或2。烯基基团的例子包括，但不限于：乙烯基、丙烯基等。

环烯基: 是指环烷基中至少某一个碳碳单键被一个碳碳双键所取代。

杂烯基: 是指杂烷基中至少某一个碳碳单键被一个碳碳双键所取代。

杂环烯基: 是指杂环烷基中至少某一个碳碳单键被一个碳碳双键所取代。

链炔基: 作为一基团的一部分时是指至少含有一个碳-碳三键的脂肪烃基团，可以作为直链也可以带有支链。优先选择具有 C₂-C₁₄的炔基。 ₁₂则更好；最为优先选择的是 C₂-C₆的炔基。该基团可在其主链中含有多个双键且其构象可各自为 £或2。炔基基团的例子包括，但不限于：乙炔基、丙炔基等。

环炔基: 是指环烷基中至少某一个碳碳单键被一个碳碳三键所取代。

杂炔基: 是指杂烷基中至少某一个碳碳单键被一个碳碳三键所取代。

杂环炔基: 是指杂环烷基中至少某一个碳碳单键被一个碳碳三键所取代。

芳基: 作为一基团或一基团的部分是指：（1 )芳香性的单环或稠环：优先选择具有 5-12个碳原子的芳香性碳环（环原子均为碳的环状构造）。芳基的实例包括，但不限于：苯基、萘基；（2)可以连接部分饱和的碳环，例如：苯基和 C₅_₇环烷基或 C₅_₇环烯基基团系互相稠合而形成一环状结构。实例包括，但不限于：四氢萘基、茚基或氢茚基等。芳基基团可被一个或多个取代基取代。

杂芳基: 是指单环性或稠合的多环芳香杂环。优先选择含有一个或多个选自 N， 0或 /和 S的杂原子 5-7员芳香环。典型的杂芳基取代基包括实例，但不限于：呋喃基，噻吩基，吡咯，吡唑，三唑，噻唑，吡啶，嘧啶，吡嗪，吲哚，苯并咪唑等。

卤素: 氟，氯，溴和碘。

酰基: 是指 [R-CO-]基团， R为烷基，环烷基，杂烷基，杂环烷基，链烯基，环烯基，杂烯基，杂环烯基，链炔基，环炔基，杂炔基，环杂炔基，芳基，杂芳基。酰基的实例包括但不局限于：乙酰基、丙酰基、异丁酰基、苯甲酰基等。

取代亚氨基：是指亚氨基（-NH-) 中的氢原子被取代基团取代后得到的基团（-NR -)， R为烷基，环烷基，杂烷基，杂环烷基，链烯基，环烯基，杂烯基，杂环烯基，链炔基，环炔基，杂炔基，环杂炔基，芳基，杂芳基。酰基的实例包括但不局限于：乙酰基、丙酰基、异丁酰基、苯甲酰基等。 R还包括上述取代基团中至少一个单键被桥接衍生化而得到的取代基。

取代基团: 包括但不局限于烷基，环烷基，杂烷基，杂环烷基，链烯基，环烯基，杂烯基，杂环烯基，链炔基，环炔基，杂炔基，环杂炔基，芳基，杂芳基，卤素， =0， = S， -CF₃，

-OCF3,羧基（-COOH),磺酸基 (-S0₃H)，氰基 (-CN)，羟基（-OH)，氨基 (- H₂)，硝基（-N0₂)。取代衍生化: 母体化合物的一个或多个氢原子被 "取代基团"取代的过程。

桥接基团: 是指具有两个连接位点的取代基（-A -)，它们可以插入某一单键 X-Y中，形成

X-A-Y的新结构。桥接基团包括但不局限于：硫醚基（-S-) , 醚基（-0-)，亚氨基（-HN -)，取代亚氨基 (- R-) ，羰基 (-(CO)-), 磺酰基 (-(S0₂)-)，亚磺酰基 (-(SO) -)。

桥接衍生化: 某一个取代基被桥接衍生化是指，通过某一个或多个单键被插入"桥接基团" 而得到新分子结构的过程。被插入桥接基团的单键可以位于取代基内，或位于该取代基与分子的其它片段的连接处。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂: 抑制组蛋白去乙酰化酶的 IC50值为 100 μ Μ或更低的化合物。

根据结构通式 Μ₂所述的结构，其可供参考的化合物包括但不局限于如下所示的分子：

11

≤9€e00/Il0Z OAV i.60S.0/0T0ZN3/13d /s/u O z-z-ososld S9i00iAV

上述结构通式 M₂的化合物优选为具有如下结构的化合物:

本发明还提供了一种药物组合物，该组合物包含权利要求上述抑制剂或其盐，以及药学上可接受的载体。

本发明还提供了上述抑制剂在制备治疗与细胞分化或增殖相关的疾病，心血管疾病，免疫类疾病和神经退行性疾病或癌症的药物中的用途。

本发明还提供了上述抑制剂的前药化合物，前药化合物的各种异构形式，抑制剂的医药活性代谢物，代谢物在药学上可接受的盐，其中异构形式包括非镜像异构体、镜像异构体、互变异构体、双键的 E/Z异构体。

本发明还提供了以上化合物所相应的药学上可接受的盐和前药，以及医药活性代谢物，和这些代谢物在药学上可接受的盐。本发明还提供了以上所有化合物的各种溶剂化形式，特别是相关化合物的水合物形式。以及以上所有化合物通过和药学上可接受的分散剂或载体物质相结合所得到的复合物，包括但不局限于脂质体，纳米颗粒，高分子聚合物，微乳等。还提供了以上所有化合物的前药分子，前药是指借助于体内代谢的方式将其于体内转化为相应的药物分子。

一种基于上述化合物或前药化合物所相应的药学上可接受的盐，以及医药活性代谢物，和这些代谢物在药学上可接受的盐。所述的药学上可接受的盐是指药物分子在能保持或部分保持原有生物活性，并且适用于医药用途的某些盐类。

这些盐类包括三种形式：

一是以上所述的化合物或前药化合物与某种酸（这些酸包括但不局限于：甲酸，乙酸，丙酸，琥珀酸，甘醇酸，葡萄糖酸，乳酸，苹果酸，酒石酸，甘氨酸，精氨酸，柠檬酸，反丁烯二酸，反丁烯二酸，烷基磺酸，芳基磺酸，盐酸，硫酸，磷酸，草酸，丙二酸，水杨酸，龙胆酸等）所对应的阴离子所形成的盐；

另一种是以上所述的化合物或前药化合物与某种阳离子（这些阳离子包括但不局限于铵基，季铵基阳离子，锂离子，钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，铝离子，锌离子等）所形成的盐；

第三种是以上所述的化合物或前药化合物与有机胺质子化后形成的阳离子所形成的盐，这些有机胺包括但不局限于：胆碱，乙二醇胺，吗啉等。立体异构体：

本发明还包括以上所述的母体药物分子或前药化合物及其盐所表示的所有化合物的各种异构形式。包括非镜像异构体，镜像异构体，互变异构体，双键的 E/Z异构体。任何具有一定基础的化学工作者均可分离出上述光学纯或者立体异构纯的化合物。

本发明还包括以上所述的母体药物分子或前药化合物及其盐所表示的化合物的可能消旋体或 /和镜像异构物或 /和非镜像异构物的混合物。

一种药物组合物，它包含：以上任一项所述的母体药物分子或前药化合物以及药学上可接受的载体。

上述化合物的医学应用

本发明包括以上任一项所述的母体药物分子、前药化合物、盐、立体异构体或组合物作为但不局限于去组蛋白乙酰化酶抑制剂，单独，或者与其它药物，稀释剂，赋形剂和 /或其它药物载体联合使用，来作为制备治疗相关疾病的药物的应用。这些疾病已有许多已知涉及或部分藉由 HDAC活性所调节。在下一段落所列出的疾病中，已知 HDAC活性对于促进使疾病发作扮演某种角色，或者可藉由本发明的化合物加以治疗。

这些病症包括但不限于增生性病症（如癌症），神经变性疾病（如，亨廷顿病，聚谷氨酰胺病，帕金森病，阿尔茨海默病，癫痈发作，纹状体黑质变性，进行性核上性麻痹，扭转张力不全，痉挛性斜颈和运动障碍，家族性震颤，抽动秽语综合症，弥漫性 Lewy体疾病，皮克病，颅内出血，原发性侧索硬化症，脊髓性肌肉萎缩症，肌萎缩侧索硬化症，肥大性间质性多神经病，视网膜色素变性，遗传性视神经萎缩，遗传性痉挛性截瘫，进行性共济失调症和 Shy— Drager症候群等），代谢性疾病（如， II型糖尿病），眼部退化疾病（包括，青光眼，老年黄斑变性，虹膜红变性青光眼），炎性疾病和 /或免疫系统病症（如，类风湿关节炎，骨性关节炎，青少年慢性关节炎，移植物抗宿主病，牛皮癣，哮喘，脊椎关节病，克罗恩病，炎性肠病，结肠溃疡，酒精型肝炎，糖尿病， Sjoegrens综合症，多发性硬化症，强直性脊椎炎，膜性肾小球病，椎间盘性疼痛，全身性红斑狼疮等），涉及血管新生的疾病（如，癌症，牛皮癣，类风湿性关节炎等），心理疾病（如，双向性神经障碍，精神分裂症，躁狂症，抑郁，痴呆等），心血管疾病（如，心力衰竭，再狭窄，动脉硬化等），纤维化疾病（如，肝纤维化，囊性纤维化，血管纤维瘤等），感染性疾病（如，真菌感染，病毒性感染，原虫感染等），造血性疾病（如，海洋性贫血，镰状细胞性贫血等）。

本发明尤其是可以作为制备治疗肿瘤的药物的应用，肿瘤类型包括但不局限于：乳癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，头癌，颈癌，直肠癌，胃癌，脑癌，白血病等。

以上任一项所述的母体药物分子、前药化合物、盐、立体异构体或组合物的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以通过胃肠给药（口服或直肠给药），或非胃肠给药（包括但不局限于皮下，肌肉，静脉内和皮肤内等途径）。

服给药的固体剂型包括但不局限于：胶囊，药锭，药片，粉末，颗粒和微胶囊。含有以上任一项所述的母体药物分子、前药化合物、盐、立体异构体或组合物的组蛋白去乙酰化酶抑制剂与至少一种惰性并且药学上可接受的赋形剂或载剂混合。这些赋形剂和载剂包括柠檬酸钠或磷酸二钙，和 /或： 1 ) 填充剂（如，淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和水杨酸）； 2) 结合剂（如，羧甲基纤维素，褐藻酸盐，明胶聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖和阿拉伯胶）； 3 ) 崩解剂（如，洋菜胶，碳酸钙，马铃薯或树薯淀粉，褐藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠）； 4) 溶解延迟剂（如，石蜡）； 5 ) 吸收加速剂（如，季铵化合物）； 6) 润湿剂（如，鲸蜡醇，单硬脂酸甘油酯）； 7) 吸附剂（如，滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇）。固体剂型可制备成具有涂层或外壳。

口服给药的液态剂型除了活性化合物以外，还包括但不局限于药学上可接受的惰性稀释剂（如，水或其它溶剂），稳定剂和乳化剂（如，乙基醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苯甲酸醇，苯甲酸苯甲酯，丙二醇， 1， 3—丁二醇，二甲基甲酰胺，棉籽油，花生油，玉米油，胚芽油，橄榄油，蓖麻油，芝麻油，甘油，四氢呋喃醇，聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯类等），悬浮剂（如，乙氧化异硬脂基醇类，聚氧乙烯山梨醇酐酯等），润湿剂，甜味剂，香料和调香剂等。

用于直肠或阴道给予的优选组合物包括但不仅限于栓剂；栓剂可由以上任一项所述的母体药物分子、前药化合物、盐、立体异构体或组合物与适当的非剌激性赋形剂或载体混合而得。

用于局部给药的剂型包括但不局限于粉末，贴片，喷剂，油膏和吸入剂。以上任一项所述的母体药物分子、前药化合物、盐、立体异构体或组合物在无菌条件下与药学上可接受的载体和所需的任何辅剂混合而得。这些辅剂包括但不限于任何防腐剂，缓冲剂和 /或混合剂等。

非肠道注射用药配方包括但不局限于药学上可以接受的无菌水剂或非水溶剂，分散剂，悬浮剂或乳化剂以及使用前才配成可注射的无菌水溶液的粉针剂。

优先选择的计量范围为每公斤体重每天约 0.01— 300 毫克；更优选的计量范围为每公斤体重每天约 0.2— 80毫克。也可以选择适当的计量每天多次分剂给药。本发明的优点和积极效果：

本发明提出的具有"分支"结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，比已有的非分支化合物具有更好的生物活性。组蛋白去乙酰化酶是新近确立的抗癌靶点蛋白；组蛋白去乙酰化酶抑制剂也可作为制备治疗治疗心血管疾病，免疫类疾病和神经退行性疾病药物的应用。具体实施方式：

化学合成实例

本发明所用的合成路线和方法，可以广泛应用于类似物的合成。下面的实施例仅仅是用来说明所发明的具体化合物的合成方法。但在合成方法上没有任何限制。本文实施例没有详述的化合物的合成，只要更换合适的原始原料，依据化学常识，在有必要时稍微更改一下反应条件即可，而对于本领域技术人员，这种化合物的合成是在其所掌握的知识范围内完全可以实现的。

反应所使用的试剂和原料主要来自但不仅限于以下供应商： Aldrich Chemical Company, Lancaster Synthesis Ltd等。反应产物通是用快速层析分离得到目标化合物（J. Org. Chem. , 1978， 43： 2923 )。反应产物使用 ¹ H- MR来确证结构；通常， s表示单峰， d表示双峰， t表示三重峰， m表示多重峰， br表示宽峰， dd表示双重峰， dt表示三重峰的双重峰；偶合常数的单位是 Hz。合成路线一（以下实施 1的合成方法如合成路线一所示。）

实施例 1 化合物 1的合成方法步骤一：合成化合物 D3

EDC的盐酸盐 (287 mg, 1.5 mmol), 2-氨基苯酚 Dl(131 mg, 1.2 mmol), HOBt(270 mg, 2.0 mmol)禾 P D2(217 mg, 1 mmol)于室温下加入到 5ml DMF溶剂中，然后加入三乙基胺（ 144 μΐ, 1.0 mmol). 反应在室温下搅拌 1小时。反应的混合物中加入 25 mL乙酸乙酯，然后用 25 ml 1M的盐酸溶液, 25 mL饱和碳酸氢钠溶液，和 25mL饱和氯化钠水溶液依次洗涤。有机相溶液用无水硫酸镁干燥后，减压蒸除溶剂。所得粗产物使用硅胶柱分离（流动相：石油醚 /乙酸乙酯 = 5/1 ) ，得到黄色固体产品 D3 275mg (分离产率 90%)。步骤二：合成化合物 D4

在室温下，将酰胺 D3(100 mg), 三苯基磷 (206 mg, 0.79 mmol) 禾 P 4A分子筛（4 g/mmol D3) 溶于 4 mL 四氢呋喃，搅拌 1小时，然后温度降低至 0°C，并滴加 DIAD ( 0.16 ml, 0.79 mmol) 的四氢呋喃（1 ml)溶液。反应液的温度逐渐升至室温，并继续搅拌 8个小时。减压旋蒸除去溶剂，然后加入乙醚 (5 ml)，并在室温下搅拌 1小时。过滤，蒸除溶剂，使用硅胶柱分离（流动相：石油醚 /乙酸乙酯 = 15/1 )得到白色固体 D4 79 mg，分离产率 74%。步骤三：合成化合物 D5

将 D4(290 mg， lmmol) 的二氯甲烷（ 10mL)溶液冷却至 0°C，加入催化量的三氟乙酸，让温度逐渐升至室温，持续搅拌直至原料 D4 消失。然后，反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。所得到的有机相溶液待用。在另一个反应瓶中，加入刚制备的 T©¾ (3 mmol) 试剂的二氯甲烷（10mL) 溶液和催化量的硫酸铜固体和碳酸钠溶液。将前述的有机溶液加入。在加入甲醇，直至水相和有机相互相融合为一相溶液。在室温下搅拌过夜。于减压下旋蒸除去溶剂，然后加入 30mL的二氯甲烷溶剂，并用水（30 mL X 3) 洗涤，干燥后减压下旋蒸除去溶剂，使用硅胶柱分离（流动相：石油醚 /乙醚 = 20/1 )得到无色液体 D5 165 mg，分离产率 80%。

步骤四：合成化合物 D7

白色固体 D6Clmmol)溶于 20 mL四氢呋喃中，在这个溶液中，顺序加入 188 mg (1.3 mmol) 叠氮化合物 D6、 350 mg (1 mmol)催化剂 P(OEt)₃CuI和 0.33 mL(2 mmol)的二异丙基乙胺。在室温下搅拌，反应过夜，并用 TLC板检验反应完全。减压蒸熘除去溶剂，残余的固体用 100 mL的二氯甲烷和 100 mL 1%的硫酸铜溶液分离。水相再用 100 mL的二氯甲烷萃取两次。混合的二氯甲烷用无水硫酸钠干燥，然后减压蒸熘除去二氯甲烷，过硅胶柱（展开剂：甲醇：二氯甲烷 =1 : 100) 纯化产物，得到 325 mg白色固体 D7，分离产率 72%。

步骤五：合成化合物 1

在含有 20mL二氯甲烷的圆底烧瓶中，顺序加入 200 mg D7、 1 mL (二氯甲烷体积的 5%) 的三氟乙酸和 0.3 mL的三异丙基硅烷。混合物在室温下搅拌，并用 TLC板检测反应的程度。反应完全后，将反应混合物溶于 50 mL乙腈中，并用 DOWEX MARATHO E WB A 阴离子交换树脂中和。树脂用 25 mL的乙腈洗涤两次。混合的乙腈减压蒸熘得到固体。用 C-18反相柱 (展开剂水：乙腈 =5: 1-1： : 1)纯化产物得到白色的化合物 1固体 120 mg

其它所列化合物均可采用类似的合成路线加以合成，下面的表格中选择列出了部分合成化合物的核磁谱图.

表 1: 1-12号化合物的结构和核磁谱

.60S.0/0T0ZN3/X3d S9CC00/ll0Z OAV

.60S.0/0T0ZN3/X3d S9CC00/ll0Z OAV 实施例 2: 组蛋白去乙酰化酶抑制剂的生物活性测试

组蛋白去乙酰基酶活性测定

酶活测定可用 BIOMOL公司的 HDACi测试试剂盒进行测试（参见 Journal of Medicinal Chemistry, 2008, 7417-7427. )。实验于 96孔板上进行。实验设置包括空白对照，阴性对照，阳性对照和化合物 5个剂量组（ 100 nM, 200 nM, 500 nM, 1.0 uM和 10 uM)。实验测定分两个阶段进行。在第一阶段的反应液包括： HDAC酶溶液（15 uL, 1U)，组蛋白去乙酰化酶抑制剂溶液（lO uL)和 HDAC酶的荧光多肽底物融液（25 uL)。这三个溶液都是 Tris的缓冲溶液（包含 50 mM Tris pH 8.0， 137 mM氯化钠， 2.7 mM氯化钾， 1 mM氯化镁和 lmg/mL 的 BSA)。该反应液在 30°C进行反应 45分钟。在第二阶段，首先加入试剂盒中的 "developer" 溶液 50 uL，然后在室温下反应 30分钟，然后在读板机上读取荧光数据（吸收光： 350 nm，发射光： 450 nm)。使用分析软件 Prism 4.0自一系列数据中得到 IC50值。

表 2: 1-12号化合物对 Hela细胞提取混酶的 IC50值

1-12号化合物抑制组蛋白去乙酰化酶的 IC50值为小于 1 μ Μ。因此其能够作为组蛋白去乙酰化酶的抑制剂。

实施例 3: 组蛋白去乙酰化酶抑制剂抑制肿瘤细 GI50值的测定

药物抑制肿瘤细胞生长的 GI50值的测定：

1. 接种细胞：用含 10 %胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000— 10000个细胞（A549(uM)， HepG2(uM), MDA-MB-231 )接种到 96孔板，每孔体积 100ul， 37°C， 5%(¾培养条件下培养 24h。

2. 加药：配置不同浓度的药物，并分别加入到对应的 96孔板，每个浓度做 3个复孔。

3. 培养细胞： 37°C， 5%C0₂培养条件下，培养 72h。

4. 呈色：每孔加 MTT溶液（5mg/ml) 20ul.继续孵育 4小时，终止培养，弃去孔内培养上

5. 清液，每孔加 150ul DMS0, 振荡 10分钟，使结晶物充分融解。

6. 比色：选择 570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

7. 将数值带入 0rigin75软件计算 IC50值。表 3 : 1-12号化合物抑制肿瘤细胞生长的 GI50值

IC50

化合物编号

A549(uM) HepG2(uM) MDA-MB-231

1 < 1 < 1 < 1 2 < 1 < 1 < 1 3 < 10 < 10 < 10 4 < 10 < 10 < 10 5 < 10 < 10 < 10

6 < 10 < 10 < 10

7 < 10 < 10 < 10

8 < 10 < 10 < 10

9 < 10 < 10 < 10

10 >20 >20 >20

11 >20 >20 >20

12 >20 <20 < 10 本发明的组蛋白去乙酰化酶抑制剂及其用途和制备方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims

1、一种利用点击化学合成的具有"分支"结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，该抑制剂为具有如下结构通式 Mi的化合物：

其中， A是一个 d-C₆的烷基链， 1¾和 R₂是被取代基取代或未被取代的烷基，环烷基，杂烷基，杂环烷基，链烯基，环烯基，杂烯基，杂环烯基，链炔基，环炔基，杂炔基，环杂炔基，芳基，或杂芳基，其中和可以相同或不同；

其中，取代基选自烷基，环烷基，杂烷基，杂环烷基，链烯基，环烯基，杂烯基，杂环烯基，链炔基，环炔基，杂炔基，环杂炔基，芳基，杂芳基，卤素， -CF₃， -OCF3, 羧基，磺酸基，氰基，羟基，氨基，或硝基。

2、根据权利要求 1所述的抑制剂，在、或中的至少一个单键中间可以插入桥接基团，桥接基团选自硫醚基（-S-) , 醚基，亚氨基（-NH-)，取代亚氨基（-NR -)，羰基，磺酰基，或亚磺酰基。

3、根据权利要求 1所述的抑制剂，结构通式的化合物是具有如下结构通式 M2的化合物：

其中， Xi、 X₂、 X₃和 X₄是 N或 CR_{3 ;} 可以是 NR₃， S或 O; Q₂可以是 N或 CR₃。其中 R₃选自 H，烷基，环烷基，杂烷基，杂环烷基，链烯基，环烯基，杂烯基，杂环烯基，链炔基，环炔基，杂炔基，环杂炔基，芳基，杂芳基， Μ, -CF₃, -OCF3, 羧基，磺酸基，氰基，羟基，氨基，或硝基。

4、根据权利要求 3所述的抑制剂，其中， CR3和 NR3中的 C、 N与 R3之间插入桥接基团，或 R3不为 H的取代基时，该取代基的至少某一个单键中间插入桥接基团，桥接基团选自硫醚基，醚基，亚氨基，取代亚氨基，羰基，磺酰基，或亚磺酰基。

5、根据权利要求 3所述的抑制剂，其中是11。

6、根据权利要求 3所述的抑制剂，该抑制剂为选自如下结构的化合物：

34 /s/u O z-z-ososld S9i00iAV

Li

S9C£00/llOZ OAV

Z.60SZ.O/OlOZM3/X3a

38

8、一种药物组合物，该组合物包含权利要求 1-7任一项所述的抑制剂或其盐，以及药学上可接受的载体。

9、权利要求 1-7任一项所述的抑制剂在制备治疗与细胞分化或增殖相关的疾病，心血管疾病，免疫类疾病和神经退行性疾病或癌症的药物中的用途。

10、权利要求 1-7任一项所述的抑制剂的前药化合物，前药化合物的各种异构形式，抑制剂的医药活性代谢物，代谢物在药学上可接受的盐，其中异构形式包括非镜像异构体、镜像异构体、互变异构体、双键的 E/Z异构体。