CN102416203B - 具有局部抗血小板效应的rna干扰血管支架涂层材料及其制成的局部抗凝血管支架 - Google Patents

Abstract

本发明“具有局部抗血小板效应的RNA干扰血管支架涂层材料及其制成的局部抗凝血管支架”，涉及生物医药领域的血管支架涂层技术。其特征在于：所述涂层材料的有效成分为至少一种RNA干扰重组质粒，所述一种RNA干扰重组质粒指其含有的插入DNA片段能够表达短链干扰RNA，该短链干扰RNA可抑制人类环氧化酶1基因PTGS1或人类P2RY12型ADP受体基因的表达。本发明的上述涂层材料籍基因调控途径实现了以阿司匹林为代表的环氧化酶抑制剂和以氯吡咯雷为代表的ADP受体抑制剂二类主要的抗血小板药物的抗血小板机制，并且使血管介入治疗中抗凝局部化，规避了药物的全身性分布所导致的使用禁忌及一系列副作用。

Description

具有局部抗血小板效应的RNA干扰血管支架涂层材料及其制成的局部抗凝血管支架

技术领域

本发明涉及生物医药领域的血管支架涂层技术，特别是一种具有局部抗血小板效应的RNA干扰血管支架涂层材料及其制成的支架。

背景技术

经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，简称PC I)已成为冠心病的重要治疗手段之一。我国目前开展PCI的机构超过1200家，年手术量达25万例。PCI的实质就是开通冠状动脉，实现病变区域的血运重建。PCI所运用的器材由球囊扩张逐步发展为血管支架，血管支架的发展经历了裸金属支架(bare metal stents，简称BMS)和药物洗脱支架(drug-eluting stents，简称DES)。药物洗脱支架的运用在带来巨大效益的同时，存在的问题也十分明显。其中，最严重的问题就是凝血反应，即血栓形成，其危险性甚至是致命的。为了预防血栓形成，从术前到术后，所有接受冠脉支架植入的患者均要经历抗凝治疗，其中，术后的抗凝治疗尤其艰巨。一般而言，在冠脉支架植入术后，抗血小板药阿司匹林须终身服用，其它抗血小板药如氯吡咯雷则需要服用1年左右。

解决PCI术后的抗凝治疗所产生的问题在心血管临床实践中是一个重大的挑战，主要表现在二个方面：(1)从总体上看，冠脉支架的血栓形成发生于局部的局部，也就是说，心脏是人体的局部，而病变部位又是心脏的局部。但是，抗凝治疗因没有局部手段而被迫采用全身性的，二者的对应性较差；(2)抗凝血药物本身的不适合和副作用问题十分突出。例如消化不良、消化性溃疡等常见病患者忌用阿司匹林这一心血管介入治疗中最常用的抗凝药，另外约1/4患者会产生阿司匹林抗药性。其它抗凝药物在长期服用后，也可能产生严重副作用，例如氯吡咯雷就可能导致血小板减少性紫癜等。

在使用冠脉支架的介入治疗后最常用的抗血小板药是阿司匹林，另一个常用的合并使用的抗血小板药是氯吡咯雷。阿斯比林的作用原理是抑制环氧化酶1(见注释1)，氯吡咯雷的药理作用原理是抑制P2RY12型ADP受体(见注释2)。短链干扰RNA(short interference RNA，简称siRNA)可以通过特定的设计对特定的基因表达在转录后和翻译前进行强力干扰。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指由高度保守的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的使同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域，但目前未见到用于静默人类环氧化酶1基因PTGS1及人类P2RY12型ADP受体基因以起到抗血小板的作用，更未见到与血管支架的联合使用方面的报道。

发明内容

本发明根据上述领域存在的技术问题和需求，提供一种具有局部抗血小板效应的，在细胞内具有表达能力的，主要生物活性成分为短链干扰RNA的血管支架涂层，特别是冠状动脉支架涂层及其制得的血管支架。

具有局部抗血小板效应的RNA干扰血管支架涂层材料，其特征在于：所述涂层材料的有效成分为至少一种RNA干扰重组质粒，所述一种RNA干扰重组质粒指其含有的插入DNA片段能够表达短链干扰RNA，所述短链干扰RNA所针对的靶序列为人类环氧化酶1基因PTGS1或人类P2RY12型ADP受体基因的转录产物上的一段长度为19nt的序列，所述靶序列的选取方法如下：

(1)靶序列长度基准为19nt；

(2)靶序列的5’端和/或3’端的6个碱基中，鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的数量之和等于或小于4；

(3)同一个靶序列二个相同的拷贝之间，连续配对的碱基不超过4个；

(4)靶序列自身不形成发卡型(hairpin)结构；

(5)如果所针对的基因存在转录变异体(见注释3)，则靶序列的选取区域锁定在该基因的所有转录变异体的共同序列部分；

(6)靶序列所在区域不存在已知的最低等位基因频率超过1％的单核苷酸多态(SNP)；

(7)靶序列与迄今为止已知的人的其它基因的连续匹配不超过16nt。

人类环氧化酶1基因PTGS1的转录产物上选取的靶序列为：

序列(A)：5’-AAGGGTGGGGAGGGGATGG-3’，

序列(B)：5’-TTCTTGCTGTTCCTGCTCC-3’或

序列(C)：5’-TTCACCCACTTCCTGCTCA-3’。

人类P2RY12型ADP受体基因的转录产物上选取的靶序列为：

序列(D)：5’-AGACTTTACTGACGAAAAC-3’，

序列(E)：5’-CATCTGTCAAGTCATTTTC-3’或

序列(F)：5’-TACACTCATTACAAAAGAA-3’。

所述涂层材料还包括涂层转染缓冲液，所述RNA干扰重组质粒溶于所述涂层转染缓冲液中，所述涂层转染缓冲液的配方如下：明胶2％(W/V)，pH7.5的HEPES 20mM，NaCl 120mM，二油酰三甲胺丙烷甲基盐酸盐0.01～0.1(g/100ml)。

所述RNA干扰重组质粒溶于涂层转染缓冲液中，浓度为50ng/ml。

用于制备上述具有局部抗血小板效应的RNA干扰血管支架涂层材料的RNA干扰重组质粒，其针对的靶标序列为：

序列(A)：5’-AAGGGTGGGGAGGGGATGG-3’，

序列(B)：5’-TTCTTGCTGTTCCTGCTCC-3’，

序列(C)：5’-TTCACCCACTTCCTGCTCA-3’，

序列(D)：5’-AGACTTTACTGACGAAAAC-3’，

序列(E)：5’-CATCTGTCAAGTCATTTTC-3’，或

序列(F)：5’-TACACTCATTACAAAAGAA-3’。

所述RNA干扰重组质粒的克隆载体为CMV质粒。

一种局部抗凝血管支架，包括支架本体和支架涂层，其特征在于所述支架涂层中包含上述任一涂层材料。

所述局部抗凝血管支架，所述支架涂层还包括由内而外依次为可溶性明胶-多聚氨基甲酸乙酯胶-热敏性多聚水凝胶-聚异丙基丙烯酰胺凝胶-鲑鱼精DNA背景阻滞剂构成的预处理涂层，所述鲑鱼精DNA背景阻滞剂的配方为：10mM pH 8.0的Tris-EDTA，2.0％明胶，5.0μg/ml鲑鱼精DNA。

所述预处理涂层由内而外第一层材料：30mg/ml可溶性明胶，厚10μm；第二层材料：30mg/ml多聚氨基甲酸乙酯胶，厚度为5μm；第三层材料：40mg/ml热敏性多聚水凝胶，厚度为6μm；第四层材料：50mg/ml聚异丙基丙烯酰胺凝胶，厚度为10μm；

所述预处理涂层表面包覆有一层所述鲑鱼精DNA背景阻滞剂；

所述涂层材料涂覆在所述预处理涂层的表面。

所述支架本体由适用于药物涂层支架的材料制成，所述适用于药物涂层的材料指316L不锈钢、钴铬合金，钛合金，钛镍合金，铁基，药物，聚乳酸，镁合金，聚乳酸与镁合金的混合物中的一种或几种材料。

一种局部抗凝血管支架的制备方法，步骤如下：

(1)在支架本体表面涂一层30mg/ml可溶性明胶，厚度为10μm；于洁净台风干后涂一层30mg/ml多聚氨基甲酸乙酯胶，厚度为4μm；然后再涂一层40mg/ml热敏性多聚水凝胶，厚度为6μm；最后再涂50mg/ml聚异丙基丙烯酰胺凝胶，厚度为10μm；

(2)将10mM pH 8.0的Tris-EDTA，2.0％明胶，5.0μg/ml鲑鱼精DNA配制成的混合液于93℃变性10分钟，然后置于0～4摄氏度环境中骤冷5分钟，取出于室温放置使其升至室温得到鲑鱼精DNA背景阻滞剂；

(3)将(1)所处理得的支架浸于所述鲑鱼精DNA背景阻滞剂中保持10分钟，取出支架并风干；

(4)以4.0瓦，254nm波长的紫外灯，距离所述支架表面20cm处，对支架表面照射，照射时间为2～5分钟；

(5)将上述涂层材料涂抹于经(4)处理后的支架表面。

本发明的目的之一是提供一种血管支架涂层材料，该涂层材料的活性成分为至少一种RNA干扰重组质粒，该重组质粒所表达的短链干扰RNA(short interference RNA，siRNA)通过环氧化酶1和P2RY12型ADP受体二个基因的转录产物(信使RNA，mRNA)上的靶标序列抑制所述二个基因的蛋白质表达。植入血管内的支架上涂覆涂层材料中的RNA干扰重组质粒在血管内能够持续动态地表达具有发卡(hairpin)结构的siRNA，该siRNA经细胞剪切加工后变为活性形式的siRNA，与靶标基因转录产生的信使RNA上同源片段特异性结合从而导致该靶标基因的信使RNA降解，由此特异地抑制靶标基因的蛋白质表达，本发明中的针对的靶标基因是环氧化酶1和/或P2RY12型ADP受体二个基因，使细胞内的环氧化酶1和P2RY12型ADP受体不再产生或产生的量大幅度降低。采用本发明的支架涂层材料的支架对采用冠脉支架介入治疗的患者能起到针对病灶的局部性的抗血小板作用，实现了局部凝血问题局部解决的治疗优化，也规避了因服用阿司匹林或/和氯吡咯雷等药物的全身抗凝疗法所引起的一系列副作用。

本发明中提供的涂层材料的有效成分至少含有一种RNA干扰重组质粒，这一种RNA干扰重组质粒所表达的短链干扰RNA针对的靶标序列为人类环氧化酶1基因PTGS1或人类P2RY12型ADP受体基因的mRNA序列上选取的一段长度为19nt的序列。本发明公开了发明人用于选取靶标序列如下规则：

(1)靶序列长度基准为19nt；

(2)靶序列的5’端和/或3’端的6个碱基中，鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的数量之和等于或小于4；

(3)同一个靶序列二个相同的拷贝之间，连续配对的碱基不超过4个；

(4)靶序列自身不形成发卡型(hairpin)结构；

(5)如果所针对的基因存在转录变异体，则靶序列的选取区域锁定在该基因的所有转录变异体的共同序列部分；

(6)靶序列所在区域不存在已知的最低等位基因频率超过1％的单核苷酸多态(SNP)；

(7)靶序列与迄今为止已知的人的其它基因序列的连续匹配不超过16nt。

本领域技术人员根据以上规则及其具备的常规实验技能，不需要付出创造性劳动即可选出若干条用于RNA干扰的靶序列片段并构建表达短链干扰RNA的重组载体，制备本发明的涂层材料，因此都属于本发明的保护范围。

为了达到足够的抑制靶标基因表达的效力，本发明的涂层材料所包含的RNA干扰重组质粒不限于一种，而是多种RNA干扰重组质粒的混合物，每一种RNA干扰重组质粒干扰靶标基因的一个片段以达到同时干扰同一个基因多个位点的目的。本发明提供的实施例5中，涂层材料的有效成分为三种RNA干扰重组质粒，同时干扰靶标基因的三个位点。

为了达到足够的抗血小板效力，本发明的涂层材料所包含的RNA干扰重组质粒也不限于针对一个基因，而可以是2个或二个以上的基因，这些基因在血小板发挥功能所必经的必要环节上具有重要作用。本发明提供的实施例6、例7和例8中，涂层材料中同时具有干扰人类环氧化酶1基因PTGS1和人类P2RY12型ADP受体基因的RNA干扰重组质粒。

本发明的发明人根据上述规则，选取了针对PTGS1基因的三个靶序列：

siR-PTGS1-knl-ts1：5’-AAGGGTGGGGAGGGGATGG-3’，

siR-PTGS1-knl-ts2：5’-TTCTTGCTGTTCCTGCTCC-3’

siR-PTGS1-knl-ts3：5’-TTCACCCACTTCCTGCTCA-3’，

针对P2RY12基因的三个靶序列：

siR-P2RY12-knl-ts1：5’-AGACTTTACTGACGAAAAC-3’

siR-P2RY12-knl-ts2：5’-CATCTGTCAAGTCATTTTC-3’和

siR-P2RY12-knl-ts3：5’-TACACTCATTACAAAAGAA-3’

来构建RNA干扰重组质粒及制备支架涂层材料。这些RNA干扰重组质粒可以单独作为涂层材料的有效成分，也可以是其中两种重组质粒或更多种重组质粒混合作为涂层材料的有效成分。

本发明中还提供了一种优选的转染缓冲液配方，用于与RNA干扰重组质粒混合制成涂层材料。当然，能够实现本发明目的的转染缓冲液不限于此，其中转染缓冲液包含的成分有二油酰三甲胺丙烷甲基盐酸盐，该成分是促使RNA干扰重组质粒进入细胞的关键成分，并且具有工作浓度区间无细胞毒性，诱导转染效率高等优点。本领域技术人员能够根据转染缓冲液配方在本发明中所具备的适用性而配制出同样能工作但是配方不一样的转染缓冲液，但这类转染缓冲液结合本发明提供的RNA干扰重组质粒而制成的涂层材料仍然在本发明的保护范围内。

本发明中还构建了用于制作涂层材料的有效成分的RNA干扰重组质粒，其核心技术在于提供了人类环氧化酶1基因PTGS1及人类P2RY12型ADP受体基因的mRNA序列上的靶序列，根据这些靶序列，本领域技术人员可以采用公开的克隆插入片断装配技术，利用不同的克隆载体，制作出具备同样效能的重组载体。用于直接构建RNA干扰重组质粒的，针对上述6个靶标序列的RNAi组装序列如Seq ID No.7～18所示。

本发明提供了这些RNA干扰重组质粒并不限于本发明公开的制作涂层材料及血管支架的用途。

本发明还提供了采用上述涂层材料的局部抗凝血支架及其制备方法。所用的支架本体由适用于药物涂层支架的材料制成，所述适用于药物涂层的材料指316L不锈钢、钴铬合金，钛合金，钛镍合金，铁基，药物，聚乳酸，镁合金，聚乳酸与镁合金的混合物中的一种或几种材料。支架的形状和大小也是不限的，由使用的具体需要而确定。

综合而言，本发明采用短链干扰RNA(short interference RNA，简称siRNA)可以通过特定的设计对特定的基因表达在转录后和翻译前进行强力干扰这一原理，我们选择了环氧化酶1和P2RY12型ADP受体二个基因实施基因表达抑制，也就是大幅度减少环氧化酶1和P2RY12型ADP受体二个由基因表达而生产的蛋白物质的产量，通过大幅减少蛋白质表达量而实质性地减弱其功能，实现了通过基因调控手段对阿司匹林和氯吡咯雷二者所代表的二类抗血小板药的药理作用模拟。这一发明在运用后替代了阿司匹林和氯吡咯雷二者所代表的二类抗血小板药的药理作用，同时弥补了其通过全身用药所产生的重大缺陷，通过局部的抗凝手段解决了局部的凝血问题，填补了因各种原因而产生的药物禁忌，并规避了服用药物带来的一系列副作用。

注释1：本发明中所称的环氧化酶1：

人类基因组织(HUGO)基因命名委员会(HGNC)全名：prostaglandin-endoperoxide synthase 1，

人类基因组织(HUGO)基因命名委员会(HGNC)代号：PTGS1，

国际酶学委员会(IEC)编号：EC 1.14.99.1

见于国际主要基因数据库的其它命名及代号：COX1；PGG/HS；PGHS-1；PTGHS1；cyclooxygenase-1；Prostaglandin H2 synthase 1；prostaglandin G/H synthase 1；COX-1；prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase；PGH synthase 1；Cyclooxygenase-1；PHS 1；COX3；PCOX1

注释2：本发明中所称的P2RY12型ADP受体：

人类基因组织(HUGO)基因命名委员会(HGNC)全名：purinergic receptor P2Y，G-proteincoupled，12

人类基因组织(HUGO)基因命名委员会(HGNC)代号：P2RY12

见于国际主要基因数据库的其它命名及代号：P2Y(cyc)；ADP-glucose receptor；HORK3；P2Y12platelet ADP receptor；SP 1999；G-protein coupled receptor SP 1999；ADPG-R；Gi-coupled ADPreceptor HORK3；P2T(AC)；P2Y purinoceptor 12；P2Y(AC)；purinergic receptor P2RY12；P2Y(ADP)；putative G-protein coupled receptor

注释3：本发明中所称的转录变异体：通常称alternative splicing，即变换剪切，例如PTGS1就存在2个不同的mRNA转录序列，所编码的蛋白质也不同，P2RY12虽然具有2个不同的mRNA转录序列，但所编码的蛋白质完全相同。

附图说明

图1.PTGS1基因区域的SNP分布状况及性质分析。

图2.P2RY12基因区域的SNP分布状况及性质分析。

图3.1个PTGS1基因的靶序列和1个P2RY12基因的靶序列BLAST结果图示。

图4.1个PTGS1基因的靶序列和1个P2RY12基因的靶序列BLAST结果列表。

图5.用于克隆的插入序列装配模式示意图。

图6.组装序列的琼脂糖电泳。

图7.转化成功的E.Coli在含氨苄青霉素培养基上生长。

图8.(A)PTGS1和(B)P2RY12基因蛋白表达水平在RNA干扰重组质粒作用下的改变。

为了区别，各重组质粒以其靶序列名称表示。蛋白水平以免疫印迹杂交图谱的光密度表示。图中虚线代表各组的均值。^*：P＜0.05，^**：P＜0.01，ANOVA，Tukey Post-Hoc统计分析。图9.三联RNA干扰载体对靶基因的抑制效应。

培养的人巨核细胞株分别转染3种针对人环氧化酶1基因的siRNA和3种针对人P2RY12型ADP受体基因的siRNA，48小时后收集细胞进行相应基因产物的免疫印迹杂交(WesternBlot)，相对于阴性对照的蛋白水平以光密度(OD)表示，所表示的数值为均值±标准差。^*：P＜0.05，^**：P＜0.01，n＝6，双侧配对t检验。

图10.定量实时聚合酶链式反应(Q-RT-PCR)图例。

图11.PTGS1和P2RY12的“阈循环-初始cDNA浓度”关系的直线拟合及拟合方程。

图12.RNA干扰重组支架对PTGS1和P2RY12基因蛋白表达的抑制。

培养的人巨核细胞株经siRNA支架作用后，以逆转录所产生的cDNA相对浓度表示转录水平，环氧化酶1基因和P2RY12型ADP受体基因的转录均降低。所表示的数值为均值±标准差。^*：P＜0.05，^**：P＜0.01，n＝5，双侧配对t检验。

具体实施方式

以下通过具体实施方式说明本发明，但本发明不限于以下实施方式，本发明与现有常规方式的结合而得的方案仍然在本发明的保护范围内。

实施例1：环氧化酶1基因和P2RY12型ADP受体基因中靶序列的确定。

环氧化酶1基因(以下简称PTGS1)和P2RY12型ADP受体基因(以下简称P2RY12)的基因序列资料均来自美国国家生物信息中心(NCBI)公开的公共数据库，此处采用的是相应的转录序列，即信使RNA(mRNA)序列。获得序列资料后，首先将序列整理成FASTA格式文本，然后采用VBA(Visual Basic for Application)计算机语言编程对序列中的靶序列进行计算机辅助的人工寻找，寻找的标准根据我们长期的实验室经验制定。具体包括：

(1)长度基准为19nt，

(2)5’端和3’端的6个碱基中，鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的数量之和等于或小于3，此条标准为选优标准，但如果候选序列中达不到此条要求，则此条标准可逐步逐次放宽，即先放弃3’端G/C数目要求，再放弃5’端G/C数目要求，由等于或小于3改为等于或小于4，依此类推；

(3)靶序列自身二个相同的拷贝序列之间不构成4个或4个以上的连续配对，如果全部候选序列均达不到此条要求，则仅排除4个以上的连续配对并且配对碱基包括3’端最后1个碱基的情形；

(4)靶序列自身不形成发卡(hairpin)型结构；

(5)如果所针对的基因存在转录变异体，则靶序列从覆盖所有转录变异体的共同序列中寻找；

(6)靶序列所在区域不存在已知的最低等位基因频率超过1％的单核苷酸多态(SNP)。已知SNP的范围则根据美国加利福利亚大学圣克鲁兹分校(University of California Santa Cruz，UCSC)所开发的基因组浏览器(genome browser)进行搜索，该浏览器及相关数据库全部为公开公共的信息资料，其中公共的SNP数据库，也包括全部公开报道的包括中国在内的亚洲人群，SNP的详细信息同时参考NCBI的公共数据库；

(7)靶序列除了与设定的基因完全匹配外，与人的其它所有迄今为止已知的约3万个基因没有超过16nt的连续匹配，匹配的判定则根据美国国家生物信息中心针对人类基因组的BLAST(basic logical alignment search tool)检索来判定。

基因转录序列资料的具体来源

本例中采用的习惯名称：环氧化酶1

基因国际标准代号：PTGS1

转录序列资料来源：NCBI

转录序列来源物种：人

已知转录变异体数目：2

转录序列变异体1代号及版本：NCBI  NM_000962.2

转录序列变异体2代号及版本：NCBI  NM_0805911

资料性质：公开的公共科学信息

本例中采用的习惯名称：P2RY12型ADP受体

基因国际标准代号：P2RY12

转录序列资料来源：NCBI

转录序列来源物种：人

已知转录变异体数目：2

转录序列变异体1代号及版本：NCBI NM_022788.3

转录序列变异体2代号及版本：NCBI NM_176876.1

资料性质：公开的公共科学信息

获得序列资料之后，为了使靶序列避开SNP，利用UCSC Genome Browser对基因区域做了SNP分析，见图1和图2。

基于上述转录序列资料和我们实验室长期得出的经验成果即前述7条标准，我们设计了针对两个基因的如下的靶序列：

针对PTGS1基因的靶序列：

Seq ID No.1siR-PTGS1-knl-ts1：5’-AAGGGTGGGGAGGGGATGG-3’

Seq ID No.2siR-PTGS1-knl-ts2：5’-TTCTTGCTGTTCCTGCTCC-3’

Seq ID No.3siR-PTGS1-knl-ts3：5’-TTCACCCACTTCCTGCTCA-3’

针对P2RY12基因的靶序列：

Seq ID No.4siR-P2RY12-knl-ts1：5’-AGACTTTACTGACGAAAAC-3’

Seq ID No.5siR-P2RY12-knl-ts2：5’-CATCTGTCAAGTCATTTTC-3’

Seq ID No.6siR-P2RY12-knl-ts3：5’-TACACTCATTACAAAAGAA-3’

基因靶序列命名说明：“siR”表示短链干扰RNA，“PTGS1”和“P2RY12”是基因标准代号，“knl”是kernel(核心)的意思，意指此为后续设计的核心序列，“ts”是target sequence(靶序列)的简称，数字表示序号。

为了确保依据靶序列的siRNA仅作用于靶基因，而不会因为非特异匹配作用于其它基因，我们用靶序列作索引序列对人类全基因组进行了BLAST检索，结果为，完全匹配的只有靶序列所来源的靶基因，其它的非特异匹配均不超过(N-3)nt(N为靶序列长度，说明靶序列具有可信的特异性。图3和图4为以siR-PTGS1-knl-ts1和siR-P2RY12-knl-ts3二个靶序列特异性序列匹配检索结果。

实施例2：针对PTGS1和P2RY12的表达型短链干扰RNA重组质粒的克隆插入序列的组装、合成、纯化和退火

克隆插入序列的组装参照图5的模式图进行，具体组装结果如下。

针对PTGS1基因的插入片断组装序列：

Seq ID No.7siR-PTGS1-is1-F：

5’-GATCCAAGGGTGGGGAGGGGATGGTTCAAGAGACCATCCCCTCCCCACCCTTAGA-3’

Seq ID No.8siR-PTGS1-is1-R：

5’-AGCTTCTAAGGGTGGGGAGGGGATGGTCTCTTGAACCATCCCCTCCCCACCCTTG-3’

Seq ID No.9siR-PTGS1-is2-F：

5’-GATCCTTCTTGCTGTTCCTGCTCCTTCAAGAGAGGAGCAGGAACAGCAAGAAAGA-3’

Seq ID No.10siR-PTGS1-is2-R：

5’-AGCTTCTTTCTTGCTGTTCCTGCTCCTCTCTTGAAGGAGCAGGAACAGCAAGAAG-3’

Seq ID No.11siR-PTGS1-is3-F：

5’-GATCCTTCACCCACTTCCTGCTCATTCAAGAGATGAGCAGGAAGTGGGTGAAAGA-3’

Seq ID No.12siR-PTGS1-is3-R：

5’-AGCTTCTTTCACCCACTTCCTGCTCATCTCTTGAATGAGCAGGAAGTGGGTGAAG-3’

针对P2RY12基因的插入片断组装序列：

Seq ID No.13.siR-P2RY12-is1-F：

5’-GATCCAGACTTTACTGACGAAAACTTCAAGAGAGTTTTCGTCAGTAAAGTCTAGA-3’

Seq ID No.14.siR-P2RY12-is1-R：

5’-AGCTTCTAGACTTTACTGACGAAAACTCTCTTGAAGTTTTCGTCAGTAAAGTCTG-3’

Seq ID No.15.siR-P2RY12-is2-F：

5’-GATCCCATCTGTCAAGTCATTTTCTTCAAGAGAGAAAATGACTTGACAGATGAGA-3’

Seq ID No.16.siR-P2RY12-is2-R：

5’-AGCTTCTCATCTGTCAAGTCATTTTCTCTCTTGAAGAAAATGACTTGACAGATGG-3’

Seq ID No.17.siR-P2RY12-is3-F：

5’-GATCCTACACTCATTACAAAAGAATTCAAGAGATTCTTTTGTAATGAGTGTAAGA-3’

Seq ID No.18.siR-P2RY12-is3-R：

5’-AGCTTCTTACACTCATTACAAAAGAATCTCTTGAATTCTTTTGTAATGAGTGTAG-3’

注：组装序列命名说明。“siR”表示短链干扰RNA，“PTGS1”和“P2RY12”是基因标准代号，“is”是inserted sequence(插入序列)的简称，数字表示序号，F：正义序列，R：反义序列。

序列组装完成后，采用ABI 391ADNA合成仪合成，合成方法根据仪器厂家说明书进行，合成后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)按常规方法纯化。在退火之前，以2％琼脂糖电泳检测，见图6。

退火所用试剂均为普通化学试剂，由市场采购获得。

退火缓冲液配方如下：

25mM  羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)(pH 7.4)

120mM醋酸钾

2.5mM醋酸镁

退火混合液配方如下：

2μl插入片断组装序列正义链寡聚核苷酸(约100ng DNA)

2μl插入片断组装序列反义链寡聚核苷酸(约100ng DNA)

46μl 1X退火缓冲液

以上混合物于90℃加热3分钟变性，再于37℃孵育1小时，退火即告完成。

实施例3：组装片段与载体连接、E.Coli转化和筛选

材料：

实施例1和2制备得到的双链插入片段。

CMV载体质粒购自美国Ambion公司。

内切酶、T4DNA连接酶、大肠杆菌(E.Coli)、LB培养基、琼脂糖、氨苄青霉素均通过商业购买获得。

方法

CMV载体质粒经BamHI和HindIII于37℃消化1小时，消化所用缓冲液为供应厂家随内切酶配送的缓冲液。消化完成后于2％琼脂糖电泳分离，采用常规的低溶点琼脂糖回收法回收，回收后与退火而得的双链插入序列一起进行连接反应，连接反应配方如下：

50mM Tris-HCl(pH 7.5)

10mM MgCl₂

1mM ATP

10mM二硫苏糖醇

90ng经退火的双链插入序列DNA

2ng回收的CMV载体质粒酶切产物

总反应体积50μl

以上混合物在16℃连接反应1小时，获得连接反应混合液备用。

连接反应结束后，按下述配方配制SOB液：

2％(W/V)胰蛋白胨

0.5％(W/V)酵母提取物

10mM NaCl

10mM MgSO₄

10mM MgCl₂

转化反应按下述步骤进行：

100μl E.Coli加20μl前述连接反应混合液混匀，冰浴30分钟，然后于42℃热休克1分钟，再转入冰浴2分钟，加1ml SOB液，置入37℃水域剧烈振摇(震动＞200次/分)1小时。然后于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖抗性培养基上划线接种，置于37℃培养24小时。转化成功的E.Coli可以在抗性培养基上生长(见图7)。

转化成功的E.Coli经扩繁以及常规质粒提取、纯化步骤，即得到RNA干扰重组质粒，可作为涂层材料的有效成分运用于血管支架涂层。

实施例4：对靶基因抑制效应的验证

材料：

实施例3获得的6种RNA干扰重组质粒

细胞株：DAMI人巨核细胞株，购自美国ATCC公司；

抗体：兔抗人Cox-1(PTGS1)抗体购自美国Santa Cruz公司，1ml包装，含抗体100μg，兔抗人P2RY12抗体购自美国Abcam公司，100μl包装，含抗体约100μg；

DMEM培养基、胎牛血清、蛋白印迹杂交的凝胶、显影剂等耗材购自美国Invitrogen公司，细胞培养皿，6孔板购自美国Falcon公司；

磷酸酶抑制剂购自Sigma-Aldrich公司，其它化学试剂均通过商业购买获得。

方法

采用人巨核细胞株DAMI(产生血小板的细胞)，在直径10cm培养皿中以DMEM加5％胎牛血清培养72小时后，收集细胞并重新后分布于8个6孔板，分别以针对人环氧化酶1基因和人P2RY12型ADP受体基因的各个RNA干扰重组质粒转染，对照采用未重组的CMV质粒，转染剂量为20ng/ml。

转染采用美国Invitrogen公司Transfectamine2000试剂盒，按其说明书进行，48小时后经1000g、10分钟离心收集细胞，将细胞沉淀重悬于1毫升冰冷的裂解缓冲液中并转移至2.0毫升Eppendorf离心管中。

裂解缓冲液配方如下：

20mM Tris-HCl(pH7.5)

1mM EDTA

1mM EGTA

2.5mM焦磷酸钠

1％Triton X-100

150mM氯化钠

1mM β-磷酸甘油

5mM二硫苏糖醇

1％磷酸酶抑制剂Cocktail I

1％磷酸酶抑制剂Cocktail II，

10％磷酸酶抑制剂Cocktail

离心管中的样本通过超声剪切后，在14000g离心5分钟去处不溶性沉渣。蛋白浓度测定采用Pierce公司BCA蛋白试剂盒进行。将等量的蛋白加入到8-16％SDS-PAGE中进行电泳分离然后电转移至硝酸纤维素膜。

硝酸纤维素膜上的非特异结合通过以下杂交液屏蔽，

杂交液：Tris缓冲盐水，0.1％吐温-20，5％脱脂牛奶。

抗体：初始测试使用1∶500稀释，此后可以根据初始测试结果调整稀释浓度。次级抗体为辣根过氧化物酶耦联抗体。

免疫复合物用美国Amersham公司ECL加强型试剂盒探测。

免疫印迹的定量分析采用英国Syngene公司Syngene G：BOX凝胶建档及分析系统进行。

通过蛋白表达水平的定量分析，判断PTGS1基因蛋白产物及P2RY12基因蛋白产物在每种siRNA作用下水平下降的程度。

结果

在RNA干扰重组质粒的作用下，PTGS1基因蛋白产物发生了15～34％的下降，P2RY12基因蛋白产物发生了28～38％的下降，见图8。

实施例5：在多个表达型RNA干扰重组质粒的协同作用下，靶基因抑制效应的验证

方法基本同实施例4，不同之处在于：此例采用3个siRNA干扰重组质粒共转染细胞，其剂量为15ng/ml，每种siRNA重组质粒的剂量为5ng/ml。

通过蛋白表达水平的定量分析，针对PTGS1基因的三联siRNA对PGST1基因抑制程度达到了53.65±14.69％，针对P2RY12基因的三联siRNA对P2RY12基因的抑制达到了67.38±18.26％，见图9。

实施例6.制作待用的siRNA重组载体血管支架

材料：

支架本体，本例采用钴铬合金作为支架的基础结构，支架由北京中孵友信医药科技股份有限公司生产。但本发明中RNA干扰重组质粒涂层材料适用的支架不限于此。适用于药物涂层支架的材料制成的支架都可以使用，所述适用于药物涂层的材料指316L不锈钢、钴铬合金，钛合金，钛镍合金，铁基，药物，聚乳酸，镁合金，聚乳酸与镁合金的混合物中的一种或几种材料。

预处理涂层试剂：30mg/ml可溶性明胶，30mg/ml多聚氨基甲酸乙酯胶，40mg/ml热敏性多聚水凝胶，50mg/ml聚异丙基丙烯酰胺凝胶(IPAAM)

鲑鱼精DNA背景阻滞剂：10mM Tris-EDTA(pH 8.0)，2.0％(W/V)明胶，5.0μg/ml鲑鱼精DNA。混合液在93℃变性10分钟，然后置于碎冰中骤冷5分钟取出于室温放置升温至室温待用。

涂层转染缓冲液：2％(W/V)明胶，20mM HEPES(pH 7.5)，120mM NaCl，0.025％(W/V)二油酰三甲胺丙烷甲基盐酸盐。

涂层材料：提纯并冷冻干燥的表达siRNA的重组质粒，全部6种RNA干扰重组质粒按等比的克分子浓度混合，溶于涂层转染缓冲液中，重组质粒的终浓度为50ng/ml。

方法

步骤1.在支架本体表面涂一层30mg/ml可溶性明胶，厚度为10μm。于洁净台风干后涂一层30mg/ml多聚氨基甲酸乙酯胶，厚度为4μm。然后再涂一层40mg/ml热敏性多聚水凝胶，厚度为6μm，50mg/ml聚异丙基丙烯酰胺凝胶(IPAAM)，厚度为10μm。于洁净台风干。

步骤2.将步骤1.制得的支架浸于鲑鱼精DNA背景阻滞剂中保持10分钟后取出于洁净台风干。

步骤3.以4.0瓦，254nm波长的紫外灯，距离支架表面20cm处，对支架表面照射，平均照射时间为3分钟。

步骤4.将涂层材料均匀涂抹于步骤3.处理后的支架表面，于无菌工作间自然干燥。至此，即制成RNA干扰重组载体的血管支架。

实施例7，siRNA重组载体血管支架对基因转录抑制的验证

材料

细胞同实施例4，引物合成同实施例2，实施例6制得的支架，RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自德国Qiagen公司，定量实时PCR扩增缓冲液购自美国Bio-Rad公司，其它材料均通过商业购买获得。

方法

步骤1.针对PTGS1基因合成下列引物用于聚合酶链式反应(PCR)

F：5’-TCTTTCACCCACTTCCTGCTC-3’

R：5’-GACTGGGGATAAGGTTGGAGC-3’，

针对P2RY12基因合成下列引物用于PCR

F：5’-CTTGGGGGCTAAGATTCTCTCT-3’

R：5’-CTGCCTGTTGGTCAGAATCAT-3’。合成方法同实施例2。

步骤2.巨核细胞置于Falcon 25ml斜颈有机玻璃方型培养瓶中于37℃培养48小时，培养液体积为5ml，然后以无菌巴斯德吸管吹打5分钟使细胞脱壁悬浮。观察组将2个直径3.5mm×18mm的siRNA重组载体血管支架加入其中，对照组将2个直径3.5mm×18mm的CMV载体质粒(空白CMV载体质粒)血管支架加入其中，此处所用二种支架均按照实施例6制作。将培养瓶置于美国Lab-line 3518型水平混旋器之上，以10次/分钟的频率，于37℃继续培养48小时，然后取出支架，用pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗支架，冲洗液收集于50ml锥形底离心管中，2500g离心10分钟收集细胞。观察组和对照组剩余的培养液收集入其它50ml锥形底离心管中，以1000g离心5分钟收集细胞，以pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗2次。至此，共有三组细胞：A.观察组由支架上冲洗的细胞；B.对照组由支架上冲洗的细胞；C.二组剩余培养液中的细胞。

步骤3.步骤2的三组细胞采用德国Qiagen RNAeasy mini试剂盒提取RNA，提取方法根据试剂盒说明书进行。A、B二组RNA用以比较基因转录水平的高低，C组RNA用作定量实时聚合酶链式反应(Q-RT-PCR)中，阈循环-初始cDNA浓度的关系曲线。

步骤4.步骤3所获得的RNA采用德国Qiagen Omniscript逆转录试剂盒进行逆转录，逆转录的反应混合物配制如下。

本步骤结束后获得逆转录产物混合液。

步骤5：对步骤4所获得的C组逆转录产物按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶6、1∶30进行梯度稀释，稀释后的混合液进行定量实时聚合酶链式反应(Q-RT-PCR)。Q-RT-PCR扩增缓冲液由Bio-Rad购买，内含四种核苷三磷酸(ATP、GTP、GTP和TTP)，Taq DNA聚合酶，MgCl₂，SYBR GreenI，荧光素，稳定剂。

反应混合物按下述配比：

反应条件设计为：95℃、3分钟变性，然后进入一个40个周期的热循环，每个循环为95℃、10秒+55℃、45秒，循环结束后在95℃保持1分钟，随后在55℃保持1分钟，然后进行80级梯度升温，每级比前一级升高0.5℃，直至95℃，在每个温度级保持10秒。

反应在美国PE公司ABI 7900HT型荧光定量PCR仪中进行，反应结果例如如图10所示。

本步骤完成后可以获得“阈循环-初始cDNA浓度”关系拟合方程，此方程是后续定量分析的基础。本步骤已知初始cDNA的相对浓度，此浓度与初始cDNA浓度的对数值呈线性相关。见图11。

步骤6：将步骤4所获得的A组和B组逆转录产物经真空离心干燥后，重悬于10μl无核酸酶的纯水，然后按步骤4的方法实施定量实时聚合酶链式反应。反应结果所获得的阈循环值，根据步骤4所获得的“阈循环-初始cDNA浓度”关系拟合方程反向推导出初始cDNA的相对浓度，因cDNA直接来源于mRNA的逆转录，所以代表了基因的转录水平。

结果

PTGS1和P2RY12二个基因的逆转录水平在siRNA支架作用下明显降低，其中，PTGS1降低了44.64±6.47％；P2RY12降低了64.13±22.92％。见图12。

实施例8，siRNA重组载体血管支架对基因翻译(蛋白质合成)抑制的验证

实施例7中的验证方法适应面广，只要能从支架冲洗下的细胞中获得10pg以上，即10^-11g以上的RNA即可，可以适用于任何大小的涂层支架。但是，实施例7的验证方法属于间接验证，因为最终发挥作用的是蛋白质。本例的验证方法属于直接验证，需要获得10万个以上从支架上冲洗下来的细胞，适用于多个或表面积较大支架，但具体以获得的细胞数为准。

材料

细胞同实施例4，抗体来源同实施例4，实施例6制得的支架，其它材料均通过商业购买获得。

方法

步骤1：巨核细胞置于Falcon 250ml斜颈有机玻璃方型培养瓶中于37℃培养48小时，培养液体积为35ml，然后以无菌巴斯德吸管吹打5分钟使细胞脱壁悬浮，观察组将5个直径3.5mm×45mm的siRNA重组载体血管支架加入其中，对照组将5个直径3.5mm×45mm的CMV载体质粒血管支架加入其中。将培养瓶置于美国Lab-line 3518型水平混旋器之上，以10次/分钟的频率，于37℃继续培养48小时，然后取出支架，用pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗支架，冲洗液收集于50ml锥形底离心管中，2500g离心10分钟收集细胞。siRNA重组质粒组和空白CMV质粒组的细胞分开收集。

步骤2：将细胞沉淀重悬于1毫升冰冷的裂解缓冲液，缓冲液配方同实施例4。样本后续处理方法同实施例4。

步骤3：蛋白免疫印迹杂交及定量分析，同实施例4。

结果

与CMV空载体质粒涂层支架相比，RNA干扰重组质粒支架对PTGS1和P2RY12二个基因的蛋白质表达均有显著的抑制作用，其中，PTGS1蛋白水平与对照相比下降了60.13±21.3％(P＜0.01，t检验)，P2RY12蛋白水平与对照相比下降了48.03±20.9％(P＜0.05，t检验)。

Claims (10)

1.具有局部抗血小板效应的RNA干扰血管支架涂层材料，其特征在于：所述涂层材料的有效成分为至少一种RNA干扰重组质粒，所述一种RNA干扰重组质粒指其含有的插入DNA片段能够表达短链干扰RNA，所述短链干扰RNA所针对的靶序列为人类环氧化酶1基因PTGS1或人类P2RY12型ADP受体基因的转录产物上的一段长度为19nt的序列，所述靶序列的选取方法如下：

(1)靶序列长度基准为19nt；

(2)靶序列的5’端和/或3’端的6个碱基中，鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的数量之和等于或小于4；

(3)同一个靶序列二个相同的拷贝之间，连续配对的碱基不超过4个；

(4)靶序列自身不形成发卡型(hairpin)结构；

(5)如果所针对的基因存在转录变异体，则靶序列的选取区域锁定在该基因的所有转录变异体的共同序列部分；

(6)靶序列所在区域不存在已知的最低等位基因频率超过1%的单核苷酸多态(SNP)；

(7)靶序列与迄今为止已知的人的其它基因序列的连续匹配不超过16nt；

人类环氧化酶1基因PTGS1的转录产物上选取的的靶序列为：

序列(A)：5’-AAGGGTGGGGAGGGGATGG-3’，

序列(B)：5’-TTCTTGCTGTTCCTGCTCC-3’或

序列(C)：5’-TTCACCCACTTCCTGCTCA-3’；

人类P2RY12型ADP受体基因的转录产物上选取的靶序列为：

序列(D)：5’-AGACTTTACTGACGAAAAC-3’，

序列(E)：5’-CATCTGTCAAGTCATTTTC-3’或

序列(F)：5’-TACACTCATTACAAAAGAA-3’。

2.根据权利要求1所述的具有局部抗血小板效应的RNA干扰血管支架涂层材料，所述涂层材料还包括涂层转染缓冲液，所述RNA干扰重组质粒溶于所述涂层转染缓冲液中，所述涂层转染缓冲液的配方如下：明胶2%（w/v），pH7.5的HEPES20mM，NaCl120mM，二油酰三甲胺丙烷甲基盐酸盐0.01～0.1%（w/v）。

3.根据权利要求4所述的具有局部抗血小板效应的RNA干扰血管支架涂层材料，所述RNA干扰重组质粒溶于涂层转染缓冲液中，浓度为50ng/ml。

4.用于制备权利要求1～5任一所述的具有局部抗血小板效应的RNA干扰血管支架涂层材料的RNA干扰重组质粒，其针对的靶标序列为：

序列(A)：5’-AAGGGTGGGGAGGGGATGG-3’，

序列(B)：5’-TTCTTGCTGTTCCTGCTCC-3’，

序列(C)：5’-TTCACCCACTTCCTGCTCA-3’，

序列(D)：5’-AGACTTTACTGACGAAAAC-3’，

序列(E)：5’-CATCTGTCAAGTCATTTTC-3’，

或序列(F)：5’-TACACTCATTACAAAAGAA-3’。

5.根据权利要求4所述的RNA干扰重组质粒，克隆载体为CMV质粒。

6.一种局部抗凝血管支架，包括支架本体和支架涂层，其特征在于：所述支架涂层中包含权利要求1～3任一所述的具有局部抗血小板效应的RNA干扰血管支架涂层材料。

7.根据权利要求6所述的局部抗凝血管支架，所述支架涂层还包括由内而外依次为可溶性明胶-多聚氨基甲酸乙酯胶-热敏性多聚水凝胶-聚异丙基丙烯酰胺凝胶-鲑鱼精DNA背景阻滞剂构成的预处理涂层，所述鲑鱼精DNA背景阻滞剂的配方为：10mM pH8.0的Tris-EDTA，2.0%明胶，5.0μg/ml鲑鱼精DNA。

8.根据权利要求7所述的局部抗凝血管支架，所述预处理涂层由内而外第一层材料：30mg/ml可溶性明胶，厚10μm；第二层材料：30mg/ml多聚氨基甲酸乙酯胶，厚度为5μm；第三层材料：40mg/ml热敏性多聚水凝胶，厚度为6μm；第四层材料：50mg/ml聚异丙基丙烯酰胺凝胶，厚度为10μm；

所述预处理涂层表面包覆有一层所述鲑鱼精DNA背景阻滞剂；

所述涂层材料涂覆在所述预处理涂层的表面。

9.根据权利要求6～8任一所述的局部抗凝血管支架，所述支架本体由适用于药物涂层支架的材料制成，所述适用于药物涂层的材料指316L不锈钢、钴铬合金，钛合金，钛镍合金，镁合金中的一种或几种材料。

10.一种局部抗凝血管支架的制备方法，步骤如下：

（1）在支架本体表面涂一层30mg/ml可溶性明胶，厚度为10μm；于洁净台风干后涂一层30mg/ml多聚氨基甲酸乙酯胶，厚度为4μm；然后再涂一层40mg/ml热敏性多聚水凝胶，厚度为6μm；最后再涂50mg/ml聚异丙基丙烯酰胺凝胶，厚度为10μm；

（2）将10mM pH8.0的Tris-EDTA，2.0%明胶，5.0μg/ml鲑鱼精DNA配制成的混合液于93°C变性10分钟，然后置于0～4摄氏度环境中骤冷5分钟，取出于室温放置使其升至室温得到鲑鱼精DNA背景阻滞剂；

（3）将（1）所处理得的支架浸于所述鲑鱼精DNA背景阻滞剂中保持10分钟，取出支架并风干；

（4）以4.0瓦，254nm波长的紫外灯，距离所述支架表面20cm处，对支架表面照射，照射时间为2～5分钟；

（5）将权利要求1～3任一所述的涂层材料涂抹于经（4）处理后的支架表面。

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