CN102416200A - 一种构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法 - Google Patents
一种构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法，其特点是在胶原为主的生物大分子存在条件下合成微米级CaCO3微球，以CaCO3微球为模板，通过CaCO3微球模板在磷酸盐溶液环境中向钙磷矿物的转化而得到羟基磷灰石微球，同时利用胶原大分子自组装形成三维纤维网络而得到结合有羟基磷灰石微球的杂化凝胶，进而得到胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料，实现了温和条件下于生物大分子基质内原位合成微米级羟基磷灰石微球。这种胶原基复合支架材料中的钙磷微球是由碳酸型羟基磷灰石构成，在成分上具有良好的仿生性和生物相容性；同时该复合支架材料在结构上具有纳米、微米至宏观的多尺度分布特性。
Description
技术领域
本发明涉及一种构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法，属于生物材料、组织工程和生物矿化领域。
背景技术
细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)是由细胞分泌到细胞外间质中的生物大分子构成的复杂网架，它支持并连接细胞和组织结构，调节细胞的生理活动。组织工程支架是利用特定生物材料构建起来的具有细胞外基质功能特性的人工仿生支架，是为构建组织的细胞提供结构支撑作用，为细胞生长提供适宜的生理微环境，引导组织再生修复并控制组织的形态结构。
理想的组织工程支架材料要求在成分和结构上都接近自然组织的细胞外基质。利用类似于细胞外基质成分中的蛋白或糖胺聚糖等天然大分子来构建三维组织工程支架[38]，相比于合成高分子材料，可以更好地支持细胞的生长，引导缺损组织的修复和重建。而在结构上，机体组织具有纳米-微米-宏观的多尺度空间分布特点。这种多尺度结构与其成分一道赋予了组织重要的生物学性能和力学性能。
机体骨组织是由有机成分和无机成分经过精巧组装构成的复合物，并具有典型的多尺度分布结构。其有机成分主要包括大量的胶原蛋白和少量的非胶原蛋白及多糖等细胞外基质成分；无机相主要是以低结晶度的纳米羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)为主的钙磷矿物。胶原是细胞外基质的主要结构蛋白，具有良好的生物相容性和完全的生物降解性，同时也具备较高的抗张强度和弹性模量；羟基磷灰石不仅有良好的生物相容性，还具有骨传导性和骨诱导性。因而仿照骨组织构建胶原与羟基磷灰石为代表的有机-无机复合支架材料是近年组织工程领域研究的热点。
目前，制备以胶原为主的天然高分子与无机矿物复合而成的复合支架材料有直接共混法、共沉淀法、原位合成法和模拟体液矿化法等[李志宏，武继民，许媛媛.纳米羟基磷灰石-胶原蛋白-壳聚糖复合生物材料.功能材材，2007增刊，38：1748-1750；廖素三，崔福斋，张伟.组织工程中胶原基纳米骨复合材料的研制.中国医学科学院学报，2003，25(1)：36-39；Xinyu Shen，Li Chen，Xuan Cai，Tong Tong，Hua Tong，Jiming Hu，A Novel Method for the Fabrication of HomogeneousHydroxyapatite/Collagen Nanocomposite and Nanocomposite Scaffold with Hierarchical Porosity.J MaterSci：Mater Med.2011，22(2)：299-305；章文苑，律娅婧.纳米羟基磷灰石/I型胶原/壳聚糖复合支架材料的制备与优化，生物骨科材料与临床研究，2011，8(3)：1-4；Zhang LJ，Feng XS，Liu HG，et al.Hydroxyapatite/collagen composite materials formation in simulated body fluid environment.MaterialsLetters，2004，58(6)：719-722；Al-Munajjed A A，Plunkett N A，Gleeson J.，Weber T.，Jungreuthmayer C，Levingstone T，Hammer JO’Brien F J.J.Biomed.Mater.Res.B：Appl.Biomater.，2009，90(2)：584-591]。这些方法所制得的复合材料在成分上仿生了自然骨组织基质。而直接共混法中，纳米羟基磷灰石粉体在与生物大分子溶液混合的过程中易发生团聚，导致所得复合材料的性能可控性差；共沉淀法、原位合成法及模拟体液矿化等方法虽然在不同程度上模拟钙磷矿物对大分子基质的生物矿化过程，但所制备的复合材料在其微结构上只存在单一的纳米级尺度分布(无机纳米粒子和有机纳米纤维)，不具备自然机体组织的纳米-微米-宏观的多尺度结构特点。
利用自组装法可以制备出具有分级结构(包括纳米级、微米级和毫米级)的胶原/羟基磷灰石复合基体[Nassif N，Gobeaux F，Seto J，Belamie E，Davidson P，Panine P，Mosser G，Fratzl P，Guille M M G.Self-Assembled Collagen-Apatite Matrix with Bone-like Hierarchy.Chem.Mater.，2010，22：3307-3309]。但是该方法对胶原蛋白所处状态有特殊要求，即要求极高浓度(300mg/ml)的液晶状态下的胶原蛋白与羟基磷灰石进行共沉淀反应，以能得到微米尺度的羟基磷灰石形核。这样的特殊要求使该方法的应用受限，且胶原基质的矿化程度较低。
在微米级羟基磷灰石微粒的获得中，有用油包水的微乳液法并后续高温烧结来制备羟基磷灰石微球[薛辉，蔡玉荣，姚菊明.微乳液法制备多孔中空羟基磷灰石微球的研究.浙江理工大学学报，2011，28(3)：338-342]。这种方法涉及使用有机溶剂和高温烧结，不能满足在生物大分子存在条件下制备的要求，且制得的微球粒径达几百至上千微米。
有研究者利用仿生方法，以牙基质蛋白和I型胶原蛋白为大分子基质来诱导并控制羟基磷灰石成核和分级组装，得到粒径达几十微米的羟基磷灰石微球[Matrix Macromolecules inHard Tissues Control the Nucleation and Hierarchical Assembly of Hydroxyapatite Sivakumar Gajjeraman，Karthikeyan Narayanan，Jianjun Hao，Chunlin Qin，and Anne George.J.Biol.Chem.，2007，282(2)：1193-1204]。这种制备方法需要在半固式的结晶介质中才能实施，晶体诱导生长的周期很长(40天以上)，并且少量的基质大分子只是作为成核诱导剂而不足构成支架网络。
在水热法合成羟基磷灰石中引入聚电解质聚苯乙苯磺酸盐作为改性剂，可以制得二十多微米左右的具有多级结构的羟基磷灰石微球[Yongsheng Wang，Meer Saiful Hassan，PoernomoGunawan，Raymond Lau，Xin Wang，Rong Xu.Polyelectrolyte mediated formation of hydroxyapatitemicrospheres of controlled size and hierarchical structure.J.Colloid Interface Sci.，2009，339：69-77]。但该方法包括在100℃以上的高温下处理十多个小时的步骤，因而不能用于在生物大分子基质内合成羟基磷灰石微粒。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法。其特点是在以胶原为主的生物大分子存在条件下合成微米级CaCO3微球，以CaCO3微球为模板，通过CaCO3微球模板在磷酸盐溶液环境中向钙磷矿物的转化而得到羟基磷灰石微球，同时利用胶原大分子自组装而得到结合有羟基磷灰石微球的三维纤维网络杂化凝胶，进而得到胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料，解决了在温和条件下于生物大分子基质内难以原位合成微米级羟基磷灰石微球的难题。
本发明的目的由以下技术措施实现。
1、构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法包括以下步骤：
以pH2～5的盐酸配制纯胶原溶液或配制含有离子型天然多糖的胶原溶液，胶原浓度为2～20mg/mL，多糖含量占体系大分子总质量的5～50％。在搅拌条件下，向胶原溶液中先加入含钙无机盐水溶液，钙离子的终浓度为0.03～0.3mol/L，之后与浓度为0.03～0.3mol/L的含碳酸根的无机盐水溶液相混合，搅拌反应0.5～20min。以上操作温度保持为4℃。将反应所得混合液低速离心后转移至一定容器中，于水浴20～40℃恒温4～40h，制得胶原/CaCO3微球复合凝胶。将胶原/CaCO3微球复合凝胶浸于浓度为0.05～0.5mol/L的含磷酸根的无机盐水溶液中，磷酸盐水溶液的温度通过水浴控温，于25～40℃恒温1～10天，每1-2天更换一次磷酸盐水溶液。最后制得的复合凝胶置于去离子水中浸洗3～5次除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料。
2、构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法包括以下步骤：
以pH2～5的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为2～20mg/mL。在搅拌条件下，向胶原溶液中先加入含钙无机盐水溶液，钙离子的终浓度为0.03～0.3mol/L，之后与浓度为0.03～0.3mol/L的含碳酸根的无机盐水溶液相混合，搅拌反应0.5～20min后加入离子型天然多糖溶液，多糖含量占体系大分子总质量的5～50％。以上操作温度保持为4℃。将反应所得混合液低速离心后转移至一定容器中，于水浴20～40℃恒温4～40h，制得胶原/CaCO3微球复合凝胶。将胶原/CaCO3微球复合凝胶浸于浓度为0.05～0.5mol/L的含磷酸根的无机盐水溶液中，磷酸盐水溶液的温度通过水浴控温，于25～40℃恒温1～10天，每1-2天更换一次磷酸盐水溶液。最后制得的复合凝胶置于去离子水中浸洗3～5次除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料。
3、构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法包括以下步骤：
以pH2～5的盐酸配制胶原溶液或配制含有离子型天然多糖的胶原溶液，胶原浓度为2～20mg/mL，多糖含量占体系大分子总质量的5～50％。在搅拌条件下，向胶原溶液中先加入含钙无机盐水溶液，钙离子的终浓度为0.03～0.3mol/L，之后与浓度为0.03～0.3mol/L的含碳酸根的无机盐水溶液相混合，搅拌反应0.5～20min，再加入按钙磷比为1.67计算所得量的含磷酸根的无机盐水溶液。以上操作温度保持为4℃。将反应所得混合液低速离心后转移至一定容器中，于水浴25～40℃恒温1～10天。制得的复合凝胶置于去离子水中浸洗3～5次除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料。
4、构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法包括以下步骤：
以pH2～5的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为2～20mg/mL。在搅拌条件下，向胶原溶液中先加入含钙无机盐水溶液，钙离子的终浓度为0.03～0.3mol/L，之后与浓度为0.03～0.3mol/L的含碳酸根的无机盐水溶液相混合，搅拌反应0.5～20min后加入离子型天然多糖溶液，多糖含量占体系大分子总质量的5～50％，之后再加入按钙磷比为1.67计算所得量的含磷酸根的无机盐水溶液。以上操作温度保持为4℃。将反应所得混合液低速离心后转移至一定容器中，于水浴25～40℃恒温1～10天。制得的复合凝胶置于去离子水中浸洗3～5次除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料。
含钙无机盐为氯化钙或硝酸钙。
含碳酸根无机盐为碳酸钠、碳酸氢钠或碳酸氢铵中的任一种。
含磷酸根的无机盐为磷酸氢二钠、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾中的任一种。
生物大分子为胶原和离子型天然多糖。胶原为I型胶原；离子型天然多糖为壳聚糖、透明质酸钠、海藻酸钠、硫酸葡聚糖、肝素钠、硫酸软骨素或硫酸角质素中的任一种。
构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法制备得到的胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料。
胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料用于组织工程、生物矿化或药物释放载体。
本发明中复合支架材料中的有机生物大分子基质成分和含量是在以胶原为核心的基础上通过调整离子型天然多糖的种类、比例以及胶原浓度来实现的；复合支架材料中无机成分的羟基磷灰石微球的粒径是通过调整预先在大分子基质中合成的CaCO3微球模板的粒径来控制的；CaCO3微球模板的粒径是通过调整含钙无机盐和含碳酸根的无机盐的浓度来实现的。
材料组成成分及结构的表征测试：
通过傅立叶转换红外光谱分析(FTIR)、X射线衍射分析(XRD)和扫描电镜分析(SEM)得知，本发明制得的复合支架材料是由胶原纤维网络或胶原多糖复合纤维网络与羟基磷灰石微球构成的有机/无机复合体；在大分子基质中预先合成的CaCO3微球模板在含磷酸根的无机盐液环境中实现了向羟基磷灰石微球的转化；复合支架材料的结构在空间尺度分布上具备包括有纳米、微米和宏观的多尺度分布特性。
本发明具有如下优点：
1.本发明中胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法新颖而简单。在胶原为主的生物大分子基质中预先合成CaCO3微球作为模板，利用胶原分子自组装成纤得到复合凝胶体；同时，通过CaCO3微球模板向磷酸钙矿物转化而得到结合在基质纤维网络中的微米级羟基磷灰石微球。
2.实现了在胶原为主的生物大分子基质中原位合成微米级羟基磷灰石微球，包括胶原大分子自组装成纤与CaCO3微球模板向羟基磷灰石微球转化的同时进行。
3.本发明中的复合支架材料的制备条件温和。通过CaCO3微球模板转化的方法途径解决了在生物大分子存在下难以在温和条件中原位合成微米级羟基磷灰石微球的难题。
4.本发明中的复合支架材料在结构上具有纳米、微米及宏观的多尺度结构特性。复合支架材料中包括构成大分子基质网络的纳米级纤维、微米级羟基磷灰石微球以及构成羟基磷灰石微球的纳米级羟基磷灰石晶粒。
5.构成本发明中复合支架材料中的羟基磷灰石微球的纳米粒子是低结晶度的碳酸根替代型的羟基磷灰石晶粒，具有可降解性，类似于生物合成得到的羟基磷灰石。
6.适用范围广。本发明制备的胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料适于用作骨组织工程的细胞支架材料；也可用作可注射型材料而用于骨缺损的填充修复和组织的诱导再生；也可作为药物或生长因子的载体材料而用于生物医学的组织工程领域。
附图说明
图1A胶原/CaCO3微球复合凝胶扫描电镜照片，表明胶原/CaCO3微球复合凝胶是由胶原纤维网络与结合在网络中的CaCO3微球构成的；胶原纤维与CaCO3微球的复合是相互贯穿绊缚的融合；微米级CaCO3微球进一步由纳米级CaCO3粒子构成。
图1B胶原/CaCO3微球复合凝胶红外光谱图展示了碳酸根特征吸收峰的出现。
图1C X射线衍射图谱表明胶原/CaCO3微球复合凝胶中的无机微球成分属于球霰石和方解石型的CaCO3。
图2A经过CaCO3微球模板的磷酸钙化转化而制得的胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料的扫描电镜照片，表明转化后复合材料中微球的形貌发生很大变化。羟基磷灰石微球与胶原纤维的复合保持了互穿绊缚的融合特征。
图2B胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料的红外光谱图展示了多个磷酸根特征吸收峰的出现，同时也存在碳酸根的特征吸收峰，表明转化后复合材料中无机微球的成分是碳酸型羟基磷灰石。
图2C胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料的X射线衍射图谱证明了羟基磷灰石的主要特征衍射峰的存在。这表明复合凝胶中CaCO3微球模板实现了向低结晶度羟基磷灰石微球的转化。
图3A浸于磷酸盐水溶液中经过CaCO3微球模板的磷酸钙化转化而制得的胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料扫描电镜照片，同图2A，羟基磷灰石微球由纳米级片状羟基磷灰石晶体构成。羟基磷灰石微球与胶原纤维的复合保持了互穿绊缚的融合特征。
图3B胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料的红外光谱图展示了多个磷酸根特征吸收峰的出现，同时也存在碳酸根的特征吸收峰，表明转化后复合材料中无机微球的成分是碳酸型羟基磷灰石。
图3C胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料的X射线衍射图谱显示了较图2中更多的羟基磷灰石特征衍射峰的出现。这表明复合凝胶中CaCO3微球模板不仅实现了向羟基磷灰石微球的转化，而且羟基磷灰石的结晶性更好一些。
图4A作为对照样的胶原/CaCO3微球复合凝胶的扫描电镜照片。
图4B通过在已合成CaCO3微球模板的胶原溶液中引入磷酸盐，使胶原分子自组装与CaCO3微球模板向羟基磷灰石微球转化同时进行制备胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料的扫描电镜照片，羟基磷灰石微球由纳米级窄片状羟基磷灰石晶体构成。羟基磷灰石微球与胶原纤维的复合仍保持了互穿绊缚的融合特征。
图4C作为对照样的胶原/CaCO3微球复合凝胶的红外光谱图。
图4D所制得的胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料的红外光谱图。谱图展示了多个磷酸根特征吸收峰的出现，同时也存在碳酸根的特征吸收峰，表明转化后复合材料中无机微球的成分是碳酸型羟基磷灰石。
图4E所制得的胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料的X射线衍射图谱。图谱中羟基磷灰石主要特征衍射峰的存在证明了CaCO3微球模板实现了向低结晶度羟基磷灰石微球的转化。
具体实施方式
以下通过实施例进行具体的描述，有必要在此提出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。
实施例1
以pH3的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为8mg/mL。在搅拌条件下向胶原溶液中加入硝酸钙水溶液，钙离子的终浓度为0.1mol/L，之后与浓度为0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液迅速混合，搅拌反应2min。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于25℃水浴恒温16小时，得到胶原/CaCO3微球复合凝胶，其扫描电镜照片详见图1A；其化学成分及物相晶体分析分别详见图1B和图1C。将胶原/CaCO3微球复合凝胶浸于浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠水溶液中，溶液温度通过水浴控温，于37℃恒温3天，每天更换一次磷酸盐水溶液。之后将复合凝胶置于去离子水中浸洗3次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料，其扫描电镜照片详见图2A；其化学成分及晶体物相分析分别详见图2B和图2C。
实施例2
以pH2的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为6mg/mL。在搅拌条件下向胶原溶液中加入氯化钙水溶液，钙离子的终浓度为0.03mol/L，之后与浓度为0.03mol/L的碳酸钠水溶液迅速混合，搅拌反应0.5min。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于28℃水浴恒温14小时，得到胶原/CaCO3微球复合凝胶，将其浸于浓度为0.4mol/L的磷酸氢二钠水溶液中，溶液温度通过水浴控温，于35℃恒温7天，每天更换一次磷酸盐水溶液。之后将复合凝胶置于去离子水中浸洗5次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料，其扫描电镜照片详见图3A；其化学成分及物相晶体分析分别详见图3B和图3C。
实施例3
以pH3.5的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为3mg/mL。在搅拌条件下向胶原溶液中加入氯化钙水溶液，钙离子的终浓度为0.06mol/L，之后与浓度为0.06mol/L的碳酸氢铵水溶液迅速混合，搅拌反应5min。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于25℃水浴恒温12小时，得到胶原/CaCO3微球复合凝胶，将其浸于浓度为0.5mol/L的磷酸氢二铵水溶液中，溶液温度通过水浴控温，于32℃恒温2天，每2天更换一次磷酸盐水溶液。之后将复合凝胶置于去离子水中浸洗5次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原纤维网络的存在。
实施例4
以pH2.5的盐酸配制含有壳聚糖的胶原溶液，胶原浓度为10mg/mL，壳聚糖含量占体系大分子总质量的10％。在搅拌条件下向胶原溶液中加入硝酸钙水溶液，钙离子的终浓度为0.08mol/L，之后与浓度为0.08mol/L的碳酸氢钠水溶液迅速混合，搅拌反应8min。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于30℃水浴恒温18小时，得到结合有壳聚糖的胶原/CaCO3微球复合凝胶(表示为胶原(壳聚糖)/CaCO3微球)。将胶原(壳聚糖)/CaCO3微球复合凝胶浸于浓度为0.2mol/L的磷酸氢二铵水溶液中，溶液温度通过水浴控温，于35℃恒温3天，每天更换一次磷酸盐水溶液。之后将复合凝胶置于去离子水中浸洗3次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(壳聚糖)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(壳聚糖)纤维网络的存在。
实施例5
以pH3的盐酸配制含有硫酸软骨素的胶原溶液，胶原浓度为12mg/mL，硫酸软骨素含量占体系大分子总质量的15％。在搅拌条件下向胶原溶液中加入硝酸钙水溶液，钙离子的终浓度为0.1mol/L，之后与浓度为0.1mol/L的碳酸钠水溶液迅速混合，搅拌反应10min。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于22℃水浴恒温24小时，得到结合有硫酸软骨素的胶原/CaCO3微球复合凝胶(表示为胶原(硫酸软骨素)/CaCO3微球)。将胶原(硫酸软骨素)/CaCO3微球复合凝胶浸于浓度为0.1mol/L的磷酸氢二钠水溶液中，溶液温度通过水浴控温，于38℃恒温5天，每2天更换一次磷酸盐水溶液。之后将复合凝胶置于去离子水中浸洗3次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(硫酸软骨素)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(硫酸软骨素)纤维网络的存在。
实施例6
以pH3.5的盐酸配制含有硫酸角质素的胶原溶液，胶原浓度为15mg/mL，硫酸角质素含量占体系大分子总质量的20％。在搅拌条件下向胶原溶液中加入氯化钙水溶液，钙离子的终浓度为0.15mol/L，之后与浓度为0.15mol/L的碳酸氢铵水溶液迅速混合，搅拌反应15min。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于30℃水浴恒温30小时，得到结合有硫酸角质素的胶原/CaCO3微球复合凝胶(表示为胶原(硫酸角质素)/CaCO3微球)。将胶原(硫酸角质素)/CaCO3微球复合凝胶浸于浓度为0.08mol/L的磷酸氢二铵水溶液中，溶液温度通过水浴控温，于40℃恒温4天，每2天更换一次磷酸盐水溶液。之后将复合凝胶置于去离子水中浸洗3次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(硫酸角质素)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(硫酸角质素)纤维网络的存在。
实施例7
以pH4的盐酸配制含有硫酸葡聚糖的胶原溶液，胶原浓度为17mg/mL，硫酸葡聚糖含量占体系大分子总质量的30％。在搅拌条件下向胶原溶液中加入硝酸钙水溶液，钙离子的终浓度为0.12mol/L，之后与浓度为0.12mol/L的碳酸钠水溶液迅速混合，搅拌反应18min。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于20℃水浴恒温40小时，得到结合有硫酸葡聚糖的胶原/CaCO3微球复合凝胶(表示为胶原(硫酸葡聚糖)/CaCO3微球)。将胶原(硫酸葡聚糖)/CaCO3微球复合凝胶浸于浓度为0.05mol/L的磷酸氢二钠水溶液中，溶液温度通过水浴控温，于25℃恒温10天，每天更换一次磷酸盐水溶液。之后将复合凝胶置于去离子水中浸洗4次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(硫酸葡聚糖)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(硫酸葡聚糖)纤维网络的存在。
实施例8
以pH4的盐酸配制含有肝素钠的胶原溶液，胶原浓度为12mg/mL，肝素钠含量占体系大分子总质量的5％。在搅拌条件下向胶原溶液中加入氯化钙水溶液，钙离子的终浓度为0.25mol/L，之后与浓度为0.25mol/L的碳酸氢钠水溶液迅速混合，搅拌反应10min。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于26℃水浴恒温24小时，得到结合有肝素钠的胶原/CaCO3微球复合凝胶(表示为胶原(肝素钠)/CaCO3微球)。将胶原(肝素钠)/CaCO3微球复合凝胶浸于浓度为0.05mol/L的磷酸氢二铵水溶液中，溶液温度通过水浴控温，于37℃恒温3天，每天更换一次磷酸盐水溶液。之后将复合凝胶置于去离子水中浸洗3次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(肝素钠)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(肝素钠)纤维网络的存在。
实施例9
以pH3的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为15mg/mL。在搅拌条件下向胶原溶液中加入氯化钙水溶液，钙离子的终浓度为0.3mol/L，之后与浓度为0.3mol/L的碳酸钠水溶液迅速混合，搅拌反应10min后加入海藻酸钠溶液，含量占体系中的大分子总质量的35％。以上操作温度保持为4℃。将反应所得混合液低速离心后转移至烧杯中，于水浴29℃恒温16小时，得到结合有海藻酸钠的胶原/CaCO3微球复合凝胶(表示为胶原(海藻酸钠)/CaCO3微球)。将胶原(海藻酸钠)/CaCO3微球复合凝胶浸于浓度为0.05mol/L的磷酸氢二铵水溶液中，溶液温度通过水浴控温，于38℃恒温4天，每天更换一次磷酸盐水溶液。之后将复合凝胶置于去离子水中浸洗5次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(海藻酸钠)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(海藻酸钠)纤维网络的存在。
实施例10
以pH4.5的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为11mg/mL。在搅拌条件下向胶原溶液中加入硝酸钙水溶液，钙离子的终浓度为0.2mol/L，之后与浓度为0.2mol/L的碳酸氢钠水溶液迅速混合，搅拌反应20min后加入透明质酸钠溶液，含量占体系中的大分子总质量的25％。以上操作温度保持为4℃。将反应所得混合液低速离心后转移至烧杯中，于水浴25℃恒温18小时，得到结合有透明质酸钠的胶原/CaCO3微球复合凝胶(表示为胶原(透明质酸钠)/CaCO3微球)。将胶原(透明质酸钠)/CaCO3微球复合凝胶浸于浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠水溶液中，溶液温度通过水浴控温，于35℃恒温8天，每天更换一次磷酸盐水溶液。之后将复合凝胶置于去离子水中浸洗5次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(透明质酸钠)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(透明质酸钠)纤维网络的存在。
实施例11
以pH2的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为13mg/mL。在搅拌条件下向胶原溶液中先加入氯化钙水溶液，钙离子的终浓度为0.2mol/L，之后与浓度为0.2mol/L的碳酸钠水溶液迅速混合，搅拌反应3min，将反应混合液分为两份，一份作为对照样；在搅拌条件下按钙磷比为1.67向另一份加入磷酸氢二钠水溶液。以上操作温度保持为4℃。将以上两份反应所得混合液低速离心后分别转移至烧杯中，于水浴35℃恒温2天，分别得到胶原/CaCO3微球复合凝胶和胶原/羟基磷灰石微球复合凝胶。将复合凝胶置于去离子水中浸洗5次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到的胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料，其扫描电镜照片详见图4B，其化学成分及物相晶体分析分别详见图4D和图4E。作为对照样的胶原/CaCO3微球复合材料的扫描电镜照片详见图4A，其化学成分分析详见图4C。
实施例12
以pH3的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为15mg/mL。在搅拌条件下向胶原溶液中加入硝酸钙水溶液，钙离子的终浓度为0.1mol/L，之后与浓度为0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液迅速混合，搅拌反应10min，再按钙磷比为1.67加入磷酸氢二铵水溶液。以上操作温度保持为4℃。将反应所得混合液低速离心后转移至烧杯中，于水浴37℃恒温4天，得到胶原/羟基磷灰石微球复合凝胶。将复合凝胶置于去离子水中浸洗5次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原纤维网络的存在。
实施例13
以pH2的盐酸配制含有壳聚糖的胶原溶液，胶原浓度为10mg/mL，壳聚糖含量占体系大分子总质量的25％。在搅拌条件下向胶原溶液中加入氯化钙水溶液，钙离子的终浓度为0.15mol/L，之后与浓度为0.15mol/L的碳酸氢铵水溶液迅速混合，搅拌反应15min，再按钙磷比为1.67加入磷酸二氢钠水溶液。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于38℃水浴恒温5天，得到结合有壳聚糖的胶原/羟基磷灰石微球复合凝胶(表示为胶原(壳聚糖)/羟基磷灰石微球)。将复合凝胶置于去离子水中浸洗4次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(壳聚糖)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(壳聚糖)纤维网络的存在。
实施例14
以pH3的盐酸配制含有硫酸软骨素的胶原溶液，胶原浓度为4mg/mL，硫酸软骨素含量占体系大分子总质量的20％。在搅拌条件下向胶原溶液中加入硝化钙水溶液，钙离子的终浓度为0.06mol/L，之后与浓度为0.09mol/L的碳酸钠水溶液迅速混合，搅拌反应20min，再按钙磷比为1.67加入磷酸二氢钾水溶液。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于40℃水浴恒温3天，得到结合有硫酸软骨素的胶原/羟基磷灰石微球复合凝胶(表示为胶原(硫酸软骨素)/羟基磷灰石微球)。将复合凝胶置于去离子水中浸洗3次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(硫酸软骨素)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(硫酸软骨素)纤维网络的存在。
实施例15
以pH2.5的盐酸配制含有硫酸角质素的胶原溶液，胶原浓度为8mg/mL，硫酸角质素含量占体系大分子总质量的15％。在搅拌条件下向胶原溶液中加入氯化钙水溶液，钙离子的终浓度为0.22mol/L，之后与浓度为0.22mol/L的碳酸氢钠水溶液迅速混合，搅拌反应15min，再按钙磷比为1.67加入磷酸氢二铵水溶液。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于37℃水浴恒温7天，得到结合有硫酸角质素的胶原/羟基磷灰石微球复合凝胶(表示为胶原(硫酸角质素)/羟基磷灰石微球)。将复合凝胶置于去离子水中浸洗5次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(硫酸角质素)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(硫酸角质素)纤维网络的存在。
实施例16
以pH3的盐酸配制含有肝素钠的胶原溶液，胶原浓度为11mg/mL，肝素钠含量占体系大分子总质量的10％。在搅拌条件下向胶原溶液中加入氯化钙水溶液，钙离子的终浓度为0.08mol/L，之后与浓度为0.08mol/L的碳酸氢钠水溶液迅速混合，搅拌反应15min，再按钙磷比为1.67加入磷酸二氢钠水溶液。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于33℃水浴恒温10天，得到结合有肝素钠的胶原/羟基磷灰石微球复合凝胶(表示为胶原(肝素钠)/羟基磷灰石微球)。将复合凝胶置于去离子水中浸洗5次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(肝素钠)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(肝素钠)纤维网络的存在。
实施例17
以pH3的盐酸配制含有硫酸葡聚糖的胶原溶液，胶原浓度为6mg/mL，硫酸葡聚糖含量占体系大分子总质量的30％。在搅拌条件下向胶原溶液中加入氯化钙水溶液，钙离子的终浓度为0.12mol/L，之后与浓度为0.12mol/L的碳酸钠水溶液迅速混合，搅拌反应20min，再按钙磷比为1.67加入磷酸氢二钠水溶液。以上操作温度保持在4℃。将反应所得混合液低速离心后转移到烧杯中，于30℃水浴恒温8天，得到结合有硫酸葡聚糖的胶原/羟基磷灰石微球复合凝胶(表示为胶原(硫酸葡聚糖)/羟基磷灰石微球)。将复合凝胶置于去离子水中浸洗4次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(硫酸葡聚糖)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(硫酸葡聚糖)纤维网络的存在。
实施例18
以pH4的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为8mg/mL。在搅拌条件下向胶原溶液中加入氯化钙水溶液，钙离子的终浓度为0.16mol/L，之后与浓度为0.16mol/L的碳酸氢铵水溶液迅速混合，搅拌反应5min后加入海藻酸钠溶液，含量占体系中的大分子总质量的40％，再按钙磷比为1.67加入磷酸氢二钠水溶液。以上操作温度保持为4℃。将反应所得混合液低速离心后转移烧杯中，于水浴37℃恒温4天，得到结合有海藻酸钠的胶原/羟基磷灰石微球复合凝胶(表示为胶原(海藻酸钠)/羟基磷灰石微球)。将复合凝胶置于去离子水中浸洗3次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(海藻酸钠)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(海藻酸钠)纤维网络的存在。
实施例19
以pH4的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为10mg/mL。在搅拌条件下向胶原溶液中加入硝酸钙水溶液，钙离子的终浓度为0.05mol/L，之后与浓度为0.05mol/L的碳酸钠水溶液迅速混合，搅拌反应10min后加入透明质酸钠溶液，含量占体系中的大分子总质量的50％，再按钙磷比为1.67加入磷酸氢二铵水溶液。以上操作温度保持为4℃。将反应所得混合液低速离心后转移烧杯中，于水浴40℃恒温1天(24小时)，得到结合有透明质酸钠的胶原/羟基磷灰石微球复合凝胶(表示为胶原(透明质酸钠)/羟基磷灰石微球)。将复合凝胶置于去离子水中浸洗3次以除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原(透明质酸钠)/羟基磷灰石微球复合支架材料。通过SEM、FTIR及XRD证明复合支架材料中无机相羟基磷灰石微球的生成及有机组成成分胶原(透明质酸钠)纤维网络的存在。
Claims (10)
1.一种构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法，其特征在于方法包括以下步骤：
以pH2～5的盐酸配制纯胶原溶液或配制含有离子型天然多糖的胶原溶液，胶原浓度为2～20mg/mL，多糖含量占体系大分子总质量的5～50％，在搅拌条件下，向胶原溶液中先加入含钙无机盐水溶液，钙离子的终浓度为0.03～0.3mol/L，之后与浓度为0.03～0.3mol/L的含碳酸根的无机盐水溶液相混合，搅拌反应0.5～20min，以上操作温度保持为4℃，将反应所得混合液低速离心后转移至一定容器中，于水浴20～40℃恒温4～40h，制得胶原/CaCO3微球复合凝胶；将胶原/CaCO3微球复合凝胶浸于浓度为0.05～0.5mol/L的含磷酸根的无机盐水溶液中，磷酸盐水溶液的温度通过水浴控温，于25～40℃恒温1～10天，每1-2天更换一次磷酸盐水溶液；最后制得的复合凝胶置于去离子水中浸洗3～5次除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料。
2.一种构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法，其特征在于方法包括以下步骤：
以pH2～5的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为2～20mg/mL，在搅拌条件下，向胶原溶液中先加入含钙无机盐水溶液，钙离子的终浓度为0.03～0.3mol/L，之后与浓度为0.03～0.3mol/L的含碳酸根的无机盐水溶液相混合，搅拌反应0.5～20min后加入离子型天然多糖溶液，多糖含量占体系大分子总质量的5～50％，以上操作温度保持为4℃，将反应所得混合液低速离心后转移至一定容器中，于水浴20～40℃恒温4～40h，制得胶原/CaCO3微球复合凝胶；将胶原/CaCO3微球复合凝胶浸于浓度为0.05～0.5mol/L的含磷酸根的无机盐水溶液中，磷酸盐水溶液的温度通过水浴控温，于25～40℃恒温1～10天，每1-2天更换一次磷酸盐水溶液；最后制得的复合凝胶置于去离子水中浸洗3～5次除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料。
3.一种构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法，其特征在于方法包括以下步骤：
以pH2～5的盐酸配制纯胶原溶液或配制含有离子型天然多糖的胶原溶液，胶原浓度为2～20mg/mL，多糖含量占体系大分子总质量的5～50％，在搅拌条件下，向胶原溶液中先加入含钙无机盐水溶液，钙离子的终浓度为0.03～0.3mol/L，之后与浓度为0.03～0.3mol/L的含碳酸根的无机盐水溶液相混合，搅拌反应0.5～20min，再加入按钙磷比为1.67计算所得量的含磷酸根的无机盐水溶液，以上操作温度保持为4℃，将反应所得混合液低速离心后转移至一定容器中，于水浴25～40℃恒温1～10天；最后制得的复合凝胶置于去离子水中浸洗3～5次除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料。
4.一种构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法，其特征在于方法包括以下步骤：
以pH2～5的盐酸配制胶原溶液，胶原浓度为2～20mg/mL，在搅拌条件下，向胶原溶液中先加入含钙无机盐水溶液，钙离子的终浓度为0.03～0.3mol/L，之后与浓度为0.03～0.3mol/L的含碳酸根的无机盐水溶液相混合，搅拌反应0.5～20min后加入离子型天然多糖溶液，多糖含量占体系大分子总质量的5～50％，之后再加入按钙磷比为1.67计算所得量的含磷酸根的无机盐水溶液，以上操作温度保持为4℃，将反应所得混合液低速离心后转移至一定容器中，于水浴25～40℃恒温1～10天；最后制得的复合凝胶置于去离子水中浸洗3～5次除去其中残留的盐分，冷冻干燥后得到胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料。
5.如权利要求1-4之一所述构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法，其特征在于含钙无机盐为氯化钙或硝酸钙。
6.如权利要求1-4之一所构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法，其特征在于含碳酸根无机盐为碳酸钠、碳酸氢钠或碳酸氢铵中的任一种。
7.如权利要求1-4之一所述构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法，其特征在于含磷酸根的无机盐为磷酸氢二钠、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾中的任一种。
8.如权利要求1-4之一所述构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法，其特征在于生物大分子为胶原和离子型天然多糖；胶原为I型胶原；离子型天然多糖为壳聚糖、透明质酸钠、海藻酸钠、硫酸葡聚糖、肝素钠、硫酸软骨素或硫酸角质素中的任一种。
9.如权利要求1-8之一所述构建胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料的制备方法制备得到的胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料。
10.如权利要求9所述胶原基生物大分子/羟基磷灰石微球复合支架材料用于组织工程、生物矿化或药物释放载体。
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