CN102416181B - 生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药胶束及制备方法 - Google Patents
生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药胶束及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药胶束及制备方法，涉及化学合成新药及其制剂领域。解决现有技术高分子-铂(IV)键合药不具有光活性的问题。该抗癌药是以生物降解的三嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸或两嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯)为载体聚合物，Pt(IV)是轴向双羟基配位的光活性四价铂配合物。本发明还提供了生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药胶束的制备方法。本发明制备的抗癌药具有显著的光活性，在UV365nm的照射下，Pt(IV)还原成Pt(II)，具有顺铂或奥沙利铂抗癌活性部分，铂质量含量可高达10-20％。
Description
技术领域
本发明属于化学合成新药及其制剂领域，具体涉及生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药胶束及制备方法。
背景技术
自从1967年发现顺铂有抗癌活性以来，铂类金属抗癌药物的研究和应用得到长足的发展。先后对几千个铂系列化合物进行了筛选，其中有几十个化合物进入临床研究，有几个已获批准进入市场。
顺式二氯二氨合铂(II)，也称顺铂(cisplatin)，为一种细胞周期性非特异性药物，是临床用量最大的二价铂类药物，能与DNA结合形成交联键，从而破坏DNA的复制功能。临床实践证明顺铂具有抗癌谱广，作用强，与多种抗肿瘤药具有协同作用，且无交叉耐药等特点，广泛用于卵巢癌，前列腺癌，睾丸癌，肺癌，鼻咽癌，食道癌，恶性淋巴瘤，乳腺癌等实体肿瘤的治疗。然而顺铂的水溶性低，重度消化道反应，骨髓抑制，听神经毒性以及容易对肾脏造成不可逆损伤等限制了其治疗指数的提高。低水溶性与毒副反应也是其它二价铂类药物普遍存在的问题。
铂(II)在化疗中已经得到了广泛的运用。在生理条件下，铂(II)有较高的反应活性，因此具有较低的稳定性，往往在铂(II)到达目标癌细胞之前，大部分已经与GSH、金属硫蛋白等生物活性分子结合而失活了。此外癌细胞对铂(II)往往具有耐药性。上述种种原因限制了铂(II)的使用。研究发现：铂(IV)化合物与铂(II)化合物相比，在竖直轴上多了两个配体，空间上形成八面体结构，因而具有动力学惰性，具有较低的反应活性，较小的毒副作用。此外通过修饰竖直轴的结构，可以改变四价铂的还原电势，以便在细胞内条件下迅速还原为铂(II)，发挥抗癌疗效。亲脂修饰还能增强亲脂性，提高细胞摄取的效率，提高疗效。
一般认为，铂(IV)配合物需要变成铂(II)配合物，才能有较高的疗效。一种是通过细胞中存在的还原剂的作用，如抗坏血酸、谷胱甘肽(GSH)、金属硫蛋白等。一旦还原成铂(II)，竖直轴上配位基团自然脱去。另一种途径是通过光化学的办法。选择合适的铂(IV)配体，可以实现光引发的还原反应，将铂(IV)还原成铂(II)。例如铂(IV)二碘化合物就有这种功能，由于存在碘配体与中心Pt原子之间的电荷和能量转移，在光照下铂(IV)确能还原成铂(II)，因而人们曾经试图将铂(IV)二碘化合物用于癌症的光化学治疗(PCT)。但是铂(IV)二碘化合物容易与血液或细胞外基质中的GSH反应，稳定性不高，在药物被输送至肿瘤位置时，其有效剂量已经大幅降低，因此不太适合做PCT。而铂(IV)二叠氮化合物对GSH等还原剂具有较好的稳定性，对紫外光却很敏感。在光的作用下它显示出良好的抗癌活性，而没有光的作用，它几乎是无毒的。因而铂(IV)二叠氮化合物是目前最好的光敏感性的铂类药物。但要将它用于PCT，必须将它安全高效的输送到病灶部位，在这之前尽可能没有损失，不被血液清除，其次是到达病灶部位后尽可能多的被病变细胞所摄取，进入细胞。裸药输送达不到上述目的，必须有适宜的输送体系。
高分子键合药的制备和研究受到大家的极大关注。所谓“高分子键合药”，就是将药物分子用共价键结合到高分子上，制成一定的剂型，采用相应的给药方式，将高分子连同药物送到病人体内，甚至送到病灶部位，在生理条件下，药物分子从高分子上解离下来，发挥治疗或诊断的作用。药物与高分子键合后可以改善亲油性药物的亲水性，在高分子的保护下，药物可以免受生理环境中酶和免疫系统的攻击，达到缓释和长效的目的。需要特别指出的是，如果两亲性聚合物键合药自组装成胶束，药物一般处于胶束的内核，由于与高分子结合牢固，一般不会通过扩散从胶束中逃逸出来。所以它既具有传统物理包埋胶束的优点，又避免了因动力学上的不稳定造成的药物突释，从而可提高药物的生物利用度和减少药物的毒副作用。张连芳等通过末端胺基化的PEG-PLA与含酮基的小分子铂(IV)反应形成席夫碱，从而合成酸敏感的可控释放的小分子四价铂高分子键合药(Zhang Lianfang et al.，ACS Nano，2008，4(1)，251-258)，一个铂药分子上挂两个高分子链，铂含量最高1.05％，无法满足临床使用要求；申请号为201110042948.X的专利，公开了将化学还原敏感和酸敏感的铂(IV)配合物与生物降解高分子键合和制备纳米胶束冻干粉的技术，解决了现有高分子-铂药键合物中铂含量低的问题，但这一类铂(IV)配合物不具有光活性，不能用于癌症的光化学治疗。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术高分子-铂(IV)键合药不具有光活性的问题，而提供生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药胶束及制备方法。
本发明提供一种生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药，其结构用式1表示：
式1
式1中，载体聚合物是生物降解的三嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸，所述的聚乙二醇的数均分子量为1000-5000，聚酯为ε-己内酯与丙交酯的无规共聚物、聚ε-己内酯或聚丙交酯，所述的聚酯的数均分子量为1000-5000，聚赖氨酸的数均分子量为1000-5000；
其中，Pt(IV)是轴向双羟基配位的光活性四价铂配合物，简写作“Pt(IV)-(OH)2”，包括c，c，t-[二氨基二叠氮基二羟基铂(IV)](CDA-Pt(IV)-(OH)2)、t，t，t-[二氨基二叠氮基二羟基铂(IV)](TDA-Pt(IV)-(OH)2)或c，c，t-[反式1，2-环己二胺基二叠氮基二羟基铂(IV)](CHDA-Pt(IV)-(OH)2)，具有下列结构：
上述Pt(IV)与载体聚合物之间采用双羧基化合物相连，双羧基化合物的一端与Pt原子配位，另一端与载体聚合物上的氨基形成酰胺键。
本发明还提供生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药的制备方法，制备式1所示的抗癌药，包括如下步骤：
(1)轴向双羟基光活性四价铂配合物Pt(IV)-(OH)2与酸酐反应，在四价铂的轴向引入带羧酸的配体，获得轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物，反应产物统称“带羧基的光活性Pt(IV)”，简作“Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x”，具有以下结构：
式中1≤x≤2，其中R是酸酐分子中除去羧基的部分，可以是烷烃、环烷烃或芳烃结构，所述的酸酐是丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、邻苯二甲酸酐、斑蝥素或去甲基斑蝥素中的一种；
(2)上述步骤(1)所获得的轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x中的自由羧基与聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸(MPEG-b-PES-b-PLL)上的聚赖氨酸的侧氨基反应，形成酰胺键，将光活性铂(IV)配合物连接到高分子链上，获得一种生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药，即聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸-铂(IV)配合物，简写作MPEG-b-PES-b-PLL-Pt(IV)；
所述的步骤(2)中轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x与聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸(MPEG-b-PES-b-PLL)反应的步骤和条件如下：
①首先配制Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x的水溶液，浓度为1mM-20mM，配制1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液，两者摩尔浓度相同，为20mM-100mM；然后将EDC和NHS的水溶液加入到Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x的水溶液中，EDC、NHS和Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x中羧基的摩尔比率1∶1∶0.5-1；在室温下搅拌10至30分钟，至水溶液澄清，得到混合溶液；
②将载体聚合物MPEG-b-PES-b-PLL溶解在蒸馏水中，质量浓度为1‰至1％，再将步骤①得到的混合溶液滴加到MPEG-b-PES-b-PLL溶液中，混合溶液中的Pt与MPEG-b-PES-b-PLL中氨基的摩尔比是0.5-4∶1；在室温下搅拌反应12至24小时，然后对蒸馏水透析12至24小时，除去其中未反应铂药和其它小分子杂质，最后冷冻干燥，得到生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-PES-b-PLL-Pt(IV)。
本发明还提供一种生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药，其结构用式2表示如下：
式2
式2中，载体聚合物是两嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯)(MPEG-b-P(ES-co-PC))，所述的聚乙二醇的数均分子量为1000-5000，聚(酯-co-碳酸酯)嵌段的数均分子量为2000-10000，环酯单元ES与碳酸酯单元PC的摩尔比1∶1-4，每个碳酸酯单元PC上带有1或2个羟基；
其中，Pt(IV)是轴向双羟基光活性四价铂配合物，简写作“Pt(IV)-(OH)2”，包括c，c，t-[二氨基二叠氮基二羟基铂(IV)](CDA-Pt(IV)-(OH)2)、t，t，t-[二氨基二叠氮基二羟基铂(IV)](TDA-Pt(IV)-(OH)2)或c，c，t-[反式1，2-环己二胺基二叠氮基二羟基铂(IV)](CHDA-Pt(IV)-(OH)2)，具有下列结构：
上述Pt(IV)与载体聚合物之间采用双羧基化合物相连，双羧基化合物的一端与Pt原子配位，另一端与载体聚合物上的羟基形成酯键。
本发明还提供生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药的制备方法，制备式2所示的抗癌药，包括如下步骤：
(1)轴向双羟基光活性四价铂配合物Pt(IV)-(OH)2与酸酐反应，在四价铂的轴向引入带羧酸的配体，获得轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物，反应产物统称“带羧基的光活性Pt(IV)”，简作“Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x”，具有以下结构：
式中1≤x≤2，其中R是酸酐分子中除去羧基的部分，可以是烷烃、环烷烃或芳烃结构，所述的酸酐是丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、邻苯二甲酸酐、斑蝥素或去甲基斑蝥素中的一种；
(2)上述步骤(1)所获得的轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x中的自由羧基与嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯)(MPEG-b-P(ES-co-PC))的侧羟基反应，形成酯键，将光活性铂(IV)配合物连接到高分子链上，获得一种生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药，即聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯-铂(IV)配合物)，简作MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))。
所述的步骤(2)中轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x与嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯)(MPEG-b-P(ES-co-PC))反应的步骤和条件如下：
①首先将Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x溶于DMSO中，浓度为1-10mg/ml，再将DCC(二环己基碳二亚胺)和HOBt(1-羟基苯并三唑)溶解在二氯甲烷溶液中，两者摩尔浓度相同，为1mM-10mM，然后将DCC和HOBt溶液加入到含铂(IV)药的DMSO溶液中，DCC、HOBt和Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x中的羧基摩尔比率为1∶1∶0.5-1；避光搅拌反应10-30分钟，得到混合溶液；
②配制载体聚合物MPEG-b-P(ES-co-PC)的CH2Cl2(二氯甲烷)溶液，浓度为20-50mg/ml，然后与步骤①制备的混合溶液在室温下混合，CH2Cl2溶液的载体聚合物MPEG-b-P(ES-co-PC)中羟基与混合溶液中Pt的摩尔比为1∶0.5-3；避光搅拌18-24h后，过滤除去反应生成的二环己基脲(DCU)沉淀，挥发除去溶剂CH2Cl2，透析除去溶剂DMSO，冷冻干燥，得到生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))。
所述的轴向双羟基光活性四价铂配合物Pt(IV)-(OH)2与酸酐反应步骤和条件如下：
配制Pt(IV)-(OH)2的二甲基亚砜(DMSO)溶液，浓度为10-20mg/mL；在上述DMSO溶液中加入酸酐，酸酐与Pt(IV)-(OH)2的摩尔比为1-5∶1；室温下，搅拌反应8至24小时，得到混合溶液；混合溶液用丙酮或乙醚沉析，沉析物依次用丙酮和乙醚洗涤，室温真空干燥，得到轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x；所述酸酐是丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、邻苯二甲酸酐、斑蝥素和去甲基斑蝥素中的一种。
所述的c，c，t-[反式1，2-环己二胺基二叠氮基二羟基铂(IV)]结构式为：
所述的c，c，t-[反式1，2-环己二胺基二叠氮基二羟基铂(IV)]制备过程如下：
(1)反式1，2-环己二胺与氯亚铂酸钾水溶液反应，两者的摩尔比为1∶1，反应时间8-16h，获得二价铂的配合物c，c-[Pt(II)(CHDA)(Cl)2]；
(2)将上述步骤(1)得到的c，c-[Pt(II)(CHDA)(Cl)2]与硝酸银水溶液在室温下反应12-24h，，硝酸银的摩尔用量是Pt的2倍，过滤法除去沉淀物AgCl，获得二价铂水合物硝酸盐c，c-[Pt2+(II)(CHDA)(H2O)2](NO3 -)2；
(3)将上述步骤(2)得到的c，c-[Pt2+(II)(CHDA)(H2O)2](NO3 -)2与叠氮化钠水溶液在室温下反应4-24h，叠氮化钠的摩尔用量是Pt的2倍，获得二价铂的双叠氮配合物c，c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]黄色沉淀；
(4)将上述步骤(3)得到的二价铂双叠氮配合物c，c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]分散在水中，加入30％双氧水溶液，双氧水的摩尔用量是Pt的5至10倍，室温下反应4-8小时，至体系完全透明，然后50℃加热反应8-12小时，除去体系中残留的双氧水，获得轴向双羟基光活性四价铂配合物c，c，t-[Pt(IV)(CHDA)(N3)2(OH)2]，简作CHDA-Pt(IV)-(OH)2；
(5)将上述步骤(4)得到的CHDA-Pt(IV)-(OH)2水溶液冷冻干燥，获得粉状产物。
本发明还提供将生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药制成纳米胶束冻干粉的方法，包括以下步骤：
(1)将生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药MPEG-b-PES-b-PLL-Pt(IV)或MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))溶解在DMSO中，获得混合溶液I，所述的生物降解高分子键合药的浓度为1‰至1％(g/mL)；
(2)将步骤(1)得到的混合溶液I中搅拌下滴加二次蒸馏水，得到胶束溶液，所述的二次蒸馏水体积为混合溶液I体积的3至10倍；
(3)将步骤(2)得到的胶束溶液进行透析，除去残留溶剂DMSO，得到混合溶液II；
(4)将步骤(3)得到的混合溶液II浓缩到固含量0.5-1.0％(g/mL)；
(5)冷冻干燥步骤(4)所得产物，获得生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药的纳米胶束冻干粉针剂。
有益效果
(1)本发明制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束具有显著的光活性，图5为几种代表性样品的紫外光照图，在UV365nm的照射下，N3配体离去，Pt(IV)还原成Pt(II)。
(2)本发明制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束的铂药释放速度同时受光照和环境酸碱性两方面条件影响。图7给出了典型的高分子光敏铂(IV)键合药分别在紫外光照和无光照条件下当pH＝7.4和5.0时的药物释放曲线。从(A)至(E)的五幅图体现出共同的特点：在给定pH值的情况下，有紫外光照较无紫外光照药物释放速度快得多；在给定光照条件(有光照或无光照)的情况下，弱酸性条件下较中性条件下的释放速度快。相比之下，光照比pH值变化对药物释放速度影响更大。这使得本发明制备的高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物的纳米胶束具备了实施光化学治疗的基本条件；
(3)本发明制成的最终是键合药的纳米胶束冻干粉针剂，可以用葡萄糖注射液为溶媒进行静脉注射或点滴，进入人体后，可以通过“细胞内吞”的途径进入癌变细胞。实验表明(图8)：含药胶束6小时的细胞摄入量是小分子Pt(II)的近10倍，Pt(IV)-(OH)(COOH)的40倍，可见铂(IV)配合物高分子化和胶束化后，细胞摄入的效率大幅度提高；
(4)本发明制备的高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束的抗癌效果通过MTT方法进行评价，图9给出了实验结果，可见在10～120μg/mL范围内，与小分子的Pt(IV)和Pt(II)配合物相比，高分子键合药纳米胶束对癌细胞SKOV-3的细胞毒性有显著增强。在有紫外光辐照的条件下，小分子光敏性Pt(IV)和高分子键合光敏性Pt(IV)药物的细胞毒性都较无光照条件下的细胞毒性有显著增强，而不具备光敏性的顺铂小分子则在两种条件下的细胞毒性无明显差别。与传统的小分子光敏性铂药相比，高分子键合药胶束兼具高效细胞摄入和紫外光照下二价铂药物的快速释放等特点。
(5)本发明制备了广谱铂类抗癌药的光敏性高分子前药，它采取纳米胶束冻干粉针剂剂型，可以用常规的静脉注射或点滴的方式给药，由于在细胞外条件下铂配合物处于+4价，它的毒副反应较小，可以较大剂量地使用；由于它是纳米胶束剂型，有较高的细胞摄入效率，同时利用外加紫外光照射，可以实现在肿瘤局域定位光照还原释放，发挥抗癌药效，而在其他健康组织中则不释放或释放量较小，从而减少对其他组织的损伤。高分子载体本身没有毒性，可以完全生物降解，被吸收或排出体外。
(6)本发明涉及生物降解高分子键合的光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束及其制备方法，与文献报道的小分子光敏性铂(IV)配合物相比，本发明的生物降解高分子与光活性铂(IV)的键合物具有下列优点：①使用生物降解高分子作为载体，在体内完全降解、代谢或吸收，没有毒性；②MPEG-b-PES-b-PLL类载体聚合物可溶于水，便于与铂(IV)配合物在水相中反应；③该嵌段共聚物及其与铂(IV)的键合物具有双亲性，利于通过自组装形成纳米胶束剂型；④在紫外光辐射条件下，光敏铂(IV)配合物迅速被还原成铂(II)，具有顺铂或奥沙利铂抗癌活性部分，它们的抗癌疗效是得到公认的；⑤采用丁二酸等二元酸作为铂(IV)与高分子链之间的连接单元，合成比较容易，铂(IV)的还原电位较低，且在弱酸性条件下，还原电位更低，便于在癌细胞内迅速还原成铂(II)，发挥疗效；⑥由于铂(IV)连接在高分子的侧链上而不是在链端，一个高分子链可以连接多个铂(IV)，而且通过调节聚赖氨酸的链长调节铂(IV)个数，因而键合药中的铂含量可以在较宽的范围内调节，可高达10-20％，远高于文献报道的数值。
附图说明
图1为本发明所述的铂配合物的红外光谱图；
图2为本发明所述的铂配合物的核磁谱图；
图3为本发明所述的铂配合物的质谱图；
图4为本发明所述的铂配合物在紫外光照下的吸收光谱变化；
图5为本发明生物降解高分子键合的光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束的紫外光照图(UV 365nm)；
图6为本发明生物降解高分子键合的光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束的电子显微照片和用DLS测定的粒径分布图；
图7为本发明生物降解高分子键合的光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束在UV365nm光照或无光照，pH＝7.4或5.0条件下的释放曲线图；
图8为顺铂系列的光敏铂药(A，C)和奥沙利铂系列的光敏铂药(B，D)对人卵巢癌细胞SKOV-3的细胞毒性实验；
图9为SKOV-3细胞在FITC-标记的生物降解高分子键合的光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束溶液中培养4小时后的激光共聚焦显微照片。
具体实施方式
本发明首先提供一种生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药，其结构可以用式1表示如下：
式1
式1中，载体聚合物是生物降解的三嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸(MPEG-b-PES-b-PLL)，所述的聚乙二醇的数均分子量为1000-5000，优选2000-4000，聚酯为ε-己内酯与丙交酯的无规共聚物、聚ε-己内酯或聚丙交酯，优选聚ε-己内酯，所述的聚酯的数均分子量为1000-5000，优选1000-3000，聚赖氨酸的数均分子量为1000-5000；优选2000-5000；
其中，Pt(IV)是轴向双羟基配位的光活性四价铂配合物，简写作“Pt(IV)-(OH)2”，包括c，c，t-[二氨基二叠氮基二羟基铂(IV)](CDA-Pt(IV)-(OH)2)、t，t，t-[二氨基二叠氮基二羟基铂(IV)](TDA-Pt(IV)-(OH)2)或c，c，t-[反式1，2-环己二胺基二叠氮基二羟基铂(IV)](CHDA-Pt(IV)-(OH)2)，具有下列结构：
上述Pt(IV)与载体聚合物之间采用双羧基化合物相连，双羧基化合物的一端与Pt原子配位，另一端与载体聚合物上的氨基形成酰胺键。
所述铂在高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物中的质量含量为5-20％，优选10-20％。
本发明还提供生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药的制备方法，制备式1所示的抗癌药，包括如下步骤：
(1)轴向双羟基光活性四价铂配合物Pt(IV)-(OH)2与酸酐反应，在四价铂的轴向引入带羧酸的配体，获得轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物，反应产物统称“带羧基的光活性Pt(IV)”，简作“Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x”，具有以下结构：
式中1≤x≤2，其中R是酸酐分子中除去羧基的部分，可以是烷烃、环烷烃或芳烃结构，所述的酸酐为是丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、邻苯二甲酸酐、斑蝥素或去甲基斑蝥素中的一种。
(2)上述步骤(1)所获得的轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x中的自由羧基与聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸(MPEG-b-PES-b-PLL)上的聚赖氨酸的侧氨基反应，形成酰胺键，将光活性铂(IV)配合物连接到高分子链上，获得一种生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药，即聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸-铂(IV)配合物，简写作MPEG-b-PES-b-PLL-Pt(IV)；
所述的步骤(2)中轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x与聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸(MPEG-b-PES-b-PLL)反应的步骤和条件如下：
①首先配制Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x的水溶液，浓度为1mM-20mM；将EDC(1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶解在蒸馏水中，两者摩尔浓度相同，为20mM-100mM；然后将EDC和NHS的水溶液加入到Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x的水溶液中，EDC、NHS和Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x中羧基的摩尔比为1∶1∶0.5-1；在室温下搅拌10至30分钟，至水溶液澄清，得到混合溶液。
②将载体聚合物MPEG-b-PES-b-PLL溶解在蒸馏水中，质量浓度为1‰至1％，优选5‰至1％；然后将步骤①得到的混合溶液滴加到MPEG-b-PES-b-PLL溶液中，混合溶液中的Pt与MPEG-b-PES-b-PLL中氨基的摩尔比是0.5-4∶1，优选1-2∶1；在室温下搅拌反应12至24小时，然后对蒸馏水透析12至24小时，除去其中未反应铂药和其它小分子杂质，最后冷冻干燥，得到生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-PES-b-PLL-Pt(IV)。
所述的载体聚合物MPEG-b-PES-b-PLL的制备方法，参见申请号为201110042948.X的中国专利，其中的聚酯嵌段包括聚乳酸、聚ε-己内酯或乳酸和ε-己内酯的无规共聚物，分子量1000-5000g/mol，共聚物的共聚比例不限，聚酯嵌段是以辛酸亚锡为催化剂，以分子量1000-5000的单端羟基聚乙二醇为大分子引发剂，经丙交酯、ε-己内酯或它们的混合物的开环聚合得到，聚赖氨酸嵌段的制备，有两种方式。其一是将MPEG-b-PES的端羟基转化为氨基，直接引发氨基保护了的赖氨酸的N-羧基酸酐(NCA)开环聚合，然后脱保护，参见邓超等人的论文：“Synthesis and characterization of poly(ethylene glycol)-b-poly(L-lactide)-b-poly(L-glutamic acid)triblock copolymer”Polymer，2005，46(3)，653-659；“Abiodegradable triblock copolymer poly(ethylene glycol)-b-poly(L-lactide)-b-poly(L-lysine)：Synthesis，self-assembly，and RGD peptide modification”，Polymer 2007，48(1)，139-149；其二是将MPEG-b-PES的端羟基转化成叠氮基，然后与带丙炔端基的PLL进行点击反应，将两者偶联起来，参见肖海华等人的论文：“Biodegradable polymer cisplatin(IV)conjugate as a pro-drugof cisplatin(II)”，Biomaterials，2011，32，7732-7739。
本发明还提供一种生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药，其结构可以用式2表示如下：
式2
式2中，载体聚合物是两嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯)(MPEG-b-P(ES-co-PC))，所述的聚乙二醇嵌段的数均分子量为1000-5000，优选2000-4000，聚(酯-co-碳酸酯)嵌段的数均分子量为2000-10000，优选2000-6000，环酯单元ES与碳酸酯单元PC的摩尔比1∶1-4，优选1∶1-2，每个碳酸酯单元PC上带有1或2个羟基；
其中，Pt(IV)是轴向双羟基光活性四价铂配合物，简写作“Pt(IV)-(OH)2”，包括c，c，t-[二氨基二叠氮基二羟基铂(IV)](CDA-Pt(IV)-(OH)2)、t，t，t-[二氨基二叠氮基二羟基铂(IV)](TDA-Pt(IV)-(OH)2)或c，c，t-[反式1，2-环己二胺基二叠氮基二羟基铂(IV)](CHDA-Pt(IV)-(OH)2)，具有下列结构：
上述Pt(IV)与载体聚合物之间采用双羧基化合物相连，双羧基化合物的一端与Pt原子配位，另一端与载体聚合物上的羟基形成酯键。
所述铂在高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物中的质量含量为5-20％，优选10-20％。
本发明还提供生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药的制备方法，制备式2所示的抗癌药，包括如下步骤：
(1)与式1的制备方法中的步骤(1)相同；
(2)上述步骤(1)所获得的轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x中的自由羧基与嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯)(MPEG-b-P(ES-co-PC))的侧羟基反应，形成酯键，将光活性铂(IV)配合物连接到高分子链上，获得一种生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药，即聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯-铂(IV)配合物)，简作MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))。
所述的步骤(2)中轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x与嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯)(MPEG-b-P(ES-co-PC))反应的步骤和条件如下：
①首先将Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x溶于DMSO中，浓度为1-10mg/ml；然后将DCC(二环己基碳二亚胺)和HOBt(1-羟基苯并三唑)溶解在二氯甲烷溶液中，两者摩尔浓度相同，为1mM-10mM；然后将DCC和HOBt溶液加入到含铂(IV)药的DMSO溶液中，DCC、HOBt和Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x中的羧基比率为1∶1∶0.5-1；避光搅拌反应10-30分钟，得到混合溶液。
②配制载体聚合物MPEG-b-P(ES-co-PC)的二氯甲烷(CH2Cl2)溶液，浓度为20-50mg/ml；然后与步骤①制备的混合溶液在室温下混合，CH2Cl2溶液的载体聚合物MPEG-b-P(ES-co-PC)中羟基与混合溶液中Pt的摩尔比为1∶0.5-3；避光搅拌18-24h后，过滤除去反应生成的二环己基脲(DCU)沉淀，挥发除去溶剂CH2Cl2，透析除去溶剂DMSO，冷冻干燥，得到生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))。
所述的载体聚合物MPEG-b-P(ES-co-PC)的制备是已知技术。参见关会立、谢志刚和胡秀丽等人的论文：“Novel biodegradable poly(ethylene glycol)-block-poly(2-methyl-2-carboxyl-propylene carbonate)copolymers：Synthesis，characterization，andmicellization”，Polymer，2005，46(23)，10523-10530；简言之，就是以辛酸亚锡或二乙基锌为催化剂，以分子量1000-5000的单端羟基聚乙二醇为大分子引发剂，将环酯单体与环状碳酸酯单体进行无规开环共聚。环酯单体包括丙交酯、ε-己内酯或它们的混合物。环状碳酸酯单体为带羟基的丙二醇的碳酸酯，例如从季戊四醇出发合成的带有两个羟基的碳酸酯单体和从1，1，1-三甲氧基乙烷或丙烷出发合成的带一个羟基的碳酸酯单体。根据需要调整环酯和碳酸酯单体的比例，例如1∶1至1∶4。
所述的式1或式2的制备方法中步骤(1)中轴向双羟基光活性四价铂配合物Pt(IV)-(OH)2与酸酐反应步骤和条件如下：
配制Pt(IV)-(OH)2的二甲基亚砜(DMSO)溶液，Pt(IV)-(OH)2的浓度为10-20mg/mL；在上述DMSO溶液中加入酸酐，酸酐与Pt(IV)-(OH)2的摩尔比为1-5∶1；室温下，搅拌反应8至24小时，得到混合溶液，混合溶液用丙酮或乙醚沉析，沉析物依次用丙酮和乙醚洗涤，室温真空干燥，得到轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x；所述酸酐是丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、邻苯二甲酸酐、斑蝥素或去甲基斑蝥素中的一种，优选丁二酸酐或斑蟊素。
所述的轴向双羟基光活性四价铂配合物Pt(IV)-(OH)2中，CDA-Pt(IV)-(OH)2和TDA-Pt(IV)-(OH)2的合成技术已知，参见P.J.Sadler等人的论文：“Nucleotide cross-linkinginduced by photoreactions of platinum(IV)azide complexes”，Angew.Chem.Int.Ed，2003，42，335-339；“A Photoactivated trans-diammine platinum complex as cytotoxic as cisplatin”，Chem.Eur.J.2006，12，3155-3161。简言之，就是将市售“顺铂”或“反铂”产品制成水溶液，依次与AgNO3、NaN3反应，将其中的Cl配体换成N3配体，然后用H2O2氧化，获得CDA-Pt(IV)-(OH)2或TDA-Pt(IV)-(OH)2。
所述的c，c，t-[反式1，2-环己二胺基二叠氮基二羟基铂(IV)]结构式为：
所述的c，c，t-[反式1，2-环己二胺基二叠氮基二羟基铂(IV)]制备过程如下：
(1)反式1，2-环己二胺与氯亚铂酸钾水溶液反应，两者的摩尔比为1∶1，反应时间8-16h，获得二价铂的配合物c，c-[Pt(II)(CHDA)(Cl)2]；
(2)将上述步骤(1)得到的c，c-[Pt(II)(CHDA)(Cl)2]与硝酸银水溶液在室温下反应12-24h，，硝酸银的摩尔用量是Pt的2倍，过滤法除去沉淀物AgCl，获得二价铂水合物硝酸盐c，c-[Pt2+(II)(CHDA)(H2O)2](NO3 -)2；
(3)将上述步骤(2)得到的c，c-[Pt2+(II)(CHDA)(H2O)2](NO3 -)2与叠氮化钠水溶液在室温下反应4-24h，叠氮化钠的摩尔用量是Pt的2倍，获得二价铂的双叠氮配合物c，c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]黄色沉淀；
(4)将上述步骤(3)得到的二价铂双叠氮配合物c，c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]分散在水中，加入30％双氧水溶液，双氧水的摩尔用量是Pt的5至10倍，室温下反应4-8小时，至体系完全透明，然后50℃加热反应8-12小时，除去体系中残留的双氧水，获得轴向双羟基光活性四价铂配合物c，c，t-[Pt(IV)(CHDA)(N3)2(OH)2]，简作CHDA-Pt(IV)-(OH)2；
(5)将上述步骤(4)得到的CHDA-Pt(IV)-(OH)2水溶液冷冻干燥，获得粉状产物。
以上制备方法可用反应方程式表示如下：
本发明还提供将生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药制成纳米胶束冻干粉的方法，包括以下步骤：
(1)将生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药MPEG-b-PES-b-PLL-Pt(IV)或MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))溶解在DMSO中，获得混合溶液I，所述的生物降解高分子键合药的浓度为1‰至1％(g/mL)，优选5‰至1％(g/mL)；
(2)在步骤(1)得到的混合溶液I中在搅拌下滴加二次蒸馏水，得到胶束溶液，所述的二次蒸馏水体积为混合溶液I体积的3至10倍；
(3)将步骤(2)得到的胶束溶液进行透析，除去残留溶剂DMSO，得到混合溶液II；
(4)将步骤(3)得到的混合溶液II浓缩到固含量0.5-1.0％(g/mL)；
(5)冷冻干燥步骤(4)所得产物，获得生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药的纳米胶束冻干粉针剂。
为了提高以上冻干粉针剂的复溶能力，本发明对上述方法做进一步改进，即在制备步骤(4)、(5)之间增加一个步骤：在浓缩到0.5％至1.0％(g/mL)的胶束溶液中添加高分子键合药质量的50％至200％的增溶剂乳糖、甘露醇、水解明胶、葡萄糖或它们的混合物，搅拌混合均匀。
实施例1：轴向双羟基光活性四价铂配合物c，c，t-[Pt(IV)(CHDA)(N3)2(OH)2]的制备
(1)1.14g(10mmol)反式1，2-环己二胺与4.15g(10mmmol)氯亚铂酸钾溶于100ml二次蒸馏水中，避光搅拌反应12小时，获得二价铂的配合物c，c-[Pt(II)(CHDA)Cl2]3.5g；
(2)将上述步骤(1)得到的1.9g(5mmol)的c，c-[Pt(II)(CHDA)Cl2]与1.7g(10mmol)的硝酸银溶于100ml的蒸馏水中，在室温下避光搅拌反应12小时，过滤法除去沉淀物AgCl，获得二价铂水合物硝酸盐c，c-[Pt2+(II)(CHDA)(H2O)2](NO3 -)2；
(3)将上述步骤(2)得到的c，c-[Pt2+(II)(CHDA)(H2O)2](NO3 -)2水溶液与0.65g(10mmol)的叠氮化钠在室温下反应4h，获得二价铂的双叠氮配合物c，c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]黄色沉淀1.8g；
(4)将上述步骤(3)得到的的二价铂双叠氮配合物c，c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]1g(2.5mmol)置于50ml蒸馏水中，加入10ml 30％的双氧水，在室温下反应8小时，至体系完全透明，然后在50℃下反应12h以除去体系中的双氧水，获得轴向双羟基光活性四价铂配合物c，c，t-[Pt(IV)(CHDA)(N3)2(OH)2]；
(5)将上述步骤(4)得到的CHDA-Pt(IV)-(OH)2水溶液冷冻干燥，获得粉状产物。
实施例2：轴向带羧基的光活性铂(IV)配合物CDA-Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x的制备
将200mg(0.576mmol)CDA-Pt(IV)-(OH)2溶解在16mL DMSO中，加入表1所列重量的丁二酸酐，室温搅拌反应12小时，得到混合溶液，混合溶液用200mL丙酮沉析，沉析物依次用丙酮和乙醚洗涤，室温真空干燥，获得CDA-Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x，结果见表1。
表1.CDA-Pt(IV)-(OH)2-丁二酸酐配合物的制备
实施例3：轴向带羧基的光活性铂(IV)配合物TDA-Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x的制备
将200mg TDA-Pt(IV)-(OH)2溶解在20mL的DMSO中，加入表2所列重量的二酸酐，室温搅拌反应12小时，得到混合溶液，混合溶液用200mL丙酮沉析，沉析物依次用丙酮和乙醚洗涤，室温真空干燥，获得TDA-Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x，结果见表2。
表2.TDA-Pt(IV)-(OH)2-二酸酐配合物的制备
实施例4：轴向带羧基的光活性铂(IV)配合物CHDA-Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x的制备将215mg CHDA-Pt(IV)-(OH)2溶解在15mL DMSO中，加入表3所列重量的丁二酸酐，室温搅拌反应12小时，得到混合溶液，混合溶液用200mL丙酮沉析，沉析物依次用丙酮和乙醚洗涤，室温真空干燥，获得铂配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x，结果见表3。
表3.CHDA-Pt(IV)-(OH)2-二酸酐配合物的制备
为了证实本专利合成了光活性的Pt(IV)化合物，测定了其中一些典型的化合物的红外谱图，见图1，其中(A)表示顺铂系列的衍生物的红外谱图，包括(a)、顺铂，(b)、c，c-[Pt(NH3)2(N3)2]，(c)、c，c，t-[Pt(NH3)2(N3)2(OH)2]，(d)、CDA-Pt-(OH)(COOH)，(e)、CDA-Pt-(COOH)2，从图中可以看出c，c-[Pt(NH3)2(N3)2]相对于顺铂多了一个非常强的峰，位于2060cm-1，归属于配位离子叠氮基团。当c，c-[Pt(NH3)2(N3)2]被双氧水氧化得到c，c，t-[Pt(NH3)2(N3)2(OH)2]，其在544cm-1出现了一个新的峰，归属于Pt-OH的伸缩振动，而在3470cm-1出现了一个尖锐的配位的O-H峰。从以上分析可知，本专利获得了轴向含羟基的c，c，t-[Pt(NH3)2(N3)2(OH)2]。用丁二酸酐与其反应，获得了轴向含一个丁二酸残基和一个羟基的光敏Pt(IV)化合物，它相对于c，c，t-[Pt(NH3)2(N3)2(OH)2]的红外谱图，在1690cm-1和1720cm-1多了两个峰，分别归属于与铂原子配位的羰基和自由羧基上的羰基的伸缩振动，此外CDA-Pt-(OH)(COOH)较c，c，t-[Pt(NH3)2(N3)2(OH)2]在轴向上少了一个配位的OH，因此它在3470cm-1处的O-H峰强度有所降低。当用大量的丁二酸酐与c，c，t-[Pt(NH3)2(N3)2(OH)2]反应时，可以制备轴向含两个丁二酸残基的光敏铂(IV)化合物，此时3470cm-1处配位的O-H峰完全消失。图1中(B)列出的是(a)、c，c-[Pt(DACH)Cl2]，(b)、c，c-[Pt(DACH)(N3)2]，(c)、c，c，t-[Pt(DACH)(N3)2(OH)2]，(d)、CHDA-Pt-(OH)(COOH)，(e)、CHDA-Pt-(COOH)2的红外谱图，其结果与顺铂的衍生物类似，不再赘述。
图2为本发明所述的铂配合物的核磁谱图，其中，(A)、c，c，t-[Pt(NH3)2(N3)2(OH)2]，(B)、CDA-Pt-(OH)(COOH)，(C)、CDA-Pt-(COOH)2，(D)、c，c，t-[Pt(CFDA)(N3)2(OH)2]，(E)、CHDA-Pt-(OH)(COOH)，(F)、CHDA-Pt-(COOH)2；其中图(A)为c，c，t-[Pt(NH3)2(N3)2(OH)2]，当核磁溶剂为d6-DMSO时，只能看到c，c，t-[Pt(NH3)2(N3)2(OH)2]中的配体胺基上的氢的化学位移，位于6.0ppm。当其与丁二酸酐反应制备CDA-Pt-(OH)(COOH)，氨配体上的氢质子的化学位移，移动到6.5ppm(图2B)。当c，c，t-[Pt(NH3)2(N3)2(OH)2]轴向上的两个羟基均与丁二酸酐反应获得CDA-Pt-(COOH)2，此时其氨基移动到5.8ppm。而当我们选择D2O做溶剂的时候，该峰消失，从而说明5.8ppm处的氢质子为活泼氢，确认了我们将其指认为氨基的氢(图2C)。其中图2(D，E，F)分别为c，c，t-[Pt(CFDA)(N3)2(OH)2]、CHDA-Pt-(OH)(COOH)、CHDA-Pt-(COOH)2的核磁氢谱图，它们在0.9-2.45ppm处有多个峰，均归属于环己二胺。
图3为本发明所述的铂配合物的电喷雾质谱图，其中(A)代表CDA-Pt-(OH)(COOH)，由于该化合物轴向含有羧基，因此其在电喷雾质谱图的负谱中容易出峰。m/z＝446为其分子离子峰，是CDA-Pt-(OH)(COOH)失去一个质子形成的。此外，我们利用质谱模拟软件模拟了CDA-Pt-(OH)(COOH)的质谱图，并将其与实际测量的结果进行对比，发现实验测得的铂的同位素峰的分布与模拟值非常接近，从而进一步证明了我们成功地合成了CDA-Pt-(OH)(COOH)；图3(B)代表CDA-Pt-(COOH)2，(C)代表CHDA-Pt-(OH)(COOH)，(D)代表CHDA-Pt-(COOH)2，内嵌图为质谱模拟图，它们有着与CDA-Pt-(OH)(COOH)类似的ESI-MS质谱图，因此在此不再详述。
图4为本发明所述的铂配合物在紫外光照下的吸收光谱变化，其中，(A)、CDA-Pt-(OH)(COOH)，(B)、CDA-Pt-(COOH)2，(C)、CHDA-Pt-(OH)(COOH)，(D)、CHDA-Pt-(COOH)2，当用UV 365nm的灯照射这几种化合物的时候，它们的紫外吸收峰都随时间迅速减少，该峰归属于N3→Pt的金属配体的转移带，它的峰强度降低暗示着配体上的叠氮基团转变为氮气，从而还原为铂(II)化合物。
实施例5：生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-PES-b-PLL-Pt(IV)的制备
①配制CDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)的水溶液200ml，其中含铂为1mmol(铂浓度5mM)；将1mmol的EDC(0.191g)和1mmol的NHS(0.115g)溶于30mL二次蒸馏水，加入上述配制的CDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)水溶液中，搅拌反应30min至溶液澄清，得到混合溶液；
②将载体聚合物MPEG5000-b-PCL2280-b-PLL12800.86g(0.1mmol，其中氨基1.0mmol，分子式中的下标数字代表该嵌段的数均分子量，下同)溶解在116mL蒸馏水中，加入步骤①得到的混合溶液，室温搅拌反应20小时，然后对蒸馏水透析12小时除去小分子物，冷冻干燥，获得生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG5000-b-PCL2280-b-PLL1280-Pt(IV)。
改变配合物CDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)与聚合物载体的比例，获得不同铂含量的生物降解高分子键合药产物，见表4。
表4.投料比对键合药产物中铂含量的影响
实施例6：生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-PES-b-PLL-Pt(IV)的制备
①配制TDA-Pt(IV)-(OH)0.5(COOH)1.5的水溶液100ml，其中含铂为1mmol(铂浓度为10mM)；将2.0mmol的EDC(0.383g)和2.0mmol NHS(0.230g)溶于40mL二次蒸馏水，加入TDA-Pt(IV)-(OH)05(COOH)15水溶液中，搅拌反应20min至溶液澄清，得到混合溶液；
②将载体聚合物MPEG5000-b-PCL2280-b-PLL12800.86g(0.1mmol，其中氨基1.0mmol)溶解在500mL蒸馏水中，加入步骤①得到的混合溶液，室温搅拌反应24小时，然后对水透析24小时除去小分子物，冷冻干燥，获得生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG5000-b-PCL2280-b-PLL1280-Pt(IV)。
实施例7：生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-PES-b-PLL-Pt(IV)的制备
①配制CHDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)的水溶液100ml，浓度为20mM(其中含铂为2mmol)；将3.0mmol的EDC(0.573g)和NHS(0.345g)溶解在50mL二次蒸馏水，加入CHDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)水溶液中，搅拌反应20min至溶液澄清。
②取三嵌段共聚物MPEG5000-b-PCL2280-b-PLL12800.86g(0.1mmol，其中氨基1.0mmol)溶解在50mL蒸馏水中，加入上述活化的CHDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)溶液，室温搅拌反应16小时，然后对水透析16小时除去小分子物，冷冻干燥，获得CHDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)与聚合物的键合物MPEG5000-b-PCL2280-b-PLL1280-Pt(IV)。
实施例8：CHDA-Pt(IV)-(COOH)2与不同比例三嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸的键合
①配制CHDA-Pt(IV)-(COOH)2的水溶液100ml，浓度为20mM(其中含铂为2mmol)；将3.0mmol的EDC(0.573g)和NHS(0.345g)溶解在50mL二次蒸馏水，加入CHDA-Pt(IV)-(COOH)2水溶液中，搅拌反应20min至溶液澄清。
②取不同嵌段比例侧氨基的三嵌段聚合物，溶解在100mL蒸馏水中，加入上述活化的CHDA-Pt(IV)-(COOH)2溶液，室温搅拌反应16小时，然后对水透析24小时除去小分子物，冷冻干燥，其他条件如表5，获得CHDA-Pt(IV)-(COOH)2与聚合物的键合物，结果见表5：
表5.CHDA-Pt(IV)-(COOH)2与生物降解高分子的键合
实施例9：生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))的制备
①配制CDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)的DMSO溶液100mL(含铂0.5mmol)，将1mmol的DCC(0.206g)和1mmol的HOBt(0.135g)溶于30mL二氯甲烷，加入上述配制的DMSO溶液中，避光搅拌反应30min，得到混合溶液；
②将载体聚合物MPEG5000-b-P(LA3200-co-PC1460)0.97g(0.1mmol，其中羟基1.0mmol，PC为三羟甲基乙烷的环状碳酸酯)溶解在20mL二氯甲烷中，加入步骤①得到的混合溶液，室温搅拌反应20小时，然后过滤除二环己基脲，旋干二氯甲烷溶液，将产物用DMSO溶解，并避光对水透析12小时除去小分子物，冷冻干燥，获得生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-P(LA-co-PC)-Pt(IV)。
改变光活性四价配合物CDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)与聚合物载体的比例，结果见表6。
表6.投料比对产物中铂含量的影响
实施例10：生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))的制备
①配制TDA-Pt(IV)-(OH)0.5(COOH)1.5的DMSO溶液100mL(含铂2mmol)，将2mmol的DCC(0.412g)和2mmol的HOBt(0.270g)溶于50mL二氯甲烷，加入上述配制的的DMSO溶液中，搅拌反应30min，得到混合溶液；
②将载体聚合物MPEG5000-b-P(LA3200-co-PC810)0.901g(0.1mmol，其中羟基2.0mmol，PC为从季戊四醇出发制备的环状碳酸酯)溶解在40mL二氯甲烷中，加入步骤①得到的混合溶液，室温搅拌反应20小时，然后过滤除二环己基脲，旋干二氯甲烷溶液，再将产物用DMSO溶解，并避光对水透析12小时除去小分子物，冷冻干燥，获得获得生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-P(LA-co-PC)-Pt(IV)。
实施例11：生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))的制备
①配制CHDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)的DMSO溶液100mL(含铂1mmol)；将2mmol的DCC(0.412g)和2mmol的HOBt(0.27g)溶于100mL的二氯甲烷，加入上述配制的DMSO溶液中，避光搅拌反应30min，得到混合溶液；
②将载体聚合物MPEG5000-b-P(LA3200-co-PC1180)0.938g(0.1mmol，其中羟基1.0mmol，PC为从甘油出发制备的环状碳酸酯)溶解在50mL二氯甲烷中，加入加入步骤①得到的混合溶液，室温搅拌反应12小时，然后过滤除二环己基脲，旋干二氯甲烷溶液，将产物用DMSO溶解，并避光对水透析24小时除去小分子物，冷冻干燥，获得获得生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-P(LA-co-PC)-Pt(IV)。
实施例12：生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))的制备
①CHDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)的羧基活化，同实施例11；
②取不同嵌段比例侧羟基的两嵌段聚合物MPEG-b-P(LA-co-PC)(其中PC为从季戊四醇出发制备的环状碳酸酯)，溶解在15mL二氯甲烷中，加入步骤①得到的混合溶液，室温搅拌反应16小时，过滤除掉二环己基脲并旋干二氯甲烷溶液，然后用DMSO溶解产物并对水透析24小时除去小分子物，冷冻干燥，其它条件如表7，获得CHDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)与聚合物的键合物，结果见表7：
表7.CHDA-Pt(IV)-(OH)(COOH)与生物降解高分子的键合
实施例13：生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉的制备
将实施例5制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG5000-b-PCL2280-b-PLL1280-Pt(IV)10mg溶解在3mL DMSO中置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加10mL二次蒸馏水，形成胶束溶液；用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析12小时，除去DMSO，浓缩至固含量0.5％w/v)，冷冻干燥，获得生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例14：生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉的制备
将实施例5表4第3号制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG5000-b-PCL2280-b-PLL1280-Pt(IV)10mg溶解在5mL DMSO中，置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加20mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析8小时，除去DMSO，浓缩至固含量为0.5％(w/v)，冷冻干燥，获得生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例15：生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物药纳米胶束冻干粉的制备
将实施例5表4第4号制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG5000-b-PCL2280-b-PLL1280-Pt(IV)10mg溶解在5mL DMSO中，置于100mL小烧杯中，往其中缓慢滴加50mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析24小时，除去DMSO，浓缩至固含量约0.8％(w/v)，冷冻干燥，获得生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例16：生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉的制备
将实施例6所制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG5000-b-PCL2280-b-PLL1280-Pt(IV)10mg溶解在2mL DMSO中置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加15mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析24小时，除去DMSO，浓缩至固含量约1％，冷冻干燥，获得生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例17：生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉的制备
将实施例7所制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG5000-b-PCL2280-b-PLL1280-Pt(IV)10mg溶解在2mL DMSO中置于50mL小烧杯中，往生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物的DMSO溶液中缓慢滴加20mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析18小时，除去DMSO，浓缩至固含量为1％(w/v)，加入10mg葡萄糖，搅拌溶解，再冷冻干燥，获得生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例18：生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉的制备
将实施例8表5第1号所制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG2000-b-PCL1460-b-PLL2980-Pt(IV)10mg溶解在5mL DMSO中置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加40mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析24小时，除去DMSO，浓缩至固含量为1％(w/v)，加入15mg乳糖，搅拌溶解，再冷冻干燥，获得生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例19：聚合物-Pt(IV)键合药纳米胶束冻干粉的制备
将实施例8表5第2号所制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG2000-b-PLA1800-b-PLL2000-Pt(IV)10mg生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物溶解在4mL DMSO中，置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加12mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析24小时，除去DMSO，浓缩至固含量为1％(w/v)，加入10mg甘露醇，搅拌溶解，再冷冻干燥，获得生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例20：生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉的制备
将实施例8表5第4号所制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG1000-b-PCL1420-b-PLL2920-Pt(IV)10mg生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物溶解在5mL DMSO中置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加40mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析24小时，除去DMSO，浓缩至固含量为1％(w/v)，加入8mg水解明胶，搅拌溶解，再冷冻干燥，获得生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例21：生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉的制备
将实施例8表5第6号所制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG1000-b-PCLA1800-b-PLL2820-Pt(IV)10mg生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物溶解在5mL DMSO中置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加30mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析24小时，除去DMSO，浓缩至固含量为1％(w/v)，加入5mg葡萄糖和5mg水解明胶，搅拌溶解，再冷冻干燥，获得生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例22：生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉的制备
将实施例9表6第3号所制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG5000-b-P(LA3200-co-PC1460-Pt(IV))10mg溶解在5mL DMSO中，置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加40mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析24小时，除去DMSO，浓缩至固含量为1％(w/v)，加入5mg葡萄糖和10mg甘露醇，搅拌溶解，再冷冻干燥，获得生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例23：生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉的制备
将实施例9表6第3号所制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG5000-b-P(LA3200-co-PC1460-Pt(IV))10mg溶解在5mL DMSO中，置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加25mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析24小时，除去DMSO，浓缩至固含量为1％(w/v)，加入10mg甘露醇和10mg乳糖，搅拌溶解，再冷冻干燥，获得生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例24：生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉的制备
将实施例9表6第5号所制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG5000-b-P(LA3200-co-PC1460-Pt(IV)10mg生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物物溶解在5mL DMSO中，置于50mL小烧杯中。往其中缓慢滴加30mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析24小时，除去DMSO，浓缩至固含量为1％(w/v)，加入5mg乳糖、5mg甘露醇和5mg葡萄糖，搅拌溶解，再冷冻干燥，获得生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例25：生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉的制备
将实施例10所制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG5000-b-P(LA3200-co-PC810-Pt(IV)10mg溶解在5mL DMSO中，置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加25mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析24小时，除去DMSO，浓缩至固含量为1％(w/v)，加入3mg乳糖、3mg葡萄糖和3mg甘露醇，搅拌溶解，再冷冻干燥，获得生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
实施例26：生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉的制备
将实施例11所制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG5000-b-P(LA3200-co-PC1180-Pt(IV))10mg生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物溶解在5mL DMSO中，置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加25mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析24小时，除去DMSO，浓缩至固含量为1％(w/v)，加入3mg乳糖、3mg葡萄糖和2mg水解明胶，搅拌溶解，再冷冻干燥，获得生物降解高分子键合Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束冻干粉。
考察了以上实施例所制备生物降解高分子键合的光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束的光活性，图5为几种代表性样品的紫外光照图(UV 365nm)，其中，
(A)、MPEG-b-PCL-b-PLL/CDA-Pt-(OH)(COOH)，
(B)、MPEG-b-PCL-b-PLL/CDA-Pt-(COOH)2，
(C)、MPEG-b-PCL-b-PLL/CHDA-Pt-(OH)(COOH)，
(D)、MPEG-b-PCL-b-PLL/CHDA-Pt-(COOH)2，
(E)、MPEG-b-P(LA-co-PC)/CDA-Pt-(OH)(COOH)，
(F)、高分子光敏铂归一化的紫外吸收值随光照时间的变化；
可见，它们具有显著的光活性，在UV365nm的照射下，N3配体离去，Pt(IV)还原成Pt(II)。
图6为本发明生物降解高分子键合的光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束的电子显微照片和用DLS测定的粒径分布图，其中，
A、MPEG-b-PCL-b-PLL/CDA-Pt-(COOH)2的电镜图，
B、MPEG-b-PCL-b-PLL/CDA-Pt-(COOH)2的DLS图，
C、MPEG-b-PCL-b-PLL/CHDA-Pt-(OH)(COOH)的电镜图，
D、MPEG-b-PCL-b-PLL/CHDA-Pt-(OH)(COOH)的DLS图；
从图中可以看出，本发明生物降解高分子键合的光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束可以在水中自组装成为纳米胶束，呈圆球形，直径150-200nm。
图7为本发明生物降解高分子键合的光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束在UV365nm光照或无光照，pH＝7.4或5.0条件下的释放曲线图，其中，
(A)、MPEG-b-PCL-b-PLL/CDA-Pt-(OH)(COOH)，
(B)、MPEG-b-PCL-b-PLL/CDA-Pt-(COOH)2，
(C)、MPEG-b-PCL-b-PLL/CHDA-Pt-(OH)(COOH)，
(D)、MPEG-b-PCL-b-PLL/CHDA-Pt-(COOH)2，
(E)、MPEG-b-P(ES-co-PC)/CDA-Pt-(OH)(COOH)；
从图中可以看出，本发明制备的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束的铂药释放速度同时受光照和环境酸碱性两方面条件影响，从图中的(A)至(E)图可以看出，五幅图体现出共同的特点，在给定pH值的情况下，有紫外光照较无紫外光照药物释放速度快得多；在给定光照条件(有光照或无光照)的情况下，弱酸性条件下较中性条件下的释放速度快。相比之下，光照比pH值变化对药物释放速度影响更大。
图8为顺铂系列的光敏铂药(A，C)和奥沙利铂系列的光敏铂药(B，D)对人卵巢癌细胞SKOV-3的细胞毒性实验，时间48小时，其中A，B为在黑暗条件下，C，D为先暗处培育4h，然后光照1h，再暗处培育43h，实验结果表明：在10～120μg/mL范围内，与小分子的Pt(IV)和Pt(II)配合物相比，高分子键合药纳米胶束对癌细胞SKOV-3的细胞毒性有显著增强，在有紫外光辐照的条件下，小分子光敏性Pt(IV)和高分子键合光敏性Pt(IV)药物的细胞毒性都较无光照条件下的细胞毒性有显著增强，而不具备光敏性的顺铂小分子则在两种条件下的细胞毒性无明显差别，与传统的小分子光敏性铂药相比，高分子键合药胶束兼具高效细胞摄入和紫外光照下二价铂药物的快速释放等特点。
本发明制成的最终是键合药的纳米胶束冻干粉针剂，可以用葡萄糖注射液为溶媒进行静脉注射或点滴，进入人体后，可以通过“细胞内吞”的途径进入癌变细胞。为了证明这一点，我们进行了下列的实验：
(1)将一种生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束和对照药物分别放在细胞培养液中，经2和6小时培养后用胰酶消化，充分洗涤后测定细胞中的铂元素含量和总蛋白量，计算单位蛋白中的铂含量，表8列出了测定结果。可见，键合药胶束6小时的细胞摄入量是小分子Pt(II)的近10倍，Pt(IV)-(OH)(COOH)的40倍。可见铂配合物高分子化和胶束化后，细胞摄入的效率大幅度提高。
表8.不同药物(铂含量全是5μM)加入SKOV-3细胞培养液中共培养6小时后细胞中的铂含量(单位：ng铂/mg蛋白)
| 药物 | 顺铂 | Pt(IV)-(OH)(COOH) | 高分子-Pt(IV)键合药 |
| 培养2小时 | 34 | 17 | 252 |
| 培养6小时 | 112 | 34 | 1140 |
(2)将键合药纳米胶束用FITC标记，放在细胞培养液中，经4小时培养和DAPI染色、充分洗涤、戊二醛固定、封片后用激光共聚焦显微镜观察。图9为SKOV-3细胞在FITC标记的生物降解高分子键合的光活性Pt(IV)类抗癌药物纳米胶束溶液中培养4小时后的激光共聚焦显微照片，图中，左下图为白光照片，左上图为蓝色荧光照片，显示细胞核，右上图为绿色荧光照片，显示胶束，右下图为加和荧光照片，显示胶束在细胞内的分布，可见带荧光的药物颗粒确实存在于细胞浆，并且充满细胞浆，证明了“细胞内吞”的效果。
Claims (12)
1.生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药，其特征在于，其结构用式1表示：
式1中，载体聚合物是生物降解的三嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸，所述的聚乙二醇的数均分子量为1000-5000，聚酯为ε-己内酯与丙交酯的无规共聚物、聚ε-己内酯或聚丙交酯，所述的聚酯的数均分子量为1000-5000，聚赖氨酸的数均分子量为1000-5000；
其中，Pt(IV)是轴向双羟基配位的光活性四价铂配合物，包括c,c,t-[二氨基二叠氮基二羟基铂(IV)]、t,t,t-[二氨基二叠氮基二羟基铂(IV)]或c,c,t-[反式1,2-环己二胺基二叠氮基二羟基铂(IV)]，具有下列结构
上述Pt(IV)与载体聚合物之间采用双羧基化合物相连，双羧基化合物的一端与Pt原子配位，另一端与载体聚合物上的氨基形成酰胺键。
2.生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药的制备方法，其特征在于，制备式1所示的抗癌药，包括如下步骤：
(1)轴向双羟基光活性四价铂配合物Pt(IV)-(OH)2与酸酐反应，在四价铂的轴向引入带羧酸的配体，获得轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物，反应产物统称“带羧基的光活性Pt(IV)”，具有以下结构：
式中1≤x≤2，其中R是酸酐分子中除去羧基的部分，可以是烷烃、环烷烃或芳烃结构， 所述的酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、邻苯二甲酸酐、斑蝥素或去甲基斑蝥素中的一种;
(2)上述步骤(1)所获得的轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x中的自由羧基与聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸上的聚赖氨酸的侧氨基反应，形成酰胺键，将光活性铂(IV)配合物连接到高分子链上，获得一种生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药，即聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸-铂(IV)配合物，简写作MPEG-b-PES-b-PLL-Pt(IV)。
3.根据权利要求2所述生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x与聚乙二醇-b-聚酯-b-聚赖氨酸反应的步骤和条件如下：
①首先配制Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x的水溶液，浓度为1mM-20mM，配制1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液，两者摩尔浓度相同，为20mM-100mM；然后将1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液加入到Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x的水溶液中，1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x中羧基的摩尔比为1:1:0.5-1；在室温下搅拌10至30分钟，至水溶液澄清，得到混合溶液；
②将载体聚合物MPEG-b-PES-b-PLL溶解在蒸馏水中，质量浓度为1‰至1%，然后将步骤①得到的混合溶液滴加到MPEG-b-PES-b-PLL溶液中，混合溶液中的Pt与MPEG-b-PES-b-PLL中氨基的摩尔比是0.5-4:1；在室温下搅拌反应12至24小时，然后对蒸馏水透析12至24小时，除去其中未反应铂药和其它小分子杂质，最后冷冻干燥，得到生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-PES-b-PLL-Pt(IV)。
4.生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药，其特征在于，其结构用式2表示：
式2
式2中，载体聚合物是两嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯)，所述的聚乙二醇的数均分子量为1000-5000，聚(酯-co-碳酸酯)嵌段的数均分子量为2000-10000，环酯单元ES与碳酸酯单元PC的摩尔比1:1-4，每个碳酸酯单元PC上带有1或2个羟基；
其中，Pt(IV)是轴向双羟基光活性四价铂配合物，包括c,c,t-[二氨基二叠氮基二羟基铂(IV)]、t,t,t-[二氨基二叠氮基二羟基铂(IV)]或c,c,t-[反式1,2-环己二胺基二叠氮基二羟基铂(IV)]，具有下列结构：
上述Pt(IV)与载体聚合物之间采用双羧基化合物相连，双羧基化合物的一端与Pt原子配位，另一端与载体聚合物上的羟基形成酯键。
5.根据权利要求1或4所述生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药，其特征在于，所述铂在高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药物中的质量含量为5-20%。
6.根据权利要求1或4所述的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药，其特征在于，所述的c,c,t-[反式1,2-环己二胺基二叠氮基二羟基铂(IV)]结构式为：
7.根据权利要求6所述的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药，其特征在于，所述的c,c,t-[反式1,2-环己二胺基二叠氮基二羟基铂(IV)]制备过程如下：
(1)反式1,2-环己二胺与氯亚铂酸钾水溶液反应，两者的摩尔比为1:1，反应时间8-16h，获得二价铂的配合物c,c-[Pt(II)(CHDA)(Cl)2]；
(2)将上述步骤(1)得到的c,c-[Pt(II)(CHDA)(Cl)2]与硝酸银水溶液在室温下反应12-24h，，硝酸银的摩尔用量是Pt的2倍，过滤法除去沉淀物AgCl，获得二价铂水合物硝酸盐c,c-[Pt2+(II)(CHDA)(H2O)2](NO3 -)2；
(3)将上述步骤(2)得到的c,c-[Pt2+(II)(CHDA)(H2O)2](NO3 -)2与叠氮化钠水溶液在室温下反应4-24h，叠氮化钠的摩尔用量是Pt的2倍，获得二价铂的双叠氮配合物c,c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]黄色沉淀；
(4)将上述步骤(3)得到的二价铂双叠氮配合物c,c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]分散在水中，加入30%双氧水溶液，双氧水的摩尔用量是Pt的5至10倍，室温下反应4-8小时，至体系完全透明，然后50°C加热反应8-12小时，除去体系中残留的双氧水，获得轴向双羟基光活性四价铂配合物c,c,t-[Pt(IV)(CHDA)(N3)2(OH)2]；
(5)将上述步骤(4)得到的CHDA-Pt(IV)-(OH)2水溶液冷冻干燥，获得粉状产物。
8.权利要求4所述生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药的制备方法，其特征在于， 制备式2所示的抗癌药，包括如下步骤：
(1)轴向双羟基光活性四价铂配合物Pt(IV)-(OH)2与酸酐反应，在四价铂的轴向引入带羧酸的配体，获得轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物，反应产物统称“带羧基的光活性Pt(IV)”，简作“Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x”，具有以下结构：
式中1≤x≤2，其中R是酸酐分子中除去羧基的部分，可以是烷烃、环烷烃或芳烃结构，所述的酸酐是丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、邻苯二甲酸酐、斑蝥素或去甲基斑蝥素中的一种；
(2)上述步骤(1)所获得的轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x中的自由羧基与嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯)的侧羟基反应，形成酯键，将光活性铂(IV)配合物连接到高分子链上，获得一种生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药，即聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯-铂(IV)配合物)，简作MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))。
9.根据权利要求8所述的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x与嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚(酯-co-碳酸酯)(MPEG-b-P(ES-co-PC))反应的步骤和条件如下：
①首先将Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x溶于DMSO中，浓度为1-10mg/ml；再将DCC和HOBt溶解在二氯甲烷中，两者摩尔浓度相同，为1mM-10mM；然后将DCC和HOBt溶液加入到含铂(IV)药的DMSO溶液中，DCC、HOBt和Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x中的羧基摩尔比率为1∶1∶0.5-1；避光搅拌反应10-30分钟，得到混合溶液；
②配制载体聚合物MPEG-b-P(ES-co-PC)的CH2Cl2溶液，浓度为20-50mg/ml；然后与步骤①制备的混合溶液在室温下混合，CH2Cl2溶液的载体聚合物MPEG-b-P(ES-co-PC)中羟基与混合溶液中Pt的摩尔比为1∶0.5-3；避光搅拌18-24h后，过滤除去反应生成的二环己基脲沉淀，挥发除去溶剂CH2Cl2，透析除去溶剂DMSO，冷冻干燥，得到生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))。
10.根据权利要求2或8所述的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药的制备方法，其特征在于，其中步骤(1)所述的轴向双羟基光活性四价铂配合物Pt(IV)-(OH)2与酸酐反应步 骤和条件如下：配制Pt(IV)-(OH)2的DMSO溶液，Pt(IV)-(OH)2的浓度为10-20mg/mL；在上述DMSO溶液中加入酸酐，酸酐与Pt(IV)-(OH)2的摩尔比为1-5∶1；室温下搅拌反应8至24小时，得到混合溶液，混合溶液用丙酮或乙醚沉析，沉析物依次用丙酮和乙醚洗涤，室温真空干燥，得到轴向带羧基的光活性Pt(IV)配合物Pt(IV)-(OH)2-x(COOH)x；所述酸酐是丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、邻苯二甲酸酐、斑蝥素和去甲基斑蝥素中的一种。
11.生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药制成纳米胶束冻干粉的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药MPEG-b-PES-b-PLL-Pt(IV)或MPEG-b-P(ES-co-PC-Pt(IV))溶解在DMSO中，获得混合溶液I，所述的生物降解高分子键合药的质量(g)/体积(ml)浓度为1‰至1％；
(2)在步骤(1)得到的混合溶液I中在搅拌下滴加二次蒸馏水，得到胶束溶液，所述的二次蒸馏水体积为混合溶液I体积的3至10倍；
(3)将步骤(2)得到的胶束溶液进行透析，除去残留溶剂DMSO，得到混合溶液II；
(4)将步骤(3)得到的混合溶液II浓缩到固含量0.5-1.0％(w/v)；
(5)冷冻干燥步骤(4)所得产物，获得生物降解高分子键合光活性Pt(IV)抗癌药的纳米胶束冻干粉针剂。
12.根据权利要求11所述的生物降解高分子键合光活性Pt(IV)类抗癌药制成纳米胶束冻干粉的方法，其特征在于，在制备步骤(4)、(5)之间增加一个步骤：在浓缩到0.5％至1.0％(w/v)的胶束溶液中添加高分子键合药质量的50％至200％的增溶剂乳糖、甘露醇、水解明胶、葡萄糖或它们的混合物，搅拌混合均匀。
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