CN102414563B - 用于表征关节炎疾患的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对14-3-3蛋白的自身抗体或其循环免疫复合体、和所述物质用于诊断和预后关节炎疾患的检测。

Description

用于表征关节炎疾患的组合物和方法
领域
本文描述了针对14-3-3的自身抗体和利用所述物质来评价关节炎疾患的方法。
背景
关节炎，或关节痛，一般是指人体关节的炎症性疾病，通常伴有疼痛、肿胀和僵硬。关节炎可由多种原因的任何原因造成，包括感染、创伤、退行性疾病、代谢紊乱或干扰或其它未知病因。骨关节炎(OA)是一种非炎症性关节炎的常见形式，可能在关节创伤后发生，在关节感染后发生，或仅仅是衰老的结果。骨关节炎也称为退行性关节病。类风湿性关节炎(RA)传统上被认为是一种导致免疫系统攻击关节的慢性、炎症性自身免疫性疾病。它是一种使人伤残和痛苦的炎症状态，由于疼痛和关节破坏，可导致基本丧失活动性。强直性脊柱炎(AS)是一种慢性、痛苦的、退行性炎症性关节炎，主要影响脊椎及骶髂关节，从而引起脊柱的最终融合。
人体以关节连接的关节称为滑膜关节，每个滑膜关节通常包括两个相邻骨的相对末端。骨骼的两端包裹在软骨组织中，而整个关节区域被包裹在称为滑膜的保护性软组织中，其包括滑液膜。滑液膜产生并释放入关节腔内的润滑滑液。在正常关节中，滑液的体积相当小。除了润滑功能以外，滑液还充当溶质和几种驻留单核细胞和滑膜细胞的储库。
滑液可响应于认为促进关节炎的许多刺激而变得被刺激和增厚，所述刺激包括关节创伤和/或人体免疫系统故障。这种刺激的结果包括过量产生和释放滑液入关节，从而导致关节区域内和周围肿胀。体积增加通常伴随着滑液中以下物质的浓度增加：成纤维细胞样滑膜细胞(FLS细胞)、促炎性细胞因子诸如白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF-α)、组胺蛋白和肽、以及降解性酶诸如基质金属蛋白酶(MMP)。FLS细胞构成正常滑液中滑膜细胞的约三分之二，具有明确定义的分泌系统，在创伤或炎症条件下通常分泌大量MMP入滑液，特别是MMP-1、3、8、9、10、11和13。认为MMP-1和MMP-3在软骨和包含关节的其下的骨组织的进行性结构损伤中具有显著的作用。活化FLS细胞产生MMP-1和MMP-3的已知因子包括IL-1和TNF-α。
RA、AS和OA的引发因素目前是未明确定义的。然而，已知与疾病进展相关的生理事件，从关节中过量滑液积累引起的长期肿胀和炎症，到经由降解性酶活性对软骨和其下的骨组织的降解和劣化，以及伴随的FLS细胞增殖到骨中(这导致永久性结构损伤)。如果足够早地检测，可以适当的物理和医学治疗逆转或至少最小化疾病的潜在长期有害作用。因此，相当多的努力放在对用于早期鉴定关节炎的适当的生物标志物的鉴定。为此目的，Kilani等(2007，J.Rheum.34：1650-1657；WO 2007/128132)已经报道，14-3-3蛋白家族的两个成员，尤其是14-3-3η和14-3-3γ，存在于关节炎患者的滑液和血清中，且这些同种型与滑液和血清中MMP-1和MMP-3的水平直接相关。
概述
本发明涉及以下发现：生物样品中针对14-3-3蛋白的自身抗体的存在与关节炎疾患的诊断和/或预后有关联。这种自身抗体与关节炎疾患之间强的关联允许通过测定来自受治疗者的生物样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体来诊断和/或预后关节炎疾患。在优选实施方案中，14-3-3蛋白包含η和/或γ同种型。
因此，本文描述了用于评价和/或表征哺乳动物受治疗者的关节炎疾患的方法，包括将来自受治疗者的生物样品与至少一种14-3-3蛋白或其片段接触，并检测针对14-3-3蛋白或其片段的自身抗体，其中针对所述至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体的存在/量指示受治疗者中关节炎疾患的存在和/或状态。本文还提供了用于评价和/或表征哺乳动物受治疗者的关节炎疾患的方法，包括检测来自受治疗者的生物样品中自身抗体与至少一种14-3-3蛋白的循环免疫复合体，其中样品中现存免疫复合体的存在/量指示受治疗者中关节炎疾患的存在和/或状态。
14-3-3蛋白或其片段可包含多个14-3-3蛋白同种型共有的表位，或可包含一个或一组14-3-3蛋白同种型特有的表位。在优选实施方案中，14-3-3蛋白或其片段包含14-3-3η和/或γ表位。在一个实施方案中，14-3-3蛋白或其片段包含至少一种其它14-3-3同种型如14-3-3γ共有的14-3-3η表位。在另一个实施方案中，14-3-3η表位是14-3-3η特有的。
在一个实施方案中，检测步骤包括定量/测量生物样品中针对14-3-3蛋白或其片段的自身抗体或与14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的水平以与对照样品比较。因此，本文要求保护的用于评价受治疗者的关节炎疾患的方法可提供预后性判断以及诊断性判断。
一方面，对照样品是正常对照，所述比较指示关节炎诊断。在一个实施方案中，与正常对照样品(如，来自未患有关节炎疾患的另一受治疗者)相比，所述生物样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的水平增加是所述受治疗者中关节炎疾患的诊断性指示物。
因此，在一些实施方案中，来自受治疗者的生物样品中针对14-3-3蛋白的自身抗体或其免疫复合体的存在和/或相对于正常(即，无关节炎)对照样品中所述自身抗体或免疫复合体的水平，来自受治疗者的生物样品中所述自身抗体或免疫复合体的增加水平的存在提供受治疗者患有关节炎疾患的诊断。
一方面，对照样品是来自哺乳动物受治疗者的先前生物样品，所述比较指示疾病发展和/或治疗方案的效力。在一个实施方案中，与先前样品(如，来自所述受治疗者的基线生物样品)相比，所述样品中针对14-3-3的自身抗体或其循环免疫复合体的水平降低指示正在进行的治疗方案的效力。
因此，在一些实施方案中，与来自同一受治疗者的基线生物样品中存在的针对14-3-3或其片段的自身抗体或与14-3-3或其片段的免疫复合体的水平相比，来自受治疗者的生物样品中检测的这种自身抗体或复合体的相对水平提供关节炎疾患的预后，或指示治疗方案的效力。
一方面，对照样品是关节炎对照，所述比较指示疾病预后。在一个实施方案中，相对于关节炎对照样品(如，来自患有明确定义的关节炎疾患的另一受治疗者)，针对14-3-3的自身抗体或其免疫复合体的相对水平是关节炎的预后性指示物。
因此，在一些实施方案中，具有不同关节炎状态的受治疗者在针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、和/或至少一种14-3-3蛋白或其片段的循环免疫复合体的水平方面具有可检测的差异，这些差异具有预后相关性。在一个示例中，本文公开的方法可用于基于受治疗者中检测的自身抗体与在另一患者等等中先前确定在关节炎疾患过程如，治疗前、治疗中、治疗后中存在的水平相比的相对水平，确定关节炎疾患的特定疾病阶段或组织病理学表型。在另一示例中，本文公开的方法可用于基于生物样品中检测的自身抗体相比于可能如，存储在数据库中的对照样品的相对水平，将生物样品分类为来自处于表现关节炎疾患的高风险的受治疗者。
另一方面，本文公开的方法可用于基于来自受治疗者的生物样品中检测的自身抗体与对照样品，如，来自用该治疗方案成功治疗的第二受治疗者的第二生物样品相比的相对水平，预测该受治疗者对治疗方案的响应性。
因此，在一些实施方案中，将来自第一受治疗者的生物样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的相对水平与来自已知其响应于治疗的能力的受治疗者的生物样品中针对14-3-3的自身抗体、或与14-3-3的免疫复合体的水平比较，其中所述比较确定第一受治疗者对该治疗的响应潜力。受治疗者对治疗方案的敏感性的确定随后可用于报告治疗患有关节炎疾患的受治疗者的方法。例如，本文描述了治疗患有关节炎疾患的受治疗者的方法，包括测量来自受治疗者的生物样品中针对14-3-3的自身抗体的水平(如，通过测量自身抗体/14-3-3免疫复合体形成的水平)，将针对14-3-3的自身抗体或与14-3-3的免疫复合体的水平与受治疗者对治疗方案的敏感性关联，和对受治疗者提供治疗方案。一方面，本发明提供监测关节炎疾患治疗的方法，包括确定患者样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的水平，和监测经历治疗的患者中关于14-3-3的自身抗体/免疫复合体的水平。
另一方面，本文提供了用于确定和/或区分患者中关节炎亚型的方法。在这方面，将来自第一受治疗者的生物样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的相对水平与来自其关节炎亚型已知和/或先前确立的一个或多个其它受治疗者的生物样品中针对14-3-3的自身抗体、或与14-3-3的免疫复合体的水平比较，其中所述比较确定第一受治疗者的关节炎亚型。
来自第一受治疗者的生物样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的水平与来自其关节炎亚型已知和/或先前确立的其它受治疗者的生物样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的水平相似的确定，可指示第一受治疗者具有与其它受治疗者相同的关节炎亚型。例如，来自第一受治疗者的生物样品与已知患有炎症性关节炎如，类风湿性关节炎的另一受治疗者的生物样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的相似水平可确定第一受治疗者也具有炎症性关节炎如，类风湿性关节炎。
另外，来自第一受治疗者的生物样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的水平与来自其关节炎亚型已知和/或先前确立的其它受治疗者的生物样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的水平不同的确定，可指示第一受治疗者具有与其它受治疗者不同的关节炎亚型。例如，来自第一受治疗者的生物样品与已知患有非炎症性关节炎如，骨关节炎的其它受治疗者的生物样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的不同水平可确定第一受治疗者具有炎症性关节炎如，类风湿性关节炎。
在一个实施方案中，检测步骤包括基于免疫学的技术，如，免疫沉淀、ELISA、Western印迹分析、免疫组织化学、免疫荧光、“三明治”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定、沉淀反应、凝集测定、补体固定测定、蛋白A测定、免疫电泳测定、荧光激活细胞分选(FACS)分析、放射免疫测定、等等。
因此，根据本文描述的方法检测和/或测量针对14-3-3蛋白或其片段的自身抗体可如下进行：通过观察样品中自身抗体与14-3-3或其片段的免疫复合体的形成，或替代地通过确定样品中现存自身抗体/14-3-3复合体的存在。在一个实施方案中，形成可借助于可检测地标记的14-3-3蛋白或其片段来检测。在另一个实施方案中，复合体可通过自身抗体/14-3-3复合体与可检测地标记的结合免疫球蛋白的第二抗体之间形成第二免疫复合体来检测，所述免疫球蛋白如，自身抗体的免疫球蛋白主链。
在一个实施方案中，方法包括检测患者的血液、滑液、血浆、血清或组织(如，滑膜关节、受损关节组织、等等)中针对14-3-3的自身抗体或其循环免疫复合体。在一个实施方案中，检测通过利用14-3-3蛋白或其片段从血液、滑液、血浆、血清或组织免疫沉淀针对14-3-3的自身抗体来进行。在一个实施方案中，检测包括使用ELISA。在一个实施方案中，检测包括Western印迹分析包括来自患者的滑液、血浆或血清的样品。在一个实施方案中，检测包括使用放射免疫测定。在一个实施方案中，检测包括使用条带测试。在一个实施方案中，检测包括使用即时测试。在一个实施方案中，针对14-3-3的自身抗体或其免疫复合体的检测联合关节炎另一标志物(如，MMP、抗CCP、抗RF和/或CRP)的检测。
本文还描述了包含用于评价受治疗者关节炎疾患的试剂的试剂盒，其中所述试剂特异性地识别针对14-3-3蛋白或其片段的自身抗体。在一个实施方案中，所述试剂可包括可检测地标记的14-3-3蛋白或其片段，其还可固定在固体支撑物上。14-3-3蛋白或其片段可包含多个14-3-3蛋白同种型共有的表位，或可包含表位一种或一组14-3-3蛋白同种型特有的表位。在优选实施方案中，14-3-3蛋白或其片段包含14-3-3η和/或γ表位。在一个实施方案中，14-3-3蛋白或其片段包含至少一种其它14-3-3同种型如14-3-3γ共有的14-3-3η表位。在另一个实施方案中，14-3-3η表位是14-3-3η特有的。
附图简述
图1显示利用来自诊断为类风湿性关节炎的患者的血清(样品3323)的连续稀释，重组14-3-3η的western印迹。
图2显示利用来自诊断为类风湿性关节炎的患者的血清(样品3365)的连续稀释，重组14-3-3η的western印迹。
图3显示利用来自未诊断为类风湿性关节炎的患者的血清(样品40)的连续稀释，重组14-3-3η的western印迹。
图4显示利用来自未诊断为类风湿性关节炎的患者的血清(样品39)的连续稀释，重组14-3-3η的western印迹。
发明详述
“受治疗者”和“患者”可互换使用，除了指明之处以外，是指哺乳动物诸如人和非人灵长类、以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其它哺乳动物物种。
“关节炎疾患”、“关节炎”和“关节痛”可互换使用，除了指明之处以外，通常是指人体关节的炎症性疾患。疼痛、肿胀、僵硬和难以移动通常与关节炎疾患有关。关节炎由多于100种不同情况组成。这些情况可以是任何情况，从相对轻微的形式到严重损害的系统形式，参见如，www.arthritis.ca/types％20of％20arthritis/default.asp？s＝1。关节炎疾患可由多种原因的任何原因造成，包括感染、创伤、退行性疾病、代谢紊乱或干扰或其它未知病因。关节炎疾患可按照亚型更具体地描述，例如，类风湿性关节炎、混合性结缔组织病(MCTD)、晶体性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、骨关节炎、类肉瘤病、复发性风湿病、创伤后关节炎、恶性肿瘤相关的关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、骨关节炎、细菌传染性关节炎、等等。关节炎还可伴有其它鉴定的疾病，包括痛风、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、银屑病、等等。明确定义的关节炎疾患是指知晓关于关节炎的类型和其阶段，如，发作、缓解、复发、等等。
“自身抗体”是特异性结合自身抗原即，正常组织成分的内源抗体。自身抗体响应于产生自身抗体的同一身体的天然存在的抗原而产生。
“免疫结合”和“免疫复合体形成”可互换使用，在本上下文中使用，通常是指抗体如，自身抗体与抗体对其特异性的抗原之间发生的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和性可以相互作用的解离常数(Kd)来表示，其中较小Kd代表较大亲和性。免疫结合性质可利用本领域公知方法来定量。例如，参见Davies等(1990)Annual Rev.Biochem.59：439-473。抗体或其抗原结合片段如果在可检测的水平(例如，在ELISA测定中)与配体反应，并且在相似条件下不与不相关配体可检测地反应，则称为“特异性结合”、“免疫结合”和/或“免疫反应性”。
“抗体”是指构成特异性结合相应抗原的蛋白的组成，并具有免疫球蛋白的共同的、一般结构。术语抗体具体地涵盖多克隆抗体、单克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(如，二特异性抗体)和抗体片段，只要其表现期望的生物活性。抗体可以是鼠、人、人源化、嵌合的，或源自其它物种。通常，抗体包含由二硫键互连的至少两条重链和两条轻链，它们联合时形成与抗原相互作用的结合结构域。每条重链包括重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3，可以是μ、δ、γ、α或ε同种型。相似地，轻链包括一个轻链可变区(VL)和一个轻链恒定区(CL)。轻链恒定区包括一个结构域CL，可以是κ或λ同种型。VH区和VL区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，散布在称为构架区(FR)的更保守的区域之间。每个VH和VL包括三个CDR和四个FR，从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(如，效应细胞)和经典补体系统的第一补体(Clq))的结合。重链恒定区介导免疫球蛋白与宿主组织或宿主因子的结合，尤其是通过细胞受体诸如Fc受体(如，FcγRI、FcγRII、FcγRIII、等等)。本文所用的抗体还包括免疫球蛋白保持结合抗原能力的抗原结合部分。作为示例，这些包括VL CL抗体结构域和VH CH抗体结构域的单价片段F(ab)；和包含由在铰链区的二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段F(ab’)2片段。术语抗体还指重组单链Fv片段(scFv)和双特异性分子诸如如，双抗体、三抗体和四抗体(参见如，美国专利No.5,844,094)。
“抗原”将宽泛地解释，是指可特异性结合抗体的任何分子、组合物或颗粒。抗原可具有与抗体相互作用的一个或多个表位，尽管其不必诱导抗体产生。
因此，术语“针对14-3-3的自身抗体”和“对14-3-3的自身抗体”可互换使用，是指由哺乳动物受治疗者产生的、特异性结合来自所述宿主的14-3-3蛋白或其片段的内源抗体。
“14-3-3”和“14-3-3蛋白”可互换使用，是指在真核细胞中普遍表达的保守胞内调节分子的14-3-3家族的至少一个成员。14-3-3蛋白具有结合许多功能各异的信号转导蛋白，包括激酶、磷酸酶和跨膜受体的能力。实际上，多于100种信号转导蛋白已被报道为14-3-3的配体。14-3-3蛋白可被认为是Tetratrico肽重复片段超家族的演化成员。它们通常具有9或10个α螺旋，通常沿着其氨基末端螺旋形成同二聚体和/或异二聚体相互作用。这些蛋白包含多个已知结构域，所述结构域包括用于二价阳离子相互作用、磷酸化&乙酰化和蛋白水解裂解的区域及其它。已知在哺乳动物中表达七种不同遗传编码的14-3-3蛋白同种型，每种同种型包含242-255个氨基酸。七种14-3-3蛋白同种型命名为14-3-3α/β(alpha/beta)、14-3-3δ/ξ(delta/zeta)、14-3-3ε(epsilon)、14-3-3γ(gamma)、14-3-3η(eta)、14-3-3τ/θ(tau/theta)和14-3-3σ(sigma/stratifin)。14-3-3蛋白具有高程度的序列相似性，已知经历翻译后处理如，磷酸化、瓜氨酸化、等等。参见如，Megidish等(1998)J.Biol.Chem.273：21834-45。因此，抗14-3-3自身抗体可特异性结合和/或识别多于一种14-3-3蛋白同种型，或可特异性结合和/或识别仅一种同种型(如，14-3-3η)。另外，抗14-3-3抗体可结合和/或识别已被如，天然(如，翻译后)或化学方法修饰的14-3-3-蛋白。
术语“特异结合”或“特异性结合”当关于抗体与蛋白或肽相互作用使用时，是指该相互作用依赖于蛋白上特定结构(即，表位)的存在；换言之，抗体识别和结合特定蛋白结构而不是总体上的蛋白。
表位是通常存在于分子表面并对与抗体相互作用可接近的化学特征。典型化学特征是氨基酸和糖基团，具有三维结构特征以及化学特性(包括电荷、亲水性和亲脂性)。构象表位区别于非构象表位在于，在分子空间要素改变而其下化学结构无任何改变后，失去与抗体的反应性。因此，术语“表位”当关于14-3-3蛋白或特定异构体使用时，通常是指能够结合抗体如，自身抗体的蛋白(包括修饰的14-3-3蛋白)的决定簇。本文描述了被诊断为关节炎尤其是类风湿性关节炎的患者的自身抗体识别的14-3-3表位，利用这种表位评价和/或表征受治疗者的关节炎疾患的方法，和包含这种表位的试剂盒。
14-3-3蛋白或其片段可包含多个14-3-3蛋白同种型共有的表位，或可包含一个或一组14-3-3蛋白同种型特有的表位。本文所用的“共有”是指两个或多个14-3-3蛋白同种型之间共同的片段或表位。在优选实施方案中，14-3-3蛋白或其片段包含14-3-3η和/或γ表位。在一个实施方案中，14-3-3蛋白或其片段包含至少一种其它14-3-3同种型如，14-3-3γ共有的14-3-3η表位。在另一个实施方案中，14-3-3η表位是14-3-3η特有的。14-3-3η的共同识别的表位包括在下表1中。
诊断、预后和治疗方法、以及治疗监测
一方面，本发明提供用于诊断牵涉针对14-3-3的自身抗体的疾病和疾患的方法。大体上，关节炎疾患的存在或不存在、或患者预后通过以下确定：(a)将从哺乳动物受治疗者获得的生物样品与至少一种14-3-3蛋白或其片段接触；(b)检测样品中特异性结合14-3-3蛋白或其片段的自身抗体的水平；和(c)比较这种抗体的水平与适当的对照。
该方法包括利用至少一种14-3-3蛋白或其片段检测针对该蛋白的自身抗体。本领域技术人员已知多种利用蛋白检测抗体样品中的抗体的测定形式。参见如，Harlow和Lane，Antibodies：A LaboratoryManual(抗体实验手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。作为非限制性例子，针对14-3-3的自身抗体的检测可利用公知方法或测定进行，如，免疫沉淀、ELISA、Western印迹分析、免疫组织化学、免疫荧光、“三明治”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定、沉淀反应、凝集测定、补体固定测定、蛋白A测定、免疫电泳测定、荧光激活细胞分选(FACS)分析、放射免疫测定、条带测定、即时测定、等等。本领域技术人员将认识到，这些方法还可用于测量生物样品中针对14-3-3蛋白的自身抗体、或与14-3-3蛋白的免疫复合体的水平。
在一些实施方案中，使用自动化检测测定。用于免疫测定自动化的方法包括美国专利No.5,885,530、4,981,785、6,159,750和5,358,691中描述的那些方法，其每一篇通过引用并入本文。在一些实施方案中，分析和结果展示也是自动化的。例如，在一些实施方案中，采用基于对应关节炎疾患的一系列蛋白(包括14-3-3蛋白)的存在或不存在产生预后的软件。
在一个实施方案中，测定包括使用固定在固体支撑物上的至少一种14-3-3蛋白或其片段来从样品的其余部分结合和捕获特异性结合14-3-3蛋白的自身抗体。然后结合的自身抗体可利用包含报告基团并特异性结合抗体/蛋白复合体的检测试剂来检测。这种检测试剂可包括例如，特异性结合自身抗体诸如抗人抗体的结合剂。
固体支撑物可以是本领域技术人员已知的任何材料。例如，固体支撑物可以是微量滴定板中的测定孔或硝酸纤维素或其它适当的膜。可选地，支撑物可以是微珠或盘，诸如玻璃、玻璃纤维、胶乳或塑料材料，诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯。支撑物还可以是磁性颗粒或纤维光学传感器，诸如例如，美国专利号5,359,681中公开的那些。14-3-3蛋白或其片段可利用本领域技术人员已知的多种技术固定在固体支撑物上，所述技术充分描述于专利和科学文献中。在本发明范畴中，术语″固定″是指非共价缔合诸如吸附和共价连接(这可以是支撑物上抗体与官能团的直接键合，或可以是借助交联剂的键合)二者。优选通过吸附于微量滴定板中的孔或吸附于膜来固定。在这样的情况，吸附可通过在适当缓冲液中将抗体与固体支撑物接触适当的时间量来实现。接触时间随温度而不同，但通常在约1小时至约1天。在一个实施方案中，包被链霉亲和素的微量滴定板连同生物素化的14-3-3蛋白或其片段使用。
14-3-3蛋白或其片段与固体支撑物的共价连接通常可通过首先将支撑物与双官能试剂反应来实现，该双官能试剂将与支撑物和14-3-3蛋白或其片段二者反应。然后可利用非竞争性的“三明治”技术检测捕获的自身抗体，在该技术中，将用于自身抗体的标记的配体暴露于洗涤的固相。可选地，竞争格式依赖于先前向样品引入标记的抗体，从而标记的形式与未标记的形式竞争对固相的结合。这种测定技术是公知的，并且充分描述在专利和科学文献中。参见如，美国专利No.3,791,932；3,817,837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876。酶联免疫吸附测定(ELISA)方法详细描述在美国专利No.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,879,262；和4,034,074。ELISA测定检测非常低滴度的自身抗体。
自身抗体还可通过固相放射免疫测定(RIA)检测。在竞争结合固定的配体的放射标记的抗体存在下，将固相暴露于血清样品。在这一测定中，结合固相的放射标记的量与血清样品中最初存在的自身抗体的量逆相关。分离固相后，通过洗涤去除非特异性结合的放射标记，确定结合固相的放射标记的量。反过来，结合的放射标记的量与样品中最初存在的自身抗体的量相关。
在一个实施方案中，测定以通流测试或条带测试格式进行，其中14-3-3蛋白或其片段固定在膜诸如硝酸纤维素上。在通流测试中，当样品接触膜时，样品中针对14-3-3蛋白的自身抗体结合固定的14-3-3蛋白或其片段。然后当包含第二结合剂的溶液接触膜时，标记的第二结合剂结合免疫复合体。然后如上所述地进行结合的第二结合剂的检测。在条带测试格式中，将结合14-3-3蛋白或其片段的膜的一端浸入包含样品的溶液中。样品沿着膜迁移穿过包含第二结合剂如，针对自身抗体的第二结合剂的区域，到达固定的14-3-3蛋白或其片段的区域。第二结合剂在固定的14-3-3蛋白或其片段区域的浓度指示关节炎疾患的存在、或患者预后、等等。通常，第二结合剂在该位置的浓度产生可视觉读取的图样，诸如线。不存在这种图样则指示阴性结果。大体上，当生物样品包含足以在以上讨论的格式的测定中产生阳性信号的一定水平自身抗体时，选择固定在膜上的结合剂的量以产生视觉可辨别的图样。用于这种测定的优选结合剂是14-3-3蛋白和其片段。这种检测通常可以非常少量的生物样品进行和即时进行，这也可以是可量化的。
除了检测样品中自身抗体的存在，许多方法可用于定量地测量自身抗体的水平。在一些方法中，抗原在液相中与自身抗体反应，通过免疫沉淀技术定量地测量自身抗体。例如，可以可检测地标记(如，以同位素或酶)14-3-3蛋白或其片段(即，全长异构体或抗原性片段)。多肽可在合成期间标记(如，通过向体外翻译体系或细胞表达体系加入35S-甲硫氨酸)或在合成后标记。向液态生物样品(如，血清)直接加入可检测的抗原来形成免疫复合体。免疫复合体可用聚乙二醇沉淀。免疫复合体还可用结合于固体支撑物(如，琼脂糖或琼脂糖微珠)的第二抗体(如，山羊抗人免疫球蛋白)或其它类型结合分子(如，蛋白A或蛋白G)来分离。从液态样品分离后，洗涤免疫沉淀物数次，检查可检测的标记(如，放射性)的强度。如此可检测和定量样品中存在的任何自身抗体。任选地，还可加入未标记的多肽以与标记的多肽竞争对自身抗体的结合。
本发明的诊断方法还涉及检测受治疗者中，14-3-3蛋白与自身抗体之间形成的循环免疫复合体。可容易地修改上述方法用于检测这种免疫复合体。例如，可将固定的结合分子(如，结合微珠的蛋白A或蛋白G)加至液态生物样品。从液相分离后，可用SDS-PAGE分析被结合分子捕获的免疫复合体，用针对14-3-3蛋白的不同抗体探测。还可对捕获的抗原进行直接氨基酸序列分析。如此可揭示免疫复合体的身份。常规地实践大量测定来检测受治疗者中的循环免疫复合体，所述测定如以下文献中描述的：Tomimori-Yamashita等，Lepr Rev，70(3)：261-71，1999(基于抗体的酶联免疫吸附测定)；Krapf等，J ClinLab Immunol，21(4)：183-7，1986(荧光联免疫吸附测定)；Kazeem等，East Afr Med J，67(6)：396-403，1990(激光免疫比浊法)；和Rodrick等，J Clin Lab Immunol，7(3)：193-8，1982(蛋白A-玻璃纤维滤镜测定、PA-GFF、和聚乙二醇不溶解测定)。为了本发明的方法可采用这些公知测定的每一种来检测循环免疫复合体。
为了改进临床灵敏度，可测定指定样品中的多种标志物。尤其是，一种或多种关节炎的其它标志物、或预后指示物、等等可联合针对14-3-3蛋白的自身抗体测定。这些其它标志物可以是蛋白或核酸。在一个优选实施方案中，一种或多种其它标志物是MMP蛋白或核酸或常用作关节炎指示物的其它因子，如，抗CCP、抗RF、CRP、SAA、IL-6、SlOO、骨桥蛋白、RF、MMP-I、MMP-3、透明质酸、sCD14、血管发生标志物和骨、软骨或滑膜代谢产物(如，CTX-I和CTX-II)、等等。用于基于参考序列分离和测定核酸的方法是本领域公知的，用于检测患者样品中目标蛋白的方法也是本领域公知的。
联合测定可同时或相继进行。标志物的选择可基于常规实验来确定导致最佳灵敏度的组合。
在一个实施方案中，本发明提供用于诊断关节炎疾患的方法。大体上，可基于患者滑液、滑膜关节、血液、血浆或血清中针对14-3-3的自身抗体的存在来检测患者的关节炎疾患。换言之，针对14-3-3蛋白的自身抗体可用作标志物来指示关节炎。
此外，通过使用14-3-3蛋白或其片段确定的，针对14-3-3的自身抗体的存在、或针对14-3-3的自身抗体的相对水平可以是在发展为衰弱形式之前，早期关节炎的预后指示物。早期预后或诊断的益处是更早地实施治疗方案。
为了确定受治疗者中关节炎疾患的存在或不存在，通常可将来自受治疗者的生物样品中针对14-3-3的自身抗体、或与14-3-3的免疫复合体的水平与对应正常对照的自身抗体/免疫复合体水平比较。在一个优选实施方案中，从来自无关节炎的患者的样品中针对14-3-3的自身抗体或与14-3-3的免疫复合体的平均水平来确定正常对照。在替代实施方案中，正常对照值可利用接受者工作特性曲线确定，例如参见Sackett等，Clinical Epidemiology：A Basic Science for ClinicalMedicine(临床流行病学：临床药物的基础科学)，Little Brown and Co.，1985，p.106-7的方法。简言之，在这一实施方案中，对照值可从对应诊断检测结果的每个可能截止值的真阳性率(即，灵敏度)和假阳性率(100％-特异性)对的曲线确定。曲线上最接近左上方转角的对照值(即，包围最大区域的值)提供最准确的值，产生高于由此方法确定的值的信号的样品被认为是阳性的。可选地，对照值可沿着曲线向左移以使假阳性率最小，或向右移以使假阴性率最小。大体上，产生高于由此方法确定的对照值的信号的样品被认为是关节炎阳性的。
一方面，本发明提供用于区分关节炎亚型的方法。在一个实施方案中，方法包括确定针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的水平。在一个优选实施方案中，将患者中针对14-3-3的自身抗体/免疫复合体的水平与来自其关节炎亚型已知和/或先前确定的受治疗者的样品的水平比较。
一方面，本发明提供用于确定患者对针对关节炎的治疗的响应潜力的方法。在一个实施方案中，该方法包括确定患者样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的水平。在一个优选实施方案中，将患者样品中针对14-3-3的自身抗体/与14-3-3的免疫复合体的水平与来自已知其响应治疗的能力的受治疗者的样品的水平比较。第一患者样品中针对14-3-3的自身抗体/与14-3-3的免疫复合体与来自非炎症性受治疗者的样品和/或来自另一炎症性患者的样品相比的相对高水平，可指示第一患者是公知治疗的优选候选者，所述治疗如，缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)疗法诸如抗TNF、甲氨蝶呤、米诺环素、羟氯喹、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、抗IL-1、抗IL-6r、等等。相反，第一患者样品中针对14-3-3的自身抗体/与14-3-3的免疫复合体与来自另一炎症性患者的样品相比的相对低水平，可指示第一患者不是公知治疗的优选候选者，尤其是如果该水平更接近来自非炎症性受治疗者的样品的水平。
用于多种类型关节炎的治疗方案是本领域已知的。例如，对诊断为类风湿性关节炎的患者最初可开非甾体抗炎药(NSAID)，以缓解不适和减少炎症。其它治疗方案可包括，例如，甾体抗炎药(SAID如，皮质醇、强的松)、环氧合酶2特异性抑制剂(CSI)、糖皮质激素、和/或标准缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)诸如，如，抗TNF-α中和剂、免疫抑制药(如，环孢霉素、硫唑嘌呤、环磷酰胺)、抗生素、抗疟疾药和细胞毒性药(如，甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、来氟米特)。治疗方案还可有利地包括直接靶向14-3-3蛋白的那些，参见如，PCT/CA2008/002154。关于剂量的细节或具体药物的例子是本领域技术人员已知的，可见于例如Harrison’s Principles of InternalMedicine(Harrison内科原理)第15版.BRAUNWALD等编著.McGraw-Hill或“The Pharmacological basis of therapeutics(治疗的药理学基础)”，第10版.5 HARDMAN HG.，LIMBIRD LE.编著.McGraw-Hill，New York，和“Clinical Oncology(临床肿瘤学)”，第3版.Churchill Livingstone/Elsevier Press，2004.ABELOFF，MD.编著。
一方面，本发明提供用于监测关节炎治疗的方法。在一个实施方案中，该方法包括确定患者样品中针对至少一种14-3-3蛋白或其片段的自身抗体、或与至少一种14-3-3蛋白或其片段的免疫复合体的水平，并监测经历治疗的患者中针对14-3-3的自身抗体/与14-3-3的免疫复合体的水平。
针对14-3-3的自身抗体/与14-3-3的免疫复合体的存在或相对水平可与已知与患者关节炎疾患相关的其它蛋白的存在或相对水平关联。公知与关节炎疾患相关的蛋白的非限制例子包括炎症性细胞因子，诸如肿瘤坏死因子、14-3-3蛋白、和基质金属蛋白酶(MMP)诸如MMP-1或MMP-3、等等。已经鉴定了至少25种不同MMP。患者样品中针对14-3-3的自身抗体的检测联合至少一种炎症性细胞因子和/或MMP的检测可用于诊断关节炎。另外，患者样品中14-3-3的自身抗体/免疫复合体联合至少一种14-3-3同种型、至少一种MMP和/或至少一种炎症性细胞因子的存在或相对水平可在关节炎发展为衰弱形式之前，用作早期关节炎的预后指示物。
本文还描述了用于评价关节炎疾患的试剂盒。这种试剂盒通常包含进行诊断和/或预后测定必需的两种或多种组分。组分可以是化合物、试剂、容器、说明书和/或装置。例如，试剂盒中的一个容器可包含14-3-3蛋白或其片段。这种试剂盒还可包含如上所述的检测试剂，所述检测试剂包含适于直接或间接检测抗体结合的报告基团。
因此，本文描述了用于检测患者样品中针对14-3-3的自身抗体/与14-3-3的免疫复合体和任选的其它标志物(如MMP)的存在的试剂盒，该试剂盒可用于提供适于诊断或区分不同关节炎疾患的诊断或预后结果。其中也可牵涉14-3-3蛋白和/或自身抗体的存在的另外适应症包括例如，心血管和/或神经变性病症。试剂盒可包含14-3-3蛋白或其片段，其可任选地被可检测地标记，如，以放射性标记、发光标记、荧光标记、酶、等等标记。用于可检测地标记蛋白的方法是本领域公知的。这种试剂盒还可包括对关节炎的其它标志物特异的检测试剂，所述其它标志物如，抗CCP、抗RF、CRP、SAA、IL-6、SlOO、骨桥蛋白、RF、MMP-I、MMP-3、透明质酸、sCD14、血管发生标志物和骨、软骨或滑膜代谢产物(如，CTX-I和CTX-II)、等等。试剂盒还可包括免疫检测针对14-3-3的自身抗体所需的其它第二试剂，诸如标记的第二抗体(如，抗人抗体)、发色或荧光试剂、聚合剂、等等。用于为了诊断或预后目的使用试剂盒的说明书(包括在特定疾病状态的范畴中定量和/或评价这种自身抗体水平的适当比较标准)，也可有利地以印刷形式提供和/或记录在适当介质上。
实验
实施例1：用人血清检测重组14-3-3η
将重组14-3-3η蛋白(Augurex，North Vancouver，BC，Canada)上样到SDS-PAGE凝胶，并转移到硝酸纤维素膜上。将来自未诊断为类风湿性关节炎的受治疗者(Biochemed，Winchester，VA)或诊断为类风湿性关节炎的受治疗者(Biochemed，Suffolk County，NY)的人血清与膜一起培养以检测和表征血清中针对14-3-3η的自身抗体。自身抗体利用共轭于HRP的抗人第二抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratories，West Grove，PA)来检测，并且通过化学发光显现。
具体地，将样品缓冲液(62.5mM Tris酸、2％SDS、10％甘油、0.01％溴苯酚蓝、5％β-巯基乙醇)中的2μg重组14-3-3η蛋白上样到15％SDS-PAGE凝胶。用电泳缓冲液(2.5mM Tris碱、19.2mM甘氨酸、0.1％SDS)将SDS-PAGE凝胶以70伏电泳30分钟，然后以140伏电泳直到前方的染料达到凝胶底部。然后在冰上以400mAh用转移缓冲液(2.5mM Tris碱、19.2mM甘氨酸、20％甲醇)转移蛋白到硝酸纤维素膜。利用Ponceau S染料在膜上显现蛋白来验证转移功效。然后将膜放在封闭缓冲液(TBS-T(10mM Tris、pH 7.5、150mMNaCl、0.05％Tween20)中5％脱脂奶粉)中，在室温在震荡器上培养1小时。去除封闭缓冲液，加入用封闭缓冲液稀释的人血清(1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100，v/v)以切割膜。在震荡器上在4℃培养膜过夜。然后用TBS-T洗涤膜3次，每次5分钟。然后加入封闭缓冲液中的抗人HRP抗体(0.1μg/ml)，在室温在震荡器上培养1小时。然后用TBS-T洗涤膜6次，每次5分钟。自身抗体利用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce，Rockford，Il)显现，并记录在膜上。
图1和图2呈现的代表性数据证实，取自关节炎患者的人血清具备针对14-3-3η的抗体，如通过免疫印迹分析显现重组14-3-3证明的。
这些自身抗体的存在表现为是炎症性疾患如关节炎中的特殊现象，因为在取自正常健康个体的血清中，这些自身抗体是不可检测的或是在较低水平可检测的(图3和4)。
作为自然防御机制的部分，免疫系统产生抗体作为破坏其遭遇的外来颗粒/病原体的手段。在关节炎的情况下，充分确立的是，14-3-3蛋白，主要是14-3-3η和γ，是滑液和血清中可检测的。目前，认为滑液和血清中14-3-3蛋白和/或针对14-3-3蛋白或其片段的自身抗体的水平与关节组织损伤直接相关，这种关联可用在本文描述的方法中。例如，针对14-3-3的自身抗体的水平增加可导致14-3-3蛋白减少，从而与关节组织损伤的较低水平或风险关联。
进行这一研究以确定免疫系统是否试图对抗或响应14-3-3的存在，通过特异性地产生抗体响应以靶向它们并将其从血清清除。这些自身抗体的存在将提供进一步的证据，表明这些蛋白通常不存在于细胞外空间，因为如果其通常存在，身体不会发起这样的响应。
数据清楚地证明，在关节炎的情况下，与来自正常健康个体的血清相比，靶向14-3-3的自身抗体以较高水平存在。因此，与正常健康个体相比，这些抗体的差异表达可用于诊断关节炎的方面。而且，差异表达可在疾病预后以及确定向患者施用哪种疗法以及监测患者对指定疗法的响应中具有用途。
实施例2：开发测定以测量抗14-3-3-抗体的滴度或水平
为了对被自身抗体最共同识别的14-3-3表位作图，利用印迹合成技术在纤维素纸上直接合成代表14-3-3η肽的完整序列的重叠的15-残基肽。半胱氨酸残基被丝氨酸代替以减少由半胱氨酸的存在造成的化学复杂性。被聚乙二醇和Fmoc-保护的氨基酸改性的纤维素膜购自Abimed(Lagenfeld，Germany)。通过在膜上偶联β-丙氨酸间隔体而界定阵列，利用如前所述的标准DIC(二异丙基碳二亚胺)/HOBt(羟基苯并三唑)偶联化学(Molina等(1996)Peptide Research 9：151-155；Frank等(1992)Tetrahedron 48：9217-9232)合成肽。
活化的氨基酸利用Abimed ASP 222机器人布点。洗涤和脱保护步骤将人工进行，在最后的合成循环后，肽将被N-末端乙酰化。肽合成后，在甲醇中洗涤膜10分钟，并在封闭物(如，TBST(Tris-缓冲盐水，带有0.1％(v/v)Tween.TM.20)和1％(w/v)酪蛋白)中洗涤。洗涤后，伴随轻微摇动，膜与从诊断为类风湿关节炎的患者获得的血清一起培养。用封闭物洗涤3次后，用HRP-标记的第二抗体培养膜。用封闭物洗涤膜3次，每次10分钟，用TBST洗涤2次，每次10分钟。结合的抗体利用SuperSignalTM West试剂(Pierce)和数字相机(Alphananotech Fluoromager)显现。
用来自至少三位不同患者的血清进行对14-3-3肽的表位作图，以确定共同识别的表位，其中每位患者诊断为关节炎并证实具有抗14-3-3自身抗体。另外，表位作图可用另一(如果不是所有)14-3-3同种型进行，以确定共同识别的表位是对1种同种型如，14-3-3η特异的，还是与1种、2种、3种、4种、5种或6种其它14-3-3同种型共有的。
合成至少14-3-3η的共同识别的表位，用来评价表位用于评价和/或表征关节炎疾患(尤其是类风湿性关节炎)与其它关节炎亚型和/或健康对照相比的特异性。建立了用于评价和/或表征关节炎疾的特异性后，可将共同识别的表位开发为测量患者样品中14-3-3自身抗体水平的定量测定。然后该测定可用于检测和/或定量患者样品中针对14-3-3蛋白的自身抗体。
本文引用的所有参考文献和专利明确地通过引用全文整体并入本文。

Claims (22)

1.检测针对包含至少一个14-3-3η表位的至少一种14-3-3η蛋白或其片段的自身抗体、或所述自身抗体与所述14-3-3η蛋白或其片段形成的免疫复合体的存在的试剂在制备用于通过下列步骤评价受治疗者的关节炎的试剂中的用途：a)提供来自怀疑患有关节炎的受治疗者的样品；b)检测所述样品中针对至少一种14-3-3η蛋白或其片段的自身抗体、或所述自身抗体与至少一种14-3-3η蛋白或其片段形成的免疫复合体的存在，其中所述14-3-3η蛋白或其片段包含至少一个14-3-3η表位；其中所述自身抗体或免疫复合体的存在指示受治疗者的关节炎；其中所述样品选自以下组成的组：血液、滑液、血浆、血清或组织。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述步骤还包括测量所述自身抗体或免疫复合体的量，将其与正常对照样品、关节炎对照样品、或来自同一受治疗者的先前样品中所述自身抗体或免疫复合体的量比较。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述步骤包括将所述样品与包含至少一个14-3-3η表位的至少一种14-3-3η蛋白或其片段接触。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述至少一种14-3-3η表位是与至少一种其它14-3-3蛋白同种型共有的。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述其它14-3-3蛋白同种型是14-3-3γ。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述14-3-3η表位是14-3-3η特有的。
7.如权利要求1-6任一项所述的用途，其中所述14-3-3η蛋白或其片段被选自以下组成的组的标记可检测地标记：放射性标记、发光标记和酶。
8.如权利要求1-6任一项所述的用途，其中所述14-3-3η蛋白或其片段被荧光标记可检测地标记。
9.如权利要求1-6任一项所述的用途，其中所述14-3-3η蛋白或其片段结合于固体支撑物。
10.如权利要求1-6任一项所述的用途，其中所述自身抗体由ELISA测定检测。
11.如权利要求1-6任一项所述的用途，其中所述检测通过化学发光进行。
12.如权利要求2所述的用途，其中与正常对照样品相比，所述样品中针对至少一种14-3-3η蛋白或其片段的自身抗体或所述自身抗体与至少一种14-3-3η蛋白或其片段形成的免疫复合体的水平增加是所述受治疗者中关节炎的诊断性指示物。
13.如权利要求2所述的用途，其中与关节炎对照样品相比，所述样品中针对至少一种14-3-3η蛋白或其片段的自身抗体或所述自身抗体与至少一种14-3-3η蛋白或其片段形成的免疫复合体的相对水平是所述受治疗者中关节炎的预后性指示物。
14.如权利要求2所述的用途，其中与来自同一受治疗者的先前样品相比，所述样品中针对至少一种14-3-3η蛋白或其片段的自身抗体或所述自身抗体与至少一种14-3-3η蛋白或其片段形成的免疫复合体的相对水平指示治疗方案的效力。
15.一种用于检测样品中针对包含至少一个14-3-3η表位的至少一种14-3-3η蛋白或其片段的自身抗体的存在的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种14-3-3η蛋白或其片段和第二试剂，其中所述第二试剂是用于检测针对所述14-3-3η蛋白的自身抗体的标记的第二抗体。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述至少一种14-3-3η蛋白或其片段结合于固体支撑物。
17.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述至少一个14-3-3η表位是与至少一种其它14-3-3蛋白同种型共有的。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述其它14-3-3蛋白同种型是14-3-3γ。
19.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述14-3-3η表位是14-3-3η特有的。
20.检测针对包含至少一个14-3-3η表位的至少一种14-3-3η蛋白或其片段的自身抗体、或所述自身抗体与所述14-3-3η蛋白或其片段形成的免疫复合体的存在的试剂在制备用于通过下列步骤确定患者的关节炎亚型的试剂中的用途：a)提供来自怀疑患有关节炎的受治疗者的第一样品；b)检测所述样品中是否存在针对至少一种14-3-3η蛋白或其片段的自身抗体或所述自身抗体与至少一种14-3-3η蛋白或其片段形成的免疫复合体，其中所述14-3-3η蛋白或其片段包含至少一个14-3-3η表位；c)测量该自身抗体或免疫复合体的量，并将其与第二生物样品中针对14-3-3η的自身抗体或所述自身抗体与14-3-3η蛋白形成的免疫复合体的量比较，该第二生物样品来自其关节炎亚型已知和/或事先确定的第二受治疗者，其中该比较确定第一受治疗者的关节炎亚型。
21.如权利要求20所述的用途，其中第一和第二样品含有相近量的所述自身抗体或免疫复合体，表明该第一受治疗者具有与该第二受治疗者相同的关节炎亚型。
22.如权利要求20所述的用途，其中第一和第二样品含有不同量的所述自身抗体或免疫复合体，表明该第一受治疗者具有与该第二受治疗者不同的关节炎亚型。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012325604B2 (en) * 2011-10-21 2017-08-03 Augurex Life Sciences Corp. Antigens derived from citrullinated 14-3-3 and uses thereof in the diagnosis of rheumatoid arthritis
CN114354919A (zh) * 2018-01-05 2022-04-15 科美诊断技术股份有限公司 检测14-3-3 eta蛋白的均相免疫检测试剂盒及其应用
CN112424608A (zh) * 2018-05-10 2021-02-26 卫理公会医院 用于疾病的预后和管理的方法
CN110531073B (zh) * 2018-05-23 2024-03-15 科美诊断技术股份有限公司 通过生物标记物联检体外评估类风湿性关节炎是否存在的方法
CN110579597A (zh) * 2018-05-23 2019-12-17 科美诊断技术股份有限公司 检测14-3-3 eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂盒及其应用
CN110579600B (zh) * 2018-05-23 2023-12-26 科美诊断技术股份有限公司 通过生物标记物联检体外评估类风湿性关节炎是否存在的方法
CN110579601B (zh) * 2018-05-24 2023-12-26 科美诊断技术股份有限公司 通过生物标记物联检体外评估类风湿性关节炎是否存在的方法
CN110726843A (zh) * 2018-07-16 2020-01-24 科美诊断技术股份有限公司 检测14-3-3eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒及其应用

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4956281A (en) * 1987-06-03 1990-09-11 Biogen, Inc. DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing lymphocyte function associated antigen-3
US6596476B1 (en) * 1989-12-22 2003-07-22 Abbott Laboratories Hepatitis C assay
US5948765A (en) 1996-03-15 1999-09-07 Washington University Inhibition of intracellular signal transduction by 14-3-3-binding peptides
US5998149A (en) 1996-04-05 1999-12-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of detecting transmissible spongiform encephalopathies
US5814507A (en) 1996-05-24 1998-09-29 Genentech, Inc. κ/μ-like protein tyrosine phosphatase, PTP λ
WO1998026293A1 (en) 1996-12-12 1998-06-18 Neuromark Methods of detecting transmissible spongiform encephalopathies by detecting 14-3-3 protein isoforms
US20020173454A1 (en) * 2000-01-31 2002-11-21 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US7011952B2 (en) * 2000-02-22 2006-03-14 University Of Iowa Research Foundation Diagnostics and therapeutics for macular degeneration-related disorders
US7056677B2 (en) 2000-03-17 2006-06-06 Gemini Science, Inc. Soluble mast cell function associated antigen (MAFA) pharmaceutical compositions and methods of making and using them
KR100380147B1 (ko) 2001-01-18 2003-04-11 주식회사 엘지생명과학 류마티스성 자가면역 항체의 검출방법 및 검출키트
WO2002067968A2 (en) 2001-02-21 2002-09-06 Emory University 14-3-3 binding molecules as sensitizers for anticancer therapies
CA2414073A1 (en) * 2001-05-04 2002-11-14 Gunars E. Valkirs Diagnostic markers of acute coronary syndromes and methods of use thereof
DE10131912A1 (de) 2001-06-06 2002-12-19 Werner E G Mueller Verwendung von 14-3-3 Proteinen und Verfahren zu deren Bestimmung
US7171311B2 (en) 2001-06-18 2007-01-30 Rosetta Inpharmatics Llc Methods of assigning treatment to breast cancer patients
US7172905B2 (en) * 2001-08-07 2007-02-06 The University Of Chicago Polypeptide immobilization
GB0208331D0 (en) 2002-04-11 2002-05-22 Oxford Glycosciences Uk Ltd Proteins
US7101962B2 (en) 2003-05-15 2006-09-05 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies of the P2Y10 receptor useful in altering T lymphocyte function
AU2004249814A1 (en) 2003-06-25 2004-12-29 Queen's University At Kingston Methods for diagnosing, monitoring, staging and treating heart failure
CN1997749A (zh) 2003-11-21 2007-07-11 约翰·霍普金斯大学 生物分子分隔基序及其用途
TWI281473B (en) * 2003-12-19 2007-05-21 Ind Tech Res Inst Biomarkers for liver diseases and method for using same
EP1745149A4 (en) 2004-04-15 2008-08-06 Univ Florida NEURO-PROTEINS USED AS BIOMARKERS TO DETECT NERVOUS SYSTEM AND OTHER NEUROLOGICAL DISORDERS
US20070253961A1 (en) 2004-06-09 2007-11-01 Ulsan Industrial Education Foundation Pharmaceutical Composition Comprising the Anti-4-1Bb Antibody for Treating or Preventing Rheumatoid Arthritis
GB2426581A (en) * 2005-05-27 2006-11-29 Univ Nottingham Immunoassay methods
GB2428240A (en) 2005-07-14 2007-01-24 Univ Gen Ve Diagnostic method for brain damage-related disorders
AU2007247742B2 (en) * 2006-05-09 2013-06-06 The University Of British Columbia Dissolved protein arthritis markers
EP2201378A2 (en) 2007-10-03 2010-06-30 OSI Pharmaceuticals, Inc. Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
US20090093005A1 (en) 2007-10-05 2009-04-09 University Of Virginia Patent Foundation Protein-based biomarkers for abdominal aortic aneurysm
US7919262B2 (en) 2007-11-07 2011-04-05 The Uab Research Foundation 14-3-3 proteins for diagnosis of Parkinson's disease
BRPI0819063A2 (pt) * 2007-11-27 2020-08-18 The University Of British Columbia método para tratamento de artrite, anticorpo, hibridoma, antagonista de 14-3-3, usos de um antagonista de 14-3-3, composições farmacêuticas, método para redução da expressão de mmp no sinóvio de um paciente e usos de uma composição farmacêutica
WO2009097584A1 (en) 2008-01-30 2009-08-06 Proteogenix, Inc. Maternal serum biomarkers for detection of pre-eclampsia
WO2009137832A2 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 Duke University Autoantibodies in the detection and treatment of cancer
SG186953A1 (en) 2010-07-09 2013-02-28 Somalogic Inc Lung cancer biomarkers and uses thereof
AU2011312491B2 (en) 2010-09-27 2015-06-04 Somalogic, Inc. Mesothelioma biomarkers and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Detection of high level of 2 isoforms of 14-3-3 proteins in synovial fluid from patients with joint inflammation;Ruhangizt. Kilani et al;《The Journal of Rheumatology》;20071231;第34卷;1650-1657页 *
Ruhangizt. Kilani et al.Detection of high level of 2 isoforms of 14-3-3 proteins in synovial fluid from patients with joint inflammation.《The Journal of Rheumatology》.2007,第34卷1650-1657页. *

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Publication number Publication date
TR201902845T4 (tr) 2019-03-21
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EP2406633A1 (en) 2012-01-18
BRPI1009573A2 (pt) 2017-07-18
CA2754741A1 (en) 2010-09-16
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