CN102408387A

CN102408387A - 一种具有抗肿瘤作用的金属络合物

Info

Publication number: CN102408387A
Application number: CN2010102915702A
Authority: CN
Inventors: 韩南银; 朱靖华; 陈鑫
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-09-26
Filing date: 2010-09-26
Publication date: 2012-04-11

Abstract

本项发明涉及一种具有抗肿瘤作用的金属络合物及其在医药领域的应用。

Description

一种具有抗肿瘤作用的金属络合物

技术领域

本项发明涉及一种具有抗肿瘤作用的普乐沙福金属络合物及其在医药领域的应用。

背景技术

CXCR4是一个由352个氨基酸构成的视紫红质样G蛋白偶联受体。基质衍生因子CXCL12是该受体唯一的配体。已有的研究表明CXCL12/CXCR4轴具有介导免疫及炎症反应，调控造血干细胞迁移及归巢，参与胚胎发育过程；它是HIV感染的一个重要因子。近年的研究发现CXCR4在多种肿瘤组织中有高表达，在肿瘤的侵袭，转移中起了重要作用。目前已经发现CXCR4在23种不同类型肿瘤中均有表达，是肿瘤细胞表达最为普遍的趋化因子受体，并且和患者的预后相关。

普乐沙福系一新颖的小分子CXCR4趋化因子受体拮抗剂，其可抑制CXCR4趋化因子与它们的天然受体配体结合，用于治疗CXCR4受体介导的疾病，如关节炎、淋巴瘤、非小细胞肺癌、肠胃道血管形成相差的疾病、成胶质细胞瘤、纤维瘤、细星形细胞瘤或骨髓瘤；肺癌、乳腺癌或前列腺癌；炎症疾病等。目前，普乐沙福有多种适应症处于临床试验阶段。

普乐沙福(Plerixafor)，化学名为：1，1′-[1，4-亚苯基二(亚甲基)]-二-1，4，8，11-四氮杂环十四烷，其分子结构式如下：

铂剂(如顺铂，奥沙利铂)为二价铂络合物，具有抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤药有协同作用、且无交叉耐药等特点，为当前联合化疗中最常用的药物之一。

由于普乐沙福的大环胺部分可与很多的金属离子络合，我们尝试将普乐沙福与锰，铂，镍，锡，铜等金属离子络合，制成络合物后考察其对多种肿瘤细胞的抑制作用和对正常细胞的毒性。我们惊奇地发现，普乐沙福-铂络合物(如结构式I所示)和普乐沙福-锰络合物(如结构式II所示)对肿瘤细胞的抑制作用比普乐沙福强3倍以上，对人癌细胞株的抑制率高达70％。普乐沙福-铂、普乐沙福-锰与普乐沙福一样，对正常细胞的毒性很小，在体外对人正常肝细胞(HL-7702)的抑制率与普乐沙福相当，明显低于5-氟尿嘧啶。

已有多项研究表明，CXCR4/SDF-1轴在多种肿瘤转移中发挥重要作用，普乐沙福主要通过与CXCR4的第二膜外环的负电荷区域结合，阻断CXCR4与其配体SDF-1的结合，抑制CXCR4/SDF-1轴的作用，从而实现对肿瘤转移的抑制作用(Nat Rev Drug Discov.2003 Jul；2(7)：581-7)。

制成普乐沙福金属络合物后并不影响普乐沙福金属络合物与CXCR4配体的结合，Transwell迁移试验表明，普乐沙福-铂、普乐沙福-锰抑制迁移作用高于普乐沙福，可能由于负电荷区与金属离子，负电荷区与大环胺上N的氢键的强联合作用有关。

因此，普乐沙福-铂、普乐沙福-锰很有希望成为具有较强抗肿瘤作用的新型分子实体。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的显示强抗肿瘤作用的分子实体。

本发明的另一目的是提供该新型分子实体的合成、纯化方法。

采用的技术方案为：

一种如结构式III所示的普乐沙福金属络合物，

其中，M为铂、锰、铜、镍、锌、锡、镉中的一种，

或有至少一个成盐基团的此种化合物的一种药物可接受的盐。

特别地，M为正二价金属离子。

特别地，普乐沙福金属络合物为普乐沙福-铂络合物(如结构式I所示)或普乐沙福-锰络合物(如结构式II所示)。

结构式III所示的化合物具有有用的药理特性，如可用作，例如，抗肿瘤药物、抗HIV药物或抗炎药物。

正如我们可能已经希望的那样，结构式III的化合物及其药理上可接受的盐具有抗增殖特性，这种特性可直接在以下的不同试验中得到验证。在那些试验中我们测定了结构式I的化合物对人的LS174-T结肠癌、Hela229宫颈癌、SMMC-7721肝癌和A549肺癌细胞生长的抑制作用。噻唑蓝(MTT)还原法检测细胞生长抑制率，取对数生长期的上述各细胞，调整细胞浓度为2×10⁵/ml，将细胞分装于数个25ml的培养瓶中，每瓶3ml，分别加入试验化合物，使终浓度分别为10、20、30、40和50μg/ml。取96孔板数个，每孔加入上述细胞悬液100μl，每种药物的每个浓度为一组，每组设3个平行孔。每组细胞培养48h后从培养箱中取出，然后每孔加入MTT(5mg/ml)10μl，继续培养4～6h后取出，离心后吸去上清液，每孔加入DMSO 100μl，再将培养板振荡均匀5min左右，显微镜下观察着色颗粒消失后，在20min内以570nm为测试波长，630nm为参考波长，读取吸光度(A)值。根据如下公式计算细胞生长抑制率：

细胞生长抑制率＝(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100％。

对于结构式I和结构式II的化合物，在50μg/ml浓度测得的抑制率为60.30％～74.81％。

由于上述的特征，结构式III的化合物尤其可用作抑制肿瘤的活性成分。如治疗结肠癌、宫颈癌、肝癌或肺癌等。

另外，还提供了一种普乐沙福金属络合物的制备方法，其特征在于：以普乐沙福，金属盐，在溶剂中，在一定条件下充分反应，滴加醚类溶剂使析出沉淀，过滤，洗涤，干燥，得到金属离子络合物。

所述的普乐沙福与金属盐投料的摩尔比为1∶0.5～2.5，优选1∶0.9～1.1，最优选1∶1。

所述的溶剂为水、二甲基亚砜、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、正丁醇、醋酸铵水溶液中的一种或任意几种的混合物。

所述溶剂与普乐沙福的体重重量比为1∶2～50，优选1∶5～10。

所述的醚类溶剂为乙醚、异丙醚、甲基乙基醚、叔丁醚中的一种或任意几种的混合物。

另外，还提供了一种药物组合物，其特征在于，包含普乐沙福金属络合物和药用辅料。

所述的药物组合物的剂型包含片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、溶液剂、注射剂。

另外，还提供了所述的普乐沙福金属络合物，在制备治疗CXCR4介导的疾病的药物中的用途。

所述的CXCR4介导的疾病包含关节炎、淋巴瘤、非小细胞肺癌、肠胃道血管形成相差的疾病、成胶质细胞瘤、纤维瘤、细星形细胞瘤、骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、炎症疾病。

附图说明

图1普乐沙福、普乐沙福-铂、普乐沙福-锰对人正常肝细胞(HL-7702)的抑制作用

图2普乐沙福、普乐沙福-铂、普乐沙福-锰对结肠癌细胞株(LS174-T)的抑制作用

图3普乐沙福、普乐沙福-铂、普乐沙福-锰对宫颈癌细胞株(Hela229)的抑制作用

图4普乐沙福、普乐沙福-铂、普乐沙福-锰对肝癌细胞株(SMMC-7721)的抑制作用

图5普乐沙福、普乐沙福-铂、普乐沙福-锰对肺癌胞株(A549)的抑制作用

图6普乐沙福、普乐沙福-铂、普乐沙福-锰抑制转移作用比较

具体实施方式

在下面的实施实例中，以实施例的方式对本发明进行例证说明。其给出目的在于理解本发明，而非意图且不能以任何方式理解为限制所附之权利要求所给出的本发明的范围。

实施实例1：普乐沙福-铂的制备

取氯铂酸钾0.4860g(1mmol)，普乐沙福0.5028g(1mmol)，加水40ml，室温搅拌过夜，加入乙醚20ml，将得到的沉淀过滤，用乙醚洗涤3次，得到普乐沙福-铂粗品，在二甲基亚砜/甲醇(1∶1)中重结晶，得到白色固体0.4872g，收率70.12％，¹H NMR(400MHz，D₂O，δppm)：1.80-1.46(8H，m)；2.96-2.55(32H，m)；3.50(3H，s)；7.30(4H，s)。IR(KBr)3439，1673，1472，1409，1204，1131，837，799，718，598，514cm^-1。元素分析：C：48.42；H：7.42；N：16.15；Pt：28.01。

实施实例2：普乐沙福-铂的制备

取二甲基亚砜(DMSO)30mL，加入普乐沙福0.5028g(1mmol)和氯铂酸钾0.4860g(1mmol)，加热至回流4h，放冷至室温后，将得到的沉淀过滤，分别用甲醇，水，乙醇和乙醚洗涤，得到普乐沙福-铂粗品，在二甲基亚砜/甲醇(1∶1)中重结晶，得到目标产物，为白色固体。

实施实例3：普乐沙福-锰的制备

取普乐沙福0.3g(0.6mmol)，加甲醇5ml使溶解，加入二氯化锰0.075g(0.6mmol)的0.4M醋酸铵溶液(pH5.5)，立即产生红棕色沉淀。继续搅拌1小时，抽滤，将滤饼加入乙醚10ml研磨，抽滤，真空干燥，得到普乐沙福-锰0.23g，收率69.1％，¹H NMR(400MHz，D₂O，δppm)：1.80-1.45(8H，m)；2.96-2.54(32H，m)；3.52(3H，s)；7.33(4H，s)。IR(KBr)3445，1670，1478，1201，1136cm^-1。元素分析：C：60.24；H：9.25；N：20.17；Mn：10.16。

实施实例4：普乐沙福-铂注射液的制备

取普乐沙福-铂664mg，加氯化钠112mg，加注射用水12ml溶解后，用1M盐酸或氢氧化钠调节pH至6.8，用0.22μm滤膜过滤，加注射用水至24ml，分装成1.45ml/支，121℃灭菌20分钟，即得。

实施实例5：体外对不同肿瘤细胞的抗肿瘤作用

细胞培养：将4种人癌细胞株：人结肠癌细胞株(LS174-T)、宫颈癌细胞株(Hela229)、肝癌细胞株(SMMC-7721)、肺癌细胞株(A549)和人正常肝细胞(HL-7702)，接种于含10％灭活小牛血清的RPMI1640培养液中，在37℃、5％CO2、饱和湿度下培养，每2～3d换液1次，取对数生长期的细胞进行实验。

试验方法：噻唑蓝(MTT)还原法检测细胞生长抑制率，取对数生长期的上述各细胞，调整细胞浓度为2×10⁵/ml，将细胞分装于数个25ml的培养瓶中，每瓶3ml，分别加入普乐沙福，普乐沙福-锰，普乐沙福-铂，使终浓度分别为10、20、30、40和50μg/ml。取96孔板数个，每孔加入上述细胞悬液100μl，每种药物的每个浓度为一组，每组设3个平行孔。每组细胞培养48h后从培养箱中取出，然后每孔加入MTT(5mg/ml)10μl，继续培养4～6h后取出，离心后吸去上清液，每孔加入DMSO 100μl，再将培养板振荡均匀5min左右，显微镜下观察着色颗粒消失后，在20min内以570nm为测试波长，630nm为参考波长，读取吸光度(A)值。根据如下公式计算细胞生长抑制率：

细胞生长抑制率＝(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100％。

表1对人正常肝细胞(HL-7702)的抑制作用

^*P＜0.01Vs.5-氟尿嘧啶组

结果表明，普乐沙福-铂和普乐沙福-锰对人正常肝细胞(HL-7702)的抑制率在10～50μg/ml范围内呈剂量相关性增加，但其抑制作用明显低于5-氟尿嘧啶，与普乐沙福相当(见附图1)。

表2对结肠癌细胞株(Hela229)的抑制作用

^*P＜0.01Vs.对照组

结果表明，普乐沙福-铂和普乐沙福-锰对结肠癌细胞株(Heal229)的抑制率在10～50μg/ml范围内呈剂量相关性增加，其同等浓度下抑制作用分别为普乐沙福的2.05和1.88倍，抑制作用强于5-氟尿嘧啶(见附图2)。

表3对宫颈癌细胞株(LS174-T)的抑制作用

^*P＜0.01Vs.对照组

结果表明，普乐沙福-铂和普乐沙福-锰对宫颈癌细胞株(LS174-T)的抑制率在10～50μg/ml范围内呈剂量相关性增加，其同等浓度下抑制作用分别为普乐沙福的1.63和1.46倍，抑制作用稍强于5-氟尿嘧啶(见附图3)。

表4对肝癌细胞株(SMMC-7721)的抑制作用

^*P＜0.01Vs.对照组

结果表明，普乐沙福-铂和普乐沙福-锰对肝癌细胞株(SMMC-7721)的抑制率在10～50μg/ml范围内呈剂量相关性增加，其同等浓度下抑制作用分别为普乐沙福的1.97和1.73倍，抑制作用强于5-氟尿嘧啶(见附图4)。

表5对肺癌细胞株(A549)的抑制作用

^*P＜0.01Vs.对照组

结果表明，普乐沙福-铂和普乐沙福-锰对肺癌细胞株(A549)的抑制率在10～50μg/ml范围内呈剂量相关性增加，其同等浓度下抑制作用分别为普乐沙福的3.04和2.71倍，抑制作用强于5-氟尿嘧啶(见附图5)。

实施实例6：Transwell迁移试验

试验方法：在Costar 24-室tarnswell(Corning，NY)的下室中，加入含有SDF-1(PeproTech，NJ)浓度为100ng/ml的迁移介质(RPMI，补充有1％胎牛血清)600μl。在上室中加入含10⁵Jurkat细胞的100μl迁移介质(孔径5μm)和不同浓度的普乐沙福、普乐沙福-铂、普乐沙福-锰，在37℃迁移3h后，收集下室中的细胞，通过流式细胞仪计数。对照组在下室中不加入趋化因子。

表6抑制转移作用比较

浓度(nM)	普乐沙福	普乐沙福-铂	普乐沙福-锰
				5	9.87％	13.24％	12.76％
25	45.21％	36.65％	39.21％
				100	68.32％	86.38％^*	83.37％^*
500	84.10％	91.22％^*	90.28％^*
				1000	88.29％	93.24％^*	93.12％^*

^*P＜0.01Vs.普乐沙福组

结果表明，普乐沙福-铂、普乐沙福-锰抑制转移作用比普乐沙福稍强(见附图6)。

实施实例7：体内抗肿瘤作用

试验方法：将80只Balb/c裸鼠右腋皮下接种0.2mL 1×10⁶/mL SGC-7901胃癌细胞后，10d后取移植瘤直径基本一致的裸鼠随机分5组：溶媒对照组、顺铂组(2.5mg/kg)、普乐沙福-铂组(2.5mg/kg)，普乐沙福-锰组(2.5mg/kg)，普乐沙福组(2.5mg/kg)，每组16只。连续5d在接种肿瘤细胞部位处给予相应注射治疗，每次0.2mL。14d后每组随机取8只裸鼠颈椎脱臼处死剥离肿瘤块并称质量，计算抑瘤率：抑瘤率＝(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100％。各组剩余8只动物观察生存期。

表7体内抗肿瘤作用

分组	肿瘤湿质量(g)	抑瘤率	生存期(天)
				溶媒对照组	2.37±0.29	0	35±3.3
顺铂组	1.25±0.26^*	47.26％^*	55±1.7^*
				普乐沙福-铂组	0.96±0.14^*	59.49％^*	65±2.2^*
普乐沙福-锰组	0.94±0.17^*	60.34％^*	67±2.3^*
				普乐沙福组	1.60±0.32^*	32.49％^*	43±1.9^*

^*P＜0.01Vs.溶媒对照组

结果表明，普乐沙福-铂、普乐沙福-锰体内抗肿瘤作用强于顺铂，明显强于普乐沙福。

实施实例8：抗荷瘤小鼠lewis肺癌转移作用

试验方法：选用C57BL小鼠，右侧腋窝皮下接种lewis肺癌细胞6.5×10⁶个/mL，将成模小鼠随机分为5组：溶媒对照组、普乐沙福-铂组(2.5mg/kg)，普乐沙福-锰组(2.5mg/kg)，普乐沙福组(2.5mg/kg)、热休克组，每组20只，由接种瘤株后第2d开始在接种肿瘤细胞部位处给予相应注射治疗，每次0.2mL。热休克组小鼠用电热恒温烤箱43℃热处理3次，每次20min。连续给药12d后，将小鼠颈椎脱臼处死，取小鼠肺脏，外观检查和病理组织学检查，计算肺转移率：肺转移率＝发生转移的动物数/所有动物数。

表8抗荷瘤小鼠lewis肺癌转移作用

分组	动物数(n)	剂量(mg/kg)	肺转移率
				溶媒对照组	20	-	100％
普乐沙福-铂组	20	2mg/kg	5％^*
				普乐沙福-锰组	20	2mg/kg	5％^*
普乐沙福组	20	2mg/kg	15％
				热休克组	20	-	20％

^*P＜0.01Vs.热休克组

结果表明，普乐沙福-铂、普乐沙福-锰抗荷瘤小鼠lewis肺癌转移作用显著优于热休克组，亦优于普乐沙福组。

Claims

1.一种式I的普乐沙福金属络合物，或有至少一个成盐基团的此种化合物的一种药物可接受的盐，

其中M为铂、锰、镍、锌、锡、镉中的一种。

2.如权利要求1所述的普乐沙福金属络合物，或有至少一个成盐基团的此种化合物的一种药物可接受的盐，其特征在于，为普乐沙福-铂络合物或普乐沙福-锰络合物或者其药学上可接受的盐。

3.权利要求1所述的普乐沙福金属络合物，或有至少一个成盐基团的此种化合物的一种药物可接受的盐，其特征在于，M均为正二价金属离子。

4.权利要求1所述的普乐沙福金属络合物的制备方法，其特征在于：以普乐沙福，金属盐，在溶剂中，在一定条件下充分反应，滴加醚类溶剂使析出沉淀，过滤，洗涤，干燥，得到金属离子络合物。

5.如权利要求4所述的普乐沙福金属络合物的制备方法，其特征在于，所述的普乐沙福与金属盐投料的摩尔比为1∶0.5～2.5。

6.如权利要求4所述的普乐沙福金属络合物的制备方法，其特征在于，所述溶剂为水、二甲基亚砜、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、正丁醇、醋酸铵水溶液中的一种或任意几种的混合物。

7.如权利要求4所述的普乐沙福金属络合物的制备方法，其特征在于，所述的醚类溶剂为乙醚、异丙醚、甲基乙基醚、叔丁醚中的一种或任意几种的混合物。

8.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的普乐沙福金属络合物或其药学上可接受的盐和药用辅料。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，剂型包含片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、溶液剂、注射剂。

10.权利要求1所述的普乐沙福金属络合物，在制备治疗CXCR4介导的疾病的药物中的用途。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的CXCR4介导的疾病包含关节炎、淋巴瘤、非小细胞肺癌、肠胃道血管形成相差的疾病、成胶质细胞瘤、纤维瘤、细星形细胞瘤、骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、炎症疾病。