CN102399874A - 一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法 - Google Patents

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王国民
肖进文
聂福平
杨俊�
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Abstract

本发明共公开了一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法，该方法包括了靶基因引物、通用放大引物和嵌套引物的设计，设计好通用放大引物后，将通用放大引物的上游分别添加到每条靶基因的上游引物5′端，将通用放大引物的下游分别添加到每条靶基因的下游引物5′端，即可得到嵌套引物。本发明克服了常规基因检测方法难以在一个反应中同步完成5个以上基因靶标的检测。本发明可以引用于转基因检测、病原微生物的检测筛查、多基因表达分析等相关领域。

Description

一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法
技术领域
本发明属于分子生物学方法进行基因检测的领域，具体涉及一种以高通量对10个及以上的基因进行高通量并行检测的WideSpace扩增方法。
背景技术
常规的基因检测技术一般是通过PCR的方法进行基因的扩增和检测，通量较低，靶基因的数量一般不超过5种。对于多个基因需要同时进行检测是无法实现的，因而一种高通量扩增方法是很必要的。本发明方法主要是基于在靶基因特异性引物的两端加上一对通用放大引物，在靶基因引物特异性扩增的基础上，利用放大引物进行信号的统一放大，从而实现多个靶基因的高通量并行检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种高通量多靶基因并行检测技术和方法。
为了实现上述目的本发明采用如下技术方案实现的：一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法包括如下步骤：
（1）设定靶基因和靶基因的数量n；
（2）靶基因引物、通用放大引物、嵌套引物的设计：a）按照引物设计的一般原理进行靶基因引物的设计；b）将所有靶基因引物按照上游和下游顺次整合为一长链DNA；c）利用FastPCR或同类软件随机生成一段随机DNA片段，针对这段随机DNA片段进行引物设计，得到通用放大引物；将通用放大引物与步骤b）中的长链DNA进行二聚体分析，若二聚体均满足自由能的绝对值在7以内，否则返回步骤c）重新设计，同时将通用放大引物和靶基因进行NCBI Primer Blast在线分析，若通用放大引物和靶基因无非特异扩增，则完成通用放大引物的设计，否则返回步骤c）重新设计；d）将通用放大引物的上游分别添加到每条靶基因引物的上游5′端，将通用放大引物的下游分别添加到每条靶基因引物的下游5′端，即得到n对嵌套引物；
（3）检测体系和反应条件：同时在一个检测体系中添加所有的嵌套引物和通用放大引物，引物间的比例为：嵌套引物1上游：嵌套引物1下游：嵌套引物2上游：嵌套引物2下游：嵌套引物3上游：嵌套引物3下游…：嵌套引物n上游：嵌套引物n下游：通用放大引物上游：通用放大引物下游等于1:1:1:1:1:1…:1:1:4:4；
检测反应：20~25uL检测反应液含有1x 反应缓冲液, 2.0~5.0mmol/L MgCl2, 200~400μmol/L dNTP, 1.5~3U 耐热DNA 聚合酶,各种嵌套引物上游和嵌套引物下游浓度均为0.1~0.5μmol/L，通用放大引物上游和通用放大引物下游的浓度均为0.4~2μmol/L，1.5~5% DMSO，0.1~0.5 mol/L甜菜碱, 50~200 ng cDNA;
反应条件为：预变性95℃，5 min；5~10个循环的预扩增：94℃，30 s；45℃～55℃, 35s; 72℃, 60 s ~120s; 35~40个循环：94℃，40s，55℃~62℃,40s，65℃~72℃，2 min ~5 min；补充延伸：72℃，10 min；
(4)产物的检测：根据步骤（1）中靶基因的长度跨度，选择电泳系统进行检测。 
本发明的优点是：克服了常规基因检测方法难以在一个反应中同步完成5个以上基因靶标的检测。本发明可以引用于转基因检测、病原微生物的检测筛查、多基因表达分析等相关领域。
附图说明
图1为WideSpace高通量扩增方法示意图；
图2为通用放大引物上下游和长链DNA序列图；
图3为通用引物和长链DNA之间互补关系图；
图4为通用放大引物上游的退火温度（TM）和二聚体分析图；
图5为通用放大引物下游的退火温度（TM）和二聚体分析图；
图6为通用放大引物NCBI Primer Blast在线分析；
图7为靶基因NCBI Primer Blast在线分析；
图1中：Target RNA-靶基因的RNA；cDNA-由RNA反转录合成的单链DNA片段；Target seq-靶基因序列引物区；Ect seq-其他序列；Wsp tag-WsP引物序列；IPC-反应的内部参照。
具体实施方式
实施例1，一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法包括如下步骤：
（1）设定靶基因和靶基因的数量n。根据靶基因的数量n和电泳系统的分辨率，合理分配终产物的片段大小的长度跨度：对于电泳系统分辨率在10 bp～20 bp之间的，各个靶基因的产物片段长度跨度在15 bp～25 bp之间；对于电泳系统分辨率在50 bp～100 bp之间的，各个靶基因的产物片段长度跨度在60 bp～110 bp之间。
（2）靶基因引物、通用放大引物、嵌套引物的设计：a）按照引物设计的一般原理进行靶基因引物的设计；为了保证后续检测的成功，要求所有上下游引物的GC%含量在55%～60%之间，TM值不小于58℃。b）将所有靶基因引物按照上游和下游顺次整合为一长链DNA；c）利用Fast PCR或同类软件随机生成一段随机DNA片段，针对这段随机DNA片段进行引物设计，得到通用放大引物，要求上下游引物的GC%含量在55%～60%之间，TM值不小于58℃；将通用放大引物与步骤b）中的长链DNA进行二聚体分析，若二聚体均满足自由能的绝对值在7以内，否则返回步骤c）重新设计，同时将通用放大引物和靶基因引物进行NCBI Primer Blast在线分析，若通用放大引物和靶基因引物均无非特异扩增，则完成通用放大引物的设计，否则返回步骤c）重新设计；d）将通用放大引物的上游分别添加到每条靶基因引物的上游5′端，将通用放大引物的下游分别添加到每条靶基因引物的下游5′端，即得到n对嵌套引物。所有的引物均按照PAGE（及以上）的纯度进行化学合成。
（3）检测体系和反应条件：同时在一个检测体系中添加所有的嵌套引物和通用放大引物，引物间的比例为：嵌套引物1上游：嵌套引物1下游：嵌套引物2上游：嵌套引物2下游：嵌套引物3上游：嵌套引物3下游：…：嵌套引物n上游：嵌套引物n下游：通用放大引物上游：通用放大引物下游等于1:1:1:1:1:1…:1:1:4:4。
检测体系中的反应液为：20~25uL检测反应液含有1x 反应缓冲液（500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl, 1% Triton X-100）, 2.0~5.0 mmol/L MgCl2, 200~400μmol/L dNTP(含A、G、C、T), 3U 耐热DNA 聚合酶,各种嵌套引物上游和嵌套引物下游浓度均为0.1~0.5μmol/L，通用放大引物上游和通用放大引物下游的浓度均为0.4~2 μmol/L，5% DMSO，0.5 mol/l 甜菜碱, 50~200 ng cDNA。其中各物质的摩尔浓度为溶液的终浓度。
反应条件为：预变性95℃，5 min；5~10个循环的预扩增：94℃，30 s；45℃～55℃, 35s; 72℃, 60 s ~120s; 35~40个循环：94℃，40s，55℃~62℃,40s，65℃~72℃，2 min ~5 min；补充延伸：72℃，10 min。
 (4)产物的检测：根据步骤（1）中靶基因的长度跨度，选择配套的电泳系统进行检测。对于片段差距在5bp～10bp之间的产物，需要使用Agilent 2100 （或类似）的毛细管电泳系统进行分离和检测。
实施例2，若检测对象为RNA，需要在实施例1步骤（3）之前，提前进行一个单独的反转录反应。20~25 uL的反转录反应液含：1x 反转录缓冲液(50 mmol/L Tris-Hcl, 75mmol/L KCl, 1.5~5.0mmol/L MgCl2, 10mmol/L DTT, pH8.3(25℃))，0.5mmol/L dNTP（含A、G、C、T）, 20U RNA酶抑制剂，1~2 U 逆转录酶, 0.1~0.5 umol/L下游嵌套引物，100～500 ng 样品RNA，按参数40～55℃，15～60 min, 85℃, 5 min进行反应。反应完毕后，进行实施例1步骤（3）的检测反应。其中各物质的摩尔浓度为溶液的终浓度。
实施例3，（1）假定的检测对象为：Gene1,Gene2,Gene3,Gene4,Gene5,一共五个基因。
（2）按引物设计普通规则设计引物的GC%含量在55%～60%之间，TM值不小于58℃，获得靶基因特异性引物如下：
Gene1     
上游：5’-TCACCTGTATCTTGAATTATG-3’
下游：5’-GTACAACTATAGCAGAATCTT-3’；
Gene2
上游：5’-TAGACGCAGGTTGAAGAT-3’
下游：5’-GAGTGAGGATAGCATACGA-3’；
Gene3
上游：5’-CCACCTGCAGCCGATAACACCTC-3’  
下游：5’-GGTGGAATTGGCTCTTCCTGCGTTT-3’；
Gene4
上游：5’-CAGTGGAGTGGAAGGAGAA-3’     
下游：5’-ATTACCGTGCCTGTTGGA-3’；
Gene5
上游：5’-CGTACGTGCCGGCGACCATT-3’     
下游：5’-GCTTGGGCGACCACGGGAAT-3’。
内参基因IPC的设计同上述基因。
（3）嵌套引物设计过程：
（a）首尾连接所有基因特异性引物（Gene1-Gene2-Gene3-Gene4-Gene5）上游-（Gene1-Gene2-Gene3-Gene4-Gene5）下游相连为1条长链DNA片段：
5’-TCACCTGTATCTTGAATTATGTAGACGCAGGTTGAAGATCCACCTGCAGCCGATAACACCTCCAGTGGAGTGGAAGGAGAACGTACGTGCCGGCGACCATTGTACAACTATAGCAGAATCTTGAGTGAGGATAGCATACGAGGTGGAATTGGCTCTTCCTGCGTTTATTACCGTGCCTGTTGGAGCTTGGGCGACCACGGGAAT-3’
(b) 根据FastPCR产生随机序列，手工获得一对上下游引物，引物符合一般原则外，还应满足：GC%含量在55%～60%之间，TM值不小于58℃。引物初定后，根据后续的分析实时调整。
通用放大引物：
上游5’-TCGTGTAGAGACTTACCCGCAT -3’
下游5’-ACACCAGACAGTCAACAGATCCT-3’。
（c）FastPCR分析通用放大引物上下游和以上长链DNA的交叉结合特性，参见图2。
（d）要求通用引物和长链DNA之间无明显的结合（互补），参见图3。.
（e）通用引物的退火温度（TM）、二聚体结构分析，满足设计要求参见图4、图5。
（f）NCBI 在线BLAST分析引物的特异性，参见图6、图7。
（g）通用放大引物添加到基因特异性引物5’端，形成嵌套引物，序列如下：
Gene1
上游：5’- TCGTGTAGAGACTTACCCGCATTCACCTGTATCTTGAATTATG-3’
下游：5’- ACACCAGACAGTCAACAGATCCTGTACAACTATAGCAGAATCTT-3’；
Gene2
上游: 5’- TCGTGTAGAGACTTACCCGCATTAGACGCAGGTTGAAGAT-3’
下游：5’- ACACCAGACAGTCAACAGATCCTGAGTGAGGATAGCATACGA-3’；
Gene3
上游：5’- TCGTGTAGAGACTTACCCGCATCCACCTGCAGCCGATAACACCTC-3’     
下游：5’- ACACCAGACAGTCAACAGATCCTGGTGGAATTGGCTCTTCCTGCGTTT-3’；
Gene4
上游：5’- TCGTGTAGAGACTTACCCGCATCAGTGGAGTGGAAGGAGAA-3’    
下游：5’- ACACCAGACAGTCAACAGATCCTATTACCGTGCCTGTTGGA-3’；
Gene5
上游：5’- TCGTGTAGAGACTTACCCGCATCGTACGTGCCGGCGACCATT-3’    
下游：5’- ACACCAGACAGTCAACAGATCCTGCTTGGGCGACCACGGGAAT-3’。
(h) 按照PAGE级别合成，使用时用RNAse酶Free水溶解，工作液浓度10 umol/L。
（4）检测反应
按照下表配制反应体系：
表1 反应体系(25uL)
试剂名称 使用量(ul)
10×反应缓冲液（500 mmol/LKCl，100 mmol/LTris-HCl(pH9.0 25℃), 1% Triton X-100） 2.5
10 mmol/LdNTP(10mmol/l) 0.5
25 mmol/L  MgCl2 3.3
耐热DNA聚合酶(5U/μL) 0.6
A引物(10μmol/L) 上游/下游 各0.5
B引物(10μmol/L) 上游/下游 各0.5
C引物(10μmol/L) 上游/下游 各0.5
D引物(10μmol/L) 上游/下游 各0.5
E引物(10μmol/L) 上游/下游 各0.5
DMSO（99%） 1.25
甜菜碱（5mol/L） 2.5
通用放大引物（10μmol/L）上游/下游 各2.0
灭菌超纯水 3.35
DNA模板 2
反应条件：预变性95℃ 5 min；7个循环的预扩增：94℃，30 s；48℃, 35 s; 72℃ 60 s; 35个循环：94℃，40 s，58℃,40 s，70℃，2 min；补充延伸：72℃，10 min。
（5）结果分析，取产物1～10μL进行毛细管电泳或琼脂糖电泳，根据基因的片段长度进行结果的确认。
（6）废弃物处理，依照当地或国家的传染性与潜在传染性废弃物处理规范来处理使用或未经使用过的试剂以及污染的废弃物。

Claims (5)

1.一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）设定靶基因和靶基因的数量n；
（2）靶基因引物、通用放大引物、嵌套引物的设计：a）按照引物设计的一般原理进行靶基因引物的设计；b）将所有靶基因引物按照上游和下游顺次整合为一长链DNA；c）利用FastPCR或同类软件随机生成一段随机DNA片段，针对这段随机DNA片段进行引物设计，得到通用放大引物；将通用放大引物与步骤b）中的长链DNA进行二聚体分析，若二聚体均满足自由能的绝对值在7以内，否则返回步骤c）重新设计，同时将通用放大引物和靶基因进行NCBI Primer Blast在线分析，若通用放大引物和靶基因无非特异扩增，则完成通用放大引物的设计，否则返回步骤c）重新设计；d）将通用放大引物的上游分别添加到每条靶基因引物的上游5′端，将通用放大引物的下游分别添加到每条靶基因引物的下游5′端，即得到n对嵌套引物；
（3）检测体系和反应条件：同时在一个检测体系中添加所有的嵌套引物和通用放大引物，引物间的比例为：嵌套引物1上游：嵌套引物1下游：嵌套引物2上游：嵌套引物2下游：嵌套引物3上游：嵌套引物3下游…：嵌套引物n上游：嵌套引物n下游：通用放大引物上游：通用放大引物下游等于1:1:1:1:1:1…:1:1:4:4；
检测反应：20~25uL检测反应液含有1x 反应缓冲液, 2.0~5.0mmol/L MgCl2, 200~400μmol/LdNTP, 1.5~3U 耐热DNA 聚合酶,各种嵌套引物上游和嵌套引物下游浓度均为0.1~0.5μmol/L，通用放大引物上游和通用放大引物下游的浓度均为0.4~2μmol/L，1.5~5% DMSO，0.1~0.5 mol/L甜菜碱, 50~200 ng cDNA;
反应条件为：预变性95℃，5 min；5~10个循环的预扩增：94℃，30 s；45℃～55℃, 35s; 72℃, 60 s ~120s; 35~40个循环：94℃，40s，55℃~62℃,40s，65℃~72℃，2 min ~5 min；补充延伸：72℃，10 min；
(4)产物的检测：根据步骤（1）中靶基因的长度跨度，选择电泳系统进行检测。
2.根据权利要求1所述一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法，其特征在于：所述1x 反应缓冲液包含500 mmol/LKCl，100 mmol/LTris-HCl和1% Triton X-100。
3.根据权利要求1所述一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法，其特征在于：当靶基因为RNA时，需要在步骤（3）之前进行反转录。
4.根据权利要求3所述一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法，其特征在于：20~25 uL的所述反转录的反应液含1x 反转录缓冲液，0.5mmol/L dNTP, 20U RNA酶抑制剂，1~2 U 逆转录酶, 0.1~0.5 umol/L下游嵌套引物，100～500 ng 样品RNA，
反应条件： 40～55℃，15～60 min, 85℃, 5 min进行反应；反应完毕后，按权利要求1所述步骤（3）和（4）进行反应、检测。
5.根据权利要求4所述一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法，其特征在于：所述1x 反转录缓冲液包含50 mmol/L Tris-Hcl, 75mmol/L KCl, 1.5~5.0mmol/L MgCl2, 10mmol/L DTT。
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