CN102395686B - 扩增富含gc的dna模板的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于提高DNA聚合酶在富含GC的模板上的持续合成能力的方法。该方法涉及提供增强剂和有偏比率的dNTP，并且可以在DNA扩增反应中使用。该方法可用于检测与富含GC的重复有关的基因型，包括脆性X综合征。

Description

扩增富含GC的DNA模板的方法
本发明在DNA合成的领域中，具体地涉及牵涉富含GC的模板和产物的合成。
从第一次分离DNA聚合酶并确定可以在体外合成DNA的条件起，DNA合成反应已经广泛用于生物技术、医学、和研究应用中的制备和分析目的。聚合酶链式反应或PCR是一类可以快速且指数性扩增DNA序列的DNA合成反应。与其它循环的合成反应一样，它牵涉以循环方式重复复制目标序列。PCR的典型的执行牵涉提供与期望的序列的末端互补的引物、合适的缓冲液、镁盐、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、和嗜热性DNA聚合酶。将在例如基因组DNA样品内含有的模板或目标DNA暴露于水溶液中的这些组分。经由不同温度的步骤来使混合物循环，所述温度促进模板的变性、引物与模板的退火、然后通过聚合酶延伸引物，产生更多的产物。因为每轮循环的产物可用作后续反应中的模板，产物的量大致以指数增加，直至耗尽其它反应组分(最初过量存在)。参见例如美国专利4,683,202；M.J.McPherson和S.G.Moller，PCR：The Basics(第2版，Taylor和Francis)(2006)。
PCR及循环核酸合成反应的其它形式是在分子生物学、生物技术中以及日益在医学中的一项标准工具。PCR及相关技术的关键优点是快速、低成本、灵敏性、对高通量分析的适应性、和通用性。扩增仅需要几小时或更少，小的个别反应可能花费价值完全不到1美元的试剂，所需要的模板量通常在毫微克范围中，自动化可以导致每台自动仪器每天运行数千次反应，并且引物可以设计为扩增几乎任何序列。
对分析和制备应用两者广泛采用PCR及相关技术。PCR的典型制备应用是扩增序列，使得它可以在异源载体中克隆。此应用的特殊化变型是诱变PCR，其中有意降低反应的保真性以生成含有突变的目标序列的拷贝。然后，可以在下游研究或实验中使用克隆的突变体拷贝。诱变PCR可以通过使用有偏向的dNTP集合来实现，其中dATP、dCTP、dGTP、和dTTP不以等摩尔比率存在。这可以提高PCR循环的延伸步骤期间掺入错配的频率，产生突变体产物。参见例如PCR Methods增刊2：28-33(1992)；Anal Biochem 224：347-353(1995)。
虽然已经在上文所描述的有意地易错PCR中使用不平衡的dNTP集合，但是此类不平衡的诱变效果在其它应用中得不到赞同。诱变一般在分析应用中以及在突变体产物不是目标的制备应用中是不利的。实际上，突变体产物一般不合需要已经激发通过修饰聚合酶或其它反应组分来表征和提高反应诸如PCR的保真性的努力。参见例如Nucleic Acids Research，24：3546-3551(1996)；美国专利7,030,220；美国专利6,881,559。此外，预期与不平衡的dNTP集合有关的错误率增加会限制反应产率，这是因为错配降低DNA聚合酶的持续合成能力(processivity)和掺入率两者。
PCR的显著的分析应用是在诊断疾病或确定涉及具有大小多态性的遗传基因座的基因型。
展现出医学相关大小多态性的基因座的例子是X染色体上的人FMR1基因的5’非翻译区(UTR)。正常的个体在此区域中通常具有5-44个CGG重复。相反，含有200至2000或更多个CGG重复的此基因座的等位基因指示脆性X综合征(Fragile X syndrome，FXS)。此类等位基因称为全突变等位基因。这些等位基因是遗传不稳定的。患有FXS的个体可以具有诸如共济失调、卵巢功能早衰、学习无能、和其它认知/行为状况(包括孤独症样症状)等综合征的多种组合。
PCR通用性的一个不幸例外是，难以长期扩增高度富含GC的序列，包括FMR1 5’UTR的全突变等位基因。优化FMR1 PCR的尝试已经包括对常规的PCR测定条件的修饰。参见Genome Res.1996年7月；6(7)：633-8；Nucleic AcidsRes.1997年10月1日；25(19)：3957-8；J.Mol.Diagn.2006年11月1日8：544-550；Am J Med Genet.1994年7月15日；51(4)：527-34。然而，FMR1 PCR测定法开发超过15年后，近至2008年(Genet Med.2008年10月；10(10)：714-9)，一项检测新生儿中的脆性X的发表的试验性筛选研究报告了，“测定女性中的FMR1重复数目的内部确认方法中使用的定量聚合酶链式反应(PCR)分析的两种方法...不能产生可靠的且可再现的结果，”以及此外“来自第一或二级分离物的第二次[PCR]失败高度提示了异常的FMR1 CGG重复大小”(添加的重点)。如此，本领域技术人员仍将全突变脆性X等位基因的可再现PCR扩增视为未解决的问题。
据报道，用PCR能精确评估的三联体重复的长度最多为约100个CGG重复，远低于全突变等位基因(Full Mutation alleles)的大小。此外，自约100个重复开始，对任何条带的检测变得越来越模糊。J Mol Diagn 7：605-12 2005)。此项困难，与FXS综合征的异质性质一起，导致应用诸如Southern印迹等方法来检测全突变等位基因。同前。Southern印迹比PCR更费时且昂贵，而且很不适应于高通量执行。
本发明部分基于令人惊讶的发现，即提供有偏向的dNTP集合，导致在DNA聚合酶对富含GC之模板的持续合成能力方面，比本领域已知方法有显著改善。
在一些实施方案中，本申请提供了提高一种或多种DNA聚合酶在至少一种富含GC的DNA模板上的持续合成能力的方法，该方法包括在包含GC/AT比率大于1的dNTP的水溶液中进行DNA扩增反应。
在其它实施方案中，本申请提供了包括通过在水溶液中进行PCR，来扩增富含GC的模板的方法，所述水溶液包含：(a)GC/AT比率2-10且总浓度0.7-0.9mM的dNTP；(b)至少一种增强剂，选自甜菜碱、DMSO、和TWEEN-20；和(c)总浓度1.5-2mM的镁；其中至少一种富含GC的模板包含FMR1的5’UTR的CGG重复。
而在其它实施方案中，本申请提供了检测与富含GC型三核苷酸重复病症诸如脆性X综合征、脆性X相关震颤共济失调综合征(Fragile X-associatedtremor ataxia syndrome)、和/或脆性X相关原发性卵巢功能不全(FragileX-associated primary ovarian insufficiency)有关的基因型的方法，包括对至少一种与富含GC的DNA模板进行DNA扩增反应，其中通过提供包含GC/AT比率大于1的dNTP的水溶液来提高一种或多种DNA聚合酶的持续合成能力。
附图简述
图1是经SYBR-金染色的凝胶的照片。第4道和第29道是大小标志物，所选条带的大小在第29道的右侧标示。所有PCR反应使用含有多个等位基因的多个模板的混合物，它们在FMR1 5’UTR中有20、28-29、118、198、和约330个CGG重复。第1道-第3道和第5道-第28道显示了用多个水平的GC/AT比率、甜菜碱浓度、和总dNTP浓度进行的反应的产物。
图2是经SYBR-金染色的凝胶的照片。第1道和第20道是大小标志物，所选条带的大小在第1道的左侧标示。第2道含有使用GC/AT比率1∶1的dNTP进行PCR反应的产物。第3道-第18道显示了用逐渐偏向于增加G和C的GC/AT比率的dNTP进行PCR反应的产物。第19道含有使用GC/AT比率1∶1的dNTP进行无模板对照PCR反应的产物。
发明详述
本发明涉及在水溶液中合成DNA的方法，其中模板具有高水平的GC丰度，并且dNTP以大于1的GC/AT比率提供。更具体地，本发明涉及通过改变反应中的dNTP的GC/AT比率来改善聚合酶持续合成能力。本发明的方法特别与合成反应诸如PCR有关，所述合成反应可以在牵涉可以是高度富含GC的基因座，诸如接近脆性X综合征相关FMR1基因的基因座的诊断应用中使用。
“增强剂”指改善DNA聚合酶和/或DNA合成反应的一个或多个方面的性能，诸如持续合成能力的化学品或组合物。
“GC/AT比率”意为给定溶液或混合物中的dCTP、dGTP、及其所有核苷酸类似物的总和的浓度与dATP、dTTP、dUTP、及其所有核苷酸类似物的总和的浓度的比率。
“dNTP”代表三磷酸脱氧核苷酸，并且指dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、及其类似物。
“核苷酸类似物”指包含与天然碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、或尿嘧啶(U)不同的碱基模块、与脱氧核糖相同或相似的糖模块、和至少一个磷酸根或多个磷酸根(例如，二磷酸根或三磷酸根)模板的分子或离子。核苷酸类似物是特定核苷酸，具体地dATP、dCTP、dGTP、dTTP、或dUTP的类似物，此时它包含三磷酸根和糖模块(这两者的结构和构型适合于通过聚合酶掺入核酸双螺旋中)和碱基，其在核酸双螺旋和通过DNA聚合酶在核酸双螺旋中掺入的基因座中的碱基配对特性与5种先前所列的核苷酸之一最相似，只是dTTP的类似物一般也会是dUTP的类似物，并且反之亦然。
与包括但不限于“核苷”、“碱基”、“核碱基”、或“残基”等术语结合使用的术语“类似物”应当以与其结合“核苷酸”使用时相同的方式解释。
“PCR”是一种DNA合成反应，其中反应混合物进行至少两轮完整的反应循环，每轮反应循环包括变性期和至少一个退火和/或延伸期，结果是如果至少在初始循环中成功合成核酸模板的拷贝，并且至少在后来的循环中合成拷贝的拷贝，那么一般导致模板的几何级扩增。
“DNA”指脱氧核糖核酸，即一般由磷酸二酯键连接的主要为脱氧核糖核苷酸残基的生物聚合链。
“甜菜碱”指N，N，N-三甲基甘氨酸。
“甜菜碱类似物”指具有不携带氢原子的带正电荷的阳离子官能团，例如铵离子或磷离子，及具有可以不接近阳离子位置的带负电荷的官能团诸如羧酸根基团的任何中性化学化合物。本发明可以涉及具有小于或等于600Da；小于或等于300Da；75和600Da之间；或75和300Da之间的分子量的甜菜碱类似物的使用。另外/或者，本发明可以涉及包含铵模块和/或羧酸根模块的甜菜碱类似物的使用。
“Tm”是给定溶液中的50％(按质量计)的给定DNA样品或引物-模板复合物是单链，而50％(按质量计)是双链的温度。
“TWEEN-20”是聚乙二醇山梨聚糖单月桂酸酯，即以CAS号9005-64-5指派的化学品。
“GC丰度”是核酸中作为鸟嘌呤残基、胞嘧啶残基、或其类似物的总核碱基残基的分数或百分比。例如，含有精确地30个胞嘧啶、精确地30个鸟嘌呤、精确地1个胞嘧啶类似物、和精确地1个鸟嘌呤类似物的100nt核酸具有62％的GC丰度。在一些实施方案中，富含GC的模板可以含有至少51、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、或99.5％鸟嘌呤残基、胞嘧啶残基、或其类似物。
“持续合成能力(processivity)”是DNA聚合酶在给定反应中合成完整拷贝的模板的能力。持续合成能力升高可以导致产物产率升高和/或产物大小增加，后一种对于牵涉持续合成能力水平较低导致完整拷贝的低水平合成的模板的反应是特别相关的。
A.DNA模板
DNA模板是作为由DNA聚合酶催化的反应中的合成靶物的存在于样品中的DNA序列。DNA模板的GC丰度可以大于或等于60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、或99.5％C和G残基。DNA模板可以包含含有C和G残基的二、三、或四核苷酸重复。DNA模板可以在疾病相关基因座内或附近。DNA模板可以至少包含FMR1基因的5’UTR的一部分。DNA模板可以包含FMR1基因的5’UTR的CGG重复。DNA模板的大小可以是约50、100、200、300、500、或700bp、或1、1.5、2、2.5、3、4、5、7、或10kb。DNA模板的大小可以是50bp-10kb、100bp-10kb、200bp-10kb、300bp-10kb、500bp-10kb、700bp-10kb、1kb-10kb、1.5bp-10kb、2bp-10kb、3bp-10kb、50bp-7kb、50bp-5kb、50bp-4kb、50bp-3kb、50bp-2kb、50bp-1.5kb、100bp-7kb、200bp-5kb、或300bp-4kb。
B.dNTP的GC/AT比率和浓度
本发明涉及如下的方法，包括提供GC/AT比率大于1且有助于使用富含GC的模板来合成DNA的总dNTP浓度的dNTP。GC/AT比率可以是约1.1、1.2、1.4、1.6、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、或更高。GC/AT比率可以是1.1-20、1.1-15、1.1-10、1.1-8、1-15、1.1-7、1.1-6、1.1-5、1.2-25、1.4-25、1.6-25、2-25、3-25、4-25、5-25、2-15、2.5-10、或4-10。总dNTP浓度可以是约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.5、2、或3mM。dNTP浓度可以是0.4-3mM、0.5-3mM、0.6-3mM、0.7-3mM、0.8-3mM、0.9-3mM、1-3mM、0.4-2mM、0.4-1.5mM、0.4-1.2mM、0.4-1mM、0.4-0.9mM、0.4-0.8mM、0.4-0.7mM、0.5-2mM、0.5-1mM、或0.6-0.9mM。
C.持续合成能力、产率和产物大小
在一些实施方案中，相对于本领域中已知的方法，本发明提供了给定聚合酶在给定的富含GC的模板的情况中的改善的持续合成能力。经由包括提供GC/AT比率大于1的dNTP的步骤来获得改善。与本领域中已知的方法相比，改善的程度可以使得改善的反应可以能够生成包含约25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000或更多个CGG重复的可检测产物。
D.DNA聚合酶
本发明涉及如下的方法，包括提供至少一种DNA聚合酶以便以模板依赖性方式自dNTP合成DNA。DNA聚合酶可以包含野生型、经修饰的、嗜热性、嵌合的、经工程化改造的聚合酶、和/或超过一种聚合酶的混合物。DNA聚合酶可以包含精确聚合酶(5PRIME GmbH)、AccuSureTM DNA聚合酶(Bioline)、PhusionTM AccuPrimeTM Pfx(Invitrogen)、Platinum Taq DNA聚合酶高保真性(Invitrogen)、PhireTM热启动DNA聚合酶(New England Biolabs)、Phusiona热启动高保真性DNA聚合酶(New England Biolabs)、JumpStartTMREDTaqTM DNA聚合酶(Sigma-Aldrich)、PfuUltraTM热启动DNA聚合酶(Stratagene)、Cx热启动DNA聚合酶(Stratagene)、PrimeSTARTM HSDNA聚合酶(Takara)、Extensor Hi-保真性PCR酶(ABgene)、ACCUZYMETMDNA聚合酶(Bioline)、SAHARATM DNA聚合酶(Bioline)、VELOCITY DNA聚合酶(Bioline)、AccuPOLTM DNA聚合酶(GeneChoice，Inc.)、UniPOLTM DNA聚合酶(GeneChoice，Inc.)、延长酶酶混合物(Invitrogen)、Pfx50TM DNA聚合酶(Invitrogen)、Phusion DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)、KOD HiFi DNA聚合酶(Novagen)、KOD XL DNA聚合酶(Novagen)、Expand 20kb PLUS热稳定性DNA聚合酶混合物(Roche AppliedScience)、延伸高保真性PLUS热稳定性DNA聚合酶混合物(Roche AppliedScience)、延伸高保真性热稳定性DNA聚合酶混合物(Roche Applied Science)、延伸长模板热稳定性DNA聚合酶混合物(Roche Applied Science)、Easy-ATM高保真性PCR克隆酶(Stratagene)、EXLTM DNA聚合酶(Stratagene)、增强型DNA聚合酶(Stratagene)、II融合DNA聚合酶(Stratagene)、Kapa LongRangeTM DNA聚合酶(Kapa Biosystems)、Kapa HiFiTM DNA聚合酶(Kapa Biosystems)、Kapa2GTM鲁棒性DNA聚合酶(Kapa Biosystems)、Kapa2GTM鲁棒性热启动DNA聚合酶(Kapa Biosystems)、Kapa2GTM快速DNA聚合酶(Kapa Biosystems)、Kapa2GTM快速热启动DNA聚合酶(KapaBiosystems)、LA TAQ DNA聚合酶(Takara)、Optimase DNA聚合酶(Transgenomic，Inc.)、外-Pfu DNA聚合酶(Stratagene)、HotMaster Taq DNA聚合酶(5PRIME GmbH)、HotTaq DNA聚合酶(Abnova Corporation)、AmpliTaqDNA聚合酶(Applied Biosystems)、Bst DNA聚合酶Lg Frag(NewEngland Biolabs)、MasterAmpTM Tfl DNA聚合酶(EPICENTREBiotechnologies)、红热DNA聚合酶(ABgene)、Thermoprime Plus DNA聚合酶(ABgene)、Taq-红DNA聚合酶(AppliChem GmbH)、BIO-X-ACTTM长DNA聚合酶(Bioline)、BIO-X-ACTTM短DNA聚合酶(Bioline)、Bioline HybriPolTM DNA聚合酶(Bioline)、BioTherm Taq DNA聚合酶(eEnzyme LLC)、EU-Taq DNA聚合酶(eEnzyme LLC)、Synergy Taq DNA聚合酶(eEnzyme LLC)、RedPOLTM DNA聚合酶(GeneChoice，Inc.)、AccuPrimeTM GC-Rich DNA聚合酶(Invitrogen)、3173DNA聚合酶、Exo Minus(Lucigen)、9DegreesNorth(Modified)DNA聚合酶(New England Biolabs)、Therminator DNA聚合酶(New England Biolabs)、Pwo DNA聚合酶(Roche Applied Science)、Paq5000TMDNA聚合酶(Stratagene)、YieldAceTM DNA聚合酶(Stratagene)、e2TAKTM DNA聚合酶(Takara)、或来自P.kodakaraensis、激烈火球菌(P.furiosus)、T.gorgonarius、T.zilligii、附岸热球菌(T.litoralis)“VentTM”、P.GB-D“DeepVent”、T.9N-7、T.aggregans、T.barossii、T.fumicolans、T.celer、火球菌菌株ST700、T.pacificus、P.abysii、T.profundus、T.siculi、T.hydrothermalis、热球菌(Thermococcus sp.)菌株GE8、T.thioreducens、P.horikoshii或T.onnurineus NA1、热球菌9°N-7、热球菌GI-J、热球菌MAR-13、vGB-C、热球菌GI-H、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、Thermus caldophilus、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄栖热菌(Thermus flavus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、或热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的天然存在的DNA聚合酶。
E.核酸扩增，PCR
本发明涉及扩增核酸的反应。扩增反应的例子包括但不限于PCR、NASBA(基于核酸序列的扩增)、SDA(链置换扩增)、LAMP(环介导的等位扩增)、和RCA(滚环扩增)。参见例如美国专利4,683,202(PCR)；美国专利6,326,173和Journal of Virological Methods 151：283-293(2008)(NASBA)；美国专利5,648,211(SDA)；美国专利6,410,278(LAMP)；和美国专利6,287,824(RCA)。通过提及而将所有前述文献收入本文。熟练技术人员应当了解何种试剂适合于提供。这些方法之每种牵涉DNA合成，并且因此牵涉在有助于DNA聚合和存在模板的溶液中使用DNA聚合酶、核苷酸、和二价阳离子(以盐形式提供)，特别是镁。该方法就提供额外的催化活性、使用热循环或等温温育、及引物的使用和结构而言有所变化。通常还提供合适pH诸如7-8、6.5-8.5、6-9、或约7.4或7.5的缓冲液。
在PCR中，提供一对引物，其在相反链上的目标区域的每个末端结合，使得它们各自引发朝向另一引物的合成。反应是热循环的，从而在高温步骤中驱动底物变性、在较低温度步骤使引物退火、及在可以但是不必比退火步骤的温度高的温度延伸。因为一轮循环的产物可以充当下一轮循环中的模板而发生扩增。
在NASBA中，在DNA聚合酶外，还提供RNA聚合酶(RNAP)，所述DNA聚合酶也可以是逆转录酶(RT)(例如，一种可以使用RNA或DNA模板来催化DNA合成的酶)。提供如下的引物，其与那些在PCR中使用的引物相似，只是至少一条引物另外包含由RNAP识别的启动子序列。如此，RT的产物充当RNAP的模板，所述RNAP合成充当RT模板的RNA，导致扩增。在NASBA的一些形式中，提供RNA酶H以在通过RT合成RNA-DNA杂合物后生成单链DNA。在没有重复的热变性的情况中经由RT和RNAP的组合作用来发生扩增。
SDA是一种以等温且异步的方式扩增DNA的技术，这意味着不使用循环热变性来分离链；取而代之，经由自身DNA合成来发生链置换，其中3’OH的延伸引起下游链的置换。最初通过外部引物，随后通过产生切口反应来提供3’OH。提供两对引物。一个“内部”对在扩增子周围结合，而且另外包含含有限制性位点的5’瓣(flap)。另一“外部”对位于远端，即距目标区域更远。内部引物可以结合模板，得到延伸，然后通过从相应的外部引物合成来置换。随后，通过例如第二条链合成来使置换的DNA成为双链。下一步是切割双链分子的一条链，这可以通过使用经修饰的核苷酸和限制性位点来完成，其中通过经修饰的核苷酸在一条链(而不是另一条)上使切割位点失活。与此位点对应的限制酶在反应中提供，并产生切口。然后，通过DNA聚合酶来延伸在所得的切口处的3’OH，置换一条链(其可以再次充当模板1)，并且再生的双链分子再次是产生切口的底物，接着为延伸和置换，导致扩增。重复的热变性不是必要的。
1注意：由于产生切口，一些被置换的链最初不会是全长，而是会缺乏内部引物瓣(flap)的远端部分的互补链。这不损害引物结合(回想引物的非瓣部分具有足以稳定地进行退火的长度)，并且在引物结合后，生成5’突出端，使聚合酶能够进行填充)。
LAMP是一种设计为高度特异性的扩增方法，即它可以区别仅相差单核苷酸多态性(SNP)的模板，因为一个等位基因是扩增的底物，而另一个不是。它也是等温的。与在SDA中一样，提供两对引物，即内部的和外部的；内部引物也具有5’瓣。然而，在LAMP中，每个内部引物的5’瓣含有与其结合的模板链内的在与引物的3’部分结合的位点内部的序列匹配的序列。例如，若引物与模板分子的(+)链(其含有下游序列A)退火，则引物瓣也可以含有序列A。值得注意地，要通过此反应区别的SNP基因座位于以瓣为界的区域的边缘，其对应于瓣的5’端的最后一个碱基。反向内部引物瓣的5’端的最后一个碱基也对应于SNP基因座。与在SDA中一样，延伸内部引物，然后通过延伸外部引物来置换。在这发生时，5’瓣通过结合其互补物(其现在是同一分子的一部分；继续上述例子，置换链含有序列A的反向互补物，称作序列T，并且瓣中的序列A在分子内结合序列T)而形成环。反向内部引物与在其3’端(其对应于反向外部引物)内部的环形置换链退火，并引发合成，这置换环，并形成部分双链的、部分单链的DNA。然后，反向外部引物与单链部分退火，并引发合成，引起链置换。现在，置换链可以形成环，其中其3’端与分子的内部部分配对。若仅SNP基因座与3’端(其源自外源供应的内部引物瓣)匹配，则发生延伸。上文所引用的参考文献中所描述的进一步的引物退火、环化、和延伸/置换事件导致具有与引物瓣匹配的SNP等位基因的模板的选择性扩增。
在RCA中，使用环形DNA模板。引物与环退火，并继续延伸，其中聚合酶在其行进时置换先前旋转过程中合成的DNA。此反应以线性动力学进行，并且生成长的、连环化的产物。在双引发RCA中，提供第二引物，其与上述反应的连环化产物退火。此型式的反应容许使用产物作为模板，因此导致指数动力学。与在其它等温反应中一样，使产物适合于在双引发RCA中与引物退火，其经由由上游引物的延伸所致的链置换进行；在此情况中，引物结合模板链中上游更远的其它多联体。
例如，本发明的一个实施方案是通过以GC/AT比率大于1提供dNTP的PCR来扩增富含GC的模板DNA。在循环扩增反应诸如例如PCR中，反应循环的数目可以是20-40，例如约20、25、30、35、或40轮循环。另外，本发明涉及其它扩增反应，其中在以GC/AT比率大于1提供dNTP的反应中扩增富含GC的模板；反应可以例如是NASBA、SDA、LAMP、或RCA。
F.PCR引物
本发明涉及包括提供正向和反向引物的方法。引物可以设计为与模板序列的每个末端的约15-30、15-25、15-20、20-30、或20-25个核苷酸退火。
引物可以与在FMR1 5’UTR中的CGG重复区侧翼的序列退火。此类正向引物的例子包括CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C(SEQ ID NO：1)，CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG GTT T(SEQ ID NO：2)，CAG TCA GGCGCT CAG CTC CGT TTC G(SEQ ID NO：3)，TCC GGT GGA GGG CCG CCTCTG AGC(SEQ ID NO：4)，GGT TCG GCC TCA GTC AGG CGC TCA GCTCCG TTT CG(SEQ ID NO：5)，GGG TTC GGC CTC AGT CAG GCG CTCAGC TCC GTT TCG(SEQ ID NO：6)，GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTCAGT CA(SEQ ID NO：7)，CAG CGG GCC GGG GGT TCG GCC TCA G(SEQID NO：8)，GCA GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC A(SEQ ID NO：9)，GGG CCG GGG GTT CGG CCT CAG TCA G(SEQ ID NO：10)，GGG GTTCGG CCT CAG TCA GGC GCT CA(SEQ ID NO：11)，GGG GTT CGG CCTCAG TCA GGC GCT CAG(SEQ ID NO：12)，GGC GCT CAG CTC CGT TTCGGT TTC ACT TCC(SEQ ID NO：13)，TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTCGGT TTC A(SEQ ID NO：14)，CAC TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GA(SEQ ID NO：15)，和TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C(SEQ IDNO：16)。此类反向引物的例子包括CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC TCCA(SEQ ID NO：17)，GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG(SEQ ID NO：18)，GGG AGC CCG CCC CCG AGA GGT(SEQ ID NO：19)，CGC ACT TCC ACCACC AGC TCC TCC AT(SEQ ID NO：20)，CGG GAG CCC GCC CCC GAGAGG TG(SEQ ID NO：21)，CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT(SEQID NO：22)，CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG(SEQ ID NO：23)，CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG(SEQ ID NO：24)，GCG CCGGGA GCC CGC CCC CGA GAG GT(SEQ ID NO：25)，CGC CGG GAG CCCGCC CCC GAG AGG T(SEQ ID NO：26)，GCG CCA TTG GAG CCC CGCACT TCC ACC A(SEQ ID NO：27)，GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACTTCC A(SEQ ID NO：28)，AGC GCC ATT GGA GCC CCG CAC TTC C(SEQID NO：29)，CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA C(SEQ ID NO：30)，TTG GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC A(SEQ ID NO：31)，AGC CCCGCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT C(SEQ ID NO：32)，GAG CCC CGCACT TCC ACC ACC AGC TCC T(SEQ ID NO：33)，CAT TGG AGC CCCGCA CTT CCA CCA CCA G(SEQ ID NO：34)，CCC GCA CTT CCA CCACCA GCT CCT CCA TCT(SEQ ID NO：35)，TAG AAA GCG CCA TTG GAGCCC CGC ACT TCC(SEQ ID NO：36)，和AAG CGC CAT TGG AGC CCCGCA CTT CC(SEQ ID NO：37)。
G.增强剂
在一些实施方案中，可以提供增强剂。增强剂促成生成富含GC的产物的反应的成功。一般可以在PCR反应中包括多种增强剂以提高产率、特异性、和一致性，而且可以通过降低模板DNA的Tm来运行。增强剂可以经由螺旋去稳定化、中和反应抑制剂、或其它机制(包括未知的机制)来发挥功能。增强剂包括但不限于甜菜碱、甜菜碱类似物、甘油、牛血清清蛋白(BSA)、聚乙二醇、氯化四甲铵、7-脱氮-GTP、中性去污剂、二甲亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、异丙醇、甲酰胺、丙酮、乙酰胺、N-甲基酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙酰胺、N-甲基乙酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、2-吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、丙酰胺、和异丁酰胺。中性去污剂包括但不限于TWEEN-20、β-辛基-葡糖苷、辛基-β-硫代-吡喃葡萄糖苷、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween-80、Pluronic F-68、Pluronic F-127、Deoxy Big CHAP、CHAPS、CHES、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(Tergitol型NP-40)、和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Igepal CA-630)。甜菜碱类似物包括但不限于高丹醇甜菜碱(homodeanol betaine)、丹醇甜菜碱(deanol betaine)、丙甜菜碱(propio betaine)、高甘油甜菜碱(homoglycerol betaine)、二乙醇高甜菜碱、三乙醇高甜菜碱、羟丙基高甜菜碱、N-甲基-N-(2-羧乙基)吗啉内盐，N-甲基-N-(2-羧乙基)哌啶内盐、N-甲基-N-(2-羧乙基)吡咯烷内盐、N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)-N-(2-磺乙基)铵内盐、N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)-N-(3-磺丙基)铵内盐、N，N-二羟乙基-N-甲基-N-(3-磺丙基)铵内盐、N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)-N-(4-磺丁基)铵内盐、N-甲基-N-(3-磺丙基)吗啉内盐、和N-甲基-N-(3-磺丙基)哌啶内盐。
可以以0.01-5M、0.01-4M、0.01-3M、0.01-2.5M、0.02-5M、0.03-5M、0.04-5M、0.05-5M、0.07-5M、0.1-5M、0.2-5M、0.3-5M、0.4-5M、0.5-5M、0.7-5M、1-5M、1.5-5M、0.1-4M、0.5-3M、1-2.5M、或1.5-2.5M，例如约0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3、3.5、4、4.5、或5M的摩尔浓度提供甜菜碱、甜菜碱类似物和/或其它增强剂。或者，可以以0.1-50％、0.2-50％、0.5-50％，1-50％、2-50％、5-50％、0.1-40％、0.1-30％、0.1-20％、0.5-40％、1-30％、或2-20％，例如约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50％(按体积计)的w/v或v/v百分比浓度提供增强剂。可以以0.0001-10％(按体积计)、0.0002-10％、0.0005-10％、0.001-10％、0.002-10％、0.005-10％、0.01-10％、0.02-10％、0.05-10％、0.0001-5％、0.0001-2％、0.0001-1％、0.0005-1％、或0.001-1％，例如约0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10％(按体积计)提供中性去污剂。本领域技术人员会认可适合于多种增强剂的浓度。
H.镁盐
本发明涉及包括提供镁盐的方法。镁盐是一种含有镁和酸的共轭碱的化学化合物。镁盐可以包含例如但不限于氯化镁、乙酸镁、磷酸镁、溴化镁、或碘化镁。以如下的数量提供镁盐，使得镁的终浓度可以是1-5mM、1-4.5mM、1-4mM、1-3.5mM、1-3mM、1.5-5mM、2-5mM、2.5-5mM、3-5mM、1.5-4.5mM、或2-4mM。例如，镁的终浓度可以是约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5mM。
I.缓冲液
本发明涉及包括提供缓冲液的方法。缓冲液可以包括例如但不限于三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、二-Tris丙烷、碳酸氢盐、磷酸盐、甘氨酸、组氨酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、和多种共轭碱/酸及其盐。
J.数据、产物、和用途
在一些实施方案中，通过本发明的方法生成的产物可以包含约5、10、20、30、40、50、70、100、150、200、250、300、400、500、700、800、900、1000、2000或更多个CGG重复。在一些实施方案中，本发明的扩增反应牵涉扩增含有比Coriell FMR1 5’UTR标准品更多的重复的等位基因，所述标准品含有20、28-29、118、198、或约330个CGG重复。通过本发明的方法生成的产物可以包含5-2000、10-2000、20-2000、30-2000、40-2000、50-2000、70-2000、100-2000、150-2000、200-2000、250-2000、300-2000、5-1000、5-700、5-500、5-400、5-300、10-1000、10-700、20-500、30-400、或100-300的CGG重复的数目。可以使用经由本发明获得的数据，即测试的结果来诊断状况或疾病的存在或缺失。可以在个体基因型的确定上使用经由使用本发明获得的数据。可以使用经由本发明获得的数据来检测与脆性X综合征、脆性X相关震颤共济失调综合征、和脆性X相关原发性卵巢功能不全有关的基因型。与这些状况有关的遗传基因座是本领域中已知的，并且包括但不限于FMR1、FMR2、FMR1的5’UTR、FMR2的5’UTR、FMR1 5’UTR内的CGG重复、和FMR2的5’UTR内的CGG重复。在别的实施方案中，可以使用经由本发明获得的数据来检测与富含GC的三核苷酸重复病症，诸如脆性X综合征、脆性X相关震颤共济失调综合征、和脆性X相关原发性卵巢功能不全、强直性肌营养不良、亨延顿氏病、脊延髓肌萎缩症、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩、和/或脊髓小脑性共济失调有关的基因型。与这些状况有关的遗传基因座是本领域中已知的，并且包括但不限于FMR1、FMR2、DMPK、ZNF9、HTT、AR、ATN1、ATXN1-3、ATXN7、ATXN10、CACNA1A、SCA8、PPP2R2B、和TBP。参见例如Nat Genet.1996年5月；13(1)：105-8；Nat Genet.1996年5月；13(1)：109-13。
实施例1
通过运行一系列反应来测量不同GC/AT比率、总dNTP浓度、和甜菜碱浓度的效果，所述反应具有1、5、或10的GC/AT比率；0.75、1.0、或1.25mM的总dNTP(Roche，GMP级产品目录编号G 04631129103、C 04631072103、A04631056103、T 04631137103)浓度；和1.7、2.0、或2.2M的甜菜碱(Sigma产品目录编号B0300-1VL)浓度。模板是表1所示多种基因组DNA各10ng的混合物。每次反应利用扩增长模板PCR系统缓冲液2(Roche产品目录编号11681834001)以及1.125个单位的重组Taq聚合酶(Roche，产品目录编号03734935001)一起。引物与在Saluto等，J Mol Diagn 7：605-12(2005)中一样，每种1μM。除循环的数目外，PCR循环概况与在Saluto等中一样，如下简要概述：98℃变性10分钟；按照97℃35秒、64℃35秒、68℃4分钟进行10轮循环；按照97℃35秒、64℃35秒、68℃4分钟，加上每轮循环20秒的增量进行15轮循环；最终于68℃延伸10分钟。将6微升PCR产物以5V/cm在具有1X Bionic缓冲液的1.75％NuSieve琼脂糖凝胶上电泳45分钟，接着进行SYBR金染色及通过UV光显现。
表1：所测试的Coriell基因组DNA对照的基因型
表2：泳道条件
  道No.   GC∶AT比率   [甜菜碱]   总[dNTP]
  1   1∶1   1.7M   0.75mM
  2   5∶1   1.7M   0.75mM
  3   10∶1   1.7M   0.75mM
  5   1∶1   2.0M   0.75mM
  6   5∶1   2.0M   0.75mM
  7   10∶1   2.0M   0.75mM
  8   1∶1   2.2M   0.75mM
  9   5∶1   2.2M   0.75mM
  10   10∶1   2.2M   0.75mM
  11   1∶1   1.7M   1.0mM
  12   5∶1   1.7M   1.0mM
  13   10∶1   1.7M   1.0mM
  14   1∶1   2.0M   1.0mM
  15   5∶1   2.0M   1.0mM
  16   10∶1   2.0M   1.0mM
  17   1∶1   2.2M   1.0mM
  18   5∶1   2.2M   1.0mM
  19   10∶1   2.2M   1.0mM
  20   1∶1   1.7M   1.25mM
  21   5∶1   1.7M   1.25mM
  22   10∶1   1.7M   1.25mM
  23   1∶1   2.0M   1.25mM
  24   5∶1   2.0M   1.25mM
  25   10∶1   2.0M   1.25mM
  26   1∶1   2.2M   1.25mM
  27   5∶1   2.2M   1.25mM
  28   10∶1   2.2M   1.25mM
在较高的甜菜碱浓度和GC/AT比率，明显改善具有较高数目的CGG重复的等位基因的扩增(图1)。
实施例2
为了进一步测试有偏向的GC/AT dNTP比率的效果，使用具有1.1至25的比率的不同偏爱程度(图2)，及具有GC/AT比率1的对照反应来运行一组PCR反应。将总dNTP(Roche，GMP级产品目录编号G 04631129103、C04631072103、A 04631056103、T 04631137103)浓度于1mM保持恒定。提供模板混合物(总共10ng)，其含有FMR1 5’UTR的具有20、28、118、198、和336个CGG重复的等位基因片段。每次反应利用扩增长模板PCR系统缓冲液2(Roche产品目录编号11681834001)以及1.125个单位的重组Taq聚合酶(Roche，产品目录编号03734935001)。甜菜碱(Sigma产品目录编号B0300-1VL)以2.2M存在。引物与在Saluto等，J Mol Diagn 7：605-12(2005)中一样，每种1μM。除循环的数目外，PCR循环概况与在Saluto等中一样，如下简要概述：98℃变性10分钟；按照97℃35秒、64℃35秒、68℃4分钟进行10轮循环；按照97℃35秒、64℃35秒、68℃4分钟，加上每轮循环20秒的增量进行15轮循环；最终于68℃延伸10分钟。将6微升PCR产物以5V/cm在具有1X Bionic缓冲液的2.0％NuSieve琼脂糖凝胶上电泳45分钟，接着进行SYBR金染色及通过UV光显现。
表3中显示了第2道-第18道的GC∶AT比率。
表3：GC∶AT比率
  道No.   GC∶AT比率
  2   1∶1
  3   1.1∶1
  4   1.2∶1
  5   1.4∶1
  6   1.6∶1
  7   1.8∶1
  8   2∶1
  9   2.5∶1
  10   3∶1
  11   3.5∶1
  12   4∶1
  13   4.5∶1
  14   5∶1
  15   10∶1
  16   15∶1
  17   20∶1
  18   25∶1
在宽范围的GC/AT比率里，较高分子量产物(其含有较高数目的CGG重复和较高的总体GC丰度)的合成和产率相对于第1道明显改善。
根据说明书内引用的参考文献的教导，本发明得到最彻底的理解。说明书内的实施方案提供了本发明的实施方案的例示，而且不应解释为限制本发明的范围。熟练技术人员容易认可，本发明涵盖许多其它实施方案。通过提及而完整收录本公开内容中所引用的所有出版物和专利。在通过提及而收录的材料与本说明书矛盾或不一致的程度，说明书会代替任何此类材料。本文中的任何参考文献的引用并不承认此类参考文献是本发明的现有技术。
除非另有指明，说明书(包括权利要求书)中所列的所有表示成分数量、反应条件等的数字都应当理解为在所有情况中以术语“约”修饰。因而，除非另有相反地指明，数字参数是近似值，并且可以随本发明寻求获得的期望特性而有所变化。最低限度且并不意图限制与权利要求书的范围等同的教条的应用，应当根据有效数的数字和普通的四舍五入方法来解释每个数字参数。
除非另有指明，在一系列元件前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元件。本领域技术人员应当认可或者仅使用常规的实验便能够确认本文中所描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。意图所附权利要求书涵盖此类等同方案。

Claims (20)

1.提高一种或多种DNA聚合酶在至少一种富含GC的DNA模板上的持续合成能力的方法，该方法包括，在含有GC/AT比率为1.2或更高的dNTP的水溶液中进行DNA扩增，其中所述水溶液进一步包含至少一种增强剂。
2.权利要求1的方法，其中所述GC/AT比率是1.4-25。
3.权利要求1的方法，其中所述GC/AT比率是2.5-10。
4.权利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板具有至少65％的GC丰度。
5.权利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板具有至少90％的GC丰度。
6.权利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板包含由G和C残基组成的二、三、或四核苷酸的至少五个连续重复。
7.权利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板至少包含FMR1的5’UTR的一部分。
8.权利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板包含FMR1的5’UTR的CGG重复。
9.权利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板至少包含FMR2的5’UTR的一部分。
10.权利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板包含FMR2的5’UTR的CGG重复。
11.权利要求1的方法，其中所述至少一种增强剂包含甜菜碱、具有不携带氢原子的带正电荷的官能团及具有带负电荷的官能团的中性化学化合物、DMSO、或中性去污剂之至少一种。
12.权利要求1的方法，其中所述至少一种增强剂包含
a.甜菜碱或具有不携带氢原子的带正电荷的官能团及具有带负电荷的官能团的中性化学化合物；和
b.至少一种选自下组的化合物：DMSO、中性去污剂、和7-脱氮-GTP。
13.权利要求1的方法，包括在水溶液中扩增所述富含GC的模板，所述水溶液包含
a.至少一种富含GC的DNA模板；
b.至少一种镁盐；
c.至少一种DNA聚合酶；
d.至少一种缓冲液；和
e.GC/AT比率为1.2或更高的dNTP，
并使所述溶液经历至少一个温育期，该期间发生扩增。
14.权利要求1的方法，其中所述至少一种增强剂包含甜菜碱、具有不携带氢原子的带正电荷的官能团及具有带负电荷的官能团的中性化学化合物、7-脱氮-GTP、DMSO、和中性去污剂之至少一种。
15.权利要求1的方法，其中通过选自SDA、NASBA、LAMP、RCA、或LCR之至少一种的方法来扩增所述至少一种富含GC的模板。
16.权利要求1的方法，进一步包括提供与所述至少一种富含GC的模板退火的至少一种引物。
17.提高一种或多种DNA聚合酶在至少一种富含GC的DNA模板上的持续合成能力的方法，该方法包括，在水溶液中经PCR扩增所述模板，所述水溶液包含：
a.GC/AT比率为2-10的dNTP；
b.至少一种增强剂，选自甜菜碱、DMSO、和中性去污剂；
c.至少一种DNA聚合酶；
d.1.5-2mM的总镁浓度；和
e.0.7-0.9mM的总dNTP浓度；
其中所述至少一种富含GC的模板包含FMR1的5’UTR的CGG重复。
18.权利要求17的方法，其中所述中性去污剂包含TWEEN-20。
19.权利要求17的方法，其中所述PCR生成包含至少200个CGG重复的产物。
20.权利要求17的方法，其中所述PCR生成包含至少300个CGG重复的产物。
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