CN102373204B - 一种转录水平基因表达调控的方法及应用 - Google Patents
一种转录水平基因表达调控的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医学和分子生物学领域，具体涉及一种利用小双链RNA进行转录水平调控基因表达的方法。本发明首先在基因组DNA序列上筛选并确认目标基因的作用靶点；然后，设计针对该作用靶点的特异siRNA或shRNA；最后，转染靶序列特异性的siRNA或者shRNA进入细胞核内。本发明利用小双链RNA，包括siRNA,shRNA和化学或者生物化学修饰后的siRNA构建到相关质粒中的shRNA等实现转录水平的基因下调或沉默，或者转录水平基因上调或者激活。所述的小双链RNA在转录水平具有强大的基因调控功能，尤其是在恶性肿瘤治疗研究中，转录水平下调癌基因或上调抑癌基因能发挥十分有效的抑癌作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学和分子生物学领域，尤其是分子生物学中基因调控技术领域。具体涉及一种利用小双链RNA进行转录水平调控基因表达的方法。
背景技术
目前，基因调控技术尤其是RNA干扰技术早已被广泛应用到生物医学研究领域。小双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）可以高效、高特异性地阻断体内特定基因表达，促使目的基因mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，即称为RNA干扰（RNA interference, RNAi），或称转录后基因沉默技术（Post-transcriptional Gene Silencing ,PTGS)。目前这些技术已经被广泛应用到生物医学研究领域，成为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具。然而，目前的RNA干扰技术都是在转录后水平（也就是在mRNA水平上）降解目的基因mRNA或者阻遏目的基因mRNA的翻译从而发挥相应的基因沉默作用，而未包括转录水平的基因沉默，更未涉及到小RNA介导的转录水平基因上调或者激活领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种转录水平基因表达调控的方法。具体涉及一种利用小双链RNA进行转录水平调控基因表达的方法。
具体而言，本发明的一种转录水平基因表达调控的方法，其特征在于，其包括步骤：
首先，在基因组DNA序列上（尤其在基因启动子区域和内含子区域）筛选并确认目标基因的作用靶点；然后，设计针对该作用靶点的特异siRNA，microRNA或shRNA；并且将靶序列特异性的小双链RNA转染进入细胞内，最后，通过PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达变化以及通过相应生物学技术观察研究作用细胞所发生的功能性以及形态学等的改变。
本发明中，所述的作用靶点主要分布在目的基因的DNA序列上，包括目的基因的启动子区域，内含子，外显子区域，以及DNA的反义转录本上。
本发明中，所述的靶序列特异性的小双链RNA包括siRNA，shRNA，化学或者生物化学修饰后的siRNA，构建到相关质粒中的shRNA等。
本发明中，所述的靶序列特异性的小双链RNA主要是通过转染试剂（如脂质体转染试剂）或者慢病毒、逆转录病毒感染系统转导进细胞内的。
本发明中，所述的靶序列特异性的小双链RNA进入细胞内以后主要通过Exportin-5等细胞内在转输体系或者病毒介导进入细胞核内的。
本发明中，所述的特异siRNA或shRNA能够导致目标基因部分沉默；或者下调靶序列转录，最终导致基因部分下调或者完全沉默。
本发明中，所述的特异siRNA或shRNA能够诱导目标基因部分上调；或者上调调靶序列转录，最终导致基因部分上调或者完全激活。
本发明中，所述的特异siRNA的 3'端包括[dT][dT]。
本发明中，所述的特异siRNA是人工合成或者从细胞、组织中分离纯化获得。
本发明中，将该方法应用于靶基因后导致该靶基因在转录水平部分下调或者完全沉默；部分上调或者完全激活；从而起到在转录水平调控目的基因表达进而调控相关基因功能的作用。
本发明中，所述shRNA即短发夹RNA。在RNAi感染过程中,产生dsRNA的一个有效方法就是在体内表达一个短发夹RNA分子,这种shRNA包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补),中间由一个loop序列分隔,组成发夹结构。
本发明的转录水平基因表达调控的方法可以理解为：提供针对哺乳动物细胞的特异基因，转染或导入靶点特异性的小双链RNA(包括siRNA或shRNA等)进入细胞核内；结果导致细胞内靶基因表达激活或上调；沉默或者下调。
本发明的转录水平基因表达调控的方法可以涉及下列技术中的若干项：（1）靶向特异性siRNA核膜穿透系统；（2）siRNA进入核内借助慢病毒共同转化系统；（3）胞核内主动运输机制；（4）细胞核转运介导构成；（5）利用Ago蛋白（包括Ago1 Ago2 Ago3 Ago4)；(6)利用Exportin-5系统；（6）利用Dicer/Drosha；（7）无论靶序列上包含有转录调节序列还是小RNA上含有与转录调节序列匹配或完全一致的序列；（8）无论作用靶点在特异基因DNA序列上的启动子区域还是内含子、外显子上；（9）无论作用靶点在转录基因的正义链还是反义转录本上；（10）无论转录调节序列上含有启动子序列还是siRNA上含有与基因启动子序列部分或者完全一致或者匹配的序列；（11）无论转录调节序列上含有转录增强子或者小双链RNA上含有与转录调节序列上完全或部分一致的或者匹配的序列;无论转录调节序列上含有转录沉默子、抑制子或者小双链RNA上含有与转录调节序列上完全或部分一致的或者匹配的序列。
本发明的小RNA时调节基因转录包括：（1）部分沉默，或者下调靶基因转录，最终导致靶基因部分沉默；（2）转录前或mRNA产生前靶基因部分或完全抑制；（3）无论部分沉默而经历短暂时间沉默后是否可恢复；（4）无论干预后靶基因DNA序列CpG岛是否发生甲基化或者去甲基化；（5）无论靶序列上是否包括标记物或者是报告基因；（6）无论干预的是哺乳动物细胞；（7）无论干预的细胞是否是人类细胞；(8)包括靶序列的进一步放大，包括RT-PCR。
本发明的小双链RNA：（1）长度可以是80,79,78,77,76,75,74,73,72,71,70,69,68,67,66,65,64,63,62,61,60,59,58，57，56，55，54，53，52，51，50，49，48，47，46，45，44，43，42，41，40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 or 10或更少的碱基数;(2)包括长度在19～25个碱基（3）包括siRNA 21～23个碱基；（4）siRNA无论3'端是否包括[dT][dT]；（5）siRNA无论是否包括只有部分siRNA包含有双链RNA的情况；（ 6）无论双链siRNA是否包含有两个分开的 oligonucleotides;（7）无论双链siRNA是否含有可折叠的oligonucleotides；无论双链RNA是否含有单链的nucleotide overhang;（8）无论siRNA是否包含有单链核苷酸 overhang 包含有3’端核苷酸overhang;（9）siRNA是否含有2，或者3个核苷酸overhang；（10）siRNA无论是合成的，非自然状态的或者修饰的RNA；(11)无论上述合成的、非自然状态的或者修饰的RNA是否包含有部分序列部分或者完全与转染试剂相匹配；（12）无论小RNA转运系统是否是DNA病毒或者逆转录病毒；（13）无论DNA病毒是否是Epstein-Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV), Rhesus monkey rhadinovirus (RRV), Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), parvovirus B19 (B19), varicella-zoster virus (VZV), and/or any or the herpesvirus, 比如是 human herpesvirus (HHV)-1, (HHV)-2, (HHV)-5, (HHV)-6, (HHV)-7, or human herpesvirus 8 (HHV-8);(14) 无论逆转录病毒是否是慢病毒；（15）无论慢病毒是否包括HIV或者说是HIV-1 或者HIV-2；（16）包括shRNA;(17)无论shRNA是否构建在质粒等载体内；(18)包括microRNA及其前体pri-microRNA和pre-microRNA。
下面，具体说明利用小双链RNA在转录水平调控基因表达上调或下调技术的设计方法、技术路线、构成及应用。
首先，确定目标基因转录起始点，核心启动子，内含子以及外显子区域。登陆美国国立生物技术信息中心网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），下载目标基因序列，分析并标记出靶基因的核心启动子，内含子，外显子，CpG岛等基因信息，在靶基因启动子区域避开CpG岛区域，避开局部复杂结构选取出CG含量较低（＜60%）不能自身形成颈环结构的的19~23bp序列作为靶序列根据所选取靶点设计成dsRNA序列（可以在相关的dsRNA序列后加如[dT][dT]增加序列稳定性），并将所设计的dsRNA使用美国国立生物技术信息中心网站的blast数据库与全基因组匹对，选取特异性较好的dsRNA序列作为候选靶序列。然后发往生物技术服务公司合成。
使用转染试剂（如Invitrogen公司的lipo2000转染试剂）转染到所培养的相关细胞株中，提取所干预细胞的总RNA，总蛋白，使用SYBER Green荧光定量PCR方法和Western blotting免疫印迹方法检测目的基因mRNA及蛋白的表达情况。
根据荧光定量PCR数据及Western blotting结果，选取上调和下调目标基因表达效果明显的dsRNA作进一步的实验检测。
然后，将包含有靶序列的目的基因启动子区域DNA序列整合到pGL3荧光素酶质粒空载体中，构建出目标基因靶点作用报告质粒。将以上实验筛选出来的dsRNA和构建出来的报告质粒以及作为内参的海肾素质粒（Rennilia）共同转染到相关细胞株中，使用荧光素酶双报告分析试剂盒检测荧光素酶活性的变化。从而判断所验证的dsRNA是否在转录水平上调或下调目的基因的表达。
将经过双报告验证的dsRNA转染到相关中，使用细胞增殖实验、划痕实验以及侵袭实验等评估所筛选dsRNA作用后肿瘤细胞生长、转移和侵袭能力等生物学行为的改变。
本发明的有益效果是：提供了一种转录水平基因表达调控的方法。利用小双链RNA实现转录水平的基因沉默，或者介导的转录水平基因激活。小双链RNA在转录水平具有强大的基因调控功能，尤其是在肿瘤治疗研究中，转录水平下调癌基因或上调抑癌基因可能发挥更为有效的抑癌作用。
例如，本发明设计的针对E-cadherin的6个dsRNA中，有3对dsRNA可以大幅度上调E-cadherin的表达，从而抑制前列腺癌细胞株PC-3、肝癌细胞株MHCC-97H肿瘤细胞生长、转移和侵袭能力等生物学行为；有3对dsRNA可以大幅度下调E-cadherin的表达，从而诱导、促进前列腺癌细胞株PC-3、肝癌细胞株MHCC-97H肿瘤细胞生长、转移和侵袭能力增强。
附图说明
图1.转录水平调控E-cadherin的靶序列A、B、C、D和E与E-cadherin启动子区域对应的位置的图示。
图2.小双链RNA位置及作用示意图。其中，小双链RNA的序列如下：
a S: CAAAAAAUUAGGCUGCUAG[dT][dT] （参见SEQ ID NO 1）
AS: CUAGCAGCCUAAUUUUUUG[dT][dT] （参见SEQ ID NO 2）
b S: GGCUCACACCUGAAAUCCU[dT][dT] （参见SEQ ID NO 3）
AS: AGGAUUUCAGGUGUGAGCC[dT][dT] （参见SEQ ID NO 4）
c S: GGATCGCTTCAGCCCAGGA[dT][dT] （参见SEQ ID NO 5）
AS: TCCTGGGCTGAAGCGATCC[dT][dT] （参见SEQ ID NO 6）
d S: CAGCTACTAGAGAGGCTGG[dT][dT] （参见SEQ ID NO 7）
AS: CCAGCCTCTCTAGTAGCTG[dT][dT] （参见SEQ ID NO 8）
e S: CACCACTGCACTCCAGCTT[dT][dT] （参见SEQ ID NO 9）
AS: AAGCTGGAGTGCAGTGGTG[dT][dT] （参见SEQ ID NO 10）
图3是2对dsRNA大幅度上调前列腺癌细胞PC-3中E-cadherin的蛋白表达。
图4显示使用dsE-a干预后PC-3细胞存活率降低。
图5显示转染dsE-a后，PC-3细胞的侵袭能力下降。
图6显示3对dsRNA大幅度下调PC-3细胞中E-cadherin的表达。
图7显示前列腺癌细胞株PC-3的肿瘤细胞侵袭能力大大增强。
具体实施方式
实施例1 设计小双链RNA
通过文献检索，确定E-cadherin基因（例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Gene ID: 999）转录起始点及核心启动子区域。登陆美国国立生物技术信息中心网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），下载E-cadherin基因序列。在E-cadherin启动子区域（转录起始点以上1000bp）范围内，避开高CpG区域，选取C、T、A和G4个碱基组合相对复杂（主要为了避免靶序列结构简单，全基因组序列中重复性较高）的19个碱基序列作为小双链RNA作用靶点，从而根据所选取靶点设计dsRNA序列，并将所设计的dsRNA使用美国国立生物技术信息中心网站的blast数据库与全基因组匹对，选取特异性较好的dsRNA序列作为筛选靶序列，然后发往生物技术服务公司合成。
使用转染试剂（如Invitrogen公司的lipo2000转染试剂）转染到所培养的前列腺癌细胞株（PC-3和DU-145）肝癌细胞株（97L、97H和LM3）中，提取所干预细胞的总RNA，总蛋白，使用SYBER Green荧光定量PCR方法和Western blotting免疫印迹方法检测目的基因(E-cadherin)mRNA及蛋白的表达情况。
根据荧光定量PCR数据及Western blotting结果，选取上调和下调E-cadherin表达效果明显的dsRNA作进一步的实验检测。
将包括E-cadherin core promoter的启动子区域（-1000bp）序列整合到pGL3荧光素酶质粒空载体中，构建出E-cadherin启动子靶点作用报告质粒。将以上实验筛选出来的dsRNA和构建出来的报告质粒以及作为内参的海肾素质粒（Rennilia）共同转染到前列腺癌细胞株（PC-3和DU-145）肝癌细胞株（97L、97H和LM3）中，使用荧光素酶双报告分析试剂盒检测荧光素酶活性的变化。从而判断所验证的dsRNA是否在转录水平上调或下调目的基因的表达。
在E-cadherin启动子区域，避开CpG岛区域，选取C、T、A和G组合相对复杂的区域，如图1和2所示的靶点A（CUAGCAGCCUAAUUUUUUG），然后根据靶点序列A设计dsRNA-a（正义链为： S: CAAAAAAUUAGGCUGCUAG[dT][dT]，反义链为CUAGCAGCCUAA UUUUUUG[dT][dT]） 并使用美国国立生物技术信息中心网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的blast数据库对该序列在全基因组中匹配，确认该序列特异性较高，然后合成小双链RNA-a，作为候选靶RNA之一。
针对E-cadherin的小双链RNA序列参见SEQ ID NO 1-12。其中，a,b,c号小RNA能够上调E-cadherin表达；d，e，f号小RNA能够下调E-cadherin表达。
实施例2 小双链RNA对细胞生长、转移、侵袭能力的作用
将经过双报告验证的dsRNA转染到前列腺癌细胞株（PC-3和DU-145）肝癌细胞株（97L、97H和LM3）中，使用细胞增殖实验、划痕实验以及侵袭实验等评估所筛选dsRNA作用后肿瘤细胞生长、转移和侵袭能力等生物学行为的改变。
将合成的小双链RNA，使用脂质体类转染试剂转染进前列腺癌细胞株（PC-3和DU-145）肝癌细胞株（97L、97H和LM3）中，转染后3天收获细胞，分别提取总RNA和总蛋白，然后使用荧光定量PCR和免疫印迹的方法检测目的基因的表达。如果使用dsRNA干预后目的基因表达上调或下调，该dsRNA则作为功能性小RNA进行下一步验证。
结果显示，有2对dsRNA（dsE-a,dsE-b）可以大幅度上调前列腺癌细胞PC-3中E-cadherin的蛋白表达（如图3），从而抑制前列腺癌细胞株PC-3细胞生长、转移和侵袭能力等生物学行为；如图4所示，使用dsE-a干预后6天,PC-3细胞存活率大大降低，为mock转染组和dsControl组的50%左右；如图5所示，transwell实验结果显示转染dsE-a后，PC-3细胞的侵袭能力大大下降。如图6所示， 3对dsRNA（dsE-c,dsE-d,dsE-e）可以大幅度下调PC-3细胞中E-cadherin的表达，从而诱导、促进前列腺癌细胞株PC-3的肿瘤细胞侵袭能力大大增强（见图7）。
该实施例子可见，通过针对目的基因DNA序列选择靶点；针对所选择靶点设计，合成小双链RNA；然后筛选出合适的干预小双链RNA，接着转染所筛选出来的小双链RNA并且使用定量PCR,western blot等分子生物学方法验证靶标基因是否被有效调节（包括上调和下调），最后通过功能性分子生物学实验方法验证目的基因被有效上调或下调以后，细胞生物学行为是否改变，发生了什么改变。该实施例子显示了转录水平调控基因表达是一种功能强大的分子生物学技术和方法。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属金山医院
<120> 一种转录水平基因表达调控的方法及应用
<130> 1061
<160> 12
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 1
caaaaaauua ggcugcuag 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 2
cuagcagccu aauuuuuug 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
ctcagtggct catggctca 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
tgagccatga gccactgag 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 5
ggcucacacc ugaaauccu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 6
aggauuucag gugugagcc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
ggatcgcttc agcccagga 19
<210> 8
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
tcctgggctg aagcgatcc 19
<210> 9
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
cagctactag agaggctgg 19
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<212> DNA
<213> Artificial
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ccagcctctc tagtagctg 19
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
caccactgca ctccagctt 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 12
aagctggagt gcagtggtg 19
Claims (5)
1.一种转录水平基因表达调控的方法，其特征在于，其包括步骤：
首先，在E-cadherin启动子区域筛选并确认目标基因的作用靶点A，所述靶点A的序列为CUAGCAGCCUAAUUUUUUG；
然后，设计针对该作用靶点A的特异小双链RNA，所述小双链RNA的正义链为CAAAAAAUUAGGCUGCUAG[dT][dT]，并且所述小双链RNA的反义链为CUAGCAGCCUAAUUUUUUG[dT][dT]；并且将所述小双链RNA转染进入细胞内；
最后，通过PCR和Western blotting方法检测E-cadherin基因的表达变化以及观察作用细胞所发生的功能性以及形态学的改变。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小双链RNA是通过转染试剂、慢病毒、或者逆转录病毒感染系统转导进细胞内的。
3.按权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转染试剂是脂质体转染试剂。
4.按权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小双链RNA进入细胞内是通过Exportin-5细胞内在转输体系进入细胞核内的。
5.小双链RNA，其正义链为CAAAAAAUUAGGCUGCUAG[dT][dT]，并且其反义链为CUAGCAGCCUAAUUUUUUG[dT][dT]。
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| 第55页第四段C可视化技术 |
| 第58页实施例1 |
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Legal Events
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Granted publication date: 20130220 Termination date: 20170827 |