CN102370646B

CN102370646B - 一种保护心脏的物质

Info

Publication number: CN102370646B
Application number: CN 201010248982
Authority: CN
Inventors: 杨黄恬; 张彩梅; 高崚
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2010-08-10
Filing date: 2010-08-10
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2030-08-10
Also published as: CN102370646A

Abstract

本发明涉及一种保护心肌的物质。本发明提出了小檗胺在心脏疾病中新的用途。小檗胺对动物心脏具有正性肌力作用，给予小檗胺可以增强正常心肌收缩力。此外，小檗胺在心肌缺血后复灌早期给药，可以减轻心肌缺血/再灌注损伤，改善缺血后心肌收缩功能，从而可用于制备心功能不全(心力衰竭疾病)的治疗药物。

Description

一种保护心脏的物质

技术领域

本发明属于医药学领域；更具体地，本发明涉及一种保护心脏的物质。

背景技术

小檗胺(berbamine，BM)系自小檗科植物提出的双苄基异喹啉类生物碱，其药理作用目前已经有一定的研究，心血管药理的研究主要集中在抗心律失常和减轻缺血复灌心肌损伤的研究，而对于其增强心肌收缩性的作用目前尚未见文献报道。小檗胺目前已经作为升高血液白细胞的药物应用于临床，长期应用安全有效。

心力衰竭(心衰)是指心肌收缩功能严重减弱，心脏输出血量减少，不足以满足机体的需要量，由此而引起一系列的症状和体征。急性心功能不全见于慢性心力衰竭的失代偿、心肌梗死后的收缩功能不全和心脏手术后的心肌顿抑。急性心功能不全是心脏疾病死亡的主要原因，应用正性肌力药物增强心肌收缩功能是目前临床挽救频死期病人和改善心脏泵血功能的重要策略。

心肌细胞的收缩是粗细肌丝相互滑行的过程，肌丝的滑行由胞内Ca²⁺的周期性变化所调控。当心肌细胞兴奋、膜电位去极化时，激活膜上电位依赖性的L型Ca²⁺通道，细胞外Ca²⁺内流，诱发肌浆网(SR)Ca²⁺释放，引起胞内Ca²⁺瞬变，升高的Ca²⁺结合到肌丝调节蛋白，启动粗细肌丝横桥循环，表现为粗细肌丝相互滑行，细胞的收缩。因此心肌细胞收缩性取决于胞浆游离Ca²⁺的水平和肌丝对Ca²⁺的敏感性。

心肌收缩的调控通过调节胞内Ca²⁺水平，或调节肌丝对Ca²⁺的敏感性，或对二者均有调节作用。调控心肌收缩主要的蛋白激酶有：1)蛋白激酶A(Proteinkinase A，PKA)的活化，主要通过调节胞内钙水平来调控心肌收缩。2)蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)的活化，激活Na⁺/H⁺交换体，使胞浆PH和Na⁺升高，PH升高使肌丝对Ca²⁺的敏感性增加；Na⁺升高激活Na⁺/Ca²⁺交换体反向转运，胞内Ca²⁺升高；通过磷酸化肌丝调节蛋白而调控肌丝功能。3)肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase，MLCK)的活化，MLC2v磷酸化水平增加，增加肌丝对Ca²⁺的敏感性。4)RhoA/Rho激酶的活化，通过磷酸化肌球蛋白磷酸酶的亚单位MYPT2而抑制磷酸酶活性，维持MLC2v的磷酸状态。

传统的正性肌力药物儿茶酚胺类、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂和洋地黄类药物是临床上常用来治疗心力衰竭的药物。这些药物都是通过增加胞内Ca²⁺水平而增强心肌细胞的收缩性。然而胞内Ca²⁺水平的增加在增强心肌细胞收缩的同时会引起一系列钙超载的副作用，细胞为维持Ca²⁺稳态能量消耗增加；Ca²⁺的升高，心律失常的发生率增加，因而增加了临床的骤死率。因此，本领域有必要开发新的正性肌力药物。

心肌缺血是由于冠状动脉严重供血不足而导致的心肌缺血、缺氧。保护缺血心肌损伤最有效的办法就是最短时间内恢复冠脉灌流，如药物溶栓、介入治疗和手术搭桥等，但是再灌注本身又会进一步加重缺血心肌的损伤，称之为再灌注损伤。缺血/再灌注损伤表现为心肌梗死，急性心脏功能不全和严重的心律失常。如何减轻缺血/再灌注造成的损伤成为心血管研究新的重要课题。

Calpains为Ca²⁺依赖的半光氨酸蛋白水解酶。缺血/复灌时，胞内Ca²⁺水平升高，激活Ca²⁺依赖性的蛋白水解酶Calpains，Calpains的活化会导致细胞内一系列Calpains敏感的底物蛋白降解，包括细胞骨架蛋白(如desmin，a-actinin)、肌丝调控蛋白(如肌钙蛋白I和T)和信号通路蛋白(如PKC)，继而导致细胞功能障碍及坏死。文献报道，应用Calpains抑制剂可减轻缺血再灌注造成的损伤。

目前研究报道小檗胺预处理能改善缺血后心脏功能，降低心律失常的发生率，减少心肌梗死面积。小檗胺在发病前给药可以减轻缺血再灌注心肌的损伤作用(预防)，但是从中无法推断出小檗胺在心肌缺血发生后复灌初给药是否也能减轻缺血再灌注心肌的损伤。由于疾病的发生具有不可预见性，心肌缺血后给药更具有临床操作性和应用价值，因此很有必要确定小檗胺在心肌缺血后复灌初给药是否有作用，以期开发心肌缺血后减轻心肌损伤的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供小檗胺或其药学上可接受的盐在制备治疗心力衰竭，改善心肌收缩药物中的应用。本发明的新型的正性肌力药物不依赖于增加胞内钙水平而增强心肌收缩力的药物，也就是通过提高肌丝对钙的敏感性而增强心肌收缩，从而避免了由于胞浆钙水平升高而引起的副作用。

本发明的目的还在于提供小檗胺或其药学上可接受的盐在制备减轻心肌缺血损伤的组合物中的应用。本发明中小檗胺在心肌缺血后复灌初给药能够改善缺血后心肌收缩功能。因为疾病的发生具有不可预见性，缺血前给药只能作为预防性用药，缺血后复灌早期给药临床应用价值更高。

在本发明的第一方面，提供小檗胺或其药学上可接受的盐的用途，用于制备促进心肌收缩的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物含有小剂量范围的小檗胺。

在另一优选例中，所述的组合物通过增加肌丝对钙的敏感性促进心肌收缩。该作用不影响胞内游离钙水平，从而避免了传统强心药物由于胞内钙升高引起的副作用。

在另一优选例中，所述的组合物增加心肌的舒张速率，从而避免了普通钙敏感剂引起的心肌舒张不全。

在另一优选例中，所述的小檗胺的药学上可接受的盐是小檗胺的盐酸盐。

在另一优选例中，所述的组合物防治心力衰竭。

在本发明的另一方面，提供小檗胺或其药学上可接受的盐的用途，用于制备减轻心肌缺血/复灌损伤的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物含有小剂量范围的小檗胺。

在另一优选例中，所述的组合物为缺血后复灌早期(复灌初1-5分钟)给药。

在另一优选例中，所述的减轻心肌缺血/复灌损伤为改善缺血后心脏功能。

在另一优选例中，所述的组合物通过抑制Calpains活性减轻缺血后再灌注损伤。

在本发明的另一方面，提供一种促进心肌收缩或减轻心肌缺血/再灌注损伤的方法，所述方法包括：给予需要治疗的对象有效量的小檗胺或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，当用于减轻心肌缺血/再灌注损伤时，在心肌缺血后复灌早期给药。

在另一优选例中，所述的有效量是小剂量。

在另一优选例中，所述的有效量对应于人的用量是血药浓度为3.2-16nM(对应于大鼠为20-100nM)；较佳地是4.8nM(对应于大鼠为30nm)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、BM对离体心脏左室功能影响的代表图。BM：小檗胺；LVP：左室压。

A：小剂量(约30nM)增强心肌收缩；

B：大剂量(大于或等于1μM)抑制心肌收缩。

图2、不同剂量BM对离体心脏左室功能指标影响(相对于给药前的百分比)的分析图。

A：Heart Rate(心率)；

B：LVDP(左室发展压)；

C：+dP/dt max(左心室等容期压力上升的最大速率)；

D：-dP/dt max(左心室等容期压力下降的最大速率)。

其中，n＝6，means±SE；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs.对照组。

图3、不同剂量BM对大鼠成体心肌细胞收缩和钙瞬变的影响。

A：收缩和钙瞬变的代表图；

B：收缩和钙瞬变分析图；

其中，n＝10个细胞，means±SE；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs.对照组。

图4、BM对细胞外液高钙条件下心肌细胞收缩和钙瞬变的影响。n＝10个细胞，means±SE；^**P＜0.01vs.基础状态细胞收缩；^##P＜0.01vs.基础状态钙瞬变；^$P＜0.05vs.4mM Ca²⁺细胞收缩。

图5、εV1-2和ML-9对BM诱导的大鼠离体心脏收缩功能增强的影响。εV1-2：PKCε特异性的抑制剂；ML-9：MLCK特异性的抑制剂。n＝4，means±SE；^**P＜0.01vs.对照组；^##P＜0.01vs.BM处理组。

图6、εV1-2对BM诱导的大鼠成体心肌细胞收缩增加的影响。εV1-2：PKCε特异性的抑制剂；Baseline：给药前。

A：对细胞收缩的影响；

B：对钙瞬变的影响；

C：对+dL/dt max的影响；

D：对+d[Ca²⁺]/dt max的影响；

E：对-dL/dt max的影响；

F：对-d[Ca²⁺]/dt max的影响；

其中，n＝10个细胞，means±SE；^**P＜0.01vs.对照组；^##P＜0.01vs.BM处理组。

图7、BM处理对PKCε由胞浆向膜转位的影响。

A：试验对象为成体大鼠心肌细胞；

B：试验对象为大鼠离体心脏。

其中，n＝3，means±SE；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs.对照组；^#P＜0.01vs.BM处理组。

图8、BM处理对MYPT磷酸化(p-MYPT)水平的影响。其中，n＝3，means±SE。

图9、BM缺血后处理对大鼠离体心脏缺血/复灌后左室心肌收缩功能的影响。BM：小檗胺；LVDP：左室发展压；I：缺血；R：复灌；PoC：Postconditioning(缺血后处理)。

A：IR期收缩功能变化的代表图；

B：IR后收缩功能变化的分析图。

其中，n＝4，means±SE；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs.对照组。

图10、BM缺血后处理明显减轻缺血/复灌引起的PKCε蛋白降低。PoC：缺血后处理。n＝3，means±SE；^*P＜0.05vs.对照组。

图11、BM缺血后处理明显抑制大鼠离体心脏缺血/复灌后心肌Calpains蛋白活性。PoC：缺血后处理。n＝3，means±SE；^*P＜0.05，vs.未缺血组；^#P＜0.05，vs.对照组。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，出乎意料地发现了小檗胺对动物心脏具有正性肌力作用，从而可用于心力衰竭的治疗。并且还发现小檗胺可用于缺血后复灌初给药以减轻再灌注对心肌造成的损伤，改善缺血后心肌收缩功能。

小檗胺

小檗胺(berbamine，BM)系自小檗科植物提取的双苄基异喹啉类生物碱，其结构式为：

在本发明中，所述的“小檗胺”可以是纯净形式存在的式I所示的化合物，或纯度大于85％的式I所示的化合物，也可以是含有1-99wt％，更佳地5-99wt％的小檗胺的小檗科植物的提取物。该术语还包括小檗胺的浓度大于1％的混合物。

小檗胺的制备方法可采用本领域现有技术人员所了解的方法，比如化学合成的方法，或从植物中提取的方法。所述的小檗胺从小檗科、防己科或毛莨科的伯乐小檗、小檗属、十大功劳属(Mahonia)、蜜花藤属植物中提取。

在本发明中，还包括小檗胺的药学上可接受的盐或小檗胺的衍生物。本发明还包括上述化合物的药学上可接受的盐、水合物或前体，只要它们也具有促进心肌收缩或治疗心力衰竭的作用。所述的“药学上可接受的盐”是指一类化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。较佳地，所述小檗胺的药学上可接受的盐是小檗胺的盐酸盐，其结构式如下：

所述的“前体”指当用适当的方法服用后，该前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成具有结构式(I)或(II)所示结构的一种化合物，或结构式(I)或(II)所示结构的一个化合物所组成的盐或溶液。

本发明还包括小檗胺的异构体、外消旋体，只要它们也具有促进心肌收缩或治疗心力衰竭的作用。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。

可将小檗胺的植物提取物直接给药；或者可将小檗胺的植物提取物进行提纯和加工，制成纯净形式的小檗胺、或各种形式的小檗胺的制剂后，用于给药。

促进心肌收缩

在本发明的实施例中，本发明人证明：小剂量范围的BM对大鼠离体心脏具有正性肌力作用，该作用不依赖于胞内钙水平的升高；PKCε的特异性抑制剂可以减弱BM的正性肌力作用。总之，小剂量BM能够诱导非钙依赖的心肌收缩力增强。

正性肌力作用是增强心肌的收缩功能，相反负心肌力作用是抑制心肌的收缩功能，两者是完全相反的两种药理作用。正性肌力药物可以用于临床上心力衰竭(心肌收缩力显著降低)的病人，而对心力衰竭的病人，如果用负心肌力药物，无疑是雪上加霜。

因此，本发明提供了小檗胺或其药学上可接受的盐的用途，用于制备促进心肌收缩的组合物。

小檗胺或其药学上可接受的盐通过增加肌丝对钙的敏感性而发挥正性肌力作用，其还能够增加心肌的舒张速率。

由于心力衰竭表现为心肌收缩功能的严重减弱，因此所述的小檗胺或其药学上可接受的盐可用于心力衰竭的治疗。

减轻心肌缺血/复灌损伤

在本发明的实施例中，本发明人证明：小檗胺缺血后处理能够改善缺血/复灌(IR)后心肌收缩功能，抑制IR心肌Calpains活性，保护PKCε蛋白降解。BM后处理与预处理具有同等的缺血复灌心肌保护效应，其保护作用是通过抑制IR心肌Calpains的活性而介导的。

可见，小檗胺或其药学上可接受的盐可发挥保护心肌的作用，用于缺血后药物溶栓、介入治疗或搭桥手术时，减轻再灌注对心肌造成的损伤，改善缺血后心肌收缩功能。

因此，本发明提供了小檗胺或其药学上可接受的盐的用途，用于制备缺血再灌注心肌保护的药物。较佳地，当用于人类时，所述的小檗胺的血药浓度为3.2-16nM。

因为疾病的发生具有不可预见性，缺血前给药只能作为预防性用药。缺血后复灌初给药可用于心肌缺血后药物溶栓、介入治疗或搭桥手术时给药，减轻再灌注对心肌造成的损伤，临床应用价值更高。

组合物

本发明人还发现了小檗胺促进心肌收缩作用的合适的剂量范围。因此，可基于该剂量范围来制备含有有效量成分的药物组合物。更佳地，所述的药物组合物可制备成一次给药量，从而方便于患者用药。

如本文所用，术语“本发明的组合物”包括药物组合物和饮食补充剂(如保健品组合物)，只要它们含有小檗胺作为促进心肌收缩的活性成分。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的小檗胺或其生理上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。

本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、或气雾剂。其中小檗胺可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。

尽管本申请以大鼠作为试验对象，当用于人时，可以通过本领域经典的换算公式来进行换算。换算方法可参考《动物实验技术》中“人与动物及各类动物间药物剂量的换算方法”(请提供出版社，作者，页码)所描述的。通常，人的用药浓度是大鼠的剂量×0.16。

通常，当所述化合物或其药学上可接受的盐及其组合物用于上述用途时，它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约25-90％，通常约为5-60％(重量)的活性成分。

所述化合物或其药学上可接受的盐及其组合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下等途径给药；优选的是口服给药。

含有合适含量小檗胺的组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。

小檗胺或其药学上可接受的盐及其组合物还可与其它活性成分或药物联合给药。

当两种或两种以上的药物联合给药时，一般具有优于两种药物分别单独给药的效果。

本发明还提供了一种促进心肌收缩或减轻心肌缺血损伤的方法，所述方法包括：给予需要治疗的对象有效量的小檗胺或其药学上可接受的盐。较佳地，当治疗心肌缺血损伤时，在心肌缺血后再灌注早期给药。

较佳地，所述的有效量对应于人的用量是血药浓度为3.2-16nM；较佳地是4.8nM。所述的有效量对应于大鼠的用量是血药浓度为20-100nM；较佳地是30nM。

本发明的主要优点在于：

(1)出乎意料地发现了小檗胺对动物心脏具有正性肌力作用，克服了现有技术的偏见。

(2)首次提出小檗胺可在缺血后给药且发挥药效。缺血后复灌时给药，具有可操作性和临床应用价值，这一点显著不同于缺血前给药。

(3)目前小檗胺作为升高血液白细胞的药物(升白胺)已经应用于临床，长期应用安全有效。开发小檗胺新的临床用途为“老药新用”，具有省时省力、安全可靠等优势，使小檗胺成为有前途的强心药物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另外说明，以下实施例中涉及的小檗胺均为小檗胺的盐酸盐，即式(II)化合物，其纯度为(99.999％)。在给药时，将小檗胺的盐酸盐溶解于双蒸水中。

实施例1、小檗胺对心肌收缩性的影响

1、材料和方法

动物

雄性Sprague-Dawlay(SD)大鼠，体重250-300g，购自上海斯莱克实验动物中心。

药物

盐酸小檗胺购自Sigma公司，货号547190，分子量681.65；纯度99.99％，溶解于37℃的双蒸水。

PKCεV1-2，PKCε特异性的抑制剂，分子量947.1，购自Anaspec，货号62186，纯度＞98％，溶解于37℃双蒸水。

ML-9，MLCK特异性的抑制剂，分子量361.3，购自BIOMOL，货号E1-153，纯度99％，溶解于乙醇∶双蒸水(1∶1)。

离体心脏灌流

灌流液

改良Krebs-Henseleit(K-H)液(mM)：NaCl 118；KCl 4.7；NaHCO₃ 2.5；MgSO₄ 1.2；CaCl₂ 2.55；KH₂PO₄ 1.2；葡萄糖5.0；EDTA 0.5。超纯水配制，以95％(v/v)O₂，5％(v/v)CO₂混合气体充气饱和40分钟，pH 7.4。

恒流Langendorff灌流装置

此系统主要由管道系统、恒温系统、氧合器和恒流泵组成。氧合器用于灌流液的供氧，恒流泵用于控制冠脉流量，本实验中冠脉流量恒定于20ml/min，恒温系统则使灌流液保持恒定温度，所用灌流液温度为37.5℃。

实验操作

雄性SD大鼠，水合氯醛(400mg.Kg^-1)腹腔注射麻醉。仰位固定，开胸，剪开心包，迅速取出心脏置于冰冷(4℃)K-H液中，分离主动脉，挤压心脏排出心脏内剩余血液，将充满灌流液的套管插入主动脉，结扎固定；将主动脉套管接于Langendorff灌流装置。在左心房侧壁剪一小口，将小乳胶水囊通过房室瓣插入左心室。和乳胶水囊相连的导管通过三通管连接压力转换器。压力换能器信号通过桥式放大器(Maclab Bridge Amp，澳大利亚)输入多导记录系统(Powerlab/8s，澳大利亚)，通过计算机运行chart软件完成信号的实时采集和处理。记录的心功能参数包括：左心室峰压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室发展压(LVDP)、左心室等容期压力最大变化速率(±dP/dtmax)和心率(HR)。

实验分组及实验方案

离体心脏经20分钟的平衡灌流稳定后，进行实验。

1)不同剂量小檗胺对离体心脏收缩功能的影响：离体心脏经20分钟的平衡灌流稳定后，实验组给予小檗胺终浓度10nM～1μM加入K-H灌流液，灌流5分钟。在整个实验过程中连续记录各项心脏功能指标。

2)探讨参与小檗胺正性肌力作用的信号通路，实验分组如下：

对照组：

正常对照组：离体心脏平衡灌流30分钟。

MLCK抑制剂组：离体心脏平衡灌流20分钟稳定后，ML-9终浓度15μM灌流7分钟。

PKCε抑制剂组：离体心脏平衡灌流20分钟稳定后，PKCεV1-2终浓度10μM灌流5分钟，洗脱2分钟。

BM组：

单独BM组：离体心脏平衡灌流20分钟稳定后，BM终浓度30nM灌流2分钟。

MLCK抑制剂组：离体心脏平衡灌流20分钟稳定后，在BM给药前5分钟开始ML-9终浓度15μM灌流，并在BM给药期间持续灌流。

PKCε抑制剂组：离体心脏平衡灌流20分钟稳定后，在BM给药前PKCεV1-2终浓度10μM灌流5分钟。

数据分析：各项心脏功能指标用Chart 4软件分析。

同步纪录心肌细胞收缩及Ca²⁺瞬变

心肌细胞的分离

无Ca²⁺HEPES液(mM)：HEPES 5；MgCl₂·6H₂O 1；NaCl 135；KCl 5.4；NaH2PO4 0.33；葡萄糖10，NaOH调PH至7.4，100％ O₂充气40分钟以上。

通过酶解方法得到单个大鼠左心室肌细胞。大鼠经腹腔注射水合氯醛(400mg.kg^-1)麻醉，快速开胸取出心脏，在冰冷4℃无Ca²⁺台氏液中剪除周围结缔组织及心包膜，将心脏置于Langendorff灌流装置上，经主动脉进行恒压逆行灌流。灌流液均用100％O₂饱和，灌流系统温度维持于37℃。首先用无Ca²⁺HEPES液灌流心脏5分钟，然后改用含50μM Ca²⁺、0.01％(w/v)胶原酶和0.06％(w/v)蛋白酶的HEPES液反复灌流，对心脏组织中的胶原进行消化约14～16分钟左右，直到流出液变粘稠，心脏比原来大30-50％，呈粉红半透明海绵状时，取下心脏，剪除心房及右心室。在含100μM Ca²⁺的上述消化酶液中，剪碎左心室肌，70转/分钟摇动孵育10分钟，轻轻吹打几次后，将单细胞悬液静置5分钟，去除上清，沉降的细胞外Ca²⁺浓度逐步提高到1.0mM，可得到80％以上杆状、横纹清晰的耐Ca²⁺细胞，室温下保存待用。

心肌细胞灌流

分离的心肌细胞滴于特定细胞灌流小室中，以正常细胞外液：即含NaHCO₃的正常Tyrode’s液(mM)：NaCl 129，KCl 4，NaHCO₃ 20，NaH₂PO₄ 0.9，MgSO₄0.5，CaCl₂ 1.8，葡萄糖10，pH7.4，持续通入95％O₂/5％ CO₂混合气(预先充气40分钟以上)，灌流10分钟后进行后续实验。

实验方案

为了观察不同剂量BM对心肌细胞收缩和胞浆钙瞬变的影响，心肌细胞平衡灌流10分钟后，BM 0.1nM～300nM从低浓度到高浓度梯度灌流心肌细胞，同步记录心肌细胞收缩和钙瞬变。在细胞收缩幅度的增加达到平台期后，切换灌流液为含更高剂量的BM。

同步纪录心肌细胞收缩及Ca²⁺瞬变

染料负载0.5ml心肌细胞悬液中加入Ca²⁺荧光指示剂Fura-2，AM(F-1221，Molecular Probe，终浓度为5μmol.L^-1)，在30℃下避光孵育15分钟后，再用不含指示剂的Tyrode’s液洗涤细胞3次，每次10分钟。

Fura-2荧光信号的检测和记录将载有负载了Fura-2的心肌细胞灌流槽放置于倒置显微镜(Olympus IX-70，Japan)的光路上，灌流槽温度控制在25℃。Fura-2和Ca²⁺结合，在340nm的激发光下产生较强的荧光，而在380nm激发光下则导致荧光减弱，通过计算340nm/380nm的荧光比值来检测细胞内Ca²⁺浓度。为记录细胞长度变化而又避免荧光发生光漂白，实验全过程均在微弱的红光下进行，每5分钟进行一次数据采集，每次约15秒。通过灌流小室底部两侧镶嵌的一对铂电极，给予细胞以频率为0.5Hz，波宽为4ms，波幅为20v方波电脉冲刺激。细胞形态由电视摄像机获得并在显示器显现，通过可视化动缘探测系统(video-edge detection system，IonOptix Co.，USA)记录细胞长度在收缩和舒张过程中的实时变化。

数据分析：在对Ca²⁺瞬变和收缩曲线的分析中，反映下降速率和反映上升速率的V_max以及其幅度都利用IonWizard 4.4软件(IonOptix，Milton，USA)取得。

统计学分析

所有统计数据都用均数±标准误(Means±SE)表示。数据采用ANOVA分析，或配对T检验，或单因素T检验进行统计学分析，P＜0.05时为有统计学差异。

2.结果

(1)小檗胺对大鼠离体心脏功能的影响

大鼠离体心脏灌流20分钟稳定后，给予含BM浓度10nM至1μM的灌流液灌流5分钟。实验结果显示，BM的作用具有剂量依赖性，小剂量(约30nM)增强心肌收缩(图1A)，大剂量(大于或等于1μM)抑制心肌收缩(图1B)。BM的正性肌力作用在30nM时作用最显著，LVDP为给药前的127±3.1％(P＜0.01)，-dP/dt max为给药前的132±3.9％(P＜0.01)，而+dP/dt max也有增加，但增加的幅度小于前二者，+dP/dtmax为给药前的116±6.5％(P＜0.05，图2B-D)。当剂量小于或大于30nM时，其作用显著减弱(图2B-D)。当剂量进一步增加达到或大于1μM时，BM表现为对心脏收缩功能先增强后抑制(图1B)。由图2A可见，BM的正性肌力作用不伴有心率的改变。以上结果提示BM小剂量处理能够增强心肌收缩力，该作用为非频率依赖性的收缩力增加。

(2)小檗胺增加大鼠左心室细胞的收缩幅度不伴有胞内Ca²⁺瞬变的变化

大部分强心药物都是通过增加胞内Ca²⁺水平而增加心肌收缩，本发明人同步监测了心肌细胞的收缩和Ca²⁺瞬变。实验结果显示，BM 0.1nM～100nM.剂量依赖性增加细胞收缩幅度，但对Ca²⁺瞬变无明显影响。心肌细胞对BM的收缩反应性在100nM时达到最大值，LDVP增加71％(图3A，B)。当BM剂量进一步增加达到或大于300nM时，细胞收缩增加的同时伴随着舒张不全，并且部分细胞出现不规则的Ca²⁺瞬变和收缩紊乱((图2A)。由图4可见，细胞外Ca²⁺浓度由1.8mM升高到4.0mM时，细胞Ca²⁺瞬变和收缩幅度增加，BM处理能进一步增加高外Ca²⁺条件下细胞的收缩幅度(P＜0.05)，但不影响Ca²⁺瞬变。表明BM是通过改善肌丝钙敏感性而发挥正性肌力作用。

(3)小檗胺的正性肌力作用依赖于PKCε信号通路的活化

为了探讨参与BM正性肌力作用的信号通路，本发明人应用了MLCK特异性的抑制剂ML-9和PKCε特异性抑制剂εV1-2。本实验中发现ML-950μM对心肌基础收缩已经具有显著的抑制作用，给药后LVDP抑制很快达80％以上，故本发明人选用了较小的剂量15μM，ML-915μM对心肌基础收缩也有抑制作用，但给药后4分钟稳定，LVDP为给药前的90±2.5％(P＞0.05)，而ML-915μM对BM的正性肌力作用没有明显的影响(LVDP为给药前的130±5.8％vs.135±6.5％，P＞0.05，图5)。提示MLCK未参与BM的正性肌力作用。

εV1-210μM单独应用能够轻度增加离体心脏的基础收缩，LVDP增加约9％(P＞0.05)。但εV1-2预处理可以减弱BM的正性肌力作用(LVDP为给药前的116±3％vs.135±6.5％，P＝0.01，图5)，该作用在大鼠成体心肌细胞得到了进一步证实(图6)。BM处理时间依赖性增加PKCε由胞浆组分向膜组分的转位(P＜0.01)，εV1-2预处理能够取消BM引起的PKCε转位(P＜0.05，图7)。以上结果提示，PKCε活化介导了BM的正性肌力作用。

MYPT2(myosin-binding phosphatase targeting subunit 2，MYPT2)为磷酸酶1(PP1)肌球蛋白结合的亚单位，其作用是将PP1定位于肌球蛋白，增加PP1在肌球蛋白的磷酸酶活性，使MLC2v脱磷酸化。MYPT2的该作用受其磷酸化状态调控，磷酸化的MYPT2脱离PP1，降低PP1在肌球蛋白的磷酸酶活性，而MYPT2的非磷酸化状态作用相反。实验结果显示，BM处理不影响MYPT2的磷酸化水平(图8)。提示BM处理不影响肌球蛋白磷酸酶活性。

3.讨论和结论

BM对心肌收缩功能的研究，早在90年代初，杨宝峰的实验室报道[杨宝峰，李柏，武喜.盐酸小檗胺对豚鼠离体工作心脏的作用.中国药理学报7[1]，67-69.1991]BM可以剂量依赖性的抑制豚鼠离体心脏左室收缩功能，在3μM时对左室的收缩及舒张功能均有显著抑制作用，但在1μM时对左室绝大多数心功能指标无明显作用，其机制不清楚。

为了进一步研究不同剂量BM对心肌收缩功能的影响及其机制，本发明人分别利用离体心脏Langendorff灌流模型和左室心肌细胞模型对其进行研究。本发明人的研究意外地发现：1)小剂量的BM对左室心脏功能呈现正性肌力作用，随着剂量的增加逐渐出现负性肌力作用；2)BM的正性肌力作用不依赖于胞浆钙的升高；3)BM对肌丝功能的调节不依赖MLCK和ROCK的活化，而依赖于PKCε信号通路的活化。BM的正性肌力作用目前尚未见有报道。

(1)小檗胺为新型的正性肌力药物

如同以往文献报道，本发明人的实验证实了BM对离体心脏收缩功能的抑制作用，但在实验中BM 1μM就表现出对心肌功能明显的抑制作用，不同于文献报道1μM时对左室绝大多数心功能指标无明显作用。有趣的是，本发明人的实验发现BM在小剂量范围对大鼠离体心脏左心室具有明显的正性肌力作用，这是首次发现BM具有增强心肌收缩的作用。BM的正性肌力作用不伴有心率的增加，提示该作用不是频率依赖性的收缩增强。在本发明人的实验中，离体心脏的灌流是恒流灌流，这说明BM的正性肌力作用是不依赖于冠脉流量的改变。为证明BM的正性肌力作用是否通过升高胞内Ca²⁺，本发明人同步记录了心肌细胞收缩和胞浆Ca²⁺瞬变，本发明人的实验发现BM 0.1nM～100nM剂量依赖性增加细胞收缩幅度，但不伴有Ca²⁺瞬变的增加，而且BM能进一步增加高外Ca²⁺条件下细胞收缩的幅度，而不影响Ca²⁺瞬变，这提示BM的正性肌力作用是不依赖于胞内Ca²⁺的增加，是通过增加肌丝对Ca²⁺的敏感性而改善心肌收缩，从而避免了传统型正性肌力药物由于胞内Ca²⁺升高而引起的一系列副作用。尤其是机体酸中毒，心肌顿抑等条件下，心肌细胞肌丝对Ca²⁺的敏感性降低，BM可改善肌丝对Ca²⁺的敏感性而增强心肌收缩。

作为Ca²⁺敏感剂，潜在的副作用就是影响心肌的舒张功能，继而会影响到舒张期心室的充盈和冠脉的血流量。如图1A所示，本发明人的实验发现BM在增加心肌收缩的同时，并不伴有心肌的舒张不全(基线的抬高)，而且左室等容舒张期压力下降的最大速率(-dP/dt max)增加的幅度与左室发展压(LVDP)增加的幅度相一致(图2B，D)，提示BM的正性肌力作用伴随有心肌的舒张速率增加，其机制目前尚不清楚。

另外，细胞实验证明当BM的剂量达到或大于300nM时，部分细胞会出现不规则的Ca²⁺瞬变和细胞收缩紊乱(图3A)，推测可能由于大剂量BM引起细胞Ca²⁺调控失稳态，继而导致细胞收缩功能紊乱，这可能与BM大剂量在离体心脏表现的负性肌力作用有关。

(2)PKCε信号通路介导了BM的正性肌力作用

BM的正性肌力作用不依赖于胞浆Ca²⁺的升高，而是通过增加肌丝Ca²⁺敏感性而实现。为了探讨参与BM增加肌丝钙敏感性的信号通路，本发明人应用了信号通路蛋白激酶的抑制剂等工具药，在离体心脏模型观察蛋白激酶抑制剂对BM正性肌力作用的影响。

MLC2v为重要的肌丝调控蛋白，其磷酸化增加肌丝对Ca²⁺敏感性和横桥循环速率。MLC2v的磷酸化水平取决于蛋白激酶MLCK和PKC与肌球蛋白磷酸酶(PP1)间的平衡。本发明人应用MLCK特异性的抑制剂ML-9不能降低BM的正性肌力作用，说明BM调节肌丝功能不依赖于MLCK的活化。

MYPT2为肌球蛋白磷酸酶PP1的亚单位，调控PP1在肌球蛋白的磷酸酶活性。ROCK(Rho kinase，ROCK)通过磷酸化MYPT2(Thr646)，抑制PP1在肌球蛋白的磷酸酶活性，维持MLC2v的磷酸化水平，增加肌丝对Ca²⁺的敏感性。本发明人证明BM处理不影响MYPT2的磷酸化水平，提示ROCK通路未参与BM的正性肌力作用。

PKC即蛋白激酶C，为丝/苏氨酸激酶，可以被某些脂类或钙激活。在静息状态，PKC主要分布在胞浆，当被活化时，PKC便由胞浆转位至特定的部位，磷酸化底物蛋白，调节其活性。

文献报道，心肌PKC活化或过表达时心肌收缩功能增强，但也有相反的报道。PKCε为新型非钙依赖的亚型，在成体的大鼠心肌细胞高表达。PKCε介导许多刺激因素引起的正性肌力作用。为证明PKCε活化在BM正性肌力中的作用，本发明人应用PKCε特异性的抑制肽PKCεV1-2。实验结果显示，应用PKCε特异性的抑制剂V1-2能减弱BM诱导的离体心脏收缩力增强。并且BM处理能引起PKCε由胞浆向膜的转位，PKCεV1-2预处理取消BM引起的PKCε转位。与本发明人实验结果相一致的是，Endoh等多个实验室的研究同样证明PKCε活化介导的非Ca²⁺依赖性收缩增强伴有PKCε由胞浆组分向膜组分的转位。以上结果提示PKCε的活化介导了BM的正性肌力作用。

总之，本发明人的研究证明了小剂量的BM处理能够增强大鼠离体心脏收缩功能，当剂量进一步增大时，逐渐出现负性肌力作用；BM的正性肌力作用不依赖于冠脉流量和心率的增加及胞浆Ca²⁺瞬变的升高；PKCε而非MLCK和ROCK的活化参与了BM的正性肌力作用。

实施例2、小檗胺缺血后处理对缺血/复灌心肌的保护及其机制

BM在心肌缺血后复灌初给药是否也具有保护作用，目前尚未见文献报道。

本实施例的目标：研究BM后处理对缺血/复灌心肌的保护作用，并着重阐明Calpains活性的调控在BM介导心肌保护中的作用。

1.材料和方法

离体心脏灌流

离体心脏Langendorff灌流：除了恒压灌流外，其它同实施例1中所述。

离体心脏缺血/复灌模型：离体心脏经过20分钟的平衡灌流后，给予30分钟的全心缺血，即停止灌流，恢复灌流45分钟。在整个过程中，连续记录各项心功能指标。

实验分组

正常平衡灌流组：离体心脏用K-H液正常灌流1小时30分钟

BM平衡灌流组：离体心脏用K-H液正常灌流45分钟，BM灌流5分钟

后继续用正常K-H液灌流40分钟。

缺血/复灌组：离体心脏平衡灌流20分钟后，缺血30分钟/复灌45分钟。

缺血/复灌+BM组：复灌初5分钟给予BM 20nM或100nM灌流，其余同缺血/复灌组。

Western blot分析

心肌组织蛋白的提取：

(1)从-70℃取出心肌组织，加入10倍体积预冷的匀浆缓冲液，先用小剪刀剪碎心肌组织块，然后用电动匀浆器匀浆10000rpm，持续10s，间隔10s，重复三次。

(2)匀浆液在冰上裂解30分钟后，4℃，10000g离心15分钟，离心后的上清做为心肌蛋白，分装，-70℃保存待用。

蛋白浓度的测定：BCA法(BCA试剂盒购自Pierce公司)。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

提取的组织蛋白经90℃变性后，10％SDS-PAGE胶电泳分离，电转膜至PVDF膜(Milipore产品)。

抗体标记

将转有蛋白的PVDF膜用5％脱脂牛奶封闭非特异性蛋白结合位点；用封闭液稀释的anti-PKCε(1∶8000，Sigma)的一抗孵育液，4℃过夜。以TBST缓冲液于摇床上洗膜10min×3次；将PVDF膜用含有辣根过氧化酶酶标记的二抗(anti-rabbit 1∶8000)的封闭液室温下摇晃孵育90-120min，再以TBST洗膜10min×3次。

显色成像

利用辣根过氧化酶显色剂的化学荧光方法使X-感光胶片成像来检测相关蛋白的位置和含量。用扫描仪将图像输入计算机，再用蛋白条带分析软件Quantity ony4.4.0，BIO-RAD，USA来对相关蛋白进行定量。

Calpains活性的测定

用InnoZyme^TM Calpain 1/2 Activity Assay Kit(Calbiochem产品)测定心肌组织蛋白样本中Calpains的活性。

原理：Calpains的底物分子(DABCYL)-TPLK|SPPPSPR-(EDANS)中的K-S为Calpains的识别位点，活化的Calpains能够使K-S处的酰胺键断链，荧光基团(EDANS)脱离抑制性分子(DABCYL)而被释放，荧光增加。荧光的激发波为320nm，发射波为480±20nm。

心肌组织蛋白提取液的准备：

组织匀浆缓冲液：Tris-HCl(pH 7.6)20mM，NaCl 150mM，Triton X-1001％。

蛋白提取的步骤：同上述

蛋白浓度测定：采用BCA法。

测定Calpains活性：操作步骤参照说明书。Calpains活性用相对荧光值(relative fluorescence units，RFU)来表示。

统计学分析

所有统计数据都用均数±标准误(Means±SE)表示。数据采用ANOVA分析，P＜0.05时为有统计学差异。

2、结果

(1)BM后处理改善大鼠离体心脏缺血复灌后心脏功能

如图9所示，大鼠离体心脏缺血/复灌后左室收缩功能显著受到抑制，BM 20nM或100nM复灌初5分钟给药能明显改善缺血/复灌后左室收缩功能的恢复，其改善程度随着剂量的增加而增强。对照组复灌45分钟，LVDP恢复为缺血前的18.8±2％，BM 20nM后处理心脏LVDP恢复为缺血前的37±4.5％(P＜0.05)，BM 100nM后处理心脏LVDP恢复为缺血前的42±2.3％(P＜0.01)。提示BM后处理能够改善缺血后心脏功能。

(2)BM后处理减少大鼠离体心脏缺血复灌心肌PKCε的降解

在后续的实验中，本发明人同样选择100nM的BM来探讨BM后处理对缺血心肌保护的机制。如图10所示，大鼠离体心脏缺血/复灌后心肌PKCε蛋白显著减少，BM后处理明显减轻缺血/复灌引起的心肌PKCε蛋白减少(P＜0.05)。

(3)BM后处理降低大鼠离体心脏缺血复灌后心肌Calpains活性

如图11所示，大鼠离体心脏缺血/复灌后心肌Calpains活性显著升高，BM后处理能明显降低缺血/复灌心肌Calpains的活性(1700±425vs 3160±233，P＜0.05)。

3、讨论

BM预处理虽然具有明显的保护作用，但由于缺血的发生在临床上通常是不可预测，从而使其临床应用具有一定的局限性。后处理的给药是在缺血发生后复灌初进行的，因此，相比而言后处理在实践中更具有操作性和临床价值。

本发明人的研究发现，BM 20nM和100nM缺血后处理均能明显改善大鼠离体心脏缺血复灌损伤，其改善程度呈剂量依赖性。而且同等剂量的BM后处理的保护效果与预处理的保护效果相当。PKCε为缺血保护性信号通路中重要的蛋白激酶。本发明人的研究证明，离体心脏缺血复灌导致信号通路蛋白PKCε显著的降解，BM后处理能明显减少缺血复灌引起的PKCε降解。缺血复灌中PKCε的降解目前报道较少，以往Urthaler等在Cardiovasc.Res.报道雪貂离体心脏缺血20分钟/复灌30分钟会导致PKCε的降解，应用Calpains特异性抑制剂MDL-28170可以减少PKCε的降解。同其他研究者的报道相一致，本发明人的实验结果证明心肌缺血复灌后Calpains活性显著升高。BM后处理能明显抑制缺血复灌心肌Calpains的活性。以上结果提示BM后处理可能是通过抑制Calpains活性而改善缺血再灌注心功能不全。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.小檗胺或其药学上可接受的盐的用途，用于制备促进心肌收缩的组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物通过增加肌丝对钙的敏感性促进心肌收缩。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物增加心肌的舒张速率。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的小檗胺的药学上可接受的盐是小檗胺的盐酸盐。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物防治心力衰竭。