CN102361648A - 沙门氏菌标记疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及适宜用作具有灭活的基因的标记物疫苗的沙门氏菌株。

Description

沙门氏菌标记疫苗
本发明涉及具有灭活的phoN基因的沙门氏菌株。尤其是，本发明涉及ΔphoN肠沙门氏菌(Salmonella enterica)减毒活疫苗株的制备方法。而且，本发明涉及用于免疫接种的动物与沙门氏菌属(Salmonella)感染的动物的区分的使用重组沙门氏菌属(Salmonella)蛋白PhoN的血清学测试系统。此外公开了用于DIVA的细菌学测试系统。 
本发明还涉及肠沙门氏菌肠亚种肠炎血清型变种(Salmonella enterica ssp.enterica serovar Enteritidis)株CLAB SE404(DSM 21972)和其用作减毒活ΔphoN沙门氏菌标记疫苗株用于治疗禽类以阻止肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)感染和/或用于制备保护家畜免于额外的病原体的多价重组沙门氏菌属载体疫苗的用途。CLAB SE404通过血清学或/和细菌学手段致使感染的动物和免疫接种的动物的区分(DIVA)。 
非伤寒沙门氏菌感染是动物和人中普遍的疾病。在人中，其是最常见的主要源于禽类和猪产品的食品来源疾病。在欧盟将建立监督系统，其应降低将病原性沙门氏菌属亚种(Salmonella ssp.)引入食品链(规定EC 2160-2003)。疫苗接种可降低病原性沙门氏菌属亚种(Salmonella ssp.)在家畜中的发病率，由此最小化传播率。例如产蛋鸡和猪的抗-沙门氏菌疫苗可商购。疫苗是细菌苗或减毒活沙门氏菌疫苗。在产蛋鸡中，这些疫苗用于减少病原体的卵巢内传播和粪便脱落。 
减毒活沙门氏菌疫苗被发现功效优于细菌苗。减毒活沙门氏菌疫苗对家畜的优选的使用，需求感染的动物和免疫接种的动物的区分(DIVA)的方法，其符合EC 2160-2003的规定。 
大部分获准的减毒活沙门氏菌疫苗从肠沙门氏菌肠亚种的血清型 变种(Salmonella enterica ssp.enterica serovar)的指定的野生型分离物通过化学诱变制备。当前，通过细菌学手段区别减毒活沙门氏菌疫苗和野生型沙门氏菌属亚种(Salmonella ssp.)。这些方法耗时耗力。免疫接种的和感染的动物的血清学区别将高度优选的。当前可用的减毒活沙门氏菌疫苗不能使根据DIVA策略血清学区别。 
DIVA活疫苗在家畜中成功地用于防止病毒感染。 
标记物疫苗可作为阳性或阴性标记物制备。阳性标记物疫苗含额外的抗原，其在免疫接种的动物中，而非感染的动物中诱导特异性抗体。阳性标记物疫苗明显有短处，因为有随后感染的免疫接种的动物不可与仅免疫接种的动物区分开。 
阴性标记物疫苗通过去除在感染的动物中引发特异性抗体的抗原来制备。由此，阴性标记物疫苗在免疫接种的动物中引发体液免疫应答，这不同于感染的动物。理想情况下，此差异可通过血清学手段检测。不同于阳性标记物疫苗，阴性标记物疫苗致使将随后感染的免疫接种的动物的鉴定。 
为选择阴性标记物抗原，必需考虑的几个方面是：抗原必需是免疫原性的，但不涉及保护动物免于病原体的免疫过程。由此，去除或灭活编码标记物抗原的基因必需维持疫苗株的免疫原性。最后，标记物抗原应特异于病原体，以便避免被可在家畜中出现且引发体液免疫应答的其他生物诱导的假阳性血清学结果。 
由于不同于病毒疫苗的减毒活细菌疫苗的高复杂性，开发减毒活细菌标记物疫苗需要更多努力。减毒活细菌标记物疫苗仍在实验阶段。通过缺失高度免疫原性表面抗原的基因从减毒活沙门氏菌疫苗株建立阴性沙门氏菌标记疫苗的第一候选物。这些减毒活沙门氏菌属DIVA疫苗能够通过血清学手段区分感染的和免疫接种的动物。但是，这些原型相比亲本疫苗株欠保护性。 
基因phoN编码非特异性酸磷酸酶，其已被发现在全部沙门氏菌属亚种中广泛保守。基因phoN在PhoPQ调控子(沙门氏菌属中毒力基因的通用的调节子)控制下表达。不知phoN是否对于动物中沙门 氏菌存活必要。 
phoN与PhoPQ调控子的连接可表明phoN在沙门氏菌属占领宿主组织时活化。由此出现问题，是否消除或灭活减毒活沙门氏菌疫苗株中的基因phoN可负面影响其在免疫接种的动物中诱导保护性免疫的潜力。已知减毒活沙门氏菌疫苗株中单个基因的删除可还降低其残留的毒力，其可减少宿主免疫应答的刺激，且结果可消除保护性免疫。 
本发明旨在提供适宜作为至少部分克服现有疫苗的以上描述的缺点的阴性标记物疫苗的沙门氏菌株。 
在本发明，基因phoN被选作制备沙门氏菌属DIVA疫苗的靶。意外地，phoN基因提供使phoN-缺陷型沙门氏菌株尤其适宜作为活疫苗的组合特性。 
第一意外的性质是PhoN蛋白在全部非-沙门氏菌属细菌相比沙门氏菌属中的不同的结构。另一方面，PhoN氨基酸序列在不同的沙门氏菌属物种中具有至少95％程度的同一性(跨氨基酸序列的总长度计算的)。 
第二意外的性质是PhoN是免疫原性的。来自经沙门氏菌属亚种(Salmonella ssp.)感染的鸡和小鼠的血清的分析明显显示出现特异性地结合纯化的PhoN蛋白的抗体。此结果提供第一证据，PhoN是免疫原性的，且可将其用作用于检测沙门氏菌属-感染的鸟和哺乳动物的血清学标记物抗原。如果在任何沙门氏菌疫苗株中基因phoN的表达消除，此可允许通过血清学手段区别感染的动物和免疫接种的动物。由此，通过耗竭PhoN抗原的沙门氏菌属活疫苗株免疫接种的动物将不产生PhoN-特异性抗体，而经野生型沙门氏菌感染的动物将产生PhoN-特异性抗体。 
第三意外的性质是去除减毒活沙门氏菌疫苗株的基因phoN可还降低疫苗株的毒力，但不影响其免疫原性和其从同源血清型变种的沙门氏菌属感染保护免疫接种的鸡的功效。 
本发明的第一主题是具有灭活的phoN基因的沙门氏菌株。此在本文中以ΔphoN表示。ΔphoN沙门氏菌株基本上无phoN活性。分子 生物学领域的技术人员知道细菌(例如沙门氏菌属细菌)中基因灭活的方法。 
phoN的灭活包括phoN基因的缺失或/和修饰。尤其是，本发明的沙门氏菌株基本上不产生PhoN蛋白或其能诱导针对PhoN蛋白或其片段的免疫应答的片段，本发明的沙门氏菌株不对于PhoN蛋白或其片段是免疫原性。phoN基因可完全或至少部分缺失。phoN基因的部分缺失可为phoN基因的全长序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或至少98％缺失。如果phoN基因序列缺失部分，其余序列优选不能表达PhoN蛋白或其片段，尤其是如本文所述的免疫原性片段。 
phoN基因序列的修饰包括序列取代。phoN基因可完全被另一序列取代。缺失的phoN基因序列可被其他序列完全或部分取代。 
phoN基因的编码序列(开放阅读框)可完全或至少部分缺失。phoN编码序列的部分缺失可为全长phoN编码序列的序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或至少98％缺失。如果phoN编码序列部分缺失，其余序列优选不能表达PhoN蛋白或其片段，尤其是如本文所述的免疫原性片段。 
phoN编码序列的修饰包括序列取代。phoN编码序列可完全被另一序列取代。phoN编码序列的缺失的序列可被其他序列完全或部分取代。 
沙门氏菌属的phoN多肽序列的典型例描述于图1(SEQ ID NO：1～20)。沙门氏菌属phoN基因座位的典型例描述于图2，包括phoN开放阅读框(ORF)和phoN ORF的上游或/和下游调控序列(SEQ ID NO：23～27)。 
本发明的phoN多肽片段可具有最小10、至少20或至少30个氨基酸残基的长度。它们可具有最大200、最大150或最大100个氨基酸残基的长度。片段包括免疫原性片段(也在本文中称为免疫原性部分)。 
phoN基因的灭活优选是不可逆的灭活，例如通过phoN编码区的 完全或至少部分缺失，或通过phoN编码区的取代，如本文所述。尤其是，不可逆的灭活阻止本发明的沙门氏菌株恢复为野生型phoN基因型。 
如上所述，本发明的沙门氏菌株基本上不产生能诱导针对PhoN蛋白的免疫应答的PhoN蛋白，即本发明的沙门氏菌株对于PhoN蛋白或其片段不是免疫原性的。对于PhoN蛋白或其片段的免疫原性可为待用本发明的沙门氏菌株处理的任何物种中的免疫原性。尤其是，对于PhoN蛋白或其片段的免疫原性是哺乳动物(例如猪)或鸟(例如禽类，例如鸡)中的免疫原性。 
本领于技术人员能鉴定沙门氏菌属或非-沙门氏菌株中的PhoN多肽和phoN基因。在本发明中，沙门氏菌属PhoN蛋白可为包括选自的下列的序列的蛋白：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20、或包括至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同于选定的序列的序列的多肽，其中同一性相对于选定的序列长度计算。非-沙门氏菌属PhoN蛋白可为从埃希氏菌属(Escherichia)或志贺菌属(Shigella)获得的PhoN蛋白，且可具有选自SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的序列、或为包括至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同于选自SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的序列的序列的多肽，其中同一性相对于选定的序列长度计算。 
使经历如本文所述phoN灭活，以便获得根据本发明的株的沙门氏菌株可选自肠沙门氏菌亚种(Salmonella enterica ssp)。优选是，选自肠沙门氏菌肠亚种(Salmonella enterica ssp.enterica)的血清型变种的沙门氏菌株，例如来自下列的血清型变种：肠炎变种(Enteritidis)、都柏林变种(Dublin)、鸡变种(Gallinarum)、伤 寒变种(鼠伤寒)、新港变种(Newport)、霍乱变种(Choleraesuis)、阿哥拉变种(Agona)、哈达尔变种(Hadar)、海德尔堡变种(Heidelberg)、肯塔基变种(Kentucky)、圣保罗变种(Saintpaul)、魏尔肖变种(Virchow)、韦尔泰夫利丁变种(Weltevreden)、爪哇变种(Javiana)、施瓦岑格隆德变种(Schwarzengrund)、副伤寒变种(Paratyphi)和伤寒变种(Typhi)或来自列于图1的血清型变种。 
使如本文所述经历phoN灭活的沙门氏菌株可为减毒的沙门氏菌株，例如减毒活沙门氏菌株，例如减毒活肠沙门氏菌肠亚种肠炎血清型变种(Salmonella enterica ssp.enterica serovar Enteritidis)His-Ade-株，例如Salmovac SE株(Springer et al.，2000，Berl.Münch. 
Figure BDA0000071676370000061
Wschr.113，246-252)或其变体。 
可也将如本文所述的phoN基因的灭活应用于获准的减毒活沙门氏菌疫苗。可将这些株不影响它们的免疫原性地转化进减毒活沙门氏菌属ΔphoN标记物疫苗，以便例如从沙门氏菌属感染保护家畜，且同时允许区别免疫接种的和沙门氏菌属感染的家畜。此转化方法可应用于通过化学诱变和/或遗传加工制备的减毒活沙门氏菌疫苗株，或应用于使用减毒活沙门氏菌疫苗株例如作为表达至少一种额外的自体抗原和/或一种额外的异源病原体的抗原的载体的任何重组沙门氏菌疫苗方法，或应用于用作载体以递送用于疫苗接种的DNA的减毒活沙门氏菌疫苗株。 
使如本文所述经历phoN灭活的是减毒活沙门氏菌疫苗株的沙门氏菌株尤其是： 
(i)通过化学诱变和/或遗传加工制备的疫苗株， 
(ii)任选重组表达至少一种自体沙门氏菌属抗原和/或至少一种异源抗原(例如异源病原体的抗原)的重组疫苗株，或者 
(iii)用于DNA递送的重组载体株。 
本发明的优选的沙门氏菌株是肠沙门氏菌肠亚种肠炎变种(Salmonella enterica enterica Enteritidis)株 CLAB SE404(DSM 21972)，和由其衍生出的任何株。 
本发明的沙门氏菌株，尤其是株DSM 21972，可用于医学，例如兽医学。本发明的沙门氏菌株，尤其是株DSM 21972，可用作疫苗。本发明的沙门氏菌株，尤其是株DSM 21972，可用作活疫苗。本发明的沙门氏菌株，尤其是如本文所述的疫苗，更特定株DSM 21972，可用作抵御沙门氏菌属感染的，尤其是抵御肠沙门氏菌亚种(Salmonella enterica ssp.)的感染的疫苗。本发明的沙门氏菌株，尤其是株DSM 21972、可用于哺乳动物(例如猪)或鸟(例如禽类，例如鸡)。 
本发明的沙门氏菌株株，尤其是株DSM 21972，可用于制备药物，例如兽医学中的药物。本发明的沙门氏菌株，尤其是株DSM 21972，可用于制备疫苗。本发明的沙门氏菌株，尤其是株DSM 21972，可用于制备活疫苗。本发明的沙门氏菌株，尤其是如本文所述的疫苗，更尤其是株DSM 21972，可用于制备抵御沙门氏菌属感染的，尤其是抵御肠沙门氏菌亚种(Salmonella enterica ssp.)感染的疫苗。本发明的沙门氏菌株、尤其是株DSM 21972，可用于制备用于哺乳动物(例如猪)或鸟(例如禽类，例如鸡)的药物。 
本发明的疫苗，尤其是株DSM 21972，可为用于抵御随后沙门氏菌属感染、尤其是抵御随后肠沙门氏菌亚种(Salmonella ssp.)感染，且为用于制备抵御额外的病原体的多价重组沙门氏菌载体疫苗的疫苗。疫苗任选重组表达至少一种自体沙门氏菌属抗原和/或至少一种异源抗原，例如异源病原体抗原。疫苗可适宜于施用给哺乳动物(例如猪)或鸟(例如禽类，例如鸡)。 
本发明的主题是预防或/和治疗沙门氏菌属感染的方法，包括给有需要的受试者施用本发明的沙门氏菌株，尤其是株DSM 21972。受试者可为哺乳动物(例如猪)或鸟(例如禽类，例如鸡)。 
本发明的另一主题是预防或/和治疗病原体感染的方法，包括给有需要的受试者施用本发明的沙门氏菌株，其中制备本发明的沙门氏菌株以赋予抵御此病原体，例如多价沙门氏菌属活疫苗。优选是，此沙门氏菌株源于DSM 21972。受试者可为哺乳动物(例如猪)或鸟(例 如禽类，例如鸡)。尤其是，不同于沙门氏菌属的病原体。 
本发明的另一主题是产生如本文所述的沙门氏菌株的方法，尤其是株DSM 21972，包括灭活沙门氏菌株的phoN基因。 
如上所述，phoN的灭活还可降低减毒活沙门氏菌疫苗株的毒力，但其不影响该转化的沙门氏菌疫苗株的免疫原性。因此phoN灭活是产生减毒活沙门氏菌属DIVA疫苗株的适宜方法。 
减毒活ΔphoN沙门氏菌属DIVA疫苗的制备可从能保护例如禽类和/或哺乳动物家畜免于沙门氏菌属感染(尤其是免于肠沙门氏菌亚种(Salmonella enterica ssp.)感染)的任何减毒活沙门氏菌疫苗株开始。DSM 21972的制备始于株Salmovac SE的变体。从所述沙门氏菌疫苗株，如本文所述通过施加遗传加工灭活基因phoN。phoN灭活完成后，应分析个体沙门氏菌属变体株，以便评估与亲本沙门氏菌疫苗株相关呈现的差异。ΔphoN沙门氏菌属变体株优选除了来自亲本沙门氏菌疫苗株的phoN之外在生物学特征上基本上相同。如果ΔphoN沙门氏菌属变体株在一个或多个与phoN不相关的特征上不同于亲本沙门氏菌疫苗株，这些改变可为永久性的，且最重要的是，可基本上维持亲本株的在适当免疫接种的动物中引发针对随后沙门氏菌属感染的保护免疫应答的原免疫原性表征。 
优先，phoN通过利用遗传加工的编码基因phoN的核酸片段的缺失来不可逆地灭活。灭活处理也可包括用于phoN起始转录的附属核酸的缺失。phoN的缺失可以抑制新转录物呈现的方式进行。遗传加工含盖致使如所示本文中沙门氏菌基因组中基因phoN缺失的同源重组的任何加工。优选地，同源重组加工应致使基因phoN的精确的缺失，而其余基因组仍不变，这在本文中被称为“干净的”缺失处理。此外，同源重组处理优选由暂时共表达的重组酶(例如Datsenko和Wanner所述的噬菌体λ红重组酶系统)驱动。 
本发明的沙门氏菌株可有降低的能动性、例如至少30％、至少50％或至少90％、或/和降低的生物膜形成能力、例如至少30％、至少50％或至少90％。 
如上所述，ΔphoN沙门氏菌株，尤其是减毒活ΔphoN沙门氏菌株，更特定DSM 21972，可为标记物疫苗。减毒活ΔphoN沙门氏菌标记疫苗株例如DSM 21972致使通过血清学和/或补充性细菌学手段区分感染的和疫苗接种的动物(DIVA)。 
本发明再一主题是包括沙门氏菌属PhoN多肽或/和其免疫原性片段的多肽作为血清学标记物抗原的用途。血清学标记物抗原可为任何源于PhoN多肽的抗原。phoN抗原可为包括全长PhoN多肽、或包括其任何免疫原性部分的多肽，其具有优选至少10个、更优选至少20个和再更优选至少30个氨基酸的长度。PhoN多肽可为包括选自下列的序列的多肽：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20、或包括至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同于选自下列的序列的序列的多肽：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，其中％同一性相对于选定的序列全长计算。免疫原性部分可具有与本文所述的PhoN多肽的序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸位置的序列，其中％同一性相对于免疫原性部分长度计算。如本文所述的同一性可通过常见的算法例如BLAST或FASTA计算。优选的序列是源于株CLAB_SE 360的SEQ ID NO：1(见图1)。 
如本文所述的血清学标记物抗原可用于在用本发明的沙门氏菌株疫苗接种后的感染的动物和免疫接种的动物的区分(DIVA)。源于 SEQ ID NO：1的血清学标记物抗原可尤其用于感染的动物和用株DSM 21972免疫接种的动物的区分。 
本发明的phoN抗原可通过，尤其在重组宿主细胞(例如大肠杆菌)中phoN核酸的重组表达来制备。phoN抗原可作为冷冻的浓储物或作为冷冻干燥物提供，任选伴随适当的防腐剂。 
本发明的再一主题是用于检测针对沙门氏菌属phoN抗原的抗体的血清学测试系统，其包括至少一种重组沙门氏菌属phoN抗原或其任何免疫原性部分，以及任选其他测试成分。血清学测试系统可区别沙门氏菌属感染的动物和通过本发明的沙门氏菌株(尤其是减毒活ΔphoN沙门氏菌属DIVA疫苗，例如CLAB SE404(DSM 21972))免疫接种的动物。至少一种phoN抗原是如本文所述的抗原。沙门氏菌属phoN抗原优选包括序列SEQ ID NO：1或至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同于SEQ ID NO：1的序列，其中同一性相对于SEQ ID NO：1长度计算。 
在血清学测试系统中，抗原作为在疫苗接种后疑似感染沙门氏菌或可成为感染沙门氏菌的动物的血清中特异性地检测抗体的靶抗原。如果使用成功地通过本发明的沙门氏菌株(尤其是减毒活ΔphoN沙门氏菌属DIVA疫苗)免疫接种的动物血清，则通过PhoN靶抗原检测不到抗体。检测可以ELISA形式进行。 
任选将额外的沙门氏菌属特异性抗原用于血清学测试系统，例如沙门氏菌属LPS、其检测由野生型沙门氏菌属和本发明的沙门氏菌疫苗株(尤其是减毒活ΔphoN沙门氏菌属DIVA疫苗)诱导的抗体。 
本发明的再一主题是编码如本文所述的沙门氏菌属抗原的phoN核酸。phoN核酸包括如本文所述编码PhoN多肽或其片段的序列，例如包括选自下列的序列的多肽：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、 SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20、或包括至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同于所述序列的序列的多肽，其中同一性相对于所述序列长度计算。核酸可编码如本文所述的PhoN多肽的任何免疫原性片段。 
phoN核酸可用于，例如在宿主(例如大肠埃希氏菌(E.coli))中通过使用适当的重组DNA载体制备重组沙门氏菌属phoN抗原或其任何免疫原性部分。phoN抗原可为如本文所述的抗原。phoN抗原可包括SEQ ID NO：1的序列、或至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同于SEQ ID NO：1的序列，或其任何免疫原性部分，如本文所述。同一性相对于SEQ ID NO：1长度计算。 
本发明还涉及用于区分野生型沙门氏菌属亚种(Salmonella ssp.)和本发明的沙门氏菌株(例如减毒活ΔphoN沙门氏菌属DIVA疫苗)的细菌学测试系统。此细菌学测试系统完善规定生物学样品中沙门氏菌属检测的官方的标准方法。 
本发明的细菌学测试系统澄清了以标准检测方法何时沙门氏菌属集落呈现，无论这些是野生型沙门氏菌株或本发明的沙门氏菌株，例如减毒活ΔphoN沙门氏菌属。分析至少一个怀疑的沙门氏菌属集落，以便评估是否个体沙门氏菌属集落的基因组含基因phoN或其片段。分析可通过PCR方法进行、或/和通过检测PhoN活性或/和PhoN基因产物来进行。可分析代表性的怀疑的沙门氏菌属集落数，例如至少5、至少10、至少15或至少20个集落。 
PhoN活性可通过将等份的单个集落转移进含PhoN特异性底物混合物的分离瓶(例如微孔板的孔)中来测量，其中PhoN产生可通过视觉对照或通过适当的装置检测的发色产物。PhoN定位在沙门氏菌属亚种的周质空间内，其允许使用用于确定PhoN活性的完整的细胞。根据测试系统，野生型沙门氏菌通过产生发色产物显示PhoN活性，然而减毒活ΔphoN沙门氏菌属则不。适宜底物可为BCIP。 
本发明的沙门氏菌株可通过根据ISO 6579的测试来检测。 ISO 6579通过引用包括在本文中。通过根据ISO 6579的测试，PhoN活性可通过发色底物BCIP检测。 
发明通过以下图、实施例和序列表进一步阐述。 
【附图说明】
【图1】各肠沙门氏菌肠亚种的血清型变种(Salmonella enterica entericaserovar)之间的PhoN蛋白的相似性。 
【图2】肠沙门氏菌肠亚种的血清型变种(Salmonella enterica entericaserovar)的phoN的基因组区。 
【图3】 
图3显示使用如Datsenko和Wanner所述的取代重组的减毒活肠沙门氏菌肠亚种肠炎变种(Salmonella enterica enterica Enteritidis)疫苗株Salmovac SE的phoN缺失突变体的制备策略。例示肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)株P125109的基因组区包括同于肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)疫苗株Salmovac SE的phoN座位。基因组区开始于保藏在NCBI(美国生物技术信息中心)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes)的序列NC_011294.1的核苷酸(nt)4.419.410。任何开放阅读框(ORF)的取向和长度通过箭头指出。注释的ORF通过黑色箭标显示，而其他通过条纹箭标显示。对于phoN，预测了通过空心箭标显示的2个启动子(P1，P2)。 
图3A例示包括基因phoN的缺失区的边界(实体垂直线)。图3B显示phoN取代后原基因组区之内的ORF。原ORF中的3种(ORF1～3)由重组处理延长(空心箭标)。 
【图4】 
图4显示由肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)疫苗株Salmovac SE通过如图3所示的取代重组制备的phoN突变体株的基因组区之内的反转录酶PCR(RT-PCR)分析。 
在A部分显示指定为推定的乙酰基转移酶(黑色箭标)的ORF的RT-PCR分析的数据。分析显示含盖推定的乙酰基转移酶及之后的 ORF 1-3的转录物(mRNA)。RT-PCR分析还显示，转录物延长到取代片段，但，意外地，不过该片段。 
在右上框图中，显示取代片段的一级结构和包括的FRT-位点。FRT-位点形成高稳定性(-17kcal/mol)的二分体结构。其提示，FRT-位点实际上发挥转录终止子的作用，其抑制超过取代片段的ORF 1-3的表达。 
构建RT-PCR引物以检测超过取代片段(1)或覆盖FRT-位点前部区(2)的转录物。图4B显示从在PCR之前用反转录酶(RNA)处理的或保持未处理的(DNA)的肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)ΔphoN疫苗株的RNA制备物获得的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。数据显示纯的RNA探针。作为对照，给出基因gyrB的RT-PCR。如已指定，超过取代片段的转录物几乎消除(泳道1)，这不同于在FRT-位点前端停止的转录物(泳道2)。 
【图5】 
将野生型肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)株的毒力与减毒活肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)疫苗株Salmovac SE和ΔphoN突变体株CLAB_SE404相比。各沙门氏菌株的相对毒力通过测定沙门氏菌属在24小时内在MDCK细胞内的存活率评定。细胞用野生型肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)株以10的MOI感染。两种减毒活肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)疫苗株以100的MOI施用。2小时感染时期后，通过洗涤去除培养基中的过量细菌。附加地，添加庆大霉素[25μg/mL]，以便抑制细胞外沙门氏菌。在适当的条件下感染的细胞的24h培养后，通过在含1％Triton-X100的PBS中裂解MDCK细胞来测定细胞内沙门氏菌的数。 
数据明显显示两种减毒活肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)疫苗株相比野生肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)分离物在MDCK细胞中的强烈降低的持续。意外地、数据显示两种沙门氏菌疫苗株在MDCK细胞中不同的存活率。CLAB_SE404是如对图3的说明中所述由减毒活肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)疫苗株Salmovac SE制备的不同的 ΔphoN突变体克隆的非-能动性变体。数据表示相比祖先株Salmovac SE，CLAB_SE404的降低的毒力。 
【图6】 
在白色来亨鸡中进一步评估2种ΔphoN肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)疫苗株的毒力。在1和21日龄用1～2×108CFU的CLAB_SE404或CLAB_SE441将动物经口免疫接种。CLAB_SE441是肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)ΔphoN[ade/his]-的能动性变体。相比对比度，CLAB_SE404是肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)ΔphoN[ade/his]-的非-能动性变体。 
在疫苗接种后不同的时间、将5个动物处死，以及测定免疫接种的动物的各组织中细菌的数。高定居值表明通过直接在选择性XLT-4琼脂板上培养检测到沙门氏菌。如ISO6579中所述在胨水上富集培养和随后在MSRV琼脂板上温育后测定到残量定居。 
数据确认两种ΔphoN肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)疫苗株之间毒力的差异。相比CLAB_SE441，CLAB_SE404从免疫接种的鸡组织更快速消失。 
【图7】 
如图6的说明中所述用CLAB_SE404免疫接种两次的白色来亨鸡接受1～2×108CFU的野生型肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)(SE 147N)的口服攻击感染。攻击感染在加施疫苗接种21天后施用及再分析14天。作为对照，在同龄感染幼稚的白色来亨鸡42天。 
在不同的时间，两个动物组之内的沙门氏菌的脱落和组织定居测定和总结于图7A。数据显示免疫接种的动物的明显的保护。由此，脱落野生型肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)的动物的数明显在免疫接种的组中降低。此外，在脾脏和肝脏中有沙门氏菌的动物的数在免疫接种的相比未处理的对照组中更低。相比幼稚的动物，免疫接种的动物甚至在盲肠含量中具有野生型沙门氏菌数的显著减少(图7B)。数据明显展示CLAB_SE404(Salmovac SE ΔphoN疫苗株的非-能动性变体)的保护性质。 
【图8】 
与根据ISO6579的标准沙门氏菌检测测试平行使用的细菌学phoN-DIVA测试的批准。 
图8A例示在补充了发色磷酸酶底物BCIP[80μg/mL]的XLT4琼脂板和LB-琼脂板上野生型伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)的分别平行平铺。野生型伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)通常在XLD/XLT4琼脂板呈现为黑色的集落，以及在BCIP LB-琼脂板(PhoN-DIVA测试)上呈现为蓝-绿染色的集落。 
在图8B中显示了活减毒的肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)ΔphoN疫苗株CLAB_SE404的平行平铺。ΔphoN沙门氏菌疫苗株在沙门氏菌属特异性XLD/XLT4琼脂板上呈现为黑色的集落，但在BCIP LB-琼脂板上仍未着色。此发现是令人意外的，由于已知沙门氏菌表达有磷酸酶活性的几种酶。得出，phoN基因的灭活足以阻止本文所述的发色磷酸反应。 
描述的测试允许在标准沙门氏菌属测试设置之内使用减毒活phoN-DIVA肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)疫苗株CLAB_SE404的感染的动物和免疫接种的动物的清楚的区分。 
【图9】 
在白色来亨鸡中PhoN-DIVA抗体测试。 
PhoN-DIVA抗体测试的特异性通过使用来自沙门氏菌属-感染的鸡(Inf)的血清和来自用减毒活肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)phoN-DIVA疫苗株CLAB_SE404(Vac)免疫接种的鸡的血清的免疫印迹分析批准。 
用沙门氏菌属PhoN、PhoNFP101和PhoNFP201的2种重组变体制备坐标图A的印迹。在杂交前，将纯化的样品在10％ 
Figure BDA0000071676370000151
-Jagow PAGE上分离。PhoNFP101覆盖原PhoN的一级结构。PhoNFP201具有截短的NH2-末端和PhoN活性中心之内的氨基酸置换产生失活的PhoN。 免疫印迹分析使用适当的碱性磷酸酶-缀合的抗血清显示IgG-特异性免疫应答。分子量标记物显示于泳道M，分别对应于43、34和26kDa。 
显示于图9A的PhoN-DIVA抗体测试用来自用减毒活肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)phoN-DIVA疫苗株CLAB_SE404(Vac)免疫接种两次的鸡的血清和来自经强毒的肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)株SE 147N(Inf)感染的幼稚的动物的血清进行。Inf-组的抗体结合两种变体PhoN抗原。Vac-组不产生PhoN-特异性抗体。 
在图9B中显示抵御肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)裂解产物的IgG-滴度，如在ELISA中使用两个动物组的血清，在不同的感染时间测定。在DIVA-Vac组中，IgG-滴度在(0)之前和攻击感染后，在感染后第7及28天测定。在Inf组中，以相同的方式测定IgG-滴度。 
【图10】用于制备融合蛋白PhoNFP101(左图)和PhoNFB201(右图)的表达质粒的图谱。 
【图11】PhoNFP101的基因(A)和编码的融合蛋白(B)的序列。 
【图12】PhoNFP201的基因(A)和编码的融合蛋白(B)的序列。 
【实施例】
【实施例1】 
在各肠沙门氏菌肠亚种的血清型变种(Salmonella enterica entericaserovar)之内通过BLAST 2.2.18使用数据库”nr”经美国生物技术信息中心(NCBI)网络门户评定蛋白PhoN的相似性。将肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)株CLAB_SE360的蛋白PhoN的氨基酸序列用作查询序列(SEQ ID NO：1)。CLAB_SE360是疫苗株Salmovac SE的变体(Springer et al.，2000，Berl.Münch. Wschr.113，246-252)。通过色彩亮显各PhoN蛋白一级结构之内的非-相同的氨基酸。数据揭示各沙门氏菌属血清型变种之内的PhoN蛋白的一级结构具有＞96％的同一性。 
相反，非-沙门氏菌属细菌之内的PhoN蛋白的一级结构与肠沙门氏菌肠亚种的血清型变种(Salmonella enterica enterica serovar)的 PhoN蛋白具有低的关系(同一性＜40％)。显示非-沙门氏菌属细菌的最相关的PhoN氨基酸序列。仅显示相同的氨基酸。指出变体(-)、额外的(+)或缺失(Δ)氨基酸。在序列表中给予全序列(SEQ ID NO：21和22)。 
结果总结于图1。 
【实施例2】 
各肠沙门氏菌肠亚种的血清型变种(Salmonella enterica enterica serovar)的包括基因phoN和与通过，如由T.Shigaki and K.D.Hirschi(Anal.Biochem.2001，298：118-120)所述或由K.A.Datsenko和B.L.Wanner(PNAS 2000，97：6640-6645)所述的遗传加工的ΔphoN沙门氏菌属突变体的制备关联的侧翼区的phoN基因组区的描述。 
phoN基因组区如下显示于图2： 
Figure BDA0000071676370000171
【实施例3】 
在本实施例中，通过遗传加工从原本源于减毒活肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)疫苗株Salmovac SE的变体的肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)株的基因组去除基因phoN。更详细的分析意外地显示ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)疫苗株变体的群中的差异。少数一些ΔphoN疫苗株变体具有祖先株和其他ΔphoN疫苗株变体的至少30％的能动性活性。此外，能动性降低的ΔphoN疫苗株变体具有降低的形成生物膜的能力，这也不同于祖先株和其他ΔphoN变体。 
除了指定的差异，研究的全部ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)变体是腺嘌呤和组氨酸的营养缺陷型，且表达复合物脂多 糖(LPS)。它们不含任何已知的强毒质粒。由此，全部ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)变体包括Salmovac SE的相关特征，其已经在德国获得批准用于疫苗接种产蛋鸡。 
单个变体、CLAB SE404选自具有降低的能动性和生物膜能力的ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)变体群。CLAB SE404的进一步分析显示，这些附加地鉴定的特征稳定超过150代。 
将株CLAB SE404根据布达佩斯条约，于2008年11月10日，以保藏号DSM 21972保藏在DSMZ-德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Inhoffenstraβe 7B，D-38124 Braunschweig)。 
在往后分析中，将CLAB SE404的毒力和功效与能动性ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)疫苗株变体和原疫苗株相比。 
通过体外和体内实验评定沙门氏菌疫苗株的毒力。MDCK-细胞的定量感染明显显示，CLAB SE404相比祖先株和能动性ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)变体在MDCK-细胞中少毒力。 
一日龄的鸡经口接种CLAB SE404或能动性ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)组的单个变体。然后，通过细菌学手段测定免疫接种的动物的各组织中沙门氏菌的存在。数据揭示疫苗接种的7天后两个动物组的肝脏和脾脏中沙门氏菌的类似量。然后肝脏和脾脏中CLAB SE404的量降低，但在接受能动性ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)变体株的动物的器官中中其仍高。在盲肠组织中得到类似结果。数据明显表明CLAB SE404相比能动性ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)变体少毒性。CLAB SE404从免疫接种的鸡的组织和粪便的消失相比能动性ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)变体早得多。 
在由CLAB SE404或能动性ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)变体在1和21日龄经口免疫接种的鸡中测定ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)株的免疫原性。通过ELISA使用沙门氏菌属抗原评定两个动物组的体液和粘膜免疫应答。数据显示，两种疫苗株在经口免疫接种的鸡中引发最后疫苗接种的多于50天后 仍高的体液和粘膜免疫应答。由此，CLAB SE404与能动性ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)变体具有类似免疫原性功效。 
最后显示，通过CLAB SE404或能动性ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)变体在1和21日龄经口免疫接种的鸡耐受强毒肠沙门氏菌肠亚种肠炎变种(Salmonella enterica enterica Enteritidis)分离物的攻击感染。由此，CLAB SE404与能动性ΔphoN肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)变体具有类似保护功效。 
总之，CLAB SE404已鉴定为能使感染的动物和免疫接种的动物的进一步区分的用于具有低脱落和高功效的禽类的新减毒活沙门氏菌疫苗。 
【实施例4】 
【用于PhoN-DIVA抗体测试的重组PhoN蛋白的制备】 
基于重组PhoN优先制备PhoN-DIVA抗体测试。用纯化的重组PhoN的之前免疫印迹分析明显显示用减毒活沙门氏菌属phoN-DIVA疫苗株免疫接种的动物不产生结合全蛋白的抗体。意外的是，尽管蛋白PhoN的复杂性和体液免疫应答的广谱反应性，无交叉-反应性抗体存在于用phoN-DIVA沙门氏菌疫苗株免疫接种的动物血清中。 
可以高纯度制备用于PhoN-DIVA抗体测试的重组PhoN。任何杂质可通过用PhoN-DIVA沙门氏菌疫苗免疫接种的家畜的广谱抗体检测，且由此导致PhoN-DIVA抗体测试中的假结果。 
纯的PhoN的制备可通过用允许高度严格纯化条件的额外的多肽片段延伸PhoN的一级结构来辅助。优先，将一系列组氨酸(His-标签)导入PhoN的氨基末端或羧基末端。此外，可将另一蛋白结构域导入特异性地被内肽酶(例如凝血酶)识别的His-标签和PhoN结构之间，其允许去除His-标签。分析显示，所述包括His-标签和凝血酶-位点的PhoN的融合蛋白不干扰用减毒活沙门氏菌属DIVA-疫苗株免疫接种的动物血清，如之前分析所示。 
PhoN的融合蛋白可在大肠杆菌中通过常规表达载体，例如 pET15b和通过应用如提供商，例如Novagen所示的标准纯化流程来制备。图10～12公开使用的表达质粒的图谱、例示制备的PhoN融合蛋白、PhoNFP101和PhoNFP201的DNA和氨基酸序列。 
【PhoN-DIVA抗体测试】 
PhoN-DIVA抗体测试在将鸡用减毒活沙门氏菌属phoN-DIVA疫苗株免疫接种时应用。在本实施例中，血清学PhoN-DIVA测试系统包括重组蛋白PhoN，例如PhoNFP101或PhoNFP201，和另一沙门氏菌属特异性抗原。优先，沙门氏菌特异性抗原用例如由Idexx实验室Inc.(Flockchek)或由Labor Diagnostik GmbH Leipzig(Flocktype Salmonella)或由Biochek和其他公司提供的检测鸡中的沙门氏菌特异性抗体的商业测试试剂盒提供。此测试设置证明疫苗接种后是否呈现沙门氏菌特异性免疫应答。附加地，其证明无野生型沙门氏菌涉及，其通过在PhoN-DIVA抗体测试中与重组蛋白PhoN的阴性反应表明。 
一般而言，用于检测沙门氏菌特异性抗体的商业测试试剂盒制备为微孔板中的间接ELISA。取决于供应商，沙门氏菌-特异性抗原混合剂已结合到微孔板的容器或必需之后使用等份的浓储物溶液偶联于其上。 
优先提供纯化的PhoN，例如PhoNFP201作为冷冻的浓储物溶液或作为含适当的防腐剂的冷冻干燥物。在本实施例中，用于检测PhoN-特异性抗体的ELISA根据如别处所述的标准流程，例如由E.Harlow and D.Lane in Antibodies.A Laboratory Manual所述的标准流程进行。 
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Claims (12)

1.肠沙门氏菌肠亚种肠炎血清型变种(Salmonella enterica ssp.enterica serovar Enteritidis)株DSM 21972或由其衍生出的任何株。
2.权利要求1的株，其用于医学，例如兽医学。
3.权利要求2的株，其用作疫苗。
4.权利要求3的株，其用作活疫苗。
5.权利要求3或4的株，其用作抵御沙门氏菌属(Salmonella)感染的疫苗。
6.权利要求1～5中任一项的株，其用于哺乳动物，例如猪；或鸟，例如禽类，例如，鸡。
7.包括沙门氏菌属(Salmonella)phoN多肽或/和其任何免疫原性部分的多肽作为血清学标记物抗原的用途，其中phoN多肽包括序列SEQ ID NO：1或至少70％同于SEQ ID NO：1的序列，且其中免疫原性部分的长度是优选至少10个、更优选至少20个和再更优选至少30个氨基酸。
8.权利要求7的用途，其用于用权利要求1～6中任一项的株疫苗接种后感染的动物和免疫接种的动物的区分(DIVA)。
9.权利要求7或8的用途，其中phoN抗原通过phoN核酸的，尤其在重组宿主细胞、例如大肠杆菌中的重组表达来制备。
10.权利要求7～9中任一项的用途，其中phoN抗原包括SEQ ID NO：1的全长phoN多肽。
11.用于检测针对沙门氏菌属(Salmonella)phoN抗原的抗体的血清学测试系统，其包括至少一种重组沙门氏菌属(Salmonella)phoN抗原或其任何免疫原性部分，以及任选其他测试成分，其中phoN抗原包括序列SEQ ID NO：1或至少70％同于SEQ ID NO：1的序列。
12.沙门氏菌属(Salmonella)phoN核酸用于制备重组沙门氏菌属(Salmonella)phoN抗原或其任何免疫原性部分的用途，其中phoN抗原包括序列SEQ ID NO：1或至少70％同于SEQ ID NO：1的序列。
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